Elaboración de un protocolo para la medición de la concentración espermática by Medicina Veterinaria JDC

ELABORACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA EN BOVINOS MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA EN MODO ABSORBANCIA

ANDRÉS RICARDO PEÑA MANOSALVA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

ELABORACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA EN BOVINOS MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA EN MODO ABSORBANCIA

ANDRÉS RICARDO PEÑA MANOSALVA

Trabajo de grado para optar el título de Médico Veterinario

Director MAURICIO BOYACÁ QUINTANA M.V. Esp. Laboratorio Clínico Veterinario

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

NOTA DE ACEPTACIﾃ誰

___________________________________

Director

___________________________________ Dr. Mauricio Boyacﾃ｡ Quintana

Jurado

___________________________________ Dr. Jefferson Castro Cruz

Jurado

___________________________________ Dr. Daniel Gonzﾃ｡lez Mendoza

Dios,

por

permitirme

culminar

este

logro

tan

importante en mi vida, pues él fue mi guía en este largo camino, y siempre ha estado ahí en los mejores momentos y en los momentos de dificultad… El señor es mi pastor nada me faltará… A mis Padres las personas que más amo, pues siempre me han apoyado, y me han brindado sus consejos, su amor y el mejor ejemplo, porque éste logro que hoy alcanzo es fruto del esfuerzo conjunto. A mi hermana y mi sobrina que siempre me han brindado palabras de aliento y los mejores consejos. A mis Docentes y compañeros, por compartir conmigo su conocimiento y experiencia. Andrés Ricardo

AGRADECIMIENTOS

A Dios y la Virgen porque siempre me han llevado por el buen camino y porque su compañía es el motivo por el cual hoy culmino este logro tan anhelado.

A mis padres Cristina y Luis Francisco, quienes me han dado los mejores consejos, el mejor ejemplo y porque sus esfuerzos hoy se ven reflejados.

A mi hermana Catalina y mi sobrina Alejandra, por brindarme el apoyo incondicional y la fortaleza en este largo camino.

Al Dr. Mauricio Boyacá Quintana MVZ UPTC. Especialista en laboratorio clínico. Por acogerme a su grupo de investigación. Por brindarme la mejor orientación como director del presente trabajo y por ofrecerme su amistad.

Al Dr. Giovanni Moreno Figueredo. MV UDCA. Por orientarme y por brindarme su ayuda incondicional en la elaboración de este trabajo.

A mi Amiga Cindy Nieves por ofrecerme su amistad y por prestarme su colaboración en este proceso.

A mis demás compañeros y amigos con los cuales compartí momentos únicos en el transcurso de mi carrera. Muchas Gracias, y que Dios los bendiga.

CONTENIDO

Pág. GLOSARIO

RESUMEN

ABSTRACT

INTRODUCCIÓN

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

2. JUSTIFICACIÓN

3. HIPÓTESIS

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

4.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5. MARCO DE REFERENCIA

5.1. ESTADO DEL ARTE

5.2. MARCO TEÓRICO

5.2.1. ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DEL TORO

5.2.1.1. Los testículos.

5.2.1.2. Esteroidogénesis.

5.2.1.3. Espermatogénesis.

5.2.1.4. Etapas de la espermatogénesis

5.2.1.5. Epidídimo

5.2.1.6. Conducto deferente

5.2.1.7. Cordón espermático

5.2.1.8. Glándulas seminales

5.2.1.9. Uretra

5.2.1.10. Glándulas Bulbo uretrales

5.2.1.11. Pene

5.2.2. EL SEMEN

5.2.2.1. El espermatozoide

5.2.2.2. Morfología del espermatozoide

5.2.3. EVALUACIÓN DEL REPRODUCTOR BOVINO

5.2.3.1. El examen andrológico

5.2.4. Obtención del semen bovino

5.2.4.1. Colecta del semen mediante electroeyaculador

5.2.5. ANÁLISIS DEL SEMEN BOVINO

5.2.5.1. Evaluación de la calidad del semen

5.2.5.2. Pruebas de rutina de valoración del semen

5.3. MARCO LEGAL

5.4. MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

6. METODOLOGÍA

6.1. TIPO DE ESTUDIO

6.2. MATERIALES

6.3. MÉTODOS

6.3.1. Fase 1. Examen clínico y andrológico de los toros

6.3.2. Fase 2. Colecta seminal mediante electroeyaculador

6.3.2. Fase 3. Procesamiento de las muestras en el laboratorio

6.3.2. Fase 4. Análisis Estadístico

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

9. CONCLUSIONES

10. IMPACTO

11. RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS

LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Nomenclatura para el análisis del semen.

Tabla 2. Parámetros de evaluación de la concentración espermática en toros Según el IRAC (Instituto de Reproducción Animal de CórdobaArgentina).

Tabla 3. Materiales utilizados.

Tabla 4. Promedio, deviación estándar, coeficiente de variación y

correlación de las mediciones de la concentración espermática por ambas técnicas para el Toro 1.

Tabla 5. Promedio, deviación estándar, coeficiente de variación y

correlación de las mediciones de la concentración espermática por ambas técnicas para el Toro 2.

LISTA DE GRÁFICOS

Pág. Gráfica 1. Comparación de los resultados de concentración espermática según la medición realizada con cámara de Neubauer para el Toro Nº1 y Toro Nº2

Gráfica 2. Comparación de los resultados de la medición realizada con espectrofotómetro en modo absorbancia para el Toro Nº1 y Toro Nº2

Gráfico 3. Comparación de los resultados obtenidos por los dos métodos de medición espermática en el toro 1 .

LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Secuencia celular de la Espermatogénesis.

Figura 2. Esquema de un espermatozoide con sus componentes estructurales

Figura 3. Cuadrícula, cámara de Neubauer o hemocitómetro

LISTA DE IMÁGENES Y ANEXOS

Pág. Imagen 1. Ubicación del municipio de Soracá en el territorio Nacional y departamental.

Imagen 2. Toro N°1.

Imagen 3. Toro N°2.

Imagen 4. Examen clínico y andrológico de los individuos.

Imagen 5. Corte del vello y lavado prepucial.

Imagen 6. Palpación de las glándulas accesorias y estímulo manual de las mismas.

Imagen 7. El proceso de Electroeyaculación.

Imagen 8. Materiales utilizados en el laboratorio.

Imagen 9. Procesamiento de las muestras en el laboratorio.

GLOSARIO

ABSORBANCIA: Este concepto es sinónimo de densidad óptica y de extinción, se define como la cantidad de energía radiante que una sustancia absorbe a determinada longitud de onda. ANDROLOGÍA: La andrología es la parte de la medicina veterinaria encargada del estudio, exploración, e investigación de cualquier aspecto relacionado con la función sexual y reproducción del macho. BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA:

Serie

biotécnicas

que

permiten

aumentar la productividad y la tasa de mejoramiento genético de los animales ampliando la eficiencia reproductiva y una calidad superior de sus productos. BUENAS PRÁCTICAS DE BIOSEGURIDAD (BPB): Son los principios básicos y prácticas generales preventivas de higiene y sanidad en la producción, almacenamiento, transporte y comercialización de material genético, con el objeto de garantizar su condición sanitaria y disminuir cualquier riesgo inherente a su producción. CAMARA DE NEUBAUER (HEMOCITÓMETRO): Es un aparato de vidrio óptico especial de precisión. Se utiliza para contar células u otras partículas en suspensiones bajo el microscopio. CASA (Computer Assisted Semen Analyser): Es un equipo automatizado, objetivo

estandarizado

que

permite

evaluar

concentración

espermatozoides, la motilidad, la morfología y vitalidad en una muestra de semen. CITOMETRÍA DE FLUJO: La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz.

COLECTA SEMINAL: Método por el cual se obtiene un eyaculado de un reproductor utilizando técnicas como: vagina artificial, electroeyaculación o masaje de las ampollas deferentes. CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA: Es el número de espermatozoides por mililitro o microlitro de semen. CONTROL DE CALIDAD DEL MATERIAL SEMINAL: Pruebas que garanticen la calidad del producto y que incluyen: cuadro espermático (movilidad, morfología y vitalidad) y análisis microbiológico. ELECTROEYACULADOR: La electroeyaculación es un procedimiento, usado para obtener muestras de semen de machos mamíferos sexualmente maduros. Esta técnica se aplica en programas de mejoramiento y de investigación en varias especies. ESPECTROFOTÓMETRO: Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. ESPERMATOZOIDE: Célula sexual masculina de los animales, destinada a la fecundación del óvulo y a la constitución, junto con este, de un nuevo ser; está formado por una cabeza, cuello y una cola móvil que le permite desplazarse hasta el óvulo. ESPERMIOGRAMA: Examen por el cual se evalúa fertilidad del macho. En el se evalúan los aspectos físicos del semen como el volumen, pH, mucólisis, viscosidad, color, olor, y los aspectos celulares que estudia el espermatozoide en relación con el número, movilidad, morfología y vitalidad.

ESTÍMULO: Es un factor externo o interno capaz de provocar una reacción positiva o negativa en una célula u organismo. EYACULADO: Es el producto de la mezcla de secreciones procedentes del testículo, donde se producen los espermatozoides, con las secreciones de la próstata, vesículas seminales y glándulas bulbouretrales. FECUNDACIÓN IN VITRO: Técnica por la cual la fecundación de los ovocitos por los espermatozoides se realiza fuera del cuerpo de la madre. El proceso implica el control hormonal del proceso ovulatorio, extrayendo uno o varios ovocitos de los ovarios maternos, para permitir que sean fecundados por espermatozoides en un medio líquido. FERTILIDAD: Es la capacidad de producir una progenie numerosa. En los animales, es el resultado de la interacción de numerosos factores biológicos, la edad, el estado de salud, el funcionamiento del sistema endocrino entre otros. GLÁNDULAS ACCESORIAS: En el toro las glándulas sexuales accesorias contribuyen a la formación del semen. Incluyen: vesículas seminales, próstata y glándulas bulbouretrales (Cowper). INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: Es todo aquel método de reproducción asistida que consiste en el depósito de espermatozoides de manera no natural en la mujer o hembra mediante instrumental especializado y utilizando técnicas que remplazan a la copulación, en el útero, en el cérvix o en las trompas de Falopio, con el fin de conseguir una preñez. IN VITRO: Se refiere a una técnica para realizar un determinado experimento en un tubo de ensayo, o generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo. La fecundación in vitro es un ejemplo ampliamente conocido .

IN VIVO: Se refiere a experimentación hecha dentro o en el tejido vivo de un organismo vivo, por oposición a uno parcial o muerto. Pruebas con animales y los ensayos clínicos son formas de investigación in vivo. MATERIAL GENÉTICO: Se designa a las muestras colectadas de gametos (semen y ovocitos) y embriones, así como los producidos por fertilización in vitro. MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA: La morfología espermática es una de las pruebas que se realiza en el seminograma, se valora el porcentaje de espermatozoides

con

morfología

normal.

Para

valorar

forma

espermatozoide, se observan básicamente sus tres partes: cabeza, cuello y cola. MOTILIDAD ESPERMÁTICA: Es la habilidad con que el espermatozoide se mueve espontánea e independientemente para llegar al óvulo y producirse la fecundación. SEMEN: El semen es un líquido blanquecino que se expulsa desde la uretra en la eyaculación. El objetivo del semen es meramente la reproducción, pues actúa como un "vehículo" que transporta los espermatozoides al tracto reproductor femenino. TESTÍCULOS:

Son

las

gónadas

masculinas,

coproductoras

los

espermatozoides y de las hormonas sexuales (testosterona). Son los órganos glandulares que forman la parte más importante del aparato reproductor masculino. TRANSMITANCIA: Es la cantidad de energía radiante que transmite o deja pasar una sustancia a una determinada longitud de onda. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES: Es una técnica mediante la cual los embriones son recolectados de una hembra donante y transferidos a una hembra receptora, que sirve como madre sustituta durante la gestación. Este proceso usualmente requiere el uso de gonadotropinas para inducir superovulación en la

donante y por otro lado, sincronizar a las receptoras para que est茅n en celo y ovulen al mismo tiempo que las donantes. VAGINA ARTIFICIAL: Dispositivo dise帽ado para imitar el 贸rgano sexual femenino. Para lograr esto, se hace de un material suave y lubricado. Las vaginas artificiales son ampliamente utilizadas en las explotaciones de ganado vacuno, en centros de inseminaci贸n artificial y en programas de recogida de esperma.

RESUMEN

ELABORACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA EN BOVINOS MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA EN MODO ABSORBANCIA El objetivo de este trabajo, fue determinar el promedio de las mediciones repetitivas

concentración

espermática,

realizadas

por

medio

del

hemocitómetro, y correlacionarlo con el promedio de las lecturas realizadas con el espectrofotómetro, para hallar una constante. Se evaluaron los eyaculados de dos toros de 2 y 3 años de edad, reproductivamente sanos; para cada muestra de semen se realizaron 30 mediciones por medio del hemocitómetro y 30 por medio de espectrofotómetro en modo absorbancia. En la medición por hemocitómetro se utilizó una dilución de semen 1:20 en agua destilada para el toro N°1, y 1:200 para el toro N° 2. En la medición espectrofotométrica se utilizó una dilución de semen 1:100 en Citrato de Sodio al 2.9%. Se encontró un alto coeficiente de correlación entre los dos métodos (r=0,96), posteriormente se realizó un paralelo entre el promedio de los resultados obtenidos en las mediciones por medio del hemocitómetro y el promedio de las lecturas del espectrofotómetro hallándose una constante matemática que los correlaciona: Nº espermatozoides / mililitro = Absorbancia * 4519099591, dicha formula remplaza el uso de tablas de estandarización. La ejecución de este protocolo será de gran utilidad para el profesional dedicado al área de andrología, como herramienta rápida y sencilla, que facilita el trabajo en el análisis seminal; además ofrece una valoración más precisa del líquido seminal de los reproductores que presentan alto valor genético, permitiendo el mejoramiento de los programas de repoblamiento bovino. Palabras Claves: Absorbancia, Biotecnología, Calidad seminal, Concentración Espermática, Espermatozoide, Semen.

ABSTRACT:

DEVELOPMENT OF A PROTOCOL FOR THE MEASUREMENT OF SPERM CONCENTRATION IN CATTLE BY SPECTOPHOTOMETRY IN ABSORBANCE MODE The objective of this study was determined the average of the repetitive measurements of sperm concentration, it was made using the hemocytometer, and correlate with the average of the readings taken with the spectrophotometer, to find a constant. Were evaluated ejaculates of two bulls, that were 2 and 3 years old, reproductively

healthy,

for

each

semen

sample

were

performed

hemocytometer and 30 measurements by spectrophotometer using absorbance mode. When measured by hemocytometer was used at a dilution of 1:20 in distilled water sperm for bull No. 1 and 1:200 for the bull No.2. In the spectrophotometric measurement used a dilution semen of 1:100 in sodium Citrate 2.9%. Found a high correlation coefficient between the two methods (r = 0.96), subsequently performed a comparison between the average of the results obtained in measurements using the hemocytometer and the average spectrophotometer readings was found a mathematical constant correlates: Nยบ spermatozoa / milliliter = Absorbance * 4519099591, this

formula

replaces

the use of standardized tables. The

implementation of this protocol will be useful for professionals dedicated to the area of andrology, as quick and easy tool that facilitates seminal work in the analysis, and offers a more accurate assessment of the seminal fluid of the players that have high genetic value, allowing the improvement of cattle restocking programs. Keywords: Absorbance, Biotechnology, Seminal Quality, Semen Concentration, Sperm, Semen.

INTRODUCCIÓN

Durante las últimas décadas, la IA (inseminación artificial), ha demostrado ser la tecnología reproductiva que más ha contribuido a acelerar el progreso genético de las diferentes especies ganaderas, sin embargo, el éxito de esta tecnología depende de que el semen utilizado mantenga su poder fecundante tras ser diluido y congelado (Muiño et al., 2005).

La evaluación de la calidad seminal de cada reproductor, es de gran importancia en dichos programas de inseminación artificial y otras biotecnologías como transferencia de embriones y fecundación in-vitro. El examen andrológico cumple un papel muy importante al determinar la potencia coeundi y generandi del reproductor bovino, no obstante, estos resultados son parciales al no determinar totalmente el potencial de fertilidad del toro. Para determinar la calidad seminal se han utilizado varias pruebas de laboratorio (espermograma). El examen general de la calidad del semen como volumen, motilidad, concentración y porcentaje de espermatozoides anormales, han sido seriamente cuestionados como predictores de la fertilidad del macho (Palmieri et al., 2004).

La eficiencia de la IA (índice de fertilidad y prolificidad) depende directamente de la calidad de la dosis de semen y la cantidad de espermatozoides para la inseminación (Zrimšek, 2011).

Una de las medidas más importantes tomadas en un eyaculado es la concentración

espermática.

Una

estimación

exacta

concentración

espermática es fundamental en la determinación y en el éxito reproductivo del programa de IA y la eficiencia de producción del semental (Singleton, 2000).

En el presente trabajo, se elaboró un protocolo simplificado, para la medición de la concentración espermática en bovinos, mediante el espectrofotómetro en modo

absorbancia, estableciendo unos parámetros de ejecución como lo son: volumen de líquido seminal, utilización de diluyentes y cantidad a utilizar,

calibración y

medición espectrofotométrica, y finalmente manejo de los resultados mediante una fórmula matemática, la cual se estableció, realizando un paralelo entre el resultado de la medición con cámara de Neubauer y el resultado obtenido con la medición en el espectrofotómetro.

Este protocolo será de gran utilidad para el profesional dedicado al área de andrología, como herramienta que facilita el trabajo en el análisis seminal; además ofrece una valoración más precisa de los reproductores que presentan alto valor genético, permitiendo el mejoramiento de los programas de repoblamiento bovino.

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Uno de los principales problemas en la producción del semen bovino radica en el conocimiento de la fertilidad o capacidad fecundante de cada toro. De una cuidadosa valoración de la fertilidad, dependerá la utilización futura del material seminal y el grado de aprovechamiento de los eyaculados obtenidos durante su vida reproductiva, es decir, las dosis producidas por eyaculado en función del número de espermatozoides viables (Madrid, 2005).

La producción de semen Bovino de alta calidad implica no solamente una buena colecta y conservación; también debe desarrollarse un protocolo donde se estima la calidad, teniendo en cuenta parámetros físicos y químicos. Un tema que siempre ha preocupado a los investigadores ha sido el desarrollo de pruebas de laboratorio que permitan predecir de forma precisa la capacidad fecundante del semen que posteriormente se va a emplear en la inseminación artificial. No hay muchas dudas de que el análisis objetivo, riguroso y simultáneo, de varios parámetros relativos a las características funcionales y morfológicas de los espermatozoides, permite estimar razonablemente el potencial fecundante de una muestra de semen (Muiño, 2008).

El análisis físico del líquido seminal en los toros incluye parámetros

como la

morfología, la motilidad individual y masal, la concentración espermática entre otras. La concentración de espermatozoides es un parámetro importante que afecta la fertilidad pues varias especies animales de interés agrícola son producidas principalmente por inseminación artificial (Zrimšek, 2011).

Cuando de medir la concentración espermática se trata, surgen varios problemas, y generalmente son generados por la técnica utilizada. Los tres métodos más utilizados en la actualidad de forma rutinaria son los siguientes: la cámara de

Neubauer, espectrofotometría y espermiodensímetro, que difieren ampliamente en cuanto a la agilidad, la velocidad de aplicación, y el costo de adquisición (Barbosa et al., 2011). Tradicionalmente, el recuento de espermatozoides se realiza utilizando la cámara de Neubauer que se ha convertido en el patrón de oro y el método recomendado por la Organización Mundial de la Salud (Cardona et al., 2008). El proceso de cuantificación de las células espermáticas en el eyaculado con el hemocitómetro (cámara de Neubauer), es tardío y laborioso, por lo que es deseable una alternativa

rápida, barata

y confiable

para

estimar la

concentración de

espermatozoides en el eyaculado (López & Mellado, 2001); además de esto, Paulenz et al. (1995), demostró que el hemocitómetro presentaba mayor variabilidad (12%), comparado con el espectrofotómetro (2.9%).

Los sistemas CASA (Computer assisted semen analyzer), también permiten la valoración de parámetros

como la concentración y motilidad espermática, sin

embargo, Verstegen et al., (2002) comprobaron, que los CASA tienden a sobre estimar la concentración de espermatozoides de la muestra. Dichos autores atribuyen el error a que, debido a las colisiones espermáticas, el mismo espermatozoide puede ser contabilizado varias veces. 1.1.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cómo elaborar un protocolo para la medición de la concentración espermática en bovinos por medio del espectrofotómetro en modo absorbancia que presente precisión, simplicidad, practicidad y rapidez?

2. JUSTIFICACIÓN

En la actualidad la investigación se encarga de crear herramientas para reducir factores como lo son el tiempo, el dinero y la necesidad de mano de obra, todo ello en cuanto a lo productivo; pero si hablamos de lo científico, los adelantos y hallazgos se encargan de acortar caminos para futuras investigaciones, y así seguir avanzando en pro del desarrollo. Los procedimientos que se realizan en reproducción animal se relacionan muy estrechamente con el ámbito productivo y científico a la vez, por ello crear técnicas de trabajo simplificadas y además efectivas resulta conveniente para quienes están involucrados con esta área Recientemente varios autores han puesto de relieve la necesidad de riguroso control de calidad, como base para alto estándar de calidad y seguridad en el laboratorio

andrología. La determinación precisa de la concentración

espermática es crucial para el diagnóstico correcto del macho y la prestación efectiva de un plan de tratamiento efectivo (Björndahl y Barratt, 2005). La esencia de este trabajo, es simplificar parte del procedimiento de evaluaci ón seminal

bovinos,

relacionado

más

específicamente

con la

medición

espectrofotométrica de la concentración espermática, planteando un nuevo protocolo en modo absorbancia. Las ventajas

que se obtienen con la técnica realizada son: simplicidad,

practicidad de la técnica como tal, rapidez en el procedimiento y precisión en el resultado, de ahí que este procedimiento puede convertirse en una herramienta clave para el trabajo con semen bovino en las distintas áreas. La forma directa, utilizando una cámara de Neubauer es la técnica con mayor fiabilidad, sin embargo, no se utiliza rutinariamente en centros de IA, ya que tarda

mucho tiempo y requiere múltiples mediciones de cada muestra para obtener una buena exactitud (Björndahl & Barratt, 2005). La determinación de la concentración espermática mediante un espectrofotómetro es un método rápido y facilita resultados con un margen de error asumible. El uso del hemocitómetro ha quedado relegado a un segundo plano

empleándose

fundamentalmente para obtener la curva de calibración del espectrofotómetro o en laboratorios en los que se evalúa un reducido número de muestras de semen, o bien cuando este proceso se realiza de forma ocasional (Muiño et al., 2005).

3. HIPÓTESIS

Ho. La medición de la concentración espermática en bovinos, por medio de espectrofotometría en modo absorbancia, no presenta precisión, simplicidad, practicidad y rapidez. H1. La medición de la concentración espermática en bovinos, por medio de espectrofotometría

modo

absorbancia, presenta

practicidad y rapidez.

precisión, simplicidad,

4. OBJETIVOS

4.1.

OBJETIVO GENERAL

Elaborar un protocolo para la medición de la concentración espermática en Bovinos mediante espectrofotometría en modo absorbancia. 4.2.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar el grado de variabilidad que presenta la técnica de medición de la concentración espermática por hemocitómetro comparada con el espectrofotómetro.

Hallar una constante matemática para el cálculo de la concentración espermática

semen

toros,

partir

medición con

espectrofotómetro en modo absorbancia. Demostrar la eficiencia de la técnica realizada, comparada con la medición mediante hemocitómetro.

5. MARCO DE REFERENCIA

5.1. ESTADO DEL ARTE

López y Mellado (2001), desarrollan un estudio que tenía como objetivo evaluar si el uso de un patrón de fotografías de eyaculados y las pruebas de nado ascendente de los espermatozoides podían ser utilizadas para estimar la concentración y motilidad del semen de toro y macho cabrío como una metodología simple y rápida, finalmente concluyeron que la comparación de eyaculados de toros y machos cabríos con patrones de fotografías de eyaculados de diferentes concentraciones de estas especies, permite estimar en forma rápida, y con relativa confiabilidad, la concentración de células espermáticas; y que con la medición del desplazamiento ascendente de los espermatozoides, existe mediana precisión en la valoración de la motilidad espermática. Knox et al. (2002), determinó el uso y precisión de los instrumentos para estimar la concentración de espermatozoides; pros, contras y economía. Resaltando el uso del

hemocitómetro y el espectrofotómetro. Concluye que el hemocitómetro

presenta un margen de error del 5 al 10%. Por otro lado en el fotómetro obtuvo un margen de error del 16.2%. En el estudio realizado por Páulenz et al. (1995) se obtuvieron resultados de error de 12% con el hemocitómetro, de 2.9% con el espectrofotómetro y 2.3% con el contador Coulter, sin embargo los resultados de las concentraciones para cada prueba fueron muy parejos. Knox (2004), habla de los aspectos prácticos y las desventajas del análisis seminal. La medición de la concentración espermática se realiza principalmente por medio del hemocitómetro y el espectrofotómetro; también han surgido otros métodos para dicho fin aunque más costosos y menos precisos. El método estándar para conteo espermático (hemocitómetro) se considera un poco difícil y tardío pero con bajo costo, sin embargo se utilizan en mayor número los espectrofotómetros y fotómetros para este fin. Cuando se utiliza este método

existen varias fuentes de error. Estos errores pueden provenir de: muestreo inadecuado, error en el pipeteo, un soporte de la muestra inadecuado (desalineado o material dañado), diluyente incorrecto, entre otros. Un estudio desarrollado en Brasil por Vianna et al. (2004), comparó los métodos de medición de la concentración espermática en cerdos, en los que se incluía: cámara de Neubauer, espermiodensímetro y espectrofotómetro; se concluyó que el espectrofotómetro tiende a subestimar al Espermiodensímetro, y a sobrestimar la concentración de espermatozoides en comparación con la cámara de Neubauer. Así mismo al utilizar un espectrofotómetro, el potencial de los reproductores de un sistema de producción sería subutilizado, y con un espermiodensímetro serían producidas dosis menores que el patrón, y que puede originar problemas de fertilización. Cuanto mayor sea el volumen de la eyaculación, mayor será la precisión de ambos espectro y espermio, en comparación con una cámara de Neubauer. Christensen et al. (2004), plantean la utilización de la citometría de flujo para la determinación de la concentración espermática en mamíferos y aves, resalta que la determinación de este parámetro por medio de la espectrofotometría en especies como los conejos, caballos y cerdos presenta margen de error constante dado que en las muestras se encuentra cierta cantidad de partículas de gel que alteran el resultado, y que por otro lado en la medición con hemocitómetro, algunos escombros del tamaño del esperma pueden incluirse en el conteo. Basándose en la descripción de la citometría de flujo realizada por Freud & Carol (1964),

con

microesferas

fluorescentes

determinando

concentración

espermática en semen de toro, Christensen et al. (2004), concluyen, que con la citometría de flujo y el hemocitómetro se obtuvieron resultados muy parejos por tanto esta técnica es óptima para el cálculo de este parámetro en especies como, el bovino el conejo, la rata el humano y las aves, además de esto supera 2 y 4 veces la precisión del espectrofotómetro y el contador electrónico de células respectivamente.

Björndahl & Barratt (2005), hablaban de los estándares de medición de la concentración espermática en laboratorios de andrología humana, y afirmaron que varios autores han puesto de relieve la necesidad de riguroso control de calidad, como base para altos estándares de calidad y seguridad en el laboratorio de andrología, pues uno de los aspectos de garantía de calidad es la selección y validación de técnicas y equipos adecuados. La determinación precisa de la concentración espermática es crucial para el diagnóstico correcto del macho y la prestación efectiva de un plan de tratamiento sensible. También, afirmaron que a mediados de los noventas surgieron varias formas para la medición de este parámetro, al parecer se trataba de una serie de cámaras utilizadas a 20mm de profundidad, pero según la OMS no presentaron la misma fiabilidad, que la medición por medio de la cámara de Neubauer.

Prathalingam et al. (2006), compararon el grado de precisión de seis técnicas para el

cálculo

concentración

espermática

utilizando

semen

toro,

principalmente para medir el grado de precisión de tres novedosas técnicas (Nuevo enfoque de la citometría de flujo, el análisis de imágenes, y un lector de placa fluorescente) frente a la hemocitometría, espectrofotometría y análisis “Microcell”. Concluyeron que el hemocitómetro en esta oportunidad tuvo un 7.8% de variabilidad,

el espectrofotómetro fue el segundo método más preciso con

4.1% de variación y es fácil de usar para el toro, la citometría de flujo es el método con menor porcentaje de variación (2.3%), por tanto es el método con mayor reproducibilidad de resultados; sin embargo, el método empleado por cada laboratorio debe ser determinado en base a una serie de factores, incluyendo el costo, conveniencia, tamaño de la muestra, y el número de eyaculados para ser evaluado.

En 2007 en la ciudad de Nanjing- China se llevó a cabo un estudio en humanos que tenía como objetivo comparar tres métodos de medición de la concentración

espermática dentro de los cuales estaban: el hemocitómetro, el Cell-VU y la cámara

Makler.

Las

muestras

semen

obtuvieron

por

masturbación de 60 pacientes voluntarios, y se realizó una selección de 38 muestras de semen con altas concentraciones, para su posterior medición mediante las tres técnicas a comparar. Se concluyó finalmente que el método CellVU presenta mayor precisión que los otros dos métodos, y por ello mismo debería plantearse como la técnica de oro en todo el mundo para el conteo de espermatozoides en semen de Humanos (Lu et al., 2007).

Castellini et al. (2007), validaron el método espectrofotométrico para la medición de la concentración espermática en conejos; para este estudio se utilizaron 360 eyaculados de 36 conejos machos. Estos eyaculados se dividieron en 3 grupos de acuerdo a la proporción partícula / espermatozoide subjetivamente determinada por visualización microscópica, la concentración de espermatozoides de cada muestra de semen se evaluó por espectrofotometría y los resultados se compararon

con

los

obtenidos

mediante

el uso

un hemocitómetro.

Posteriormente se concluyó que la simplicidad, rapidez y bajo costo de este método lo hace adecuado para la medición rutinaria de la concentración de espermatozoides en centros de inseminación artificial de conejos.

Cardona et al. (2008), junto con el Grupo de Reproducción Humana de la Universidad de Antioquia (Colombia), compararon la concentración espermática usando la cámara de Makler® y la cámara de Neubauer y determinaron que no existe acuerdo sobre el protocolo a utilizar en la prueba recomendada para este procedimiento por la OMS como el patrón de oro. Cada laboratorio deberá experimentar con su propia población para decidir que cámara es la mas adecuada. Sin embargo, hay que resaltar que el uso de la cámara de Makler® es rápido y sencillo. En resumen, los resultados muestran que ambas cámaras son precisas, incluso cuando se utiliza con muestras cuyo recuento es bajo.

Rodríguez et al. (2008), en la Universidad Nacional de Colombia, realizaron un trabajo que tenía como objetivo, comparar dos métodos para la medición de concentración espermática, espectrofotometría y cámara de Neubauer, para las especies bovina, equina, porcina, ovina y canina, verificando el porcentaje de correlación existente entre las pruebas y generando así un índice que permitiera la lectura equivalente en ambos métodos. Realizaron una estandarización para cada una de estas especies y concluyeron que la medición de la concentración por medio de espectrofotometría es un método rápido y preciso, que permite procesar un mayor número de muestras en menor tiempo.

Un estudio desarrollado en Pakistán por Atiq et al. (2011),

se basó en una

comparación entre el fotómetro (Lp 300 SDM Minitüb GmHb), el hemocitómetro Neubauer y la cámara de Makler® en la medición de la concentración de espermatozoides en los toros el análisis de la varianza reveló que no había diferencias significativas entre las tres técnicas y concluyeron que el uso de fotómetro en la evaluación de la concentración de espermatozoides reduce las posibilidades de error humano.

Se realizó un estudio en la Universidad Nacional de La Plata (Argentina) elaborado

por

Díaz

al.

(2011),

llamado:

“Estandarización

espectrofotometría para la medición de la concentración seminal en el perro doméstico”, donde se determinó la repetitividad de las lecturas seminales realizadas con el espectrofotómetro y se comparó con las del hemocitómetro, se elaboró una curva de estandarización de los datos obtenidos y se correlacionaron los valores. Finalmente concluyeron que no se encuentra diferencias significativas entre los conteos espermáticos obtenidos por ambos equipos.

Barbosa et al. (2011) realizaron un estudio llamado “Comparación de las principales técnicas para el análisis de la concentración de espermatozoides en

los exámenes andrológicos de toros en campo” en el cual realizaron una comparación entre las tres técnicas más comunes: el espermiodensímetro cámara de Neubauer y espectrofotometría. Concluyeron que el espermiodensímetro bien estandarizado, se puede utilizar en la evaluación de la concentración de espermatozoides en los exámenes andrológicos de toros pues es más rápido que la medición con cámara de Neubauer y menos costoso que el espectrofotómetro, con la misma seguridad de resultados.

Cisneros (2011), elaboró un método para la determinación rápida de la concentración espermática en eyaculados de bovino, porcino y ovino; por medio de un manual donde se ilustran las diversas concentraciones espermáticas según la dilución del semen, partiendo de un máximo total de mil millones por especie; para así facilitar al alumno y a todo aquel dedicado a la Reproducción, la determinación rápida, sencilla y sobre todo económica, de las concentraciones espermáticas de los eyaculados;

dicho manual cuenta con 79 fotografías de

extendidos de muestras seminales con concentraciones conocidas especies mencionadas anteriormente.

para las

5.2. MARCO TEÓRICO

5.2.1. ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DEL TORO 5.2.1.1. Los testículos. Son los órganos sexuales primarios que tienen como funciones principales la producción de espermatozoides (función exocrina) y como función endocrina, la producción de hormonas esteroides (Galina & Valencia, 2006). Los espermatozoides se producen en el interior de los tubos seminíferos microscópicos, y las células intersticiales entre los túbulos producen la hormona (Shively, 1993). Los testículos están contenidos en una bolsa de piel especializada denominada escroto (Sisson, 1982), que protege y soporta a los testículos. La función principal del escroto es regular la temperatura interna de las gónadas mediante la contracción involuntaria del músculo Dartos que recubre el escroto interna y basalmente (Barrios, 2002). Los testículos están rodeados por una firme cápsula de tejido conectivo, la túnica albugínea, por fuera se encuentra la hoja visceral del proceso vaginal del peritoneo como una cubierta serosa de una sola capa. Desde la cápsula irradian hacia el interior del testículo pequeños tabiques de tejido conectivo, los septos, testiculares que dividen al parénquima testicular en lobulillos, estos tabiques de tejido conectivo se unen entre sí en el eje testicular para formar el mediastino del testículo. El parénquima testicular incluye túbulos seminíferos contorneados, túbulos seminíferos rectos y red del testículo con conductillos eferentes (konig & Liebich, 2005). Cada lobulillo testicular contiene entre dos y cinco canalículos testiculares contiene células de sostén (Células de Sertoli), y células del epitelio germinativo, estas últimas durante la espermatogénesis se diferencian desde espermátides de la fase acrosómica, de la fase de Golgi y de la fase de maduración hasta convertirse en espermatozoides (konig & Liebich, 2005). 34

El testículo

tiene dos funciones principales que son: a) la esteroidogénesis o

secreción de hormonas masculinas, como la testosterona y androstenediona a través del proceso de esteroidogénesis en las células de Leydig y b) la gametogénesis o producción de espermatozoides a través del proceso de espermatogénesis, en los túbulos seminíferos (Barrios, 2002). 5.2.1.2. Esteroidogénesis. Las células de Leydig producen hormonas masculinas como respuesta a su estimulación por parte de su hormona luteinizante (LH), liberada por la hipófisis, a su vez estimulada por la GNRH secretada por el hipotálamo. La testosterona producida por las células de Leydig es necesaria, entre otras cosas para la función de las células de Sertoli y la producción de espermatozoides. Las células de Leydig se localizan en el tejido intersticial en estrecha

aposición con los

vasos sanguíneos y linfáticos

(Chenoweth, 1997). Los productos de secreción de estas células son los andrógenos, mas la inhibina, la activina y el “factor de crecimiento similar a la insulina” o IGF-I (Maddocks et al., 1995). 5.2.1.3. Espermatogénesis. La espermatogénesis es un proceso complejo mediante el cual las células madres germinales se dividen para renovarse y para generar células hijas que se convertirán en espermatozoides. Este proceso que convierte una célula esférica diploide (46 cromosomas, XY) en cuanto a células haploides (23 cromosomas X o Y) flageladas, ocurre dentro de los túbulos seminíferos en los testículos y dura aproximadamente 2 meses en los mamíferos. Los túbulos seminíferos están recubiertos por las células de Sertoli (Griswold, 1998), de sostén, las cuales están unidas fuertemente para dividir el espacio de los túbulos seminíferos en dos compartimentos: el basal y el luminal, formando la base de la barrera hemato-testicular con el fin de que la espermatogénesis ocurra en un sitio

privilegiado

inmunológicamente, ya que los espermatozoides

comienzan a ser producidos en la pubertad y son considerados “extraños” para el sistema inmune que desarrolla el reconocimiento de lo propio durante el primer

año de vida. Dentro de los túbulos, las células germinales van formando capas dependiendo de su grado de diferenciación; es decir, junto a la membrana basal yacen

las

espermatogonias,

seguidas

por

los

espermatocitos

primarios,

espermatocitos secundarios y las espermátides cerca a la luz del túbulo (De Kretser et al., 1998). 5.2.1.4. Etapas de la espermatogénesis. La espermatogénesis es un proceso continuo que comienza en la pubertad y perdura toda la vida. La espermatogénesis comienza con la división mitótica de la espermatogonia (2n), que da origen a los espermatocitos primarios (2n). Posteriormente se da una división meiótica que da origen a los espermatocitos secundarios (1n) y esos a su vez por otro ciclo de meiosis dan origen a las espermátides (1n), las cuales tendrán la mitad del material genético original (23 cromosomas) como se observa en la figura 1. Figura 1. Secuencia celular de la Espermatogénesis.

Fuente: Toro, 2009.

Luego comienza un ciclo de maduración mediante el cual las espermátides maduran a espermatozoides funcionales en las células de Sertoli (Griswold, 1998). Este proceso de maduración se conoce con el nombre de espermiogénesis, el cual

puede

durar

varias

semanas.

completarse

maduración

del

espermatozoide, el citoplasma de las células de Sertoli se retracta alrededor del espermatozoide, liberándolo a la luz de los túbulos (Toro, 2009). Los espermatozoides dentro de los testículos tienen poca o ninguna movilidad y son incapaces de fertilizar el ovocito, adquieren su funcionalidad solo después de atravesar el epidídimo, donde finalizan su proceso de maduración (De Kretser et al., 1998). 5.2.1.5. Epidídimo. El epidídimo es un órgano alargado que se encuentra adyacente a los testículos y recibe continuamente esperma inmaduro que entra a través de los conductos eferentes. Estos se unen al conducto del epidídimo que es único y flexuroso, donde el esperma alcanza su maduración. En la eyaculación contracciones peristálticas forzan al esperma hacia el conducto deferente, que se continúa con la cola del epidídimo (Shively, 1993). Las funciones del epidídimo son el transporte y la maduración de los espermatozoides, los cuales a través del pasaje por los conductos deferentes y el epidídimo, adquieren la habilidad de tener movimiento progresivo lineal y la capacidad de fertilizar. Durante este proceso, en la célula espermática ocurren cambios funcionales, bioquímicos y morfológicos. También ocurre la reabsorción e intercambio de fluidos. Específicamente en la cabeza ocurre la reabsorción de solutos y fluidos, en el cuerpo del epidídimo la maduración espermática y en la cola del epidídimo, el almacenamiento de espermatozoides fértiles (Barrios, 2002). 5.2.1.6. Conducto deferente. Los conductos deferentes transportan a los espermatozoides de la cola del epidídimo a la uretra. Su parte inicial es tortuosa y muy relacionada con el epidídimo. Cursa proximalmente junto con los vasos y nervios testiculares para formar parte del cordón espermático, el cual pasa a

través del conducto inguinal. Dentro de la cavidad abdominal los vasos y nervios corren hacia los riñones (donde se desarrollan originalmente los testículos) y cada conducto deferente da vuelta hacia la entrada pélvica y se dirigen hacia el cuello de la vejiga (Shively, 1993). 5.2.1.7. Cordón espermático. El cordón espermático es el conjunto de estructuras que se extiende desde la extremidad caudal del testículo a través del conducto inguinal. Se incluyen: Conducto deferente y sus delgados vasos así como la arteria, vena, linfáticos y nervios testiculares (Shively, 1993). 5.2.1.8. Glándulas seminales. Las vesículas seminales, encuentran en posición lateral respecto a las porciones terminales de cada conducto deferente, son compactas y lobuladas. El conducto de las vesículas seminales y el conducto deferente suelen compartir un conducto eyaculatorio común que se abre en la uretra (Hafez, 2000). La próstata, se encuentra en posición caudal respecto a las glándulas vesiculares y dorsal a la uretra, en el cuello de la vejiga. La función de estas dos glándulas es la de producir compuestos orgánicos que sirven de fuente de energía para los espermatozoides y evitan el cambio de acidez del semen, Estas glándulas producen las secreciones que componen la mayor parte de la porción líquida del semen. Además estas secreciones activan la motilidad de los espermatozoides (Dyce et al., 1999). 5.2.1.9. Uretra. Comienza en el orificio uretral interno en el extremo caudal del cuello de la vejiga y llega hasta el orificio uretral externo de la punta del pene (Olivera, 2009). Revestida por un músculo esquelético capaz de continuar la ola de contracción eyaculativa. Alberga al colículo seminal de la uretra cráneo dorsal y recibe las secreciones de las glándulas vesiculares y el esperma proveniente de las ámpulas. Además las aberturas de los conductos prostáticos vacían su contenido

en esta sección de la uretra antes y durante la eyaculación (konig & Liebich, 2005). 5.2.1.10. Glándulas Bulbouretrales. Se encuentra en posición dorsal a la uretra. Cerca de su terminación de su parte pélvica. En el toro están casi ocultas por el músculo bulboesponjoso (Olivera, 2009). La secreción de estas glándulas no forman parte del eyaculado, ya que sus funciones son básicamente limpiar y lubricar la uretra para el paso del eyaculado (Galina y Valencia, 2006). 5.2.1.11. Pene. El pene es un órgano complejo y altamente especializado, se origina en el isquion y se extiende hasta el glande en su extremo libre y distal. Rodea la parte terminal de la uretra y funciona tanto para el aparato reproductor como para el urinario (Shively, 1993). El pene es el órgano copulador delos machos; presenta una flexura sigmoidea, que le permite que se retraiga dentro del cuerpo y no se observe por fuera el pene de un macho durante el descanso. El pene está formado por : Cuerpo del pene el glande y el proceso uretral. El glande es el extremo del pene, está formado por tejido fibroelástico, una pequeña cantidad de tejido eréctil y un gran número de terminaciones nerviosas. El proceso uretral es una extensión de la uretra, en forma de una pequeña manguera, que permite que el eyaculado del macho llegue al fondo de la vagina a modo de aspersión (Dyce et al., 1999). 5.2.2. EL SEMEN

Es una suspensión celular líquida que contiene los gametos masculinos (Espermatozoides), y las secreciones de los óranos accesorios sexuales del aparato reproductor masculino, y se mezclan en el momento de la eyaculación (Knobil et al., 1998).

5.2.2.1. Espermatozoide. Gametos masculinos que se forman en los túbulos seminíferos

de los testículos. Las células alargadas consistentes con cabeza

aplanada portadora de núcleo y una cola que es el aparato necesario para la motilidad celular (Knobil et al., 1998). 5.2.2.2. Morfología del espermatozoide.

a) Cabeza. La característica principal de la cabeza del espermatozoide es el núcleo aplanado oval que contiene cromatina muy compacta. La cromatina consiste en un complejo formado por ácido desoxirribonucleico (DNA) y proteína especiales llamadas protaminas espermáticas. Su número cromosómico y el contenido de DNA nuclear es haploide (Hafez, 2000). b) Acrosoma. Delgado saco membranoso de doble capa ubicado sobre el núcleo y que se establece en las últimas etapas de la formación del espermatozoide. Esta estructura en forma de casquete, que contiene acrosina, hialuronidasa, y otras enzimas hidrolíticas participan en el proceso de la fecundación (Hafez, 2000). c) Cola. Formada por el cuello y los segmentos medio, principal y caudal. El cuello o segmento conector, forma una placa basal que embona en una depresión en el extremo posterior del núcleo (Hafez, 2000).

La región de la cola comprendida entre el cuello y el anillo citoplasmático es el segmento medio, el centro de este segmento medio, junto con la longitud de la cola comprende el axonema. El axonema se compone de nueve pares de micro túbulos dispuestos radialmente alrededor de los filamentos centrales. El segmento medio está en disposición 9 mas 2 de los microtúbulos está rodeado por nueve fibras gruesas o densas que al parecer están relacionadas con los nueve dobletes del axonema. El axonema y las nueve fibras densas asociadas del segmento

medio están cubiertos de manera periférica por numerosas mitocondrias. La vaina mitocondrial, dispuesta

en un padrón helicoidal alrededor de las fibras

longitudinales de la cola, es la fuente de energía necesaria para la motilidad espermática (Hafez, 2000).

El segmento principal, que continúa en sentido posterior desde el anillo citoplasmático y se extiende casi hasta la punta de la cola, está formado por axonema en el centro y sus fibras gruesas asociadas. La vaina fibrosa da estabilidad a los elementos contráctiles de la cola.

El segmento caudal, posterior a la terminación de la vaina fibrosa, contiene solo el axonema central cubierto por la membrana plasmática. El axonema es el que le da motilidad a espermatozoide. Los pares externos de microtúbulos del patrón 9 mas 2, generan las ondas de flexión de la cola por un movimiento deslizante de pares adyacentes (Hafez, 2000). Figura 2. Esquema de un espermatozoide con sus componentes estructurales

Fuente: Toro, 2009.

5.2.3. EVALUACIÓN DEL REPRODUCTOR BOVINO La evaluación reproductiva de los toros es un análisis que

se utiliza para

determinar el potencial reproductivo de un bovino macho, este potencial es la suma de factores inherentes a la reproducción como la edad, la pubertad, la calidad del semen, la circunferencia escrotal y la libido, y es totalmente compatible con la condición física apropiada para poner en práctica los procesos que culminan con la monta (Martins, 2002). Este potencial tiene un fuerte componente genético, con heredabilidad de algunas características de reproducción de medios a altos como la edad de la pubertad y circunferencia escrotal y puede ser interferido por la edad, la nutrición, el medio ambiente y la salud (Gonçalves, 2005).

Por el examen andrológico completo puede detectarse alteraciones del desarrollo del

sistema

genital,

alteraciones

regresivas,

alteraciones

progresivas

alteraciones inflamatorias en los diversos órganos, bien como disturbios de la libido y la habilidad de cópula. Estas alteraciones llevan tanto a la incapacidad de fertilización como de monta, en varios grados, caracterizando cuadros de subfertilidad como de infertilidad (Barbosa, 2005).

5.2.3.1. El Examen andrológico. Según (Pimentel, 2008), un examen andrológico debe realizarse siguiendo varios pasos: a) Examen clínico general. b) El examen clínico de los órganos externos. c) El examen clínico de los órganos internos. d) El examen del comportamiento sexual. e) El examen delas enfermedades venéreas.

f) El examen de esperma.

a) El examen clínico general

Tiene como objetivo, identificar los defectos en los órganos locomotores, dientes, prognatismo, hernias y defectos en los órganos reproductivos que pueden estar asociados con la infertilidad, pueden ser indeseables por anomalías heredables o que pueden indicar causas de infertilidad en sus descendientes. Un reproductor debe ser analizado de pié, andando y no en el acto de la monta, a fin de diagnosticar posibles alteraciones, principalmente en los miembros posteriores, pueden ser responsables por la baja capacidad reproductiva animal debiendo también evaluarse pesuñas y miembros anteriores (Silva et al., 1993).

b) El examen de los órganos externos

Se verifican cambios en los testículos, el epidídimo, escroto, pene y prepucio. Un paso importante en esta prueba es determinar la circunferencia escrotal. Esta característica está asociada con la fertilidad y es hereditaria. Los toros con mayor circunferencia escrotal producen mayor esperma y tienen hijas que llegan a la pubertad antes. Por esta razón, en el mismo rebaño y en toros jóvenes de la misma edad se debe seleccionarlos individuos con mayor circunferencia escrotal (Pimentel, 2008). La

circunferencia

escrotal

característica

más

importante

selección de toros para la fertilidad, precocidad y aumento de peso, debido a la facilidad de evaluación. La circunferencia escrotal se asocia positivamente con las características de peso, la pubertad y se informó recientemente la correlación genética positiva que presenta con la libido (Pineda, 2005).

Dentro de las estructuras en el escroto, analizar su simetría, la movilidad de varias capas, y presencia de condiciones patológicas, los testículos deben presentar una

forma oval alargada, coherencia simétrica tensa elástica, siendo móvil en todas direcciones, y su sensibilidad no puede ser dolorosa al tacto y la temperatura debe estar por debajo de la corporal; se observa en el epidídimo simetría, tamaño, forma, consistencia y la movilidad, lo que sería normal ligeramente elástico, y la cola es suave; en el prepucio por palpación se verifica si hay abertura del orificio prepucial, fibrosis, inflamación, entre otros que pueden dificultar la salida del pene; en el pene se debe observar la existencia de lesiones, adherencias, fimosis, parafimosis entre otras; en el cordón espermático la aparición de acumulaciones pueden indicar la existencia de quistes (Martins, 2002) c) El examen de los órganos internos

La palpación de los genitales internos de los toros debe ser la última parte del examen físico durante el examen del reproductor. El examen rectal tiene los siguientes propósitos:

Evaluar los órganos genitales internos.

Retirar las heces del recto para aumentar el contacto de la sonda del electroeyaculador con la mucosa rectal.

La exploración rectal puede revelar la existencia de anomalías genéticas o adquiridas, lesiones peritoneales o trastornos de los órganos urinarios que pueden interferir en la capacidad reproductiva de los animales (Gandolfo, 2007). d) El examen del comportamiento sexual.

Entre los factores comportamentales, la libido es de fundamental importancia para que sean seleccionados animales que efectivamente demuestren interés por la hembra (Chenowet, 1993).

Un examen de comportamiento sexual debe contar con tres etapas: libido, habilidad de servicio y capacidad de servicio (Pimentel, 2008). 5.2.4. OBTENCIÓN DEL SEMEN BOVINO La recogida del semen bovino normalmente se realiza utilizando dos métodos: la vagina artificial, o el electroeyaculador. En los centros de inseminación artificial se emplea de forma rutinaria la vagina artificial. Excepcionalmente en casos muy concretos, como pueden ser toros con problemas físicos que no puedan realizar la monta, animales jóvenes o machos mal entrenados que se niegan a saltar, se puede utilizar el electroeyaculador. La vagina artificial está constituida por un cilindro rígido de dimensiones diferentes en función de la edad del semental. En ambos extremos del cilindro se fija la camisa de caucho que delimita una cámara interior. El espacio interior se rellena de agua a 45ºC a través de una válvula, pudiendo insuflarse también aire con el objeto de incrementar la presión y facilitar la eyaculación del semental. En uno de los extremos del cilindro se acopla un embudo de caucho unido a un tubo de vidrio graduado, protegido de la luz y del frío por una funda protectora. El pene en erección se introduce en el interior de la vagina artificial y, gracias a las condiciones de temperatura y presión, se desencadena la eyaculación del macho. Es un método muy eficaz que, realizado apropiadamente, puede utilizarse a lo largo de la vida reproductiva del semental. Si la temperatura o la presión interior de la vagina no son las adecuadas o la recogida la realiza personal no entrenado, se pueden originar lesiones en el pene que pueden llegar a suprimir la libido del toro y el rechazo de la monta. En la recogida del semen se facilitará la extracción si se utiliza un animal entrenado para realizar las funciones de maniquí; suele emplearse un semental que ha terminado su etapa reproductiva y que se encuentra en buena condición corporal (Muiño, 2008). 5.2.4.1.

Colecta del semen mediante electroeyaculador:

El electroeyaculador permite extraer semen a todos los toros sin previo acostumbramiento, con libido pobre o ausente, con afecciones de los miembros posteriores que le impiden cubrir la hembra o en el caso de examen de infertilidad de varios animales (Cisneros, 2011)

El toro estimulado lograra la protrusión del pene entre 5 y 8 minutos después de iniciada la estimulación, en algunos casos se debe ayudar al toro, estimulándole la próstata por vía rectal (Arthur et al., 1991). El electroeyaculador es introducido en el recto del toro y su función es dar pulsos eléctricos muy leves en la próstata y vesículas seminales para que el animal presente erección y eyaculación (Cancino, 2009).

Un sistema de electroeyaculación está constituido por los siguientes componentes: una caja de transporte, la sonda rectal, la unidad de control, el cargador de batería, el cable de energía, el cable de conexión de la sonda, el mango, el cono y el envase de colección (Olivera, 2009).

El Cilindro del electroeyaculador se lubrica y se introduce por el ano en la región rectal ocupando la cavidad pélvica. La emisión del semen se logra al estimular los nervios simpáticos lumbares (hipogástrico) en la parte más anterior de la cavidad pélvica, los nervios sacros que causan erección y eyaculación están localizados en una zona posterior. Al aplicar el estímulo, este debe ser intermitente, rítmico y en su intensidad deberá aumentarse paulatinamente hasta que se produzca la eyaculación. El semen se recoge colocando el embudo con el tubo colector en la punta del glande del pene (Galina & Valencia, 2006).

El toro estimulado logrará la protrusión del pene entre 5 y 8 minutos después de iniciada la estimulación, en algunos casos se debe ayudar al toro, estimulándole la próstata por vía rectal (Arthur et al., 1991).

5.2.5. ANÁLISIS DEL SEMEN BOVINO

5.2.5.1. Evaluación de la Calidad del Semen Durante las últimas décadas, la IA ha demostrado ser la tecnología reproductiva que más ha contribuido a acelerar el progreso genético de las diferentes especies ganaderas, especialmente del ganado vacuno de aptitud láctea; sin embargo, el éxito de esta tecnología depende de que el semen utilizado tenga una calidad adecuada. Uno de los objetivos prioritarios de la industria de la IA ha sido la predicción de la capacidad fecundante del semen comercializado; con esta finalidad se han ido desarrollando a lo largo del tiempo diferentes métodos diagnósticos, desde la evaluación de la motilidad, concentración y morfología espermática de los eyaculados hasta la contrastación de dosis de semen congelado mediante sistemas de análisis computarizado, citometría de flujo y test de funcionalidad espermática basados en la fecundación in vitro (Olivera, 2009).

La fertilidad potencial de una muestra de semen probablemente va a depender de que contenga un número suficiente de espermatozoides viables, morfológicamente normales y funcionalmente competentes, capaces de alcanzar el oviducto y de establecer un reservorio oviductal, de llevar a cabo la fecundación del ovocito, y de contribuir al desarrollo embrionario. La evaluación del semen mediante técnicas in vitro, si ha de tener algún valor predictivo de su capacidad fecundante in vivo, debería incluir el estudio de tantas características espermáticas como sea posible, especialmente cuando se trata de dosis de semen congelado o cuando se están evaluando nuevos métodos de criopreservación (Muiño, 2008). 5.2.5.2. Pruebas de rutina de valoración del semen

a) Motilidad. La motilidad progresiva de los espermatozoides ha sido utilizada ampliamente para predecir la fertilidad de una muestra de semen; sin embargo, los

resultados obtenidos en relación con la fertilidad son contradictorios. Se han señalado correlaciones entre motilidad y fertilidad a campo de los machos, que van desde r=0,15 hasta r=0,83, sin embargo, estos hallazgos no siempre han podido se corroborados. La evaluación subjetiva con microscopio de contraste de fases es la práctica más común para determinar la motilidad. En las últimas décadas, la utilización de los equipos CASA es una práctica que cada vez se hace más habitual para evaluar en forma objetiva la motilidad espermática. Se ha reportado la relación entre ciertos patrones del movimiento espermático, especialmente movimiento lineal, con la fertilidad in vivo. Sin embargo, es importante resaltar que al determinar la motilidad, no se toma en consideración, la habilidad

las

células

espermáticas

para

desarrollar ciertos procesos

importantes para la fertilización in vivo, como son la capacitación, la reacción del acrosoma y la fertilización (Madrid, 2005). b) Morfología. Con esta prueba se valora la proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de defecto morfológico y se determina su relación con la fertilidad in vivo de los toros. Es utilizada para eliminar toros con pobre calidad seminal y refleja la funcionalidad de los testículos, epidídimos y de las glándulas accesorias.

Se han mostrado correlaciones negativas entre los espermatozoides anormales con la viabilidad y con la fertilidad, sin embargo, su utilidad está limitada cuando se evalúan toros en centros de IA que poseen alta fertilidad, ya que las muestras de semen tienen aceptables porcentajes de espermatozoides normales. Generalmente, la morfología no se correlaciona con la fertilidad del toro, a no ser que exista un alto porcentaje de espermatozoides con formas anormales en la muestra (Madrid, 2005). c)

Concentración Espermática. La concentración determina el número de

espermatozoides por unidad de volumen (cm3), ya que esto, multiplicado por el

volumen total permite conocer el número total de espermatozoides por eyaculado. Aunque se sabe que la relación entre la concentración y la fertilidad es baja, es un hecho que si no existen espermatozoides en el eyaculado, el macho es estéril (Azoospermia); en cierta concentración, el animal es de dudosa fertilidad (Oligospermia) y en otras, la fecundidad debe ser elevada (Normospermia), (Sorensen, 1982).

Tabla 1. Nomenclatura para el análisis del semen

Parámetro

Criterio de

Nomenclatura

evaluación Volumen

Nulo

Aspermia

Reducido

Hipospermia

Aumentado

Hiperespermia

Cero

Azoospermia

Reducido

Oligospermia

Normal

Normospermia

Aumentado

Polizoospermia

Motilidad espermática

Reducido

Astenozoospermia

Viabilidad Espermática

Todos muertos

Necrozoospermia

Espermatozoides Anormales

Alto porcentaje

Teratozoospermia

Concentración

Fuente: Hafez, 2000

concentración varía dependiendo de factores extrínsecos (método de

recolección, la frecuencia de cópulas) e intrínsecos (edad, biometría testicular). (Barbosa et al., 2005).

El cálculo del volumen y de la concentración de espermatozoides del eyaculado, debe hacerse de forma precisa, ya que de estos dos parámetros va a depender el número de dosis seminales que pueden elaborarse a partir de un eyaculado. El

volumen debe calcularse mediante pesada y transformación posterior de este valor mediante el factor de densidad correspondiente. La comprobación del volumen directamente en un tubo graduado, aunque de uso frecuente, suele inducir a error, bien por la presencia de burbujas de aire que dificultan la observación, o por la inexactitud de la propia escala del tubo (Muiño, 2008).

La sociedad de Teriogenología ha establecido que el número mínimo de espermatozoides para obtener la máxima capacidad fecundante en el caso de la inseminación artificial debe ser de 15 millones de espermatozoides vivos por dosis (0.25ml y 0.5ml), (Muiño et al, 2005); y más de 500 millones de espermatozoides por ml en caso de la monta directa (Hafez, 2000).

En la producción comercial de semen bovino congelado, el número mínimo de espermatozoides por pajuela necesario para obtener la máxima fertilidad in vivo se ha establecido en 15 millones, con al menos el 50% de motilidad progresiva postdescongelación. No obstante, las dosis seminales producidas por muchos centros de IA exceden este número mínimo establecido, intentando garantizar la presencia de al menos 10 millones de espermatozoides vivos y con motilidad progresiva en cada

dosis

seminal.

Este

número

mínimo,

para

algunos

sementales

excepcionales, probablemente pueda ser reducido hasta 5 ó 6 millones de espermatozoides vivos por dosis sin un descenso significativo en la fertilidad, pero estos individuos tendrían que ser identificados previamente. A partir de ese mínimo establecido, por mucho que se incremente la concentración espermática de las dosis seminales no se va a reflejar en un aumento de la fertilidad (Muiño, 2008)

El método más preciso para evaluar la concentración espermática del eyaculado es el recuento de espermatozoides en un hemocitómetro. Este método, para uso rutinario en centros de inseminación artificial (IA) donde cada día se evalúan un gran número de eyaculados y es necesario agilizar el trabajo, se hace laborioso y

lleva tiempo. En estos casos, normalmente se opta por el uso de un espectrofotómetro, que permite estimar de forma indirecta la concentración espermática basándose en la absorción o dispersión de la luz provocada por los espermatozoides

suspensión.

determinación

concentración

espermática mediante un espectrofotómetro es un método rápido y facilita resultados con un margen de error asumible. El uso del hemocitómetro ha quedado relegado a un segundo plano, empleándose fundamentalmente para obtener la curva de calibración del espectrofotómetro, o en laboratorios en los que se evalúa un número reducido de muestras de semen, o bien cuando este proceso se realiza de forma ocasional (Muiño, 2008).

Existe una variabilidad muy grande en la concentración de un eyaculado a otro, y de un toro a otro, siendo importante conocer el número de espermatozoides por eyaculado, ya que de este parámetro depende el número de hembras a inseminar. La concentración puede calcularse por varios métodos a partir de la muestra de semen. Entre estos métodos, destacan la

espectrofotometría, la colorimetría, la

citometría de flujo y el uso de cámara de recuento celular, como las de Bürker, Neubauer o Thoma. La espectrofotometría, es un método indirecto, que mide la luz

monocromática

absorbida

por

las

partículas

suspensión

los

espermatozoides. Esta densidad óptica de la muestra es comparada frente a una curva estándar patrón previamente validada, y permite, así, conocer el número de espermatozoides (Hidalgo et al., 2005)

La fertilidad de una muestra de semen dependerá del número de espermatozoides con atributos normales que posea. La fertilidad de los machos bovinos describe una curva de dosis-respuesta en relación al número total de espermatozoides normales inseminados y ese comportamiento es individual para cada toro. Al inicio, la curva muestra un desplazamiento casi vertical, para luego llegar a una meseta, conocida como fertilidad individual máxima. Eso significa, que si se aumenta el número de espermatozoides por dosis por encima del número

presente al inicio de la meseta de la curva de fertilidad de un determinado toro, no necesariamente se incrementará en forma significativa la fertilidad de ese animal (Madrid, 2005).

Las características como densidad y motilidad seminal se describen en la Tabla 2, como Muy Buena (MB), Buena (B), Regular (R) y Mala (M). Esta descripción ha sido Utilizada en los últimos treinta años, tiene un significado específico que debe ser aplicado uniformemente por todos aquellos que evalúen semen. La descripción de densidad espermática es: Tabla 2. Parámetros de evaluación de la concentración espermática en toros Según el IRAC (Instituto de Reproducción Animal de Córdoba- Argentina) Apariencia granulosa con 750 millones a 1000 millones o Muy Buena (MB)

mas de espermatozoides por ml Semen opaco, lechoso con 400 millones a 750 millones de

Buena (B)

espermatozoides por ml Semen como leche aguada con 250 a 400 millones de

Regular (R)

espermatozoides por ml Semen translúcido u acuoso con menos de 250 millones de

Mala (M)

espermatozoides por ml

5.3. MARCO LEGAL A continuación será señalada la legislación tenida en cuenta en la elaboración del presente trabajo según las leyes Colombianas vigentes. 5.3.1. Ley 576 del 15 de febrero del 2000 Por la cual se expide el Código de Ética para el ejercicio profesional de la Medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y zootecnia Artículo 15. El médico veterinario, el médico veterinario y zootecnista y el zootecnista, deberán ser conscientes de que la base y material primordial sobre el cual desempeñan su función, es el animal, sus poblaciones, el material genético; por lo que todas las actividades que ejerzan sobre éstos: producción,

transformación,

comercialización,

salud,

docencia,

investigación y administración deben estar enmarcadas dentro de un trato humanitario que implica el respeto por todos los seres vivos de la naturaleza. ARTICULO 78. Los trabajos de investigación podrán ser divulgados o publicados con la debida autorización de sus autores, de conformidad con las normas sobre Derechos de Autor.

5.3.2. Ley 84 del 27 de diciembre de 1989: Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales y se crean unas contravenciones y se regula lo referente a su procedimiento y competencia ARTICULO 1º A partir de la promulgación de la presente ley, los animales tendrán en todo el territorio nacional especial protección contra el sufrimiento y el dolor, causados directa o indirectamente por el hombre. ARTÍCULO 2. Las disposiciones de la presente Ley, tienen por objeto:

a) Prevenir y tratar el dolor y el sufrimiento de los animales; b) Promover la salud y el bienestar de los animales, asegurándoles higiene, sanidad y condiciones apropiadas de existencia; c) Erradicar y sancionar el maltrato y los actos de crueldad para con los animales.

5.3.3. RESOLUCIÓN

Por medio de la cual se establecen las condiciones sanitarias y de bioseguridad en la importación, procesamiento y comercialización de material genético de especies de interés zootécnico

EL GERENTE GENERAL DEL INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO (ICA)

En ejercicio de sus atribuciones legales y en especial las conferidas por el artículo 4 del Decreto 3761 de 2009 y el artículo 6 del Decreto 1840 de 1994, y CONSIDERANDO

El Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) es el responsable de prevenir, controlar y erradicar las enfermedades que afectan a la ganadería nacional tanto en la producción como en la calidad de sus productos, para ello debe establecer las medidas básicas de bioseguridad y sanitarias que deben implementar las personas naturales y jurídicas que se dediquen a la recolección y procesamiento de material genético de especies de interés zootécnico.

A través del material genético se pueden transmitir enfermedades que ocasionan grandes pérdidas económicas en el sector pecuario nacional, por lo que es

necesario establecer un control sobre este material para elevar la producción y mejorar la calidad sanitaria.

En el marco de la producción pecuaria, la actividad de comercializar material genético ocupa un lugar predominante y por tanto su manejo en condiciones sanitarias inadecuadas constituye un riesgo para la salud de los animales.

En virtud de lo anterior, R E S U E L V E:

ARTÍCULO 1. OBJETO. La presente Resolución establece los requisitos sanitarios y de bioseguridad que deben cumplir las personas naturales y jurídicas que importen, recolecten, procesen y comercialicen material genético de especies de interés zootécnico. ARTÍCULO 2. CAMPO DE APLICACIÓN. Las disposiciones contenidas en la presente Resolución serán aplicables a las personas naturales o jurídicas dedicadas a la importación, recolección y procesamiento de material genético de especies de interés zootécnico con destino a la comercialización o al autoconsumo.

ARTÍCULO 3. DEFINICIONES. Para la aplicación de la presente Resolución, se utilizaran las siguientes definiciones: 1. BIOSEGURIDAD: Conjunto de prácticas o medidas sanitarias orientadas a prevenir el contacto de los animales con microorganismos patógenos y que utilizadas en forma permanente buscan evitar la entrada y salida de agentes infectocontagiosos.

2. CENTRAL DE RECOLECCION Y PROCESAMIENTO DE MATERIAL GENETICO: Establecimiento con las condiciones para el alojamiento de donantes, la recolección, procesamiento y almacenamiento de material genético. 3. ESPECIES DE INTERES ZOOTECNICO: Son aquellas especies animales que a través de cambios genéticos, se han adaptado a vivir en cautiverio y junto al ser humano, para esta norma se consideran: los bovinos, equinos, porcinos, ovinos y caprinos. 4. LOTE: Cantidad definida de material genético producida por un solo donante en un solo día y bajo condiciones que son consideradas uniformes para propósitos de muestreo. 5. MATERIAL GENETICO: Se designa a las muestras colectadas de gametos (semen y ovocitos) y embriones, así como los producidos por fertilización in vitro. 6. RIESGO: Es la probabilidad de que un peligro se presente. 7. UNIDAD DE PROCESAMIENTO DE MATERIAL GENETICO: Establecimiento con las condiciones para el procesamiento y almacenamiento de material genético que incluye fertilización In vitro y micro manipulación. 8. UNIDADES DE RECOLECCION DE MATERIAL GENETICO: Persona natural o jurídica que se dedica a la recolección de material genético en predios, para ser utilizado en fresco o remitido a una unidad de procesamiento registrada. 9. UNIDADES DE RECOLECCION Y PROCESAMIENTO DE MATERIAL GENETICO:

Establecimiento

con las

condiciones necesarias para el

procesamiento y almacenamiento de material genético y que realiza la recolección del mismo en predio. ARTÍCULO 11. ROTULADO. Todo material procesado y congelado debe contener como mínimo la siguiente información:

1. Código de la central, Unidad recolectora y procesadora o Unidad recolectora y Unidad procesadora. 2. Identificación del donante 3. Identificación de la raza 4. Identificación por lote y fecha de colecta de los embriones o material seminal.

ARTÍCULO 12. DOCUMENTOS. Hace parte integral de la presente Resolución el Anexo 1 denominado: “Manual de Buenas practicas de bioseguridad para centrales y/o unidades de recolección y/o procesamiento de material genético”. MANUAL DE BUENAS PRACTICAS DE BIOSEGURIDAD (BPB) PARACENTRALES Y UNIDADES DE RECOLECCIÓN Y /O PROCESAMIENTODE MATERIAL GENÉTICO

1.1.

DEFINICIONES

ANIMALES DONANTES: Es aquel que por su condición zootécnica y

sanitaria está destinado a proporcionar material genético. 1.2.

BUENAS PRÁCTICAS DE BIOSEGURIDAD (BPB): Son los principios

básicos y prácticas generales preventivas de higiene y sanidad en la producción, almacenamiento, transporte y comercialización de material genético, con el objeto de garantizar su condición sanitaria y disminuir cualquier riesgo inherente a su producción.

1.3.

CONTROL DE CALIDAD DE MATERIAL SEMINAL: Pruebas que

garanticen la calidad del producto y que incluyen: cuadro espermático (movilidad, morfología y vitalidad) y análisis microbiológico. 1.4.

FILTRO SANITARIO: Sitio al ingreso de las áreas diseñado y ubicado de

tal forma que obligue al personal a hacer uso de este y que cuente con un sistema para el lavado y desinfección de botas y en las áreas donde se requiera lavamanos provisto con agua potable, jabón y solución desinfectante y un sistema de secado (vehículos). 1.5.

INSUMO VETERINARIO: Todo producto natural, sintético, biológico o de

origen biotecnológico, utilizado para promover la producción pecuaria, así como para el diagnóstico, prevención, control, erradicación y tratamiento de las enfermedades, plagas y otros agentes nocivos que afecten a las especies animales o a sus productos. 1.6.

MONITOREO: Secuencia planificada de observaciones o mediciones

relacionadas con el cumplimiento de una buena práctica en particular. 1.7.

PELIGRO: Agente biológico, químico o físico que pueda comprometer la

seguridad y/o la salud de las animales o la integridad del material genético. 1.8.

POE: Procedimiento Operacional Estandarizado: Procedimiento que debe

ser documentado, implementado y mantenido. 1.9.

TRAZABILIDAD: Aptitud para rastrear o seguir la historia, la aplicación o a

localización de un producto por medio de identificaciones registradas.

2. CENTRAL DE RECOLECCION Y PROCESAMIENTO DE MATERIAL GENETICO

2.1. COLECTA DE MATERIAL SEMINAL Y/O EMBRIONES.

2.1.1. Debe encontrarse alejada de cualquier foco de contaminación y estar en buen estado para evitar que los animales donantes se lastimen.

2.1.2. La temperatura ambiental y ventilación de las áreas de manejo y alojamiento de los animales deben permitir el confort de los operarios y animales donantes.

2.1.3. Disponer de corral, corredor de conducción y brete con el objeto de garantizar la seguridad de los operarios y animales.

2.1.4. Tener un sistema de higienización con agua y presión suficiente para el cumplimiento de los objetivos establecidos en cada etapa del proceso. 2.2. LABORATORIO DE PROCESAMIENTO

2.2.1. Los pisos y mesones deben ser de color claro, lisos y la unión entre paredes, pisos y mesones deben ser redondeadas.

2.2.2. Contar con ventilación e iluminación que permita garantizar la calidad del material genético.

2.2.3. Los gabinetes del laboratorio deben ser en cantidad suficiente para garantizar el almacenamiento de la totalidad de los reactivos, medios y otros insumos y estar elaborados de material lavable y liso.

2.2.4. Contar con un sitio exclusivo para almacenamiento de equipos, termos y repuestos.

2.2.5. El área de proceso del material genético debe estar físicamente separado de la sala de colecta y a este sector sólo ingresará el personal debidamente autorizado.

2.2.6. El área de lavado, desinfección y esterilización de material debe estar completamente separada del área de procesamiento de material genético y debe disponer de los instrumentos necesarios para las labores de limpieza y desinfección de los equipos y utensilios de esta zona. 2.3.

ALOJAMIENTO DE DONANTES. El área puede estar conformada por

potreros o corrales.

2.3.1. Realizar inspección por lo menos una vez al día a los animales que se encuentran en el potrero.

Los corrales y/o establos deben:

1. Estar construidos en un material que permita su fácil limpieza y desinfección. 2. Brindar condiciones ambientales adecuadas de luz y temperatura. 3. Tener espacio suficiente para que los animales se muevan con facilidad, contar con bebederos, comederos y saladeros. 4. Cuando se utilizan camas estas deben estar siempre limpias y secas para prevenir la contaminación con desechos.

2.3.2. Lavar a diario los bebederos y comederos de los animales. 3. PERSONAL

3.1.

El personal debe evitar el contacto con animales ajenos al centro, con el fin

de evitar la posibilidad de transmitir enfermedades.

3.2.

Contar con la dotación de ropa de trabajo y calzado, el cual debe ser de uso

exclusivo para el personal que labora en el centro, la misma debe ser diferente de acuerdo al área de trabajo. 3.3.

Contar con dotación para los visitantes.

3.4.

La ropa de dotación debe ser lavada dentro de la central.

3.5.

Los visitantes deben cumplir con todas las normas de bioseguridad

establecidas. 3.6.

Todo el personal debe recibir capacitación continúa con relación a normas

de higiene y manejo de los animales.

4. CONTROLES SANITARIOS

Los donantes deberán tener un plan de vacunación que incluya las enfermedades de control oficial y ser sometidos cada año a las siguientes pruebas diagnósticas con resultados negativo. 4.1.

Bovinos: Tuberculosis, Brucelosis, Diarrea Viral Bovina (detección de

antígeno) y 21 días después prueba serológica para anticuerpos específicos, Rinotraqueitis Infecciosa Bovina.

1. Historial de vacunación que deberá incluir: tipo de vacuna, lote, fecha de aplicación y nombre comercial. 2. Tricomoniasis y Campilobacteriosis: Sólo serán sometidos a la prueba de diagnóstico los toros destinados a la producción de semen o en contacto con toros destinados a la producción de semen. Los toros que vuelvan a ser seleccionados para tomas de semen después de un período de interrupción

de más de 6 meses serán sometidos a la prueba de diagnóstico no más de 30 días antes de la toma de semen. 5. BIENESTAR ANIMAL

Las condiciones en que se mantengan los animales, deben ser de acuerdo a su especie, grado de desarrollo, adaptación y domesticación, así como a sus necesidades fisiológicas y etológicas para esto se debe tener en cuenta que se cumpla con los siguientes parámetros:

5.1.

Contar con personal capacitado y suficiente para el cuidado de los

animales.

5.2.

El diseño de las instalaciones debe tener en cuenta los riesgos de

perturbación ocasionados por el medio externo, como el ruido, la luz, las vibraciones, las condiciones atmosféricas y la contaminación, así como los riesgos de incendios e inundaciones.

5.3.

Deberán tomarse las disposiciones necesarias para desalojar y evacuar los

animales en caso de emergencia.

5.4.

Las cercas deben impedir que se escapen los animales, estar levantadas

de forma conveniente y conservada para evitar riesgos de heridas.

Cuando se utilice cualquier tipo de enrejado o alambrada en particular para especies pequeñas, deberá garantizarse que estén bien tensionadas y revisarse periódicamente para evitar accidentes en los ejemplares.

5.5.

A los animales se les debe proveer de una alimentación sana, acorde a su

edad y especie, en cantidad suficiente con el fin de mantener su buen estado de salud y de satisfacer sus correctas necesidades de nutrición.

5.6.

La superficie total disponible para todos los animales y la dimensión del

grupo deberán calcularse en función de la edad, del tamaño y de otras características biológicas de la especie.

5.4.

MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

Soracá pertenece a la Cordillera Central de los Andes y se encuentra en las estribaciones de la meseta Cundiboyacense; la zona urbana se esconde en una meseta entre los cerros Arzobispo, los chorros y Tibará en donde contrastan tierras erosionadas, frías y de barrancos amarillos. Soracá es una región apta para la producción de papa, trigo, frutales y pastos para la ganadería. Está localizado en la zona centro del departamento de Boyacá a 5º 30´ de latitud Norte y 73º de longitud Oeste de Grenwich. Cuenta con un área total de extensión de 57 Km², dista de Tunja 7 Km por la carretera del progreso y a 4.5 Km por la avenida de los patriotas. Se encuentra entre los pisos térmicos frío y páramo, la temperatura oscila entre 7 y 12°C, promedio de trece (13) grados centígrados, tiene pisos térmicos de frío 55 Km² y páramo 3 Km². El municipio de Soracá cuenta con un gran número de nacederos principalmente en las veredas de El Rosal, Faitoque, Chaine, Quebrada Vieja y Quebrada Grande los cuales forman las Microcuencas de las Quebradas El Muerto, El Arzobispo, Puente Hamaca y Quebrada Vieja. Soracá cuenta con una extensión total de 2974 Km2, una extensión de área urbana de 27 Km2 una extensión de área rural de 2947 Km2; la cabecera municipal tiene una altitud de 2.942 msnm, la temperatura es de11 a 14º C. Limita por el Norte con el Municipio de Chivata; por el Oriente con los municipios de Siachoque, Viracacha y Ramiriqui; por el Sur con el municipio de BoyacáBoyacá y por el occidente con el municipio de Tunja.

Imagen 1. Ubicaci贸n del municipio de Sorac谩 en el territorio Nacional y departamental.

Fuente: http://soraca-boyaca.gov.co/nuestromunicipio.shtml Visitado: 10 Marzo 2012

6. METODOLOGÍA 6.1. TIPO DE ESTUDIO El presente estudio es de tipo exploratorio, experimental y descriptivo. 6.2. MATERIALES Muestra: Se utilizaron como unidades experimentales dos bovinos machos de 2 y 3 años de edad, sanos, libres de enfermedades reproductivas, que fueron seleccionados mediante evaluación clínica y andrológica. Dichos animales son alimentados con

kikuyo (Pennissetum clandestinum), trébol rojo (Trifolium

pratense l), sal mineralizada y agua a voluntad, bajo un sistema de producción de tipo extensivo. Instalaciones: Los animales se colectaron en el brete para manejo de grandes animales, de la Clínica Veterinaria Francisco de Asís, de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos ubicada en el municipio de Soracá, las colectas obtenidas se llevaron al laboratorio Clínico MICROZOO ubicado en la Carrera 11a No 23-62 de la ciudad de Tunja.

Tabla 3. Materiales utilizados MATERIAL

UNIDAD

CANTIDAD

MATERIALES PARA SUJECIÓN Y EXAMEN CLÍNICO / ANDROLÓGICO Soga

Unidad

Fonendoscopio

Unidad

Termómetro

Unidad

Guantes de palpación

Unidad

Cinta métrica (Circunferencia escrotal)

Unidad

MATERIALES PARA COLECTA SEMINAL Materiales para lavado prepucial Guantes de examen clínico

Pares

Tijeras

Unidad

Cateter

Unidad

Venoclisis Macrogoteo

Unidad

Cloruro de Sodio al 0,9%

500 ml

Materiales para la colecta por el m étodo de electroeyaculador Electroeyaculador Electro Jac 5

Unidad

Cono Colector

Unidad

Tubos Eppendorf

15ml

Guantes de examen clínico

Pares

Unidad

Materiales para transporte del material seminal Cava icopor

MATERIALES DE LABORATORIO PARA MEDICIÓN DE CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Medición por Cám ara Neubauer Agua destilada

Micropipetas

Unidad

Tubos de ensayo

Unidad

Cámara de Neubauer

Unidad

Laminilla cubreobjetos en cuarzo

Unidad

Microscopio

Unidad

Medición por Espectrofotóm etro Citrato de Sodio al 2.9%

310

Pipeta

5 ml

Micropipeta

Unidad

Tubos de ensayo

Unidad

Gradilla

Unidad

Espectrofotómetro

Unidad

Spectyronic 20® Bausch & Lomb

6.3. MÉTODOS

6.3.1. Fase 1. Examen Clínico y andrológico de los toros.

A los animales seleccionados se les realizó examen clínico para determinar el estado fisiológico de cada uno de ellos, igualmente se realizó examen andrológico con el fin de identificar patologías y para determinar su aptitud reproductiva. En el examen clínico se tuvo en cuenta la normalidad en las constantes fisiológicas como lo son: frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, temperatura corporal, estado general y condición corporal.

En el examen andrológico se realizó: palpación del pene y del prepucio, con la respectiva inspección de sus mucosas, palpación del escroto, testículos y epidídimo, adicionalmente se midió la circunferencia escrotal, posterior a ello se realizó una palpación vía rectal de las glándulas accesorias.

6.3.2. Fase 2. Colecta seminal mediante el método de electro eyaculador. La sujeción de cada animal se realizó en un brete, donde inicialmente se sujetó la cabeza y se manearon los miembros posteriores, se cortó el vello prepucial con tijeras desinfectadas y se realizó posterior lavado de prepucio utilizando suero fisiológico, el cual se introduce por el agujero prepucial mediante un catéter estéril; se utiliza 500ml de NaCl al 0.9% y se administran mediante un venoclisis de macrogotéo que se conecta al catéter anteriormente mencionado; posteriormente se seca el área externa con una toalla de papel. El proceso de electroeyaculación se realiza siguiendo los siguientes pasos según la descripción realizada por Olivera (2009):

Usando un guante de palpación rectal, se retiró completamente la materia fecal del recto y se aplicó durante 1 a 2 minutos un masaje longitudinal sobre las ampollas deferentes y el músculo uretral. Se lubricó e introdujo la sonda vía rectal con los electrodos rígidos ventralmente. Introducida la sonda al recto, se conectó el cable del electroeyaculador, y se inició lentamente la estimulación hasta encontrar mínima respuesta por parte del toro. Luego se aplicó los estímulos consecutivos aumentando gradualmente la intensidad en cada uno, cada estímulo duró 1-2 segundos, con un descanso de 0.5-1 segundo, antes de iniciar el siguiente, cuidando que la sonda no se saliera debido a los movimientos del toro Debido a los estímulos eléctricos el pene alcanza el estado de erección extendiéndose por fuera del prepucio, emitiéndose una secreción pre seminal. Esta secreción no se colectó. El cono colector llevaba un aislante de temperatura y un protector contra los rayos solares. Cuando se observó la salida de una porción seminal turbia (eyaculado) el cono con el envase de colección se colocó alrededor del glande del pene para recolectar la muestra seminal. Después de colectar la muestra seminal deseada, se suspendió la estimulación y se retiró la sonda rectal. Embalaje y envío de la muestra al laboratorio: Posterior a la colecta del toro se introdujo la muestra en una cava de icopor manteniendo una temperatura de 37°c y se envió inmediatamente al laboratorio donde se realizó el procesado de la misma. 6.3.3. Fase 3. Procesamiento de las Muestras en el laboratorio:

Para cada muestra de semen, se realizó 30 mediciones de la concentración espermática por el método de hemocitómetro (Cámara de Neubauer) y 30 mediciones por Espectrofotómetro de la siguiente manera: Medición de la concentración espermática con Cámara de Neubauer: Para el conteo con hemocitómetro se utilizó una Cámara “Neubauer Improved Optic Labor”. A la muestra de semen Nº 1 se le realizó una dilución en agua destilada 1:20 (50µl de semen puro, en 950µl de agua destilada); y a la muestra de semen Nº2 se le realizó una dilución 1:200 (5 µl de semen puro, en 995µl de agua destilada). El procedimiento se realizó de la siguiente manera: En un tubo de ensayo estéril se introdujo el volumen de agua destilada antes mencionado mediante micropipeta y posteriormente se agregó el semen de la misma forma. Se agitó el tubo manualmente para homogenizar y se ubicó en una gradilla. Se realizó el llenado de la cámara de Neubauer y se llevó al microscopio para el conteo respectivo. El conteo se efectúa a 40x sobre los 5 cuadros (1, 2, 3, 4 y 5) de 0.2mm x 0.2mm representados en la figura 3. Figura 3. Cuadrícula, cámara de Neubauer o hemocitómetro

Posteriormente se multiplica el dato obtenido por 10 6 si la dilución es 1:20, o por 107 si la dilución es 1:200. El Resultado se expresa en # espermatozoides por ml de semen. De esta forma se realizaron los 30 conteos para cada muestra se de semen, y se tabularon. Medición de la concentración espermática con espectrofotómetro: Para la medición de la concentración espermática en bovinos se utilizó una dilución de semen puro en Citrato de Sodio al 2.9%, 1:100 (50µl de semen en 4950µl de Citrato de Sodio). El procedimiento se realizó de la siguiente manera: Se introdujo en un tubo de ensayo 5ml de Citrato de Sodio al 2.9% sin semen y se llevó al espectrofotómetro para calibrarlo. Se graduó a 620nm como lo indica Bouchard (1990) y Rodríguez (1985). Y se establece 0 para transmitancia y 0 para absorbancia. Se utilizó el espectrofotómetro Spectronic® Bausch & Lomb. Posteriormente en un tubo de ensayo se introdujo 4950 µl de Citrato de Sodio al 2.9% mediante pipeta, y a este se agregó 50µl de semen puro con la ayuda de una micropipeta, se agitó el tubo manualmente para homogenizar el contenido, luego se limpió el tubo con papel y se introdujo en el espectrofotómetro. Se tomó la lectura para absorbancia y se recopiló. De esta forma se tomaron las 30 mediciones para cada muestra se de semen, y se tabularon. Fase 4: Análisis estadístico: Se tabularon los resultados obtenidos para el toro N°1 y N°2, en la medición con Cámara de Neubauer Vs Espectrofotómetro.

Se realizó un análisis estadístico descriptivo, mediante el programa SPSS 19 donde se determinó el promedio y el coeficiente de variación de los resultados obtenidos en las 30 mediciones con Cámara de Neubauer y 30 mediciones con espectrofotómetro para cada muestra de semen. Se creó una matriz de correlación entre la absorbancia y la concentración, para cada muestra de semen. Posteriormente se realizó un paralelo entre el promedio de los resultados obtenidos en las mediciones por medio de Hemocitómetro y espectrofotómetro para la muestra de semen Nº1 (la cual presentó mayor correlación y menor coeficiente de variación que la Nº2), y se halló una constante matemática que correlaciona los resultados de los dos métodos.

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS

En las Tablas 4 y 5 se presentan los resultados obtenidos de acuerdo al análisis estadístico que se elaboró, se observa una diferencia significativa entre el coeficiente de variación de la medición por hemocitómetro y espectrofotómetro para las dos muestras de semen (Hemocitómetro: Cv1=8,86%; Cv2=17%), (Espectrofotómetro: Cv1=10.69%; Cv2=11.6%). Se demostró alta correlación entre la técnica de conteo con hemocitómetro y los valores de absorbancia para la muestra de semen Nº1 (r1=0.96), comparándolo con la muestra Nº2 (r2=0.96); esta correlación, permitió la generación de una fórmula que relaciona el promedio de medición con cámara de Neubauer y el promedio de espectrofotometría. Tabla 4. Promedio, deviación estándar, coeficiente de variación y correlación de las mediciones de la concentración espermática por ambas técnicas para el Toro 1. Cámara de Neubauer

Espectrofotómetro

Promedio de medición

Promedio medición (Absorbancia)

(espermatozoides/ml)

220833333,3

Desviación estándar

19580221,08 Desviación estándar (Absorbancia)

0,048866667 0,00522417

(espermatozoides/ml) Coeficiente de variación (Cv)

8,86% Coeficiente de variación (Cv) Correlación de Pearson r1= 0,963899784 73

10,69%

Tabla 5. Promedio, deviación estándar, coeficiente de variación y correlación de las mediciones de la concentración espermática por ambas técnicas para el Toro 2. Cámara de Neubauer

Espectrofotómetro

Promedio medición (espermatozoides/ml)

389000000 Promedio medición (Absorbancia)

0,127133333

66142479,44 Desviación estándar (Absorbancia)

0,01475018

Desviación estándar (espermatozoides/ml) Coeficiente de variación (Cv)

17.00% Coeficiente de variación (Cv) Correlación de Pearson r2=0,95798254

11,60%

Gráfica 1. Comparación de los resultados de concentración espermática según la medición realizada con cámara de Neubauer para el Toro Nº1 y Toro Nº2

COMPARACIÓN RESULTADOS OBTENIDOS POR HEMOCITÓMETRO, TORO 1 Y 2

600000000 500000000

400000000 300000000 200000000 100000000 0 0

10 15 20 25 Concentración espermática (esp/ml) Toro1, (Dilución 1:20)

Concentración espermática (esp/ml) Toro2, (Dilución 1:200)

Al graficar los promedios de los valores obtenidos de concentración espermática según la medición realizada con cámara de Neubauer para cada una de las muestras de semen, se observa que en el caso de la muestra seminal del segundo toro presenta mayor coeficiente de variación (observese la dispersión de los datos) con respecto al primero (Cv Nº1=8,86%; Cv Nº2=17.00%).

Gráfica 2. Comparación de los resultados de la medición realizada con espectrofotómetro en modo absorbancia para el Toro Nº1 y Toro Nº2

COMPARACIÓN RESULTADOS OBTENIDOS POR ESPECTROFOTÓMETRO TORO 1 Y 2 0,16 0,14 0,12

0,1 0,08 0,06 0,04

0,02 0 0

15 Toro 1

Toro 2

Al graficar los promedios de los valores obtenidos de concentración espermática según la medición realizada con espectrofotómetro para cada una de las muestras de semen, se observa que en el caso de la muestra seminal del segundo toro presenta mayor coeficiente de variación (observese la dispersión de los datos) con respecto al primero (Cv Nº1=10,69%; Cv Nº2=11,60%) 76

Comparando los Coeficientes de variación

y los valores de Correlación de

Pearson en las muestras seminales Nº1 y Nº2, se determinó que los valores de los promedios obtenidos para el toro Nº1 son mas confiables; por tanto se realizó un paralelo

estos

dos

valores

para llegar a la fórmula de aplicación

espectrofotométrica (modo absorbancia) para la medición de la concentración espermática en Bovinos, de la siguiente manera: Promedio medición con hemocitómetro: 220833333,3 espermatozoides/ml. Promedio medición con espectrofotómetro (Modo absorbancia): 0,048866667 Se divide el promedio de medición con hemocitómetro, entre el promedio de medición con espectrofotómetro (Modo absorbancia) y se tiene el siguiente valor: 4519099591 Este valor relaciona los resultados de la medición real en Nº de espermatozoides/ ml obtenida

en Cámara de Neubauer con los resultados de un valor

espectofotométrico (modo absorbancia) que simplemente nos expresa una cifra diferente de la concentración real de espermatozoides en la muestra de semen. Si se multiplica un dato obtenido en espectrofotometría por el dato obtenido anteriormente

tendremos

un valor real de concentración espermática sin

necesidad de realizar previa

curva de calibración y estandarización lo cual

representa simplicidad, practicidad y rapidez en el resultado En el gráfico 3 se observa la dispersión de los resultados y los promedios en Nº espermatozoides/ ml previa aplicación del valor 4519099591 sobre los resultados obtenidos en espectrofotometría, comparado con los valores obtenidos por conteo con cámara de Neubauer para las muestras de semen del Toro Nº 1.

Gráfico 3. Comparación de los resultados obtenidos por los dos métodos de medición espermática en el toro 1.

COMPARACIÓN RESULTADOS OBTENIDOS POR LOS DOS MÉTODOS, TORO 1. 300000000 250000000

200000000 150000000 100000000 50000000

0 0

Concentración espermática por CÁMARA DE NEUBAUER, (esp/ml), (DILUCIÓN 1:20) Concentración espermática por ESPECTROFOTÓMETRO EN MODO ABSORBANCIA, (esp/ml)

Al graficar la dispersión de los resultados de los valores obtenidos con la medición de la concentración espermática por los dos métodos observamos mayor dispersión en la medición con espectrofotómetro ( Medición con cámara CV= 8,86%, medición con espectrofotómetro CV=10,69%) sin embargo el coeficiente de correlación de las dos pruebas es alto (0,963899784) 78

La dilución utilizada para el conteo de espermatozoides con cámara de Neubauer al microscopio fue semen 1:20 para la primera muestra de semen. Al intentar realizar la medición de la concentración espermática de la segunda muestra de semen por medio del hemocitómetro con una dilución 1:20 se encontró aglomeración de los espermatozoides lo cual impedía realizar un conteo, pues se sobreponen colas y cabezas. Por ello se decide realizar dilución de semen 1:200 en el agua destilada. En la medición por hemocitómetro de la muestra N°1 se encontró menor coeficiente de variación, que en la muestra N°2 (Cv Nº1=8,86%; Cv Nº2=17.00%). Según esto la dilución 1:20 ofrece más exactitud que la dilución 1:200 pues en esta última los espermatozoides se encuentran muy dispersos en el conteo microscópico. Según el promedio obtenido en la medición por hemocitómetro para cada muestra de semen (X1= 220´833.333,3; X2=389`000.000) y siguiendo los parámetros de evaluación de la concentración espermática representados en la Tabla 2; el toro Nº 1 presenta una concentración mala y el toro Nº2 presenta una concentración regular. Según lo anterior una dilución 1:20 solo se puede realizar en muestras de semen que presentan mala concentración espermática. Según la información de la tabla 2, y de acuerdo al coeficiente de variación de las mediciones realizadas con la cámara de Neubauer para la muestra del semen Nº 2; al evaluar muestras seminales que presentan regular, buena y muy buena concentración espermática deben hacerse con una dilución 1:200 el cual presenta un coeficiente de variación de 17.00% como se representa en la Gráfica 1. Dado esto se planteó el protocolo de espectrofotometría en modo absorbancia el cual presenta, coeficientes de variación muy similares las lecturas de juntas muestras seminales, como se representa la Gráfica 2. (Cv Nº1=10,69%; Cv Nº2=11,60%); y se elaboró una formula matemática a partir los promedios obtenidos en la medición con cámara de Neubauer y espectrofotometría en la muestra de semen

Nº 1, la cual se aplicará sobre un resultado de absorbancia para cualquier muestra de semen fresco siquiedo los pasos del protocolo planteado. De acuerdo a los resultados obtenidos, el protocolo de medición de la concentración espermática por medio del espectrofotómetro se plantea de la siguiente manera: Introduzca en un tubo de ensayo limpio y sin rayones, 5ml de Citrato de Sodio al 2.9% (Blanco). En otro tubo limpio y sin rayones introduzca mediante pipeta 5 ml de Citrato de Sodio al 2.9%; mediante micropipeta saque del mismo 50 µl de Citrato y reemplácelos con 50 µl de semen puro (50 µl de semen en 4950 µl de Citrato de Sodio). Gradue el espectrofotómetro a 620nm Limpie el primer tubo con toalla de papel

e introdúzcalo a la celda del

espectrofotómetro para calibrarlo (0 absorbancia y 0 transmitancia). Agite el segundo tubo manualmente para homogenizar el contenido y límpielo con una toalla de papel, introdúzcalo en el espectrofotómetro. Tome el resultado por absorbancia y multiplíquelo por 4519099591

El resultado final se expresa en espermatozoides por mililitro de semen y presenta una variación del 10,69% (+/-10,69% )

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS La medición de la concentración espermática en bovinos es un tema muy limitado en cuanto a literatura, dado que en reproducción animal la mayoría de investigaciones se desarrollan en el área de ginecología y obstetricia. Sin embargo en Suramérica han surgido varios trabajos de importancia científica en este tema. Hasta este momento, el patrón de oro para medir concentración de semen en bovinos es la medición mediante el hemocitómetro (según la OMS), pues es una técnica, de bajo costo que generalmente se realiza en centros de procesamiento genético donde no se justifica la adquisición de equipos más sofisticados, o bien cuando este proceso se realiza de forma ocasional; sin embargo, Muiño et al., (2005), reporta que, el uso del hemocitómetro ha quedado relegado a un segundo plano empleándose fundamentalmente para obtener la curva de calibración del espectrofotómetro. Esto se evidencia en el trabajo realizado por Rodríguez et al. (2008), y Díaz et al., (2011). Donde se elaboraron curvas de estandarización espectrofotométrica de la concentración espermática para diferentes especies, partiendo de una medición previa con el hemocitómetro. Varios autores han evaluado la eficiencia del espectrofotómetro comparado con el hemocitómetro sin embargo los resultados en todos los casos no son los mismos. Páulenz et al. (1995) compararon estas dos técnicas obteniendo 12% de error con el hemocitómetro y 2.9% con el espectrofotómetro. Prathalingam et al. (2006), obtuvieron 7.8% de variación para el conteo manual con hemocitómetro y 4.1% de variación para el espectrofotómetro. Los resultados del presente trabajo muestran que el espectrofotómetro en modo absorbancia presentan menor variación que el Hemocitómetro (Medición con espectrofotómetro CV=10,69%; Medición con cámara CV= 8,86%). Sin embargo las dos técnicas presentaron alta correlación (r=0.96); similar al resultado obtenido por Rodríguez et al., (2008) que para el caso de bovinos fue de r=0.97, Díaz et al., obtuvo r=0.89 para el caso de la especie bovina.

Si en algo coinciden varios autores, es que el uso del espectrofotómetro reduce las posibilidades de error humano en la medición de la concentración espermática Atiq et al. (2011), dado que estos errores pueden provenir de muestreo inadecuado, error en el pipeteo, un soporte de muestra inadecuado, diluyente incorrecto, entre otros, como lo afirma Knox, (2004). Rodríguez et al., (2008), reporta que la determinación de la concentración espermática es un proceso dispendioso cuando se realiza manualmente y sigue siendo un procedimiento que consume mucho tiempo dentro de la evaluación seminal, por consiguiente es necesario elaborar y comparar varios métodos para la determinación de este parámetro. Como lo realizó López y Mellado (2001) con un patrón de fotografías de eyaculados y pruebas de Nado ascendente, Knox et al. (2002), con el espectrofotómetro y el hemocitómetro, Christensen et al. (2004), con la citometría de flujo y el hemocitómetro, Cardona et al. (2008), con la cámara de Makler® y la cámara de Neubauer. Cisneros (2011), con la elaboración de una técnica donde se ilustran las diversas concentraciones espermáticas según la dilución del semen, entre otros. Finalmente podemos decir que el método empleado por cada laboratorio debe ser determinado en base a una serie de factores, incluyendo el costo, conveniencia, tamaño de la muestra, y el número de eyaculados para ser evaluado, como lo reporta Prathalingam et al. (2006).

9. CONCLUSIONES El protocolo de Espectrofotometría por absorbancia, para hallar la concentración espermática en bovinos tiene precisión, simplicidad, practicidad y rapidez. La constante matemática para el cálculo de la concentración espermática en semen de toros, a partir de la medición con espectrofotómetro en modo absorbancia es 4519099591 El protocolo planteado presenta mayor eficiencia que la medición manual mediante hemocitómetro pues se ejecuta con mayor rapidez y presenta menor variación. Los resultados de la medición con hemocitómetro y los resultados de la medición con

espectrofotómetro

modo

absorbancia

presentan

alta

correlación

(0,95798254). La precisión de la medición de la concentración espermática por cámara de Neubauer depende del grado de dilución que se utilice; a mayor dilución menor precisión, sin embargo las diluciones bajas (1:20) solo se posibilitan en muestras seminales con baja concentración espermática. Se obtuvo resultados confiables en el procesamiento de las muestras seminales en el laboratorio pues se siguieron las pautas internacionales de ejecución de las mismas. El protocolo de espectrofotometría por absorbancia, para hallar la concentración espermática en bovinos es una opción de trabajo para centros de recolección y análisis seminal pues garantiza de la calidad de los resultados.

10. IMPACTO

En el ámbito científico, este trabajo representa un avance crucial, pues el desarrollo de procedimientos que buscan simplificar las técnicas laboratoriales en andrología,

representa finalmente un rendimiento productivo ya que se analiza

mayor número de muestras seminales en menor tiempo. La ejecución de este protocolo será de gran utilidad para el profesional dedicado al área de andrología, como herramienta que facilita el trabajo en el análisis seminal; además ofrece una valoración precisa del líquido seminal de los reproductores que presentan alto valor genético. La capacidad fecundante de una muestra de semen es analizada, teniendo en cuenta un sinnúmero de aspectos, pero al ser empacado en las palillas, se adiciona diluyentes de acuerdo a la concentración que esta presente; con una técnica precisa en la medición de este parámetro, podemos evitar sea subestimada o sobreestimada

dicha muestra, por consiguiente, el material

genético que se obtiene de los reproductores, garantiza eficiencia en los programas

inseminación

artificial

demás

tecnologías

reproductivas,

aumentando la taza de preñez y permitiendo el mejoramiento de los programas de repoblamiento bovino. Este trabajo debe ser comparado mediante otros trabajos mas adelante, y que tal vez sirva como modelo de aplicabilidad en las demás especies de interés zootécnico, pues el análisis seminal es un procedimiento de rutina no solo para los centros de reproducción en bovinos sino que se lleva a cabo en las demás especies.

11. RECOMENDACIONES

En cuanto al protocolo planteado se recomienda realizar colectas con la mayor limpieza posible dado que las partículas de suciedad alteran los resultados espectrofotométricos. Desarrollar el protocolo planteado según los pasos que en el se indican pues, al omitir uno de ellos, se puede ver afectada la precisión de la técnica. Implementar este protocolo en Centrales de reproducción bovina, con el fin de obtener mejores resultados y rendimiento, en la evaluación seminal de los reproductores. Elaborar el protocolo para la medición de la concentración espermática para las demás especies de interés zootécnico, basado en el presente modelo, principalmente en aquellas donde se realiza a diario colecta, evaluación y comercialización del semen. Desarrollar trabajos de investigación donde se compare este protocolo con las demás técnicas utilizadas en la medición de la concentración espermática en bovinos. Elaborar investigaciones que tengan como fin analizar el factor económico en la aplicación de protocolos como este para las distintas áreas de trabajo. Fomentar la investigación a nivel regional y nacional en el área de andrología para la especie bovina y para las demás especies, con el fin de hacer aportes de trascendencia internacional.

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Abril 24 de 2013 http://www.mineducacion.gov.co/1621/articles-105017_archivo_pdf.pdf Abril 24 de 2013

Citado:

ANEXOS Imagen 2. Toro N°1. Fuente: El autor, 2013

Imagen 3. Toro N°2. Fuente: El Autor, 2013

Imagen 4. Examen clínico y andrológico de los toros. Fuente: El Autor, 2013

Imagen 5. Corte del vello y lavado prepucial. Fuente: El Autor, 2013

Imagen 6. Palpación de las glándulas accesorias y estímulo manual de las mismas. Fuente: El Autor, 2013

Imagen 7. El proceso de electroeyaculaci贸n. Fuente: El Autor, 2013

Imagen 8. Materiales utilizados en el laboratorio. Fuente: El Autor, 2013

Imagen 9. Procesamiento de las muestras en el laboratorio. Autor, 2013

Fuente: El