Estudio leucocitario de la carpa coy (cyprinus carpio) etapa by Medicina Veterinaria JDC

ESTUDIO LEUCOCITARIO DE LA CARPA COY (Cyprinus carpio) ETAPA ADULTA EN SISTEMA EXTENSIVO DE PRODUCCION, EMBALSE LA COPA MUNICIPIO DE TOCA (Boyacรก)

JUAN GABRIEL BARAJAS BAUTISTA

FUNDACIร N UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2012

ESTUDIO LEUCOCITARIO DE LA CARPA COY (Cyprinus carpio) ETAPA ADULTA EN SISTEMA EXTENSIVO DE PRODUCCION, EMBALSE LA COPA MUNICIPIO DE TOCA (Boyacá)

JUAN GABRIEL BARAJAS BAUTISTA

TESIS DE GRADO PRESENTADA COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA OPTAR EL TITULO DE MEDICO VETERINARIO

DIRECTOR

Mauricio Boyacá Quintana Mvz Especialista en Laboratorio Clínico

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2012 2

HOJA DE ACEPTACION

_____________________________________________

DIRECTOR:

_____________________________________________

DR. MAURICIO BOYACÁ QUINTANA

JURADO:

_____________________________________________

MVZ. LUDY PAOLA VILLAMIL

DEDICATORIA

A mi hijo Juan Martin Barajas por ser ese motor el cual impulsa cada instante de mi vida.

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecerle a DIOS por permitirme culminar este importante ciclo en mi vida.

A mis padres Arcenio Barajas y Fanny Bautista por darme la vida y ser desde el primer instante mi guía.

A mi familia, Mónica y Martin por brindarme su apoyo incondicional.

A la doctora Ludy Paola Villamil por su orientación en el desarrollo de este trabajo, quien sin su apoyo no culminaría exitosamente.

A los docentes y la Universidad Juan de Castellanos quienes me dieron la oportunidad y me brindaron las herramientas para formarme como Médico Veterinario.

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCION

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

OBJETIVOS

1. MARCOS DE REFERENCIA

1.1 Estado del Arte

1.2 Marco Teórico

1.3 Marco Geográfico y Climático

1.4 Marco Social

1.5 Marco Legal

2. METODOLOGIA

2.1 Tipo de Estudio

2.2 Lugar y Características del Sitio de Estudio

2.3 Características de los Animales Muestras

2.4 Procesamiento de muestras

3. RESULTADOS Y ANALISIS

DISCUSÌON

4. CONCLUSIONES

5. IMPACTO

6. RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFIA

ANEXOS

LISTA DE FOTOS

Pág. Foto 1. Embalse La Copa

Foto 2. Carpa coy (Cyprinus carpio)

Foto 3. Toma de Muestras

Foto 4. Montaje Cámara de Newbauer

Foto 5. Solución de Natt Herrick

Foto 6. Cámara de Newbauer

Foto 7. Neutrofilo de carpa coy (Cyprinus carpio) en una vista de 100X

Foto 8. Monocito de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

Foto 9. Linfocito de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

Foto 10. Eosinofilo de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

Foto 11. Basofilos de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

TABLA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Descripción de la Especie Carpa Coy (Cyprinus carpio)

Figura 2. Sitio de muestreo en el Embalse La Copa

Figura 3. Mapa provincia centro de Boyacá, principales embalses

Grafica 1. Niveles conteo total de leucocitos

Grafica 2. Niveles de leucocitos

Grafica 3. Gráfico de normalidad

Grafica 4. Porcentaje total de leucocitos

Tabla 1. Estadística Descriptiva Cámara 1

Tabla 2. Estadística Descriptiva Cámara 2

Tabla 3. Estadística Descriptiva Cámara 3

Tabla 4. Estadística Descriptiva Cámara 4

Tabla 5. Total Cámaras

Tabla 6. Contraste de ajuste a una distribución normal, procedimiento prueba de Kolmogorov-Smirnou

Tabla 7. Porcentaje del recuento total de leucocitos

RESUMEN

La carpa común (Cyprinus carpio) fue cultivada por primera vez en el antiguo imperio chino hace cuatro o cinco millares de años, estableciéndose en el siglo XI en Europa.

Actualmente en Colombia la carpa coy (Cyprinus carpio) se presenta como una de las alternativas a utilizar en explotaciones piscícolas de agua fría, a pesar de esto es limitada la información acerca de los parámetros hematológicos que se puedan dar en condiciones medioambientales de embalse en un cultivo artesanal, por esto es importante dotar al veterinario con herramientas que le faciliten la identificación y control de diferentes patologías que afecten la línea blanca encargada de la inmunidad del animal. Este estudio se realizo en el municipio de Toca (Boyacá) en el Embalse La Copa, el cual posee un sistema extensivo de producción de la especie carpa coy (Cyprinus carpio), el embalse está ubicado a 2810 m.s.n.m y cuenta con una temperatura de 13 °C, donde se efectuó el análisis de datos leucocitarios a un número de 100 ejemplares en etapa adulta.

Los ejemplares fueron seleccionados en etapa adulta y no presentaron ninguna anormalidad física, las pruebas de sangre se recolectaron por medio de punción intracardiaca, procurando recolectar 2ml de sangre por animal, para un conteo de leucocitos se utilizo el reactivo de Natt Herrick para determinar el valor total de leucocitos por microlitro de sangre, posteriormente se hizo un frotis sanguíneo de Wright para el conteo y diferenciación de neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos, basofilos.

Los resultados obtenidos para el conteo total de leucocitos por microlitro de sangre es de 94250. Los resultados para conteo diferencial se obtuvieron valores para neutrofilos entre 6206,0 a 56550,0, linfocitos entre 1579,0 a 64800,0, monocitos entre 0,0 a 140,0, eosinofilos entre 0,0 a 142,5, basofilos entre 0,0 a 107,5. Los 10

resultados obtenidos presentaron similitud con los rangos reportados por otros autores en especies de agua frĂa y condiciones de altitud similares a las dadas en el Embalse La Copa.

PALABRAS CLAVE

Leucocito, HematologĂa, Carpa Coy, Embalse 11

ABSTRACT

The common carp (Cyprinus carpio) was first cultivated in ancient Chinese empire for four or five thousand years, settling in the XXI century in Europe. Currently in Colombia coy carp (Cyprinus carpio) is presented as one of the alternatives to use in cold water fish farms, although this is limited information on haematological parameters may occur in environmental conditions in a reservoirtraditional culture, so it is important to provide the veterinarian with tools to facilitate the identification and control of various diseases affecting the white line in charge of animal immunity. This study was conducted in the municipality of Toca (BoyacĂĄ) in the Reservoir Cup, which is located at 2810 m and has a temperature of 13 Â° C, which made data analysis a number of white blood cell 100 in step adult.

The specimens were selected in adulthood and showed no physical abnormality, blood tests were collected by intracardiac puncture, trying to collect 2 ml of blood per animal, for a total leukocyte count reagent was used to determine Natt Herricktotal value of leukocytes per microliter of blood, later became Wright's blood smear for counting and differentiation of neutrophils, lymphocytes, monocytes, eosinophils,

basophils.

The results obtained for total leukocyte count per microliter of blood is 94250. The results

for differential counts were

obtained for values between 6206.0

56550.0neutrophils, lymphocytes from 1579.0 to 64800.0, monocytes from 0.0 to 140.0,from 0.0

142.5 eosinophils,

basophils between 0.0

107.5. The

resultsobtained showed similarity with the ranges reported by other authors in cold water species and altitude conditions similar to those given in the Embalse La Copa.

Keywords Leukocytes, hematology, coy carp, reservoir 12

INTRODUCCIÓN

La carpa común Cyprinus carpio fue cultivada por primera vez en el antiguo imperio chino hace cuatro o cinco millares de años. Sin embargo, no fue hasta el siglo XI cuando la cría de la carpa se estableció en Europa, donde los monjes cultivaban los peces en sus estanques que también servían como reservas de agua de bebida para los animales de granja. Durante los siglos posteriores se establecieron importantes centros de cultivo de carpa en Silesia, Bohemia, Polonia, Babaría y zonas de Francia (Brown, 2000).

La carpa se ha venido posicionando en las explotaciones piscícolas como una de las mejores especies en rusticidad y alto rendimiento en canal, además de otras bondades como la precocidad, rápido crecimiento y adaptabilidad; en los países donde se ha establecido explotaciones a gran escala se han obtenido resultados que brindan mejores alternativas para el cultivo de peces de estanque, además de ganancias representativas al mercado piscícola.

Las producciones acuícolas dependen de diversos factores para alcanzar su máximo nivel productivo, entre esos factores se encuentra el manejo sanitario, entendido como la prevención de las principales enfermedades que afectan a la población. Estas se manifiestan en los peces con la aparición de lesiones y síntomas como cambios en el comportamiento lo que genera pérdidas productivas y a menudo la muerte de estos especímenes (Kinkelin, 1991).

Para realizar un diagnóstico sanguíneo eficaz, se deben determinar los valores normales de la sangre en las más diversas condiciones ecológicas con el fin de conocer la variabilidad de los mismos (Deufel & Pollnitz, 1977).

Antes de valorar las alteraciones de leucocitos en análisis de sangre es necesario tener en cuenta el recuento y análisis de las demás células leocucitarias y repetir el estudio sanguíneo a corto plazo. Estas alteraciones pueden ser de su forma y funcionamiento sobre todo en neutrofilos y linfocitos. También se producen en algunas infecciones, como la mononucleosis infecciosa, en reacciones ante algunos medicamentos, en anemias y neoplasias.

Cuando hay un aumento de los leucocitos se denomina leucocitosis, en esta pueden aumentar todos los tipos de glóbulos blancos y principalmente los neutrófilos y los linfocitos.

Según los autores Niraj K. Tripathi, Kenneth S. Latimer, Victoria V. Burnley encontrados en el libro Veterinary Clinical Pathology se reporta que para la especie Carpa coy (Cyprinus carpio) el recuento de leucocitos predomino los linfocitos (que representan hasta un 80% de todos los leucocitos), donde los eosinófilos son raros. La siguiente investigación se baso en uno de los primeros intentos para establecer valores hematológicos para la especie carpa coy (Cyprinus carpio) estudiando la línea blanca, denominada leucograma con el fin de establecer los valores leucocitarios estándar en esta especie en condiciones sanitarias normales para de esta forma llegar a un diagnóstico definitivo de algunas patologías que afecten esta línea celular y que atacan con frecuencia a la especie causando pérdidas económicas a los habitantes que dependen de una u otra forma de la extracción artesanal de esta especie a los alrededores del Embalse la copa.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El desconocimiento de los valores hematológicos en condiciones sanitarias normales ha disminuido la posibilidad de tener estudios más profundos sobre la especie Carpa coy (Cyprinus carpio) frenando así la divulgación e interés por querer promoverla por parte de los productores y trabajadores de las explotaciones piscícolas.

En los peces teleósteos es de relevancia tener en cuenta que el tejido hematopoyético se localiza en el intersticio, estroma esplénico y en poca cantidad en los espacio periportales hepáticos y submucosa intestinal como también en el peritone y en el timo, por lo tanto es de gran interés llegar a establecer los valores normales para esta especie haciendo un acercamiento a la línea blanca en este caso los leucocitos para la especie (Cyprinus carpio) en un sistema extensivo de producción en el departamento de Boyacá, que ha generado carencias a la hora de dar un diagnóstico acertado y rápido por parte del médico veterinario.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Establecer los valores normales del leucograma de la carpa coy (Cyprinus carpio) etapa adulta en el Embalse La Copa ubicada en el municipio de Toca (Boyacá).

. OBJETIVOS ESPECIFICOS  Determinar los valores normales de los

leucocitos para la especie

(Cyprinus carpio).  Establecer los porcentajes aproximados para el recuento diferencial de leucocitos en la especie carpa coy (Cyprinus carpio)  Describir la morfología de las células sanguíneas presentes en la Carpa Coy (Cyprinus carpio).

1. MARCOS DE REFERENCIA

1.1 Estado del Arte

La Ictiohematología es una herramienta de uso común con fines clínicos en peces de importancia económica, con un menor aporte en la comprensión de la fisiología del organismo en relación con su medio (Iannacone & Va, 2006).

Existen poca información sobre estudios hematológicos realizados en la especie Carpa coy (Cyprinus carpio) lo que dificulta avances en el estudio de la especie sin embargo se han realizado varios estudios hematológicos en especies con características similares, se encuentra un estudio en la paragua (Chaetodipterus faber) en el que se realizo el análisis hematológico dentro de las cuatro horas inmediatas a la toma de muestra sanguínea. El número de eritrocitos y leucocitos por milímetro cúbico se determinó en una cámara doble de Newbauer, usando la muestra sanguínea diluida (1:200) en la solución de Dacie para peces (Bastardo & Barberan, 2004).

Se realizó un estudio en el departamento de Córdoba donde solo fue posible examinar diez rubios juveniles (Salminus affinis) debido a la dificultad para capturar ejemplares de esta especie en la cuenca del río Sinú, los cuales presentaron valores promedio de 19,63±3,3 cm de longitud total y 117,5±38,6 g de peso. Los linfocitos representaron el mayor porcentaje del grupo de las células blancas (68,8 %); son células de tamaño y forma variables, observándose pequeñas, grandes, redondas y ligeramente redondas; citoplasma escaso agranular, frecuentemente irregular y basófilo. El área celular se estimó en 50,5 µm2. Los monocitos representaron el 2,1% de las células blancas, de mayor tamaño que los linfocitos, son células esféricas cuyo núcleo presenta forma variable entre redonda y ovalada y es frecuente observar una ligera invaginación 17

en forma de riñón; la cromatina se encontró un poco dispersa. (Atencio, Mendoza, & Carrasco, 2008). Otro estudio realizado en especies de caracteristicas y condiciones similares a la Carpa coy (Cyprinus carpio) es un proyecto de investigacion en trucha arco iris (O. mykiss) que se llevo cabo en la cuenca alta de la provincia del Napo en Ecuador que arrojo como resultado que esta especie muestra principalmente linfocitos pequeños, seguidos de linfocitos grandes. El porcentaje de linfocitos pequeños en el leucograma, manifiesta diferencias significativas. Dentro de los tipos leucocitarios determinados para la especie después de los linfocitos pequeños y grandes, se encuentran los monocitos, neutrófilos con valores mayores para reproductoras hembras (9,04 ± 1,36 % y 5,63 ± 1,12 % respectivamente). Seguido por los heterófilos con cifras mayores para reproductores machos (2,54 ± 0,68 %) y finalmente macrófagos con datos altos para reproductoras hembras (0,44 ± 0,25 %) (Buenaño, 2010).

También se encuentran estudios hematológicos realizados en Brycon amazonicus que arrojaron resultados para amazonicus obtenido entre (13.324 ± 7.677 l) fueron menores que para los jóvenes orbignyanus (23.290 ± 7.041 l). aunque se ha utilizado métodos similares para el recuento de glóbulos blancos, por lo tanto, esto indica una variación interespecífica. Las diferencias en el recuento de glóbulos blancos puede atribuirse a diversos factores, tanto bióticos (como la edad, la estación, la madurez, los agentes patógenos) y abióticos (incluyendo la temperatura, pH, contenido de oxígeno disuelto, el sexo o estado de madurez) y, en particular al estrés (Tavares, Alfonso, & Ragonha, 2008).

1.2 MARCO TEÓRICO

1.2.1 Origen de la Carpa coy (Cyprinus carpio)

La Carpa coy (Cyprinus carpio) es un pez de agua dulce. La carpa común es un pez nativo de Asia y se introdujo en casi todos los lugares del mundo. La carpa común fue encontrada en el Danubio hace aproximadamente 2000 años atrás. Era un espécimen con forma de torpedo y de color dorado y amarillo. Vivian en grandes piscinas romanas en el centro y sur de Europa. La carpa común está emparentada con la carpa dorada, con la cual puede incluso tener descendencia hibrida. En muchos lugares donde ha sido introducidas se considera una amenaza para el ecosistema debido a su predilección por el sustrato vegetal de los fondos poco profundos, que sirve de alimento a numerosas especies animales (Pasaku, 2011).

Hoy en día la carpa se cultiva en estanques en el lejano oriente aunque esta menos extendido que el cultivo de otros peces. El cultivo de la carpa es mucho más importante en Europa central y del Este (parte de Francia, Alemania central y del sur, Polonia, Hungría, Rusia, Ucrania, Rumania Y Croacia) y en oriente próximo (especialmente Israel y Egipto) y también en Norteamérica (Brown, 2000).

La mayor parte de la alimentación de las carpas se origina en el estanque, con un aporte suplementario de pienso artificial de acuerdo con la estación y las densidades de población. La mayoría de alimento (especialmente la proteína) está en forma de zooplancton o de animales bénticos como rotíferos, copépodos, tudifisidos y quironomidos, y la tasas de producción de estos nutrientes animales dependen de la productividad natural del suelo, la influencia de las condiciones atmosféricas (especialmente la luz solar) y el uso de fertilizantes para mejorar la producción primaria de zooplancton como alimento. Los aditivos, especialmente como suministro energético se administran comúnmente en forma de cereales que 19

aportan carbohidratos. Los piensos comerciales para optimizar la productividad se suministran principalmente en primavera y otoño (Brown, 2000).

Figura 1. Descripción de la Especie CARPA COY (Cyprinus carpio)

FUENTE: Infodepesca, 2011

Taxonomía:

Reino: Animalia Filo: Chordata Clase: Actinopterygii Orden: Cypriniformes Familia: Cyprinidae Superfamilia: Cyprinoidea Género: Cyprinus Especie: C. carpio (Bayon, 2008)

A. Características Fenotípicas y Ambientales

Como podemos observar en la figura 1. La carpa posee un cuerpo macizo, alargado, comprimido en los laterales y con grandes escamas que cubren todo su cuerpo.

Talla mínima: 18 cm.

Color: Su color es variable en función del lugar donde habite, aunque predomina el pardo verdoso con reflejos dorados y azulados. Su vientre es amarillento (Rodriguez, 2010).

Longitud y peso: La carpa puede alcanzar una longitud de casi 1 metro y un peso de hasta unos 30 kilos. Sin embargo, lo más frecuente es que mida alrededor de 70 cm y pese unos 5 kilos (Rodriguez, 2010).

Hábitat y biología: Es un pez de aguas templadas, alcanzando su madurez sexual entre los 18 meses y dos años de vida dependiendo de la temperatura de la región, es un desovador parcial, teniendo 2 o 3 desoves en intervalos de 14 días. Tiene una fecundidad relativa de 100.000 a 300.000 huevos por kilogramo de peso, teniéndose reportes de hembras con una fecundidad de 400.000 a 600.000 huevos por individuo (Rodriguez, 2010).

Alimentación: Es un pez omnívoro, con predominancia bentófago. Por su forma de alimentación, basada en la remoción de sedimentos, incrementa la turbidez en el medio, pudiendo causar serios problemas en el sistema. 21

1.2.2 Tejido Hematopoyético

A. El Timo Es un órgano par, homogéneo, representado por unas delgadas láminas ovales de tejido linfoide, dispuesto subcutáneamente en la comisura dorsal del opérculo, revestido por tejido mucoso del epitelio faríngeo. No existe una división clara entre región medular y cortical, y la cápsula epitelial ejerce un importante papel en la relación del órgano con el medio externo, aunque dependiendo de la edad. En alevines muy jóvenes, esta cápsula se compone únicamente de una capa de células que aísla a los timocitos del agua, sin embargo, en ella aparecen fenestraciones o poros que sugieren que puede haber contacto directo entre el antígeno externo y el órgano, y que están presentes hasta que el animal es adulto. Cuando alcanzan la madurez, las perforaciones desaparecen y se observa un mayor número de células mucosas (Fernandez & Ruiz, 2002).

nivel

estructural,

compone

mayoritariamente

células

linfoides,

principalmente timocitos, en distintos estados de maduración, dispuestos en una red formada por células epitelio-reticulares. También pueden encontrarse células mioides, células del tipo de los macrófagos y células granulares eosinofílicas. En ocasiones pueden aparecer nidos focales epiteliales, conocidos como corpúsculos de Hassal (Fernandez & Ruiz, 2002).

B. El Riñón El riñón aparece como una hoja de tejido en posición dorsal, unida a las paredes de la cavidad general del cuerpo del pez mediante el mesotelio y parte de tejido conectivo.

Macroscópicamente

órgano

homogéneo,

pero

puede

diferenciarse un segmento anterior o riñón craneal, derivado del pronefros y constituido fundamentalmente por tejido linfo-hematopoyético, y un segmento medio y/o posterior o riñón troncal derivado del mesonefros, en el que el tejido

hematopoyético forma una matriz entre las nefronas y estructuras del sistema excretor (Fernandez & Ruiz, 2002).

Estructuralmente, el riñón anterior se compone de una red de fibras reticulares que proporcionan soporte para el tejido linfo-hematopoyético, que se encuentra disperso entre un sistema de sinusoides revestido por células reticuloepiteliales. Aparecen como células principales un gran número de macrófagos, CMMs, y células linfoides en todos sus estadios evolutivos, mayoritariamente células Ig+ (linfocitos B). Las células reticulares juegan un papel importante proporcionando las interacciones necesarias para el funcionamiento de las células linfoides y las células endoteliales de los sinusoides suponen el principal sistema de filtrado de la sangre gracias a su capacidad de endocitosis (Fernandez & Ruiz, 2002).

C. El Bazo Es un órgano abdominal, que suele ser único, aunque en ocasiones pueden encontrarse dos o más bazos menores. Está bien definido por una cápsula fibrosa, pero no presenta ni trabéculas ni una clara diferenciación entre pulpa blanca y pulpa roja, característico del bazo de los mamíferos. Está compuesto por un sistema de elipsoides esplénicos, CMMs y tejido linfoide que en la mayoría de las especies aparece organizado formando acúmulos alrededor de los otros dos componentes (Fernandez & Ruiz, 2002).

Los elipsoides son capilares de paredes gruesas que se abren en la pulpa y que resultan de la división de las arteriolas esplénicas. En sus paredes aparecen macrófagos que participan activamente en la fagocitosis de antígenos, generalmente bajo la forma de complejos antígeno-anticuerpo o de productos metabólicos, material que puede ser retenido largos periodos de tiempo y jugar un papel importante en el fenómeno de memoria inmune (Fernandez & Ruiz, 2002).

1.2.3 Leucocitos

De los tres grupos principales de células observadas en la sangre observada en los peces, los leucocitos son el grupo más diverso en cuanto a morfología (Stoskopf, 1993).

Los leucocitos son las células involucradas en el sistema inmune, pueden encontrarse en la sangre circulante o en tejidos y en ocasiones pueden formar parte

complejos

celulares,

los

cuales

denominan

centros

melanomacrofagos. La clasificación de los leucocitos de peces, como en todos los vertebrados, se ha realizado por criterios morfológicos según los cuales se distinguen varios tipos: Linfocitos, Monocitos, Granulocitos (Ellis, 1988).

A. Linfocitos Los leucocitos (glóbulos blancos) en la sangre de todos los animales son una de las primeras líneas de defensa de los animales de la innata (no específicos) del sistema inmune. Ellos buscan y destruyen las partículas extrañas y patógenos, y claro el cuerpo de los desechos de los residuos del metabolismo normal y la cicatrización de heridas. En todos los animales que hay 5 diferentes tipos de leucocitos, que cada uno realiza tareas diferentes en el sistema inmune, pero todos los que trabajan en concierto.

Estos son los linfocitos, neutrófilos,

eosinófilos, basófilos y monocitos. En los reptiles y las aves, los neutrófilos se sustituyen por heterófilos, que realizan la misma función (Davis, 2009).

Morfológicamente son descritos por varios autores, quienes coinciden en señalar que en general, los linfocitos maduros son mayoritarios y son células de borde irregular, cuyo interior está casi ocupado en su totalidad por un núcleo con la cromatina muy agrupada y el citoplasma se dispone como un fino anillo basofilo alrededor del núcleo, en el se encuentra mitocondrias, retículo endoplasmatico liso

y rugoso, ribosomas y aparato de golgi lo cual demuestra que son células de alto potencial metabólico (Ellis, 1988).

Los linfocitos presentan linfocitopenia y linfocitosis, la primera presenta una disminución en el número de linfocitos en inmunodeficiencias y la segunda aumento del número de linfocitos presente en la fase de recuperación de infecciones bacterianas y en las infecciones víricas.

B. Monocitos El monocito es un leucocito del tipo agranulocito. Entre otros aspectos se caracteriza por tener un núcleo arriñonado. Representa del 2 al 9% del total de los leucocitos circulantes por los vasos sanguíneos. Puede pasar a los tejidos donde se convierte en macrófago. Además de llevar a cabo la fagocitosis puede actuar como célula presentadora

antígenos

(FIBAO,

2008).

El monocito es un leucocito del tipo agranulocito. Se caracteriza por presentar un núcleo en forma de riñón y expresar el antígeno CD14. Circulan por la sangre aproximadamente de 1-3 días, tras los cuales pasan a los tejidos en un proceso conocido como extravasación. La extravasación ocurre gracias a la capacidad de los monocitos de reconocer a las células endoteliales y unirse a ellas. La unión se produce gracias a las moléculas de adhesión ICAM-1 expresadas en las células endoteliales y las LFA-1 presentes en los monocitos. Una vez están en los tejidos los monocitos se convierten en macrófagos para llevar a cabo la función de fagocitosis y la

presentación

antigénica

(FIBAO,

2008).

El monocito lleva a cabo la función de fagocitosis de partículas rodeadas de IgG y de factores del complemento (FIBAO, 2008).

Los monocitos presentan monocitopenia en el cual se ve una disminución del número de monocitos presente en leucemias y otras alteraciones y los monocitosis aumento del número de monocitos presentes en algunas infecciones.

C. Neutrofilos Estas células, denominadas también heterófilos, polimorfonucleares (PMNs) o simplemente granulocitos, se caracterizan morfológicamente por un núcleo excéntrico multilobulado (dos o tres lóbulos), con la cromatina densa y agrupada que se tiñe púrpura oscuro con tinción de Giemsa o Wright, y por la presencia de un gran citoplasma pálido en el que se distinguen gránulos que varían desde el gris, al rosa pálido. Los gránulos son de forma redonda u ovalada, variables de tamaño y electrónicamente densos. Su tamaño es mayor que el de los linfocitos y el de los eritrocitos (Blaxhall & Daisley, 1997).

Aunque el grado de polimorfismo nuclear es variable, se asemejan a los neutrófilos de mamíferos por su morfología y por sus características histoquímicas, presentando tinción positiva por reacción al ácido periódico de Schiff (PAS) y sudán negro B, así como reacción positiva a las pruebas de benzidina-peroxidasa, fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina. Recientemente se han encontrado anticuerpos monoclonales específicos para este tipo celular, que permiten identificarlos y realizar estudios con las distintas poblaciones leucocitarias (Blaxhall & Daisley, 1997). En los neutrofilos encontramos la neutropenia que es la disminución en el número de neutrofilos causada por algunas anemias e infecciones víricas, la neutrofilia consiste en el aumento del número de neutrofilos y son causadas por infecciones bacterianas.

D. Eosinofilos Se han descrito como células redondas que presentan un núcleo a menudo bilobulado y excéntrico, y un citoplasma azul pálido con gránulos de forma alargada o esférica, que se tiñen con colorantes ácidos en medio alcalino. Se han denominado a todos los eosinófilos de teleósteos como HGEs (eosinófilos granulares homogéneos, del inglés Homogeneous Granule Eosinophils). Esta morfología coincide con la de los eosinófilos de mamíferos, pero sin embargo, no ha podido demostrarse una analogía similar respecto a sus funciones (Hine, 1992).

Aunque no existen dudas de su presencia en sangre de ciprínidos y peces cartilaginosos, en los que se encuentran distintos tipos, en salmónidos se han descrito como células de rara aparición o ausentes en sangre (Hine, 1992). En los eosinofilos se presentan la eosinopenia por la disminución en el numero de eosinofilos se da en la fase de lucha contra las infecciones y la eosinofilia presenta aumento en el numero de eosinofilos en iinfecciones agudas y fase de recuperación, parasitosis, hipersensibilidad.

E. Basofilos Se describen como células con citoplasma ligeramente basófilo y grandes gránulos redondeados que a menudo ocultan el núcleo y que recuerdan a los basófilos y mastocitos de mamíferos. Sin embargo, se conoce muy poco de ellos y según estudios ultraestructurales y citoquímicos se pueden confundir con eosinófilos y no se pueden hacer analogías con las células de mamíferos. Se les considera ausentes en la circulación de la mayoría de especies salmónidas (Ellis, 1988).

Los basófilos presentan la basopenia que consiste en la disminución del número de basófilos, presente en algunas infecciones y la basofilia aumento en el numero de basófilos presentes en infecciones viricas.

1.2.4 Variación de los Leucocitos

A. Estrés en los peces

El estrés es una respuesta fisiológica del pez compleja a su condición ambiental.

Sus

efectos

directos

indirectos

atacan

pez.

Los factores causales de una respuesta aguda al estrés (de corta duración) forman parte de las actividades diarias o rutinarias tales como el inventario de la población, la limpieza de los estanques, el transporte y la administración de productos químicos utilizados en procesos infecciosos. Los factores comunes de una respuesta crónica al estrés (de larga duración) son la densidad de la población y la calidad de agua (Niño, 2008).

El principal signo clínico en una respuesta aguda al estrés es la hiperactividad. Fisiológicamente existen muchas alteraciones. Las principales son : la rápida pérdida intrarrenal del ácido ascórbico, el incremento del cortisol circulatorio, el paro de la actividad renal e intestinal, la hemoconcentración, la leucocitosis y un incremento de amoniaco en la sangre. Esta respuesta es una reacción de alarma. Al quitar del sistema al causante del estrés, las actividades fisiológicas regresan a su estado original (Niño, 2008).

Un estrés aumentado reduce la capacidad del pez para protegerse de enfermedades y de curarse el mismo. Además, el estrés reduce la capacidad de los peces de criar con éxito y acorta su esperanza de vida natural. Un poco de estrés por si solo no suele ser fatal, pero a medida que el estrés aumenta su 28

capacidad para resistirlo disminuye. Por ello, uno de los principales objetivos de un acuario filo es la de eliminar las fuentes de estrés siempre que sea posible (Patak).

1.2.5 Métodos para el Conteo de Leucocitos  Colorante de WRIGHT El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamaño de los leucocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloración. La información obtenida de un frotis de sangre periférica depende en gran parte de la calidad del extendido y la coloración (Zambrano & Cortijo, 2005).

Materiales Colorante de Wright Frasco gotero. Solución amortiguada tamponada

Procedimiento Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20m i n u t o s . Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante de Wright, dejándolo por espacio de 5 minutos. Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada en partes iguales hasta obtener un brillo metálico, dejando 6 minutos adicionales. Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar. Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad de la coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge el sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se enfoca a un aumento de 100x, la forma de

los glóbulos blancos se examinará detenidamente observ a n d o a d e m á s d e l c o l o r ( c a n t i d a d d e h e m o g l o b i n a ) (Zambrano & Cortijo, 2005).  Reactivo de Natt Herrick Se trata de un método directo. El violeta de metilo 2B tiñe todas las células con diferentes tonos de azul.

Es necesario utilizar una Camara de Neubauer modificada y una pipeta hemacitométrica de bola roja.

Aspirar sangre hasta la marca 0.5 y limpiar la parte exterior de la pipeta Aspirar solución de Natt y Herrick hasta la marca 101 (Dilución 1 : 200) Mezclar durante 1-2 minutos. Desechar las primeras gotas, llenar la cámara de recuento y esperar 3 minutos, contar el número total de leucocitos en los nueve cuadros grandes de un lado de la cámara y aplicar la fórmula: Recuento Total de Leucocitos (células/ul) = Leucocitos contados x 1.1x 200. Los leucocitos se tiñen de color azul oscuro (Lopez, 2006 ).  Coloracion de May-Grünwald-Giemsa El frotis, una vez seco, se fija y se tiñe mediante colorantes adecuados. Generalmente, en los laboratorios hematológicos se emplean colorantes basados en la tinción de Romanowsky, basado en una combinación de eosina y azul de metileno.

1. Secar el frotis. 2. Fijar en solución de May-Grünwald (1 volumen de colorante y 1 volumen de PBS) durante 2 minutos. 3. Sumergir en solución de Giemsa durante 15-20 minutos. 4. Lavar en abundante agua y dejar secar. 30

Colorante May-Grünwald contiene: 0,3 g de polvo de May-Grünwald + 100 mL de acohol metílico absoluto calentado a 56 grados hasta la disolución completa del colorante, dejar enfriar a 4 grados durante 24 horas (agitación intermitente). Filtrar antes de su empleo.

1.2.6 Mecanismos de Defensa

Los peces tienes tres métodos para resistir el proceso infeccioso. La habilidad para poner en acción estos mecanismos depende de la salud del pez y de los efectos del estrés en su sistema (Estevez, 1990).

A. Barreras Protectores en la Piel La piel es la primera barrera de protección del pez frente al medio acuático. Esta es húmeda y tiene en la epidermis glándulas mucosas que a través de la secreción de mucus lubrican la piel y la protegen de agentes externos nocivos. El mucus puede aumentar por agentes irritantes, parásitos y bacterias y, por otra parte, le permite al pez desplazarse mejor (Mancini, 2002).

También se encuentran en la piel una cubierta de escamas que protegen al cuerpo y una serie de pigmentos y células sensitivas de la línea lateral. Las escamas se forman a medida que crecen los peces, comenzando aproximadamente a desarrollarse desde los tres centímetros de longitud a partir de la dermis. Las escamas tienen cuatro campos: anterior, posterior y dos laterales; solo el posterior es visible; es resto está cubierto por la dermis. Los pigmentos son sustancias químicas producidas en su mayoría por el pez. Se alojan en células especializadas llamadas cromatóforos o están impregnados en los tejidos (Mancini, 2002).

B. Reacción Inmune Esta reacción se inicia después de la introducción he invasión del patógeno dentro del organismo del pez. Cuando este penetra, el sistema del animal lo reconoce 31

como una sustancia extraña (antígeno) y reacciona simultáneamente para expulsarlo, produciendo los anticuerpos (Estevez, 1990).

La inmunidad la podemos clasificar en:  Inmunidad natural: Es la resistencia a una enfermedad específica sin haber tomado contacto previamente con el agente causal. Esta inmunidad natural está determinada por la herencia, edad, sexo, nutrición e influencias ambientales (Petracini, 2010).  Inmunidad adquirida natural: Es la que el individuo adquiere por haber tomado contacto con el agente causal. Cuando esto ocurre, algunos linfocitos B se transforman en células plasmáticas que sintetizan

las moléculas de anticuerpos y otros

permanecen circulando en el organismo como células memoria de modo que ante una nueva invasión del mismo antígeno, la respuesta sea más rápida y efectiva (a esto se denomina inmunidad humoral) (Petracini, 2010).  Inmunidad adquirida artificial: Se puede adquirir inmunidad mediante la introducción de antígenos atenuados en el organismo. Esto es lo que conocemos como vacuna. Los antígenos atenuados (y en algunos casos muertos) son poco patógenos pero tienen la capacidad de generar los correspondientes anticuerpos. De ese modo se toman bacterias, parásitos u otros microorganismos, se los somete a tratamientos físicos, químicos y luego de muertos o atenuados en su actividad patógena, se los introduce en el organismo para fomentar la creación

anticuerpos.

este

modo,

cuando

los

mismos

microorganismos, pero en su forma patógena, se introduzcan al cuerpo del

pez, los linfocitos B transformados en células memoria, tienen la capacidad de reaccionar en forma específica (Petracini, 2010).  Inflamación Es una reacción fisiológica que ocurre en el sitio de la infección la cual trata de prevenir el desarrollo del patógeno dentro del pez y el daño a los tejidos circundantes. Se caracteriza por hinchazón, color rojizo y fiebre en el área afectada (Estevez, 1990).

Los leucocitos o glóbulos blancos son células que están principalmente en la sangre y circulan por ella con la función de combatir las infecciones o cuerpos extraños; pero en ocasiones pueden atacar los tejidos normales del propio cuerpo. Es una parte de las defensas inmunitarias (Petracini, 2010). Se llaman glóbulos blancos, ya que éste color es el de su aspecto al microscopio. Hay diferentes grupos de glóbulos blancos:  Polimorfonucleares: neutrófilos, eosinófilos y los basófilos  Mononucleares los linfocitos y los monocitos El origen de todas las formas de leucocitos es a partir de células madres de la médula ósea La modificación de la cantidad de leucocitos puede orientar al diagnóstico de enfermedades infecciosas, inflamatorias, cáncer y leucemias, y otros procesos. Por ello el recuento es muy orientativo en diferentes enfermedades. Además el porcentaje de cada grupo de leucocitos nos ofrecerá una mayor información para precisar un diagnóstico (Petracini, 2010).

1.3 MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

El municipio de Toca está ubicada a 2810 m.s.n.m, con una temperatura de 13 °C y su extensión es de 165 km2, situado en la zona oriental de la Provincia Centro en el departamento de Boyacá, sobre la cordillera oriental que en su zona se conforma por sistemas montañosos como el paramo de la cortadera, paramo santo Ecce Homo, los altos de Leonera, Ratiba y el Cangrejo; “estos simulan una especie de copa”. (Toca la Espiga de Oro de Colombia)

Toca cuenta con 6 veredas entre las cuales se destacan: Centro, Cunuca, La Chorrera, La Leonera, Raiba y San Francisco. Por el occidente Toca limita con los municipios de Oicata y Chivata, por el sur con Siachoque, por el norte con Tuta y por el oriente con la provincia de Sugamuxi.

Se observa el Río Cormechoque figura 2. Los principales ríos son: El San Francisco, que nace en el "Pantano Colorado", del municipio de Siachoque y El Toca, que nace en el cerro de "Tibamoa". A estos ríos llevan sus aguas los arroyos La Chorrera, que nace en el Cerro de Pesca; La de Tuaneca, que nace en el cerro de Tibamoa. una vez reunidos todos toman la dirección del norte hasta confundirse con las cabeceras del río que desciende de Tunja, llamado "Río Sogamoso" y más adelante Chicamocha (S.N, 2011).

Figura 2. SITIOS DE MUESTREO EN EL EMBALSE LA COPA

1 3 4

2 1

1 Ubicación de los puntos de muestreo en el Río Cormechoque y el Embalse la Copa. 1. Río Cormechoque 2. Zona riverina (Cola) 3 y 4. Zona de transición (Transición 2 y Transición 1) 5. Zona lacustre o de presa (Muro).

FUENTE: Aquatic Experts, 2011

Figura 3. Mapa de la Provincia Centro de Boyacá, principales embalses

FUENTE: Sitio Oficial de Toca en Boyaca, 2009

1.4 MARCO SOCIAL

Se puede observar en la figura 3. Que Toca es un municipio con una población que cuenta con 12.200 habitantes según censo de 2007, posee unos suelos fértiles y privilegiados, apto para múltiples labores agropecuarias (Toca la Espiga de Oro de Colombia).

Las actividades generadoras de empleo en el área son: la agricultura, la ganadería y la producción de carne y leche, estas actividades se realizan por que las condiciones y características del municipio lo permiten. En los sectores centro y aledaños a la represa se dedican en su mayoría a la agricultura al igual que a la producción y comercialización de peces. A nivel industrial se cultivan flores en vivero, la cual genera un buen nivel de empleo en ingresos para las familias de la localidad (Toca la Espiga de Oro de Colombia). 36

1.5 MARCO LEGAL

ESTATUTO NACIONAL DE PROTECCIÓN ANIMAL Ley 84 de 1989 – Colombia Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales y se crean unas contravenciones y se regula lo referente a su procedimiento y competencia.

EL CONGRESO DE COLOMBIA DECRETA:

CAPÍTULO I

Artículo 1: A partir de la promulgación de la presente Ley, los animales tendrán en todo el Territorio Nacional especial protección contra el sufrimiento y dolor, causados directa o indirectamente por el hombre.

Parágrafo: La expresión "animal" utilizada genéricamente en este Estatuto, comprende los silvestres, bravíos o salvajes, y los domésticos o domesticados, cualquiera sea el medio donde se encuentren o vivan en libertad o en cautividad.

Artículo 2: Las disposiciones de la presente Ley tienen por objeto: • Prevenir y tratar el dolor y sufrimiento de los animales. • Promover la salud y el bienestar de los animales, asegurándoles higiene, sanidad y condiciones apropiadas de existencia. 37

• Erradicar y sancionar el maltrato y los actos de crueldad para con los animales. • Desarrollar programas educativos a través de medios de comunicación del Estado y de los establecimientos de educación oficiales y privados que promuevan el respecto y cuidado de los animales. • Desarrollar medidas efectivas para la preservación de la fauna silvestre.

CAPÍTULO VI

DEL USO DE ANIMALES VIVOS EN EXPERIMENTOS O INVESTIGACIÓN

Artículo 23: Los experimentos que se lleven a cabo con animales vivos, se realizarán únicamente con autorización del Ministerio de Salud Pública y sólo cuando tales actos sean imprescindibles para el estudio y avance de la ciencia y siempre y cuando esté demostrado: •

Que

los

resultados

experimentales

pueden

obtenerse

por otros

procedimientos o alternativas; • Que las experiencias son necesarias para el control, prevención, el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades que afecten al hombre o al animal; • Que los experimentos no puedan ser sustituidos por cultivo de tejidos, modos computarizados, dibujos, películas, fotografías, video u otros procedimientos análogos.

Artículo 24: 38

El animal usado en cualquier experimento deberá ser puesto bajo los efectos de anestesia lo suficientemente fuerte para evitar que sufra dolor. Si sus heridas son de consideración o implican mutilación grave, serán sacrificados inmediatamente al término del experimento.

Artículo 25: Se prohíbe realizar experimentos con animales vivos, como medio de ilustración de conferencias en facultades de medicina, veterinaria, zootecnia, hospitales o laboratorios o en cualquier otro sitio dedicado al aprendizaje, o con el propósito de obtener destreza manual. Los experimentos de investigación se llevarán a cabo únicamente en los laboratorios autorizados previamente por las autoridades del Ministerio de Salud Pública y el Decreto 1608 de 1978 en lo pertinente.

También se prohíbe el uso de animales vivos en los siguientes casos expresamente: • Cuando los resultados del experimento son conocidos con anterioridad. • Cuando el experimento no tiene un fin científico y especialmente cuando está orientado hacia una actividad comercial. • Realizar experimentos con animales vivos de grado superior en la escala zoológica al indispensable, según la naturaleza de la experiencia.

2. METODOLOGIA

2.1 TIPO DE ESTUDIO

En este caso el estudio es de tipo descriptivo con el fin de obtener la información de carácter cuantitativo y cualitativo del leucograma en la carpa coy (Cyprinus carpio) y así poder determinar las características morfológicas de los leucocitos en animales sanos.

2.2 LUGAR Y CARACTERÍSTICAS DEL SITIO DE ESTUDIO

Este proyecto se realizo en el municipio de Toca Boyacá Embalse La Copa Foto 1. Ubicada en la vereda centro abajo que cuenta con una extensión aproximada de 880 hectáreas y profundidades hasta de 60 metros aproximadamente lo cual hace que se pueda encontrar gran población de la especie Carpa coy (Cyprinus carpio) este embalse cuenta con una temperatura promedio de 9-11° Centigrados. Este embalse es un lugar ideal para practicar pesca deportiva, además que se destina a programas de riego del Valle de Duitama y Sogamoso.

Foto 1. Embalse La Copa

Fuente: Autor 40

2.3 CARACTERÍSTICAS DE LOS ANIMALES MUESTREALES

En este proyecto se tomaron animales en la última etapa de su desarrollo entre 400 y 500 gr próximo a su sacrificio, se realizo el muestreo a un total de 100 animales

aparentemente sanos,

teniendo

en cuenta que no presenten

alteraciones en su conformación o algún tipo de patología aparente.

A. Determinación de la Muestra

Para la determinación de la muestra se utilizo el programa epidemiológico WIN EPISCOPE 2.0 con un nivel confianza del 95%.

B. Diseño Metodológico

En este proyecto se tendrán en cuenta animales en la última etapa de su desarrollo ya próximo para su sacrificio, se tomaron muestras en 100 animales aparentemente sanos, teniendo en cuenta que no presenten alteraciones de comportamiento o algún tipo de patología aparente, posteriormente se realizo las pruebas de campo en el embalse la copa en el municipio de Toca (Boyacá) donde se tomaron el numero de muestras necesarias, estas pruebas hematológicas se trasportaron al laboratorio en termos de refrigeración para la conservación de las muestras a la ciudad de Tunja para el estudio correspondiente.

Las pruebas sanguíneas se recolectaron por medio de punción intracardiaca, procurando recolectar 2ml aproximadamente de sangre por animal, para realizar el conteo total de leucocitos fue necesario utilizar el reactivo de Natt Herrick para determinar el valor total de leucocitos por microlitro de sangre, se realizo un frotis sanguíneo con tinción de Wright para el conteo y diferenciación de neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos, basofilos.

C. Toma de muestras

Se capturaron los animales con atarraya, se llevan a recipientes plásticos donde depositamos diez carpas en cada uno, como se puede observar en la foto 2. Introducimos hielo para la tranquilizacion y manipulación de los peces. Se ubica una de las Carpas en un recipiente a parte de tal manera que la cabeza quede hacia abajo. La punción se hace de manera intracardiaca según Nicolas Jaramillo (2005) para peces teleostos, en medio de las dos aletas ubicadas en la parte lateral del cuerpo del animal. La aguja debe ser introducida en ángulo de 10 a 20 grados como se ve en la foto 3. Recolectando la sangre necesaria llevándola en el menor tiempo posible a un tubo tapa lila con anticoagulante EDTA, esto se logro mediante un tubo de sistema de vacio con anticoagulante como es el sistema vacutainer ideal para evitar la hemolisis, se homogeniza la sangre con el anticoagulante agitándola suavemente, una vez recolectadas las muestras son transportadas en una nevera de icopor con gel refrigerante hasta su llegada al laboratorio para el estudio correspondiente

Foto 2. Carpa coy (Cyprinus carpio)

Fuente: Autor 42

Foto 3. Toma de Muestras

Fuente: Autor

2.4 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

A. Frotis Sanguíneo

Se coloca una gota de sangre anticuagulada con la ayuda de una micropipeta en una lámina que debe ser preferiblemente nueva o en su defecto laminas completamente desengrasadas y con una lamina (Extensora) en una ángulo de 30 a 45° de forma tal que la sangre se extienda por capilaridad a lo largo del ángulo agudo formado por dos laminas y se deja secar de 15 a 20 minutos aproximadamente.

B. Recuento Diferencial de Leucocitos

Para lograr este recuento fue necesario aplicar de 5-10 gotas de coloración de Wright Foto 5. y dejándola secar por 10 minutos, luego se agrego una solución tampón (Agua destilada) dejando secar por 5 minutos, se lavo la lamina con 43

abundante agua dejándola secar, se coloco la lamina al microscopio óptico para empezar el conteo leucocitario.

C. Recuento Total de Leucocitos

Para el recuento se utilizo una pipeta para glóbulos blancos tomando 0.5 ml de sangre anticuagulada, depositándolo en un tubo de ensayo suavemente, posteriormente colocamos solución de Natt Henrrick llegando a la marca de 201 en una dilución 1:200 se mezcla por homogéneamente por 3 minutos.

Una vez montada la cámara Newbauer en la foto 4. Se cargo con la dilución (sangre y solución Natt Henrrick) esperando que la solución se decante, se realiza el conteo con la ayuda del microscopio óptico tomando los cuadros de las cuatro esquinas de la cámara de Newbauer.

El número total de los leucocitos se determina empleando la siguiente formula C1+C2+C3+C4*250 = N° Leucocitos/mm3

Donde C1, C2, C3, C4 equivalen al número de cuadros observados en la cámara de Neubauer y el 250 perteneciente a la constante obtenida por la dilución y características de la cámara.

Foto 4.Montaje C谩mara de Newbauer

Fuente: Autor

Foto 5. Soluci贸n de Natt Herrick

Fuente: Autor 45

Foto 6. Camara de Newbawer

Fuente: Autor

C. Análisis de Datos

Para el procesamiento de datos recolectados en la población a estudiar

del

Embalse La Copa se uso el programa de Microsoft office Excel 2007, posteriormente se analizaron y determinaron los valores normales del leucograma en la especia Carpa coy (Cyprinus Carpio) se ingresaron los datos a el programa estadístico SPSS 2.0, donde se realizaron pruebas de normalidad y uniformidad para los distintos parámetros.

3. RESULTADOS Y ANALISIS

A. Niveles de Leucocitos

Gráfica 1. Niveles conteo total de leucocitos

En la gráfica 1. Se muestra los Niveles de leucocitos en 100 muestras para cada una de

las cuatro cámaras, 13 de las muestras tienen valores de leucocitos

distantes numéricamente del resto de los datos.

Así que estas serán descartadas del estudio; ya que las estadísticas derivadas del conjunto de datos que incluyen valores atípicos serán engañosas.

Gráfica 2. Niveles de leucocitos

En la gráfica 2 se muestra los niveles de leucocitos en las 4 Cámaras siendo eliminados los 13 datos atípicos.

B. Estadística Descriptiva para la Totalidad de leucocitos en las Camaras de Newbauer

Tabla 1.Estadística descriptiva de leucocitos cámara 1 C1 Media

13,862069

Mediana

Moda

Desviación estándar

5,47546836

Varianza de la muestra

29,9807538

Mínimo

Máximo

Suma

1206

Muestra

En la Tabla 1. Se muestran las 87 de las 100 muestras procesadas en el laboratorio, se establecen los siguientes valores estadísticos; que para la media es de 13,862069, mediana 12, moda 12, desviación estándar 5,47546836, varianza 29,9807538, mínimo 5 y máximo 1206.

Tabla 2 Estadística descriptiva de leucocitos cámara 2 C2 Media

14,5517241

Mediana

Moda

Desviación estándar

5,11440879

Varianza de la muestra

26,1571772

Mínimo

Máximo

Suma

1266

Muestra

En la Tabla 2. Se muestran las 87 de las 100 muestras procesadas en el laboratorio, se establecen los siguientes valores estadísticos; que para la media es de 14,5517241, mediana 14, moda 14, desviación estándar 5,11440879, varianza 26,1571772, mínimo 6 y máximo 28.

Tabla 3. Estadística descriptiva de leucocitos cámara 3

C3 Media

14,2528736

Mediana

Moda

Desviación estándar

5,04680048

Varianza de la muestra

25,4701951

Mínimo

Máximo

Suma

1240

Muestra

En la Tabla 3. Se muestran las 87 de las 100 muestras procesadas en el laboratorio, se establecen los siguientes valores estadísticos; que para la media es de 14,5517241, mediana 14, moda 14, desviación estándar 5,04680048, varianza 25,4701951, mínimo 7 y máximo 27.

Tabla 4. Estadística descriptiva de leucocitos cámara 4

C4 Media

14,2758621

Mediana

Moda

Desviación estándar

4,68964633

Varianza de la muestra

21,9927827

Mínimo

Máximo

Suma

1242

Muestra

En la Tabla 4. Se muestran las 87 de las 100 muestras procesadas en el laboratorio, se establecen los siguientes valores estadísticos; que para la media es de 14,2758621, mediana 15, moda 15, desviación estándar 4,68964633, varianza 21,9927827, mínimo 6 y máximo 25.

Tabla 5. Estadística descriptiva de leucocitos cámara TOTAL Media

14235,6322

Mediana

13750

Moda

10750

Desviación estándar

4814,03537

Varianza de la muestra

23174936,5

Mínimo

6500

Máximo

26250

Suma

1238500

Muestra

En las tablas 1, 2, 3 ,4 y total se encuentra la estadística descriptiva de las 87 muestras de 100, como podemos observar entre los niveles promedio de leucocitos y su variabilidad de las cuatro cámaras la diferencia es mínima.

TABLA 6. CONTRASTE DE AJUSTE A UNA DISTRIBUCIÓN NORMAL PROCEDIMIENTO PRUEBA DE KOLMOGOROV-SMIRNOV

Prueba de Kolmogorov-Smirnov C1

TOTAL

Media

13,8

14,5

14,25

14,2

14235,6

Desviación típica

5,47

5,11

5,04

4,69

4814,03

Z de Kolmogorov-Smirnov

1,29

1,19

1,01

,99

,900

Sig. asintót. (bilateral)

,070

,11

,25

,27

,392

Numero de Muestras

Parámetros normales

En la tabla se observa que el valor de Sig. asintót. (bilateral) es menor a 0,01; luego hay normalidad en las 4 cámaras en C1, C2, C3, C4 y el Total.

Utilizando las técnicas de análisis exploratorio gráfico y formal con SPSS 17. Esta prueba de bondad y ajuste contrasta si las observaciones podrían razonablemente proceder de una distribución normal

Grafico 3. Grafico de normalidad

Como podemos observar en el gráfico 3. Se muestra un ajuste correcto de los datos a una distribución normal.

Tabla 7. Porcentaje del recuento total de leucositos NIVELES DE LEUCOCITOS CARPA COY %

Número

Neutrofilos

21,7545418

269430

Bandas

0,00726686

Eosinofilos

0,72991522

9040

Basofilos

1,78724263

22135

Linfocitos

74,7884538

926255

Monocitos

0,93257973

11550

100

1238500

TOTAL

En la tabla 7. Muestra

que los linfocitos representan un 74%, un 21% de

neutrรณfilos y en menor porcentaje los monocitos, Basofilos, eosinofilos y bandas.

Grรกfico 4. Porcentaje total de leucocitos

En el grafico 4. Encontramos el porcentaje total para leucocitos en 87 muestras รณptimas.

Intervalo de confianza para la media poblacional de los niveles de leucocitos

Para este caso como desconocemos la desviaciรณn estรกndar poblacional; pero conocemos la muestra utilizaremos T- student, para estima un intervalo de confianza para la media poblacional

Intervalo de confianza para la media poblacional de niveles de leucocitos

Es decir que con una confianza del 95% que la media poblacional de los niveles de leucocitos se encuentran entre 13058,1987 y 15413,0657 respectivamente.

MORFOLOGIA DE LOS LEUCOCITOS

Foto 7. Neutrofilo de carpa coy (Cyprinus carpio) en una vista de 100X

FUENTE: AUTOR

Como se observa en la foto 7. El neutrofilo presenta un núcleo exentrico multilobulado y con cromatina densa y agrupada. En este estudio de la especie carpa coy (Cyprinus Carpio) presenta características para teleostos como lo son su forma redondeada, núcleo lobulado con un citoplasma basofilo y lleno de granulos finos del mismo color

Foto 8. Monocito de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

FUENTE: AUTOR

Encontramos en la foto 8. un monocito con apariencia granulocitica con nucleo arriñonado este tipo de celulas representa del 2 al 9% del total de leucocitos en sangre. En esta vista del monocito para la especie carpa coy (Cyprinus Carpio) encontramos similitud tales como su forma irregular, gran tamaño y nucleo exentrico algo basofilo.

Foto 9. Linfocito de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

FUENTE: AUTOR

Presenta un núcleo con la cromatina muy agrupada y de citoplasma muy fino. Vimos que para esta especie al igual que como se observa en los teleostos predomina la forma redondeada que ocupa casi toda la totalidad del especio citoplasmático

Foto 10. Eosinofilo de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloración de Wright en una vista de 100X

FUENTE: AUTOR

En la foto 10. Se encuentra un eosinofilo de forma redondeada y de núcleo bilobulado y citoplasma pálido y granulocitos grandes y alargados. El eosinofilo para la especie carpa coy (Cyprinus carpio) es de gran tamaño redondo, núcleo lobulado y gran cantidad de granulocitos. Presentado gran similitud para los de la especie teleostos.

Foto 11. Basofilos de carpa coy (Cyprinus carpio) con coloraci贸n de Wright en una vista de 100X

FUENTE: AUTOR

El basofilo de la foto 11. Presenta citoplasma ligeramente basofilo y granulos grandes y redondeados. En la carpa coy (Cyprinus carpio) se observa un basofilo algo redondeado con n煤cleo lobulado, con granulos grandes del mismo color y con citoplasma basofilo.

Discusión

Para el estudio del tejido hematológico en peces se han adecuado técnicas de laboratorio usadas originalmente en el humano y/o a nivel veterinario, por lo tanto, los resultados se deben interpretar a la luz del criterio metodológico empleado (Mendoza & Cantu, 1980).

Uno de los problemas que encontramos, es la obtención de la muestra (tejido sanguíneo) y para este propósito se han aplicado varios métodos de los cuales destacaremos la puncion cardiaca, punción de arteria dorsal, punción de arteria cardiaca en el pedúnculo caudal y sección del pedúnculo caudal (Mendoza & Cantu, 1980).

Es importante tener en cuenta que la temperatura es uno de los factores que afecta los índices hematológicos, producto del efecto inversamente proporcional entre la temperatura y el oxigeno disuelto en agua (Brown, 1993).

Debido a la carencia de parámetros hematológicos en la especie carpa coy (Cyprinus carpio) en especial de la línea blanca o leucograma, es necesario comparar resultados obtenidos en investigaciones a especies que presenten características y condiciones similares, con el fin de hacer un acercamiento a los estándares hematológicos normales.

En diferentes investigaciones hematológicas a especies similares a la carpa coy (Cyprinus Carpio) encontramos que los límites establecidos por Bastardo y Barberan en el salmón Salmo trutta y Rutilus rutila obtuvieron un rango de 79.000 a 137.000 leucocitos por mm3 de sangre y en el Thunmus alalunga registraron variaciones entre 2.000 y 10.000 leucocitos mm 3 mientras que los valores encontrados para la especie carpa coy (Cyprinus carpio) fue entre 6500 y 94250 leucocitos mm3 para este caso encontramos mayor similitud con el Salmo 61

trutta y Rutilus rutila que son peces de agua dulce al igual que la especie Cyprinus carpio y para la especie Thunmus alalunga de agua salada se registran limites más bajos.

Para el conteo diferencial de leucocitos se observaron neutrofilos, linfocitos, monocitos, basofilos, bandas y eosinofilos. El valor de linfocitos para la especie Cyprinus carpio se registra un porcentaje de 74% mientras que para el pez rubio el rango se encuentra entre 5.9 - 68,8 %. Los monocitos registran un rango de 1% los cuales coinciden con los establecidos por Atencio (2007) en la especie Salminus affinis que registran un rango de 0,9 – 2.1%. Los basofilos para Salminus affinis registraron 0,4 - 1,3%, para Sorubim cuspicaudus entre 3,28 3,7% mientras que para la especie Cyprinus carpio 2%. Los eosinofilos para la especie Cyprinus carpio registro un rango de 0 concordando con el rango registrado por Hines (1992) para la misma especie, Sopinska (1998) registran entre 0 y 0.2% mientras que para las especies Sorubim cuspicaudus y Salminus affinis según y Atencio (2008) los rangos oscilan entre 0,2 - 1,1% eosinófilos. Los neutrofilos oscilan en un porcentaje de 21% se encuentra una similitud para los rangos establecidos por Atencio para la especie Salminus affinis que están entre 5,2 - 28,5%, lo que quiere decir que los peces en el momento de la toma de muestras tenían un nivel de estrés bajo y se encontraban en buen estado general.

Para llegar a unas estandarización correcta de leucocitos en la especie carpa coy (Cyprinus carpio) tendríamos que realizar múltiples estudios y en diferentes épocas del año para de esta forma analizar factores externos que puedan generar alteraciones en la estandarización de los parámetros.

4. CONCLUSIONES



La medición de los leucocitos se presenta como una buena alternativa sanitaria en las explotaciones piscícolas.



En este estudio los resultados obtenidos presentaron gran similitud con los de otras especies en el conteo total y diferencial de leucocitos, como el caso de la paragua Chaetodipterus faber, salmon Salmo trutta y el Rutilus rutila, que están en condiciones similares de clima y altitud con el Embalse la copa.



En el conteo diferencial de leucocitos, los linfocitos fueron las células con mayor concentración en sangre lo cual se produjo por las condiciones climáticas.



Hasta el momento podemos establecer estos valores como normales debido a que es uno de los primeros estudios hematológicos para la especie carpa coy (Cyprinus carpio) en condiciones de alta montaña ya que los resultados obtenidos se encentran entre los rangos reportados en teleostos.



Es de gran importancia realizar estudios hematológicos continuamente en explotaciones de la región para lograr un mejor control sanitario de las explotaciones psicolas.



Este proyecto brinda nuevas herramientas al médico veterinario para llegar a un diagnostico acertado y rápido a la hora de identificar alteraciones de tipo inmunológico, nutricional, sanitario y reproductivo. 63



En el estudio hematológico para la línea celular de leucocito no encontramos alteraciones relevantes en cuanto a las líneas celulares de leucocitos entre hembras y machos etapa adulta de la especie carpa coy (Cyprinus carpio).

5. IMPACTO SOCIAL

Se realizo la medición e interpretación de los niveles normales de leucocitos en sangre de la Carpa Coy (Cyprinus carpio) en etapa adulta en sistema de producción de alta montaña en la represa la copa en el municipio de Toca, con el fin de proporcionar herramientas viables e indispensables para fomentar el análisis e investigación en los futuros médicos veterinarios.

Así mismo generar un ambiente propicio para los venideros productores de la especie Carpa Coy (Cyprinus carpio) proporcionando información sobre los análisis y estándares de los leucocitos o línea blanca que son los encargados de la inmunidad del animal, teniendo como base la información proporcionada en este proyecto de investigación de tal forma que se pueda prevenir futuras patologías en sus explotaciones piscícolas y así reducir los índices de morbilidad y mortalidad ya que estas pueden generar la pérdida total de la producción.

De hecho el imperativo de la población piscícola del Embalse La Copa consiste en utilizar los valores hematológicos de morbilidad para aplicarlos en la mejora nutricional sanitaria y reproductiva en los cultivos de este pez para generar satisfacción de los propietarios que se dedican al cultivo de esta especie animal e impactar en el mercado.

6. RECOMENDACIONES

 Se debe realizar las pruebas como trombograma y eritograma en la especie carpa coy (Cyprinus carpio) en el embalse La Copa para de esta forma tener valores completos para el cuadro hematico para realizar un diagnostico acertado.  Es necesario tener buenas prácticas de manejo y sedación para la extracción de muestras sanguíneas previniendo así la presentación de alteraciones significativas en los resultados de laboratorio.  Mantener contacto con los productores psicolas de la región con el fin de complementar investigaciones sobre la especie carpa coy (Cyprinus carpio)

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ANEXOS

RESULTADOS

LABORATORIO

PARA

CONTEO

TOTAL

LEUCOCITOS

Los resultados dados en la siguiente tabla se manifiestan de acuerdo a los valores obtenidos por el laboratorio para el conteo, en base a 100 muestras y de acuerdo al conteo del numero de los cuadros extremos (C1, C2, C3, C4) de la cámara de Neubauer y multiplicados por la constante de 250 obtenido por la dilución y características propias de la cámara.

Tabla 1. Resultados de Laboratorio para el conteo total de Leucocitos

N° Muestra

TOTAL

13750

8000

19000

15500

17500

14000

12250

17000

14250

10750

13000

18500

11000

10500

7000

10750

19000

14750

11750

11500

14000

14500

12500

13250

12250

13000

10250

13500

15500

16000

9750

15000

9000

15750

18250

17250

20250

10750

16750

10250

10750

20500

7750

23250

10500

12500

25000

8500

26000

14250

18750

6750

9750

13750

20500

18250

10250

9250

13500

21000

8000

10750

15750

16500

25500

18500

22250

14750

10000

13750

6500

8000

9000

17250

17000

11750

13750

13000

9750

22000

73250

6750

14250

24500

26250

54250

100

103

94250

77500

76500

77750

44000

81000

78500

51000

74500

59000

100

76750

RESULTADOS DE LABORATORIO PARA EL RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

En la siguiente tabla se presenta los resultados del recuento total de leucocitos. En la celda número 1 representada con % es el equivalente del total de células halladas en todo el recuento celular para cada tipo. La celda número 2 representada con V.A (Valor Absoluto) se halla multiplicando el conteo total de leucocitos por el valor equivalente del total de células halladas en el recuento celular (celda 1) y dividido en 100, el resultado de lo anterior es el que se tiene en cuanta para realizar el análisis estadístico.

Tabla 2. Resultados de Laboratorio para recuento diferencial de leucocitos NEUTROFILOS

BANDAS

N°

TOTAL

V. A

13750

6875

8000

800

19000

1520

15500

17500

EOSINOFILOS

V.A %

BASOFILOS

LINFOCITOS

MONOCITOS

V.A

275

6600

160

6880

160

17480

1240

14260

1575

175

15575

14000

1120

280

12320

12250

2940

8943

367,5

17000

4760

680

11050

510

14250

1567,5

11400

1283

14250

3135

285

10830

10750

860

215

9460

215

13000

1430

11570

18500

1110

740

555

15910

185

11000

1430

9350

220

10500

1680

105

8610

105

10500

2310

105

8085

7000

350

210

6300

10750

1720

8923

107,5

19000

570

190

18050

14750

5162,5

590

147,5

8408

442,5

11750

1762,5

117,5

9400

352,5

11500

1150

9660

690

14000

1400

280

11900

140

14500

1450

12760

290

12500

1500

250

10250

500

13250

927,5

132,5

12058

132,5

12250

4900

245

6615

490

13000

3510

9230

260

10250

1025

8815

410

13500

1350

405

135

10935

675

15500

3565

930

10540

465

16000

1440

160

480

13920

9750

2340

7410

15000

6300

8700

9000

2880

5850

15750

7875

18250

5657,5

182,5

12228

182,5

17250

6727,5

172,5

10350

20250

4455

15795

10750

2150

215

107,5

8063

215

16750

4522,5

335

167,5

11725

10250

2870

102,5

7278

10750

4300

6450

20500

7995

205

410

11890

7750

2247,5

5425

77,5

23250

15113

232,5

7208

465

10500

5040

105

5355

12500

2375

500

9000

625

25000

5500

19500

8500

1870

6630

26000

3120

22880

14250

2850

142,5

11115

18750

6750

375

11438

187,5

6750

945

135

5670

9750

1950

97,5

7703

13750

1100

137,5

12375

137,5

20500

1845

205

18450

18250

6205

12045

10250

1845

205

8200

9250

2312,5

370

6383

185

13500

1890

11610

21000

8610

420

11340

630

8000

1920

5840

240

10750

3225

7525

15750

2520

157,5

12758

315

16500

2640

13860

25500

3060

22440

18500

3145

185

15170

22250

3115

19135

14750

2950

11800

10000

1800

8200

10000

2000

100

7900

13750

4950

275

8525

6500

910

5525

8000

2560

5440

9000

1620

7380

17250

3795

345

13110

17000

4420

510

12070

11750

3055

8695

13750

2750

11000

13000

1300

130

11570

9750

1560

8190

22000

4400

17380

220

73250

21243

1465

3662,5

46880

6750

540

6210

14250

3135

285

10830

24500

4410

20090

26250

7875

525

17850

54250

9222,5

1627,5

43400

94250

56550

37700

77500

38750

76500

22950

53550

77750

41985

35765

44000

15840

28160

81000

14580

1620

64800

78500

15700

785

62015

51000

8160

510

41820

74500

17880

745

52895

2980

59000

35400

1180

22420

100

76750

41445

767,5

34538