Evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y METANÓLICOS DE COLA DE CABALLO (Equisetum arvense) SOBRE Aeromonas spp Y Staphylococcus aureus.

MIGUEL ANGEL BÁEZ BENAVIDES

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2015

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y METANÓLICOS DE COLA DE CABALLO (Equisetum arvense) SOBRE Aeromonas spp Y Staphylococcus aureus.

Modalidad Investigación

MIGUEL ANGEL BÁEZ BENAVIDES

Director CLAUDIA PÉREZ RUBIANO Bióloga M.Sc. Microbiología

Co- Director DARIO MARTÍN GORDO Químico de Alimentos M.Sc. (c) Química

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2015

NOTA DE ACEPTACIÓN

______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________

_____________________________________ FIRMA DIRECTOR

_____________________________________ FIRMA JURADO

AGRADECIMIENTOS

A Dios principalmente por darme fuerzas y valor de poder culminar este proyecto. A mi madre por su colaboración y apoyo absoluto además por darme ánimo de seguir adelante. A la profesora Claudia Pérez Rubiano por su tiempo, apoyo y paciencia en el proceso de realización de este trabajo. Al profesor Darío Martín Gordo por su colaboración, dedicación y compromiso además de la paciencia a lo largo del proyecto. A la profesora Ludy Paola Villamil por asesorarme y colaborarme en la culminación del proyecto. A Yaneth Martínez, coordinadora de laboratorio de universidad Juan de Castellanos, por colaborarme con la disposición de los laboratorios, además por su generosidad y paciencia.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 15

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...................................................... 17

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ........................................................... 19

JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 20

OBJETIVOS .............................................................................................. 22

4.1

OBJETIVO GENERAL ........................................................................ 22

4.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................... 22

MARCO REFERENCIAL ........................................................................... 23 6.1

ESTADO DEL ARTE .......................................................................... 23

6.2

MARCO TEÓRICO ............................................................................. 25

6.2.1

BACTERIAS ................................................................................. 25

6.2.2

Aeromonas spp........................................................................... 27

6.2.4

Staphylococcus aureus ............................................................. 29

6.2.5

MEDIOS DE CULTIVO ................................................................. 29

6.2.6

ANTIBIOGRAMA ......................................................................... 30

6.2.7

RESISTENCIA BACTERIANA ..................................................... 32

6.2.8

FITOTERAPIA .............................................................................. 33

6.2.9

COLA DE CABALLO, Equisetum arvense ................................ 34

6.2.10 METANOL .................................................................................... 37 6.2.11 ETANOL ....................................................................................... 38 6.2.12 EXTRACTOR SOXHLET ............................................................ 38

6.3

MARCO LEGAL.................................................................................. 40

6.4

MARCO GEOGRÁFICO ..................................................................... 42

HIPÓTESIS................................................................................................ 44 7.1

HIPÓTESIS NULA .............................................................................. 44

7.2

HIPÓTESIS ALTERNA ....................................................................... 44

DISEÑO METODOLÓGICO ...................................................................... 45 8.1

TIPO DE ESTUDIO ............................................................................. 45

8.2

DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................. 46

8.3

METODOLOGÍA ................................................................................. 47

8.3.1

PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL .............................. 47

8.3.2

OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS ........................................... 47

8.3.3

CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS ............................................. 48

8.3.4

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA ............. 52

RESULTADOS Y ANÁLISIS ..................................................................... 56

DISCUSIÓN............................................................................................ 66

IMPACTO ............................................................................................... 69

CONCLUSIONES................................................................................... 70

RECOMENDACIONES .......................................................................... 71

BIBLIOGRAFÍA...................................................................................... 72

LISTA DE FIGURAS Pág.

FIGURA 1

PLANTA “Equisetum arvense”

FIGURA 2

EXTRACTOR SOXHLET

FIGURA 3

MAPA GEOGRÁFICO DE BARBOSA SANTANDER

FIGURA 4

MAPA GEOGRÁFICO DE TUNJA BOYACÁ

FIGURA 5

EQUIPO SOXHLET INICIO DE PREPARACIÓN

FIGURA 6

EQUIPO SOXHLET 6 HORAS DESPUÉS

FIGURA 7

EVAPORADOR ROTATORIO

FIGURA 8-9 CULTIVOS BHI

FIGURA 10

PREPARACIÓN DE LA MEZCLA

FIGURA 11

VIALES PARA Aeromonas spp

FIGURA 12

VIALES PARA Staphylococus aureus

FIGURA 13

SIEMBRA EN AGAR NUTRITIVO

FIGURA 14

TURBIDEZ EQUIVALENTE A ESCALA DE MC FARLAND

FIGURA 15

COMPUESTOS QUÍMICOS MC FARLAND

FIGURA 16

PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES

FIGURA 17

DILUCIONES EN DIFERENTES CONCENTRACIONES

FIGURA 18

MÉTODO DE DIFUSIÓN EN DISCO

FIGURA 19

HALOS DE INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA FIGURA 20

DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL EXTRACTO

METANOLICO EN S. aureus. FIGURA 21

HALO INHIBITORIO DEL EXTRACTO ETANOLICO EN S.

aureus. FIGURA 22

DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL EXTRACTO

METANOLICO EN Aeromonas spp. FIGURA 23

DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL EXTRACTO

ETANOLICO EN Aeromonas spp. FIGURA 24

HALO INHIBITORIO EXTRACTO METANOLICO SOBRE

S. aureus. FIGURA 25

HALO INHIBITORIO EXTRACTO METANOLICO SOBRE Aeromonas spp. 7

FIGURA 26

HALO INHIBITORIO EXTRACTO ETANOLICO SOBRE S.

aureus FIGURA 27

HALO INHIBITORIO EXTRACTO ETANOLICO SOBRE

Aeromonas spp FIGURA 28

HALOS DE INHIBICIÓN, COMPARADOS POR MEDIO

DEL TEST DE DUNCAN FIGURA 29

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA OBTENIDA DE

LOS EXTRACTOS FIGURA 30

PORCENTAJE DE INHIBICION UTILIZANDO LA MEDIA

DE LAS CONCENTRACIONES 0,99 G/ML DE LOS EXTRACTOS FIGURA 31

REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL ÍNDICE DE ACTIVIDAD

LISTA DE TABLAS Pág. TABLA 1

INFECCIONES POR Aeromonas spp EN ANIMALES

TABLA 2

Staphylococcus spp DE IMPORTANCIA VETERINARIA

TABLA 3

RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD DE Aeromonas Y S. aureus

TABLA 4

CONCENTRACIÓN DE CADA UNA DE LAS DILUCIONES

TABLA 5

ESCALA DE MC FARLAND

TABLA 6

DISEÑO FACTORIAL 22

TABLA 7

ANOVA. HALOS DE INHIBICIÓN

TABLA 8

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DEL EXTRACTO

METANÓLICO EN S. aureus TABLA 9

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DEL EXTRACTO

METANÓLICO EN Aeromonas spp TABLA 10

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO

EN S. aureus TABLA 11

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO

EN Aeromonas spp TABLA 12

ÍNDICE DE ACTIVIDAD EXTRACTO METANÓLICO EN S.

aureus TABLA 13

ÍNDICE DE ACTIVIDAD EXTRACTO METANÓLICO EN

Aeromonas spp TABLA 14

ÍNDICE DE ACTIVIDAD EXTRACTO ETANÓLICO EN S.

aureus TABLA 15

ÍNDICE DE ACTIVIDAD EXTRACTO ETANÓLICO EN

Aeromonas spp TABLA 16

ANOVA. PORCENTAJES DE INHIBICIÓN CON CONCENTRACIÓN DE 0.99g/ml

GLOSARIO

Aerobio: es todo organismo requieren oxigeno como aceptor terminal de electrones, no proliferan en ausencia de oxígeno Alcaloide: son compuestos orgánicos nitrogenados, se les llama alcaloides a los metabolitos secundarios de las plantas generalmente a partir de aminoácidos. Anaerobios: son organismos que no utilizan oxígeno en su metabolismo, sino que requieren de otras sustancias para vivir y desarrollarsen. Antibiótico: es una sustancia química producida por un ser vivo o derivado sintético con la capacidad de eliminar o inhibir el desarrollo de ciertas clases de microorganismos. Antimicrobiano: sustancia que actúa contra parásitos como bacterias, virus, u hongos matando o inhibiendo su crecimiento. Según el agente microbiano que ataca se habla de antibiótico, antifúngico, antiviral, etc. Antioxidante: es una molécula capaza de evitar o prevenir la oxidación de otras moléculas. Citotoxinas: es una toxina de origen celular capaz de destruir células, las citotoxinas aparecen en el suero o en los linfocitos de un animal después de inyecciones repetidas de células de la misma variedad procedentes de otro animal. Concentración mínima inhibitoria: se refiere a la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo. Desinfectante: es un agente químico que inactiva o mata agentes patógenos como virus, bacterias y protozoos. Difusión: movimiento de partículas a través de bicapa lipídica o por canales, de zonas de alta concentración a baja concentración (a favor del gradiente de concentración), es proceso físico irreversible. Diurético: es una sustancia que estimula la eliminación de agua y electrolitos en el organismo por medio de los desechos naturales. 10

Enzimas: son proteínas que producen un cambio químico específico en el organismo. Epidemia: ocurre cuando una enfermedad afecta a un número de individuos superior al que se esperaba en una población durante un tiempo determinado. Estéril: se usa para designar a todo aquel objeto o sustancia que está libre de microorganismos y que es incapaz de producir cualquier forma de vida. Estróbilo: es una estructura de las plantas en el cual se despliegan hojas reproductivas a su alrededor. Extracto: es una sustancia obtenida por extracción de una parte de una materia prima, usando un solvente como etanol. Flavonoide: son metabolitos secundarios de las plantas sintetizados a partir de una molécula de fenilalanina y 3 de malonil-CoA a través de la vía biosintética de los flavonoides Hisopo: es un utensilio, normalmente con forma de bastoncillo acabado en una punta de algodón, utilizado en Medicina para recoger muestras. Infección: es la contaminación como respuesta inmunológica y daño estructural por un agente patógeno. Inflamable: es un material capaz de liberar energía cuando se oxida de forma violenta con desprendimiento de calor. Lipopolisacáridos: también llamados endotoxinas, son polímeros complejos con restos de ácidos grasos como parte lipófila y cadenas características de oligosacáridos y polisacáridos, que forman la parte mayoritaria de la capa externa de la membrana externa de bacterias Gram negativas. Maceración: es un proceso de extracción sólido-líquido que se emplea para diversidad de alimentos entre otras cosas. Macrólidos: son un grupo de antibióticos muy relacionados entre sí que se caracterizan por tener un anillo macrocíclico de lactona con 14 a 16 miembros, cuyo prototipo, y el macrólido más utilizado es la eritromicina. La claritromicina y la azitromicina son derivados sintéticos de la eritromicina. 11

Matraz: es un recipiente de vidrio generalmente con base circular o algo esférica y un cuello recto y estrecho, que se usa en laboratorios para medir líquidos o mezclar soluciones químicas. Metabolito: es cualquier molécula utilizada, capaz o producida durante el metabolismo. Nosocomial: es una infección que se ha adquirido durante el ingreso en un hospital. Resistencia bacteriana: es la capacidad que tiene un microorganismo de vivir frente a la acción de un antimicrobiano. Saponina: son glucósidos de esteroides o de triterpenoides, llamadas así por sus propiedades semejantes a las del jabón: cada molécula está constituida por un elemento soluble en lípidos. Solvente: aquella sustancia que permite la dispersión de otra en su seno. Es el medio dispersante de la disolución. Normalmente, el disolvente establece el estado físico de la disolución. Terpenos: son una vasta y diversa clase de compuestos orgánicos derivados del isopreno, un hidrocarburo de 5 átomos de carbono. Virulencia: es el grado de patogenicidad de un serotipo, de una cepa o de una colonia microbiana en un huésped susceptible. Volátil: se aplica a toda sustancia que se transforma fácilmente en vapor o en gas cuando está expuesta al aire. Zoonótico: es cualquier enfermedad que puede transmitirse de animales a seres humanos, ya sea por contacto directo o mediante intermediarios como insectos, también pueden ser contraídas por el consumo de alimento de origen animal.

RESUMEN

Las bacterias son los principales agentes que producen infecciones en toda explotación pecuaria, generan pérdidas económicas por su alta morbilidad y letalidad, entre los microorganismos más frecuentes están Aeromonas spp y Staphylococcus aureus, bacterias que son altamente resistentes a gran variedad de antibióticos, por esta razón se ve la necesidad de investigar y evaluar alternativas amigables medio ambientalmente como lo son los productos naturales de Equisetum arvense, una planta que se ha empleado para tratar diversas enfermedades debido a componentes como saponinas, flavonoides, alcaloides, vitamina C entre otras, a los que se les atribuye efectos antiinflamatorios y antimicrobianos. El propósito de este trabajo fue evaluar los extractos etanólicos y metanólicos de cola caballo (Equisetum arvense) sobre dos cepas bacterianas (Aeromonas spp y S. aureus). Se recolectaron tallos de la planta, se procedió a una deshidratación durante 8 días a una temperatura no mayor de 30 °C, finalizado este periodo se trituro para homogenizar el material vegetal en un molino analítico. Posterior a esto se puso la muestra en un dedal de papel filtro, se procedió a la extracción Soxhlet durante 5 horas con etanol y metanol, obtenidos los extractos se concentraron en un evaporador rotatorio. Para la evaluación de los extractos se utilizó el método de difusión en disco. S. aureus presento mayor sensibilidad a diferentes concentraciones con una concentración mínima inhibitoria de 0,21 g/ml, Aeromonas spp presento concentración mínima inhibitoria en la mayor concentración 0,99 g/ml demostrando resistencia a las demás concentraciones, el extracto metanólico presento mayor porcentaje inhibitorio con una media de 58.9% frente a 33% en el extracto etanólico, el índice de mayor actividad fue el del extracto metanólico con una media de 0,59 y el extracto etanólico presento un índice de actividad de 0,33 concluyendo que la cepa bacteriana más sensible es S. aureus y el solvente más eficiente es el metanol. PALABRAS CLAVE: Antibiótico, concentración mínima inhibitoria, extractos naturales, resistencia bacteriana. 13

ABSTRACT The bacteria are the main agents causing infections in all animal exploitation, economic losses generated by high morbidity and mortality among the most common organisms are Aeromona spp and Staphylococcus aureus bacteria that are highly resistant to many antibiotics, for this reason sees the need to investigate and evaluate means friendly alternatives environmentally as are natural products Equisetum arvense, a plant that has been used to treat various diseases due to components such as saponins, flavonoids, alkaloids, vitamin C, among others, to which attributed anti-inflammatory and antimicrobial effects them. The purpose of this study was to evaluate the methanolic and ethanolic extracts of horse tail (Equisetum arvense) on two bacterial strains (Aeromonas spp and S. aureus). Stems of the plant were collected, we proceeded to dehydration for 8 days at a temperature not exceeding 30 째 C, following this period was ground to homogenize the plant material in an analytical mill. Following this the sample was placed in a filter paper thimble for proceeded to Soxhlet extraction for 5 hours with ethanol and methanol, obtained extracts were concentrated on a rotary evaporator. The disk diffusion method was used for the evaluation of the extracts. S. aureus showed higher sensitivity to different concentrations with a minimum inhibitory concentration of 0.21 g/ml, Aeromona spp minimum inhibitory concentration present in the highest concentration 0.99 g/ml showing resistance to other concentrations, the methanol extract showed higher inhibitory percentage averaging 58.9% vs. 33% in the ethanol extract, the index was increased activity of the methanol extract with an average of 0.59 and the ethanol extract showed a level of activity of 0.33 concluding that more sensitive bacterial strain is S. aureus and the most efficient solvent is methanol. KEYWORDS: Antibiotic,

minimum

inhibitory

concentration,

resistance.

natural

extracts,

bacterial

INTRODUCCIÓN

La historia del uso de las plantas en la medicina data aproximadamente en el año 5.000 A.C cuya cultura oriental se basaba en la herbolaria y se describen cerca de 300 plantas en el libro Chino Pen Tsao, descubierto en el siglo XVI (Wheelers Hill, 2000), más adelante en un pergamino egipcio llamado el Papiro Ebers se descubrió el uso medicinal que utilizaban los egipcios en el año 1.500 a. C, donde explican varias plantas y su toxicología de cerca de 700 sustancias vegetales (Lopez, 1997). En la edad media los árabes impulsaron en la innovación de métodos utilizados para extracción de las sustancias vegetales, seguido de ello con herramientas más avanzadas, Arnau de Vilanova en el siglo XIII descubre el sistema de destilación de las esencias de las plantas (Suárez, 2007). Hoy en día existen diversos medios y formas de extraer una amplia gama de productos y extractos con una alta efectividad en el tratamiento de enfermedades (Rangel et al., 2001). Los extractos garantizan el alto rendimiento del material vegetal y elevado contenido de principios activos, los cuales se obtienen mediante solventes apropiados como etanol, metanol, agua entre otros, las moléculas obtenidas son necesarias para el crecimiento y la reproducción de las plantas, según Domingo & Lopez, (2003) en el mundo se producen cerca de 100.000 metabolitos de los cuales un gran porcenaje posee efectos ante miroorganismos, entre estos compuestos se encuentran taninos, quinonas, cumarinas, flavonas, terpenoides y alcaloides. La planta que se utilizó, en el presente trabajo, es una especie de arbusto de la familia Equisetácea, llamada cola de caballo “Equisetum arvense” la cual se ha empleado en la medicina naturista, ya que posee diversos metabolitos como flavonoides, alcaloides, saponinas y minerales, etc. sirve como antioxidante, diurético, hipoglucemiante, hematopoyético, antimicrobiano especialmente contra S. aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae entre otras (Martínez, 2008). En Colombia, esta planta crece en bosque roble (Quercus humboltii) y se encuentra ubicado en Nariño, Antioquia, Boyacá, Santanderes, Caldas, Cauca, 15

Caquetá, Cundinamarca, Tolima y Risaralda se distribuye desde los 1.500 metros hasta altitudes de 3.000 msnm (Becerra, 1989). Las bacterias que se utilizaron en esta investigación son Aeromonas spp y S. aureus esta última es la especie bacteriana más virulenta del género Staphylococcus, es una bacteria Gram positiva, anaerobia facultativa, no esporulada, la cual es causante de graves enfermedades principalmente en el sistema tegumentario y sistema gastrointestinal en diferentes especies animales (Pahissa, 2009); Aeromonas spp

es un bacilo Gram negativo anaerobio y

aerobio facultativo, que comprende diversas especies, las cuales habitan en medios acuáticos, su patogenicidad se caracteriza por causar infecciones intestinales y tegumentarias principalmente en reptiles y peces de agua dulce (Romero, 2007). La actividad antibacteriana se evalua por varios métodos, uno de los más utilizados es el método de difusión en disco (método Kirby-Bauer) empleado para determinar la sensibilidad microbiana, este método consiste en depositar discos de papel impregnados con el antibiótico en una placa de agar Mueller Hinton donde esta inoculado el microorganismo, con el fin de que el filtro absorba agua y el antibiótico se difunda por el agar, formando un gradiente de concentración (Toraco et al., 2008). Con base a lo anterior se plantea estudiar y analizar extractos etanólicos y metanólicos de la cola de caballo con el fin de generar conocimiento en cuanto la actividad antibacteriana frente a microorganismos patógenos S. aureus y Aeromonas spp.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las infecciones causadas por bacterias son un problema que día a día va dejando secuelas significativas a nivel mundial, ya que afecta a todo ser vivo, y es causante de pérdidas en explotaciones agrícolas y del surgimiento de nuevas enfermedades. Bacterias como Aeromonas spp y S. aureus constituyen un problema en medicina veterinaria por su alta morbilidad y mortalidad en todas las especies animales. S. aureus es una bacteria gram positiva habitual en la flora normal de la piel y mucosas, provoca enfermedades como botriomicosis en bovinos, equinos y porcinos, mastitis, piemias en cerdos, dermatitis postulosa contagiosa en caninos y forúnculos (Radames & Garcia, 2013) La patogenia de Aeromonas spp involucra como factores virulentos citotoxinas, hemolisinas, adhesinas y enterotoxinas, ésta afecta a peces causando septicemia hemorrágica (Vivas et al., 2000). Los anfibios que se destinan en laboratorios con fines investigativos, mueren por una enfermedad denominada ‘’pierna roja’’ en la que se evidencia úlceras y septicemias, en reptiles se presenta estomatitis ulcerosa (Koneman, 2008). A esta problemática se añade el uso intensivo de antimicrobianos y como consecuencia la ineficiencia de los tratamientos (Muñoz, 2008). Tanto para Aeromonas spp como S. aureus se han tratado con una serie de antibióticos que controlaban la infección, pero estudios demuestran que estas bacterias han desarrollado resistencia a varios antibióticos entre ellos cefalosporinas de primera y segunda generación, tetraciclinas, cloranfenicol y macrólidos (Ruiz & Guillen, 2005., Anonimo, 2004). Según la Organización Mundial de la Salud (2013) S. aureus es la bacteria nosocomial más resistente en los últimos tiempos y la infección por Aeromonas spp, avanzó de presentar enfermedades intestinales a la presentación extraintestinal y nosocomial.

Debido a la patogenicidad y resistencia de estas bacterias surge la necesidad de indagar mĂĄs acerca del uso de las plantas como alternativa para controlar la replicaciĂłn de estos microorganismos.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Los extractos metanólico y etanólico de E. arvense tienen actividad antimicrobiana contra Aeromonas spp y Staphylococcus aureus?

JUSTIFICACIÓN

Las microbiota se localiza en distintas partes del cuerpo en los seres vivos, principalmente en el sistema gastrointestinal y del sistema tegumentario, pero cuando estas poblaciones son alteradas son capaces de generar enfermedades, debido a los componentes de estos microorganismos, en el caso de S. aureus, su patogenicidad es producto de enzimas y toxinas tales como coagulasa, fibrinolisina, dermonecrotoxina, entre otros y Aeromonas spp posee hemolisinas y enterotoxinas (Radames & Garcia, 2013). Las septicemias ocasionan grandes pérdidas millonarias en las explotaciones agrícolas, por ejemplo en Colombia la presencia de Aeromonas spp en tilapia roja arroja mortalidades de hasta el 90% de los alevines los cuales representan la mayor susceptibilidad (Pulido, 2010). Por otra parte en la ganadería bovina S. aureus y S. agalactiae son los principales agentes causantes de la mastitis, Andrade et al. (2011) determinaron la prevalencia de mastitis en el altiplano Boyacense de un total de 231 vacas de ordeño, donde se observó un porcentaje del 65,8%, resultados que se consideran alarmantes ya que sobrepasan la mitad de la población, y no sólo se ven afectadas estas especies sino que estas bacterias afectan a casi toda población animal. En México Serrano et al. (2012) realizaron una investigación sobre las tortugas lora especie considerada en peligro de extinción, el objetivo del estudio fue determinar los agentes virales, bacteriano o micóticos que afectaban esta especie, entre los resultados obtenidos indicaron que las bacterias causantes de mortandad de tortugas por afecciones pulmonares son Staphylococcus spp, Vibrio y Aeromonas spp. Tanto Aeromonas spp como S. aureus son bacterias resistentes a varios antibióticos, debido a estas tolerancias y a su patogenicidad, se ve la necesidad de implementar el uso de plantas cuya transcendencia medicinal se le atribuye a sus componentes, como la cola de caballo “Equisetum arvense”, que posee en su fitoquímica minerales, alcaloides, saponinas y flavonoides, esta última sustancia en varias plantas se le destaca su acción en bacterias y hongos (Emin 20

et al., 2013), pero seg煤n Lopez., (2002) la acci贸n que ejercen los extractos vegetales se debe al sinergismo de sus componentes.

5.1

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL



Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto etanólico y metanólico de cola de caballo (Equisetum arvense) sobre Aeromonas spp y Staphylococcus aureus.

5.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS



Determinar la concentración mínima inhibitoria de los extractos etanólicos de cola de caballo (Equisetum arvense) sobre dos cepas bacterianas (Aeromonas spp y Staphylococcus aureus).



Determinar la concentración mínima inhibitoria de los extractos metanólicos de cola de caballo (Equisetum arvense) sobre dos cepas bacterianas (Aeromonas spp y Staphylococcus aureus).



Evaluar comparativamente las respuestas de los extractos etanólicos y metanólicos mediante el método de difusión en disco.

6.1

MARCO REFERENCIAL

ESTADO DEL ARTE

Lotfipour et al. (2008) examinaron las actividad antibacteriana de diferentes extractos vegetales utilizados tradicionalmente en la zona de Azerbaiyán (Irán) como plantas medicinales, se utilizaron 36 extractos obtenidos a partir de diferentes partes de diez plantas, entre las que se encuentra Equisetum arvense contra algunas cepas de bacterias Gram- y también en cepas Gram-positivas como Staphylococcus aureus, Staphylococcus mediante el método de difusión en disco, los resultados indicaron que Equisetum arvense tiene actividad antibacteriana contra S. aureus. Ramirez & Diana (2014) determinaron la actividad antibacteriana del extracto en metanol y diclorometano de Gnaphalium polycephalum Michx, contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, los extractos mostraron efecto inhibitorio contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli, otra planta efectiva frene a Staphylococcus aureus estudiada por Chang et al. (2013) fue Solanum nigrum L. empleando el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco. Por medio de los métodos difusión en disco y difusión en pozo Cruz et al. (2010) evaluaron la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de B. pilosa, L. camara, S. molle y S. marianum, localizadas en el departamento de Boyacá en las cepas de S. aureus, Escherichia coli y P. aeruginosa, los resultados de los extractos fueron efectivos para la cepa de Staphylococcus aureus.

Por otro lado Toribio et al. (2007) determinaron la susceptibilidad de Staphylococcus aureus a extractos vegetales obtenidos de plantas nativas y naturalizadas de la provincia de Pampas, Argentina, donde se escogieron 80 plantas de las cuales solo 33 de ellas mostraron actividad antibacteriana, además se demostró que Capsella bursa pastoris y Tribulus terrestris presentan actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus utilizando como

solvente

de extracción cloroformo, mientras que los extractos metanólicos

dieron negativo.

Garcia et al. ( 2012) evaluaron el efecto antibacteriano del aceite esencial de orégano en Aeromonas hydrophila, P. fluorescens, Vibrio mimicus, V. alginolyticus, V. fluvialis y V. vulnificus; como control se utilizó enrofloxacina, los resultados demostraron que la concentración mínima inhibitoria (CMI) fue similar entre el antibiótico natural y el antibiótico comercial en todas las especies excepto con Aeromonas hydrophila, también Magallanes et al, (2003) mediante la actividad antibacteriana de extractos etanólicos de 12 especies de macroalgas marinas sobre las cepas de Staphylococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Aeromonas y Vibrio, observo que Aeromona spp fue más resistente que las demás cepas.

Nuñez et al, (2001) evaluaron extractos fluidos al 70 % de Eucalyptus spp., Schinus terebintifolius y tintura al 20 % de Cassia alata sobre cepas de Aeromonas salmonicida típica, Aeromonas salmonicida atípica y Aeromonas hydrophila, aisladas de procesos patológicos ocurridos en peces de agua dulce, los resultados determinaron que el extracto fluido al 70% de Eucalyptus spp tuvo actividad en todas las cepas y demostró un amplio espectro.

6.2

MARCO TEÓRICO

6.2.1 BACTERIAS

Las bacterias son organismos procariotas, unicelulares carentes de núcleo, poseen nucleoide, pueden o no poseer cápsula, poseen o no flagelos como estructura de locomoción, con capacidad de vivir en tierra, agua, materia orgánica o en plantas, animales, hombre, entre otros (Silva, 2014). La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular (Pirez & Mota, 2010), básicamente, se diferencian según su morfología en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilindros, bastones o formas alargadas), espirilos (espiral), formas formas micelares o filamentosas y formas pleomórficas, estas últimas son formas no convencionales, diferentes a las anteriores (Stanchi et al., 2010)



Genética de las bacterias

Desde 1970 los conocimientos sobre procesos básicos de fisiología, bioquímica y genética bacteriana avanzaron de modo que fue posible manipular experimentalmente el material genético de las células usando bacterias como instrumento, además fue posible introducir material genético de origen exógeno en bacterias y controlar la replicación y características de éstas. En el nuevo milenio, se pueden secuenciar los genomas completos (Madigan et al., 2009).

El genoma de las bacterias posee uno o más cromosomas los cuales contienen genes y varios plásmidos que codifican para genes no esenciales, el cromosoma está compuesto por una doble cadena de ADN circular, el genoma mide entre 16 Mb. Las bacterias son organismos haploides y se dividen por fisión binaria que dura entre 20 minutos a varias horas, existen tres mecanismos por los cuales las bacterias pueden intercambiar material genético que son: transformación, conjugación y transducción (Molina & Uribarren, 2014).



Pared celular

Según la estructura de las bacterias se clasifican en gram negativas (-) y gram positivas (+), las bacterias Gram negativas se caracterizan por poseer una pared celular delgada de peptidoglucano mientras que la pared de las Gram positivas es gruesa (Asca et al., 2010), pero en definitivo para diferenciar estos agentes es por medio de tinción de Gram donde la bacteria Gram positiva tiñe de morado y la Gram negativa de rosado (Saceda, 2014).



Pared en Bacterias Gram negativas

Las bacterias gram negativas poseen en su pared un 10% de peptidoglicano o mureína, macromolécula que rodea a bacterias proporcionando resistencia mecánica y les confiere la forma, está formada por finas láminas compuestas por dos derivados de azúcares: N-acetil glucosamina y N- acetilmurámico unido por enlaces B 1-4 y un pequeño grupo de aminoácidos que incluyen L-alanina, Dalanina, D- glutámico o bien lisina o ácido diaminopimélico (DAP); también tienen una membrana externa o lipopolisacárido (LPS) que posee tres partes, antígeno O, corazón, y lípido A (Montoya, 2008), además se encuentran unos poros denominados porinas que actúan como canales de entrada y salida de sustancias hidrofílicas de bajo peso. Entre la membrana citoplásmática y la pared celular hay un espacio denominado periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte (Madigan et al., 2009). 

Pared en Bacterias Gram positivas

Las bacterias gram positivas en su pared tienen una capa de peptidoglicano más gruesa (90%), ésta capa lo que permite es una mayor retención de la tinción que en este caso se utiliza violeta cristal, y su coloración es morada; además presenta ácidos teicoicos y ácidos teicurónicos entre otros (Asca et al., 2010). Los ácidos teicoicos son en parte los responsables de la carga neta de las 26

superficie de las células y pueden intervenir en el transporte de iones de la pared celular. Algunos de éstos ácidos que poseen glicerol están unidos a los lípidos se les llaman: ácidos lipoteicoicos (Madigan et al., 2009).

6.2.2 Aeromonas spp.

Aeromonas spp es un bacilo Gram negativo corto, que mide entre 1,1 y 4,4 por 0,4 a 1,0 µm, no forma cápsula, ni esporas, es móvil ya que poseen un flagelo polar, aerobio y anaerobio facultativo, es considerado como un parásito de reptiles, anfibios y peces (Romero, 2007). Dentro del género Aeromonas se encuentran dos grupos, psicrófilo en el que se encuentra Aeromona salmonicida, se involucra principalmente en peces produciendo furunculosis, y el segundo grupo es llamado mesófilo la principal diferencia es que este grupo es móvil, ésta ocasiona aeromoniasis afectando tanto animales como humanos (Salud, 2001), ésta bacteria produce oxidasa y catalasa, fermenta glucosa y otros carbohidratos a ácidos sin gas. Tabla 1. Infecciones por Aeromonas spp en animales (Stanchi et al., 2010). ESPECIES PECES

ENFERMEDADES FURUNCULOSIS: en salmónidos. ENFERMEDAD ULCEROSA: en peces dorados.

REPTILES

SEPTICEMIA: es procedente de traumas, absedacíon local, parasitismo y estrés ambiental. DERMATITIS ULCERATIVA: (enfermedad de las escamas) en serpientes y lagartos. ABSCESOS: se produce por mordeduras o mala calidad ambiental, se observa en todos los órdenes. ESTOMATITIS INFECCIOSA: es común en serpientes, lagartos y tortugas, caracterizada por presencia de petequias en la cavidad oral.

ANFIBIOS

SINDROME DE LA PATA ROJA: se produce en sapos donde la malnutrición y el parasitismo son comunes, principalmente en el sapo leopardo y sapo buey, se caracteriza por presentar letargo, ulceraciones de piel, nariz y dedos, hemorragias puntiformes cutáneas de patas y abdomen.

Esta bacteria se ha tratado durante décadas generando resistencia, investigaciones muestran que Aeromonas spp es susceptible a azitromicina, nitrofuranos, quinolonas, cefalosporinas de 3a y 4a generación, carbapenémicos, tetraciclinas, y resistentes a ampicilina (Silva et al., 2011).

6.2.3 Staphylococcus spp

Se encuentran presente en mucosas y en la piel, son cocos gram positivos, contiene varias características en sus factores de virulencia, existen más de 30 especies en la familia estafilocócica de bacterias, y pueden producir distintos tipos de enfermedades, entre las más patógenas se encuentra Staphylococcus aureus.

Tabla 2. Staphylococcus spp de importancia veterinaria (Velasco & Yamasaky, 2000). ESPECIES

ENFERMEDADES

S. aureus

Produce gran variedad de infecciones supurativas

heridas

(Abscesos),

mastitis,

endometritis,

cistitis, osteomielitis, piodermas en bovinos, caprinos, ovinos, caninos, felinos, aves. S. epidermidis

Mastitis

S. hyicus

asocia

específicamente

epidermitis exudativa en cerdos. S. intermedius

Piodermas,

otitis,

conjuntivitis,

osteomielitis y rara vez mastitis en perros. S. saprophyticus

Patógeno oportunista.

6.2.4 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es la bacteria más infecciosa del género Staphylococcus, es Gram positiva mide de 0,5 a 1,5 µm de cadenas cortas o forma de racimo de uvas, no móvil, no tiene cápsula, no esporulada y es anaerobia facultativa, producen como mayoría de los Staphylococcus catalasa y ésta es la principal característica que las diferencia de Streptococcus y Enterococcus ya que estos son catalasa negativos (Cervantes at al., 2014). Los factores virulentos de S. aureus son hemolisina, exfoliatinas, leucocidina, enterotoxina y toxinas de shock tóxico, estas bacterias afectan tanto a humanos como a animales y tienen una alta patogenicidad (Sheagren & Schaberg, 1998). Ésta bacteria tiene varios factores defensivos, posee una cápsula polisacárida con capacidades antifagocitarias y formación de abscesos. Tienen una proteína de superficie llamada proteína A con la característica de inactivar la actividad opsonizante de la IgG, por otro lado, produce una proteína inhibidora de la quimiotaxis y la extravasación de los leucocitos polimorfonucleares en el lugar de la infección y posee varias citotoxinas capaces de destruir los leucocitos (Pahissa, 2009).

6.2.5 MEDIOS DE CULTIVO Según Gutierrez & Pedrique (2008) un medio de cultivo es “Cualquier material que presente una adecuada combinación de nutrientes para permitir el crecimiento o el incremento del número de células de una población microbiana”. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo según su consistencia se clasifican en: líquidos, sólidos y semisólidos. Líquidos: usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua; permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos Ejemplo: Caldo nutritivo.

Sólidos: se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Tiene 1,6% de agar Ejemplo: Agar nutritivo. Semisólidos: presentan

0,8% de agar Ejemplo: medio SIM (sulfuro indol

motilidad)

6.2.6 ANTIBIOGRAMA

Es la prueba microbiológica utilizada principalmente para medir la sensibilidad de una cepa bacteriana, además tiene como objetivo seguir la evolución de las resistencias bacterianas, por medio de esta prueba se deciden las terapias individuales a cada cepa bacteriana (Cercenado & Saavedra, 2009), existen varios métodos para determinar la sensibilidad bacteriana a las drogas antimicrobianas, entre los más conocidos se encuentran antibiograma por dilución en agar y en caldo y el antibiograma por difusión en agar (Mattar & Martinez, 2007).



ANTIBIOGRAMA POR DILUCIÓN:

Este procedimiento permite cuantificar la sensibilidad del microorganismo frente a diferentes concentraciones de antibiótico determinando la concentración mínima inhibitoria (Cercenado & Saavedra, 2009).



DILUCIÓN AGAR:

Es considerado el método de referencia, consiste en placas conteniendo una concentración determinada de antibiótico inoculadas con el microorganismo en agar Mueller Hinton y se incuban por 16 a 18 horas, en este método se evalúa si el microorganismo crece o no en cada placa (Velasco et al., 2008).



DILUCIÓN EN MEDIO LÍQUIDO:

Se preparan diluciones seriadas del antibiótico adicionándolas a una serie de tubos con medio de cultivo liquido como caldo de Mueller Hinton o caldo tripticasa de soya; se prepara un número de tubos de igual número de concentraciones del antibiótico a evaluar, se inocula luego cada tubo con una suspensión conocida y constante del microorganismo al cual se le determina la CMI (Mattar & Martinez, 2007).



ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN AGAR

Es el método más utilizado en el laboratorio de microbiología, es conocido como antibiograma de discos, esta técnica fue estandarizada por Kirby y Bauer de allí el nombre de Kirby Bauer, nos brinda información cualitativa o semicuantitativa sobre la sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico (Mattar & Martinez, 2007).

Procedimiento: Según Velasco et al., (2008). 1. La cepa bacteriana debe provenir de un cultivo fresco. 2. Se inocula una o dos colonias a un tubo que contenga solución fisiológica estéril. 3. Se introduce un hisopo de algodón estéril dentro del tubo que contiene el inóculo con el fin de eliminar el exceso de líquido rotando el hisopo contra las paredes. 4. El hisopo húmedo se inocula en tres o cuatro direcciones en la superficie de una placa con agar Mueller Hinton, se deja secar a temperatura ambiente no más de 20 minutos. 5. Se ponen con una pinza estéril en un máximo de 6 discos del antibiótico en forma equidistante. 6. Se ponen las placas a 36°C, en atmósfera aeróbica durante toda la noche.

7. Se realiza la lectura después de 18 horas de incubación, se mide con una regla milimetrada alrededor del disco de antibiótico y se compara con los diámetros establecidos para cada antibiótico, los resultados se expresan como sensible (S) o resistente (R), ligeramente sensible.

6.2.7 RESISTENCIA BACTERIANA

Alexander Fleming, desde 1945, se dio cuenta de los riesgos potenciales ligados a la utilización de los antibióticos, presiente que la utilización a gran escala selecciona bacterias resistentes; en su laboratorio observó que las bacterias sensibles a la penicilina consiguen multiplicarse al comienzo del experimento en presencia de concentraciones del antibiótico y que dichas bacterias iban ejerciendo menor sensibilidad (Allchin, 1997). S. aureus fue la primer bacteria en la que se descubrió resistencia frente a la penicilina en el año de 1947 luego se detectó resistencias a la estreptomicina antibiótico utilizado para el tratamiento de la tuberculosis y en la década de los 80 se demostró que los enterococos adquirían resistencias frente a aminoglucósidos, más adelante ejercieron resistencia a la ampicilina y así sigue creciendo esta problemática (FAO, 2004). Los antibióticos actúan interfiriendo con algún mecanismo del metabolismo celular para inhibir el crecimiento del microorganismo o eliminarlo, pero estos a su vez, adquieren una mutación genética que les permite sobrevivir a la acción de los antimicrobianos, los mecanismos de resistencias a los antibióticos según Sussmann et al., (2008) son: 

Destrucción e inactivación del antibiótico, la cual es efecto de las enzimas que tienen las bacterias como eritromicina y B, lactamasa entre otros.



Barrera de permeabilidad lo cual se basa en la mutación de la membrana externa, además por las porinas y características fisicoquímicas del antimicrobiano



Alteración del sitio blanco que consiste en el cambio anatómico de la célula.

Tabla 3. Resistencia y sensibilidad de Aeromonas y Staphylococcus aureus (Ruiz & Guillen, 2005) (Salud, 2004). BACTERIA

SENSIBILIDAD

RESISTENCIA

Aeromonas

Piperacilina

Ampicilina

Ticarcilina

Cefuroxima

Cafalotina

Ceftazidima

Cefazolina

Cefixima

Ceftriaxona

Cefepima

Amikacina

Imipenem

Gentamicina

Tobramicina

Tetraciclinas

Ácido nalidíxico

Trimetropim-Sulfametoxazol

Ácido pipemidico Ciprofloxacina

Staphylococcus

Trimetoprim-sulfametoxasol

cefalosporinas de 1ª

aureus

Clindamicina

generación

Rifampicina Fosfomicina

Macrólidos

Teicoplanina

Azálidos

Linezolid Telitromicina Moxifloxacina Ácido Fusídico Mupirocina Gentamicina

6.2.8 FITOTERAPIA

Etimológicamente se denomina “terapia o tratamiento mediante productos vegetales” hace referencia al uso de fitofármacos es decir extractos de diferentes plantas, desde 1975 la OMS ha reconocido la importancia de la medicina tradicional en el control de la salud (Haya, 2006). 33



SUSTANCIAS ACTIVAS

Existen de dos orígenes, del metabolito primario y metabolito segundario Del metabolito primario, sacáridos, por la fotosíntesis y del metabolito secundario por la elaboración debida al nitrógeno como resinas aceites esenciales y alcaloides (Fernández , 2000).



PRINCIPIOS ACTIVOS DE LAS PLANTAS

Según Masson (2003) los principios activos de dividen en: I.

Derivados de acetatos y sikimatos: flavonoides, taninos, quinonas y derivados atracénicos, lignanos y cumarinas, fenoles simples y ácidos fenólicos, lípidos y compuestos relacionados.

II.

Derivados del ácido mevalónico: monoterpenos y sesquiterpenos, lactonas

sesquiterpénicas,

irdoides

secoiridoides,

diterpenos,

saponosidos triterpénicos y esteroidicos, heterosidos cardiotónicos y cannabinoides. III.

Derivados de aminoácidos: alcaloides.

6.2.9 COLA DE CABALLO, Equisetum arvense

Nombre común: Cola de caballo Otros nombres: Carricillo, Equiseto, Pinillo, Horse tail y Cañuela Nombre científico: “Equisetum arvense” Superdivisión: Pteridófitas División: Equisetophyta Clase: Sphenopsida Subclase: Equisetidae Orden: Equisetales Familia: Equisetaceae 34

Género: Equisetum. Especie: arvense L. (Gurusar et al., 2010).

Es una de las plantas más antiguas, hace más de 400 millones de años, ésta formaba bosques en la era paleozoica, su nombre se deriva de “Equus” caballo y “Sacta” cerda, debido a la resistencia de los tallos tales como las cerdas de los caballos, es una herbácea con tallos dimorfos, estériles y fértiles, los tallos estériles miden hasta 1 m de altura, tienen varias bifurcaciones con coloración verde y los tallos fértiles miden hasta 25 cm, estas no poseen clorofila, el estróbilo es la parte fértil de hasta 4 cm con esporangios que producen esporas (Castroviejo et al., 1993).

FIGURA 1. Planta “Equisetum arvense” (Martineau, 2014)



HÁBITAT

La cola de caballo prefiere suelo húmedo fértil y se encuentra en los bosques tropicales y subtropicales, por lo general a lo largo de los arroyos y de las carreteras húmedas también en los pantanos en altitudes de entre 200 - 3.000

msnm. La cola de caballo es una especie abundante, sobre todo en Colombia, México, Ecuador y Perú, además en Europa y Asia (Blair & Madrigal, 2005).



PROPIEDADES

El contenido fenólico total de la planta es de 92-349 micromol, expresado en equivalente de ácido clorogénico por gramo de planta seca. Los principales componentes identificados son derivados de quercetina, kaempferol, glicósidos y ácido caféico. En las hojas de la cola de caballo se ha encontrado más de una veintena de sustancias volátiles. Entre estos, los más abundantes son hexahidrofarnesil acetona (18,34%), cis-geranil acetona (13,74%), timol (12,09%) y transfitol (10,06%). La fracción esterólica del Equisetum arvense contiene esencialmente betasitosterol (60.0%), campesterol (32.9%), isofucosterol (5.9%) y colesterol (cantidades traza). Esta equisetácea contiene entre 10 y 20% de minerales, de los que el 65% son ácido silícico y silicatos, muy abundante en los tallos estériles. Otras sustancias incluyen alcaloides, como nicotina, palustrina y palustrinina, flavonoides como isoquercitrina y equicertina, una saponina (equisitonina), dimetilsulfona, tiaminasa y ácido aconitínico (Muñoz et al.,1999).



USOS MEDICINALES

Según Gurusar et al (2010) el aceite esencial de E. arvense muestra actividad antimicrobiana contra amplia gama de cepas, bacterias: S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. enteritidis; hongos: A. niger y C. albicans. La actividad antibacteriana de los extractos de la planta ejercen efecto debido al sinergismo de sus componentes; según López, (2002) el uso de los flavonoides contra infecciones bacterianas o fúngicas tiene como objetivos matar las células de los microorganismos o dificultar los efectos de las toxinas bacterianas.

Esta planta es usada principalmente como diurético, hematopoyético, cicatrizante,

antidiabético,

hepatoprotector,

astringente,

antioxidante

antiséptico (Anónimo, 2012).



TOXICIDAD

La cola de caballo puede producir efectos tóxicos en su uso constante. Los silicatos producen problemas digestivos, especialmente cuando se usa prolongadamente. Los alcaloides, aunque no aparecen en concentraciones fuertes, el uso continuo puede tener lugar a facilitar el parto prematuro, trastornos nerviosos, cefalea, pérdida de apetito, problemas para deglutir, etc. Estas intoxicaciones obligan a un tratamiento que restaura la deficiencia de tiamina, aunque en el caso de los animales, en muchas ocasiones no son recuperables (Castroviejo et al., 1993).

Para la obtención de los extractos de origen vegetal es necesario de la utilización de solventes con el fin de lograr que se extraiga el compuesto de interés, dos de los solventes más utilizados son metanol y etanol, además del instrumental como es el caso del extractor, para realizar la extracción rápida se utiliza el extractor Soxhlet.

6.2.10 METANOL

El metanol es un disolvente industrial, es materia prima en la fabricación de formaldehido, combustible de bombonas de camping-gas, se utiliza como anticongelante en vehículos, disolvente de tintas, tintes, resinas y adhesivos. Su olor suave a alcohol puede ser percibido a un umbral de concentración de 6,54 a 131 mg/m3 (5-100 ppm) inflamable a temperatura ambiente que contiene menos carbono y más hidrógeno que cualquier otro combustible líquido (METHENOL INSTITUTE, 1989).

6.2.11 ETANOL

También llamada alcohol etílico es una sustancia psicoactiva de mayor consumo en el mundo, es un líquido incoloro, inflamable y volátil, se utilizada en la producción de bebidas alcohólicas y como tal, se usa como desinfectante casero y como disolvente para lacas, barnices, perfumes, entre otros (Tellez & Cote, 1998).

6.2.12 EXTRACTOR SOXHLET

Es un equipo de laboratorio el cual la función es de extracción sólido-líquido, donde además se emplea un solvente de bajo punto de ebullición, las etapas del método Soxhlet son vaporización, condensación, extracción y evacuación (Nuñez, 2008).

PARTES 

Matraz o balón colector.



Extractor



Condensador



Cartucho de papel filtro o de vidrio sintetizado

REFRIGERANTE

CONDENSADOR

CARTUCHO

ASCENSO DE VAPORES

MATRAZ O BALON COLECTOR FIGURA 2. Extractor Soxhlet Fuente: AUTOR

La extracción Soxhlet se fundamenta en las siguientes etapas: 1) colocación del solvente en un balón. 2) ebullición del solvente que se evapora hasta un condensador a reflujo. 3) el condensado cae sobre un recipiente que contiene un cartucho poroso con la muestra en su interior. 4) ascenso del nivel del solvente cubriendo el cartucho hasta un punto en que se produce el reflujo que vuelve el solvente con el material extraído al balón. 5) Se vuelve a producir este proceso la cantidad de veces necesaria para que la muestra quede agotada. Lo extraído se va concentrando en el balón del solvente (Grau, 1982).

6.3

MARCO LEGAL

A continuación se describe la normatividad bioética del médico veterinario, para el desarrollo de actividades tanto investigativos como experimentales. DECRETO 77 DE 1997, CAPITULO II, De la clasificación de los laboratorios clínicos ARTICULO 36. Aplicación de las medidas sanitarias de seguridad. Establecida la necesidad de aplicar una medida sanitaria de seguridad, la autoridad competente, teniendo en cuenta la naturaleza del artículo, producto, o el hecho que origina la violación de las disposiciones del presente decreto y demás normas sanitarias y de la incidencia sobre la salud individual o colectiva impondrá la media correspondiente (Forero, 1997). LEY 576 DEL 2000, (Febrero 15), Diario oficial No 43.897, del 17 de febrero del 2000, Código de ética para el ejercicio profesional de la medicina veterinaria y zootecnia. TITULO

LAS

DISPOSICIONES

GENERALES,

CAPITULO

DECLARACION DE PRINCIPIOS ARTICULO 3. Los profesionales objeto de la presente ley, como integrante de la sociedad, deberán preocuparse por realizar los diferentes problemas de la vida nacional en el campo de su ejercicio profesional, teniendo la responsabilidad social de contribuir eficazmente al desarrollo del sector agropecuario del país. ARTICULO 4. Los profesionales de la medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y de la zootecnia, son servidores de la sociedad y por consiguiente quedan sometidas a los principios que se derivan de la naturaleza y dignidad humana, debiendo por tanto conservar una intachable conducta pública y privada. ARTICULO 7. Los profesionales objetos a la presente ley, se vincularan con el desarrollo de estudios relacionados con la conservación de los ecosistemas animales, su entorno de vida y bienestar, sistemas de cofinanciamiento y práctica de producción animal, frente a los sistemas apropiados de producción y

desarrollo tecnológico. Teniendo como objetivo primordial del bienestar del ser humano, dentro de los más altos y sanos principios éticos. DECRETO 1375 DE 2013 “por el cual se reglamentan las colecciones biológicas” numeral 11 del artículo 189 de la Constitución Política y el artículo 2 numeral 11 y 12 del Decreto Ley 3570 de 2011 Ley 3570 de 2011 es función del ministerio de ambiente y desarrollo sostenible las colecciones biológicas contribuyen a una investigación responsable en tanto que si se optimiza su uso y comparte la información asociada a éstas, se reduce la necesidad de realizar nuevas colectas de material biológico. ARTICULO 4 Actividades a desarrollar en las colecciones biológicas Actividades con fines científicos, orientadas de manera exclusiva a generar conocimiento e información científica básica, con el fin de descubrir y explicar fenómenos y procesos naturales, sin que incluyan actividades de prospección biológica, aplicación industrial o aprovechamiento comercial. DECRETO 1376 DE 2013 "por el cual se reglamenta el permiso de recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica con fines de investigación científica no comercial" numeral 11 del artículo 189 de la Constitución Política, así como el artículo 51 del Decreto-Ley 2811 de 1974 ARTICULO 2. Ámbito de aplicación. El presente decreto se aplicará a las actividades de recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica con fines de investigación científica no comercial, que se realice en el territorio nacional. Parágrafo 4. La recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica que se adelanta dentro de un proyecto de investigación, deberá tener la finalidad exclusiva de investigación científica no comercial. Las disposiciones de este decreto no aplican a la recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica con fines industriales, comerciales o de prospección biológica.

6.4



MARCO GEOGRÁFICO

LOCALIZACIÓN DE RECOLECTA DE LAS PLANTAS

La cola de caballo se extraerá a orillas del río Suárez en el municipio de Barbosa, Santander (Figura 3) Barbosa Santander, localizada en el extremo sur del departamento, límites con el departamento de Boyacá, en la provincia de Vélez y Ricaurte, sobre la ribera del río Suárez entre las montañas que conforman la cordillera Oriental, a una distancia de la capital del país de 190 km y de Bucaramanga a 214 km. Tiene una temperatura cuyo promedio anual es de 20 °C. Sus actividades económicas son la agricultura, la ganadería y el comercio. Población 25,768 habitantes (DANE, 2005).

Figura 3. Mapa geográfico de Barbosa Santander (Alcaldia de Barbosa, 2012)



AREA DE ESTUDIO

El proceso de elaboración se llevó a cabo en la ciudad de Tunja en el Laboratorio de Microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos y Laboratorio de Espectroscopia y Análisis Instrumental de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia Tunja es la capital del departamento de Boyacá, Altitud de 2782 metros sobre el nivel del mar y temperatura media: 13º C (Tunja, 2013).

Figura 4. Mapa geográfico de Tunja Boyacá

(Salamanca, 2010)

7.1

HIPÓTESIS

HIPÓTESIS NULA

Los extractos obtenidos de la planta Equisetum arvense mediante los disolventes etanólicos y metanólicos no presentan actividad antibacteriana sobre las cepas Aeromonas spp y S. aureus.

7.2

HIPÓTESIS ALTERNA

Los extractos obtenidos de la planta Equisetum arvense mediante los disolventes etanólicos y metanólicos presentan actividad antibacteriana sobre las cepas Aeromonas spp y S. aureus.

8.1

DISEÑO METODOLÓGICO

TIPO DE ESTUDIO

Este trabajo se circunscribe como experimental, correlacional cuantitativo, busca encontrar la mayor actividad antimicrobiana representada en halos de inhibición que tienen los extractos obtenidos, los métodos y variables son evaluados acorde a lo descrito así: 

Experimental:

Estudio experimenta cuando investigador manipula las condiciones de la investigación. Este tipo de estudios se utilizan para evaluar la eficacia de diferentes terapias, de actividades preventivas o para la evaluación de actividades de planificación y programación sanitarias (Fernández, 2001). En esta investigación se determinan tres tratamientos diferentes cada uno en dos replicas bacterianas 

Cuantitativo:

Es aquella que permite examinar los datos de manera numérica, especialmente en el campo de la estadística (Mendoza, 2006). 

Correlacional:

Este tipo de investigación tiene como objetivo medir el grado de relación que existe entre dos o más conceptos o variables, en un contexto en particular. En ocasiones solo se realiza la relación entre dos variables, pero frecuentemente se ubican en el estudio relaciones entre tres variables (Hernández, 2014).

8.2

DISEÑO EXPERIMENTAL

El diseño experimental es basado en tratamientos y repeticiones, las cepas bacterianas fueron extraídas del cepario de la Universidad de Boyacá y replicadas en el laboratorio de microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, para el experimento se utilizaron tres replicas por tratamiento, las concentraciones de los extractos se realizaron agregando 5 gr del material vegetal en 5 ml del solvente, de esta dilución madre cuya concentración es 1: 0.99 g/ml se hace las segunda dilución tomando 3 ml de la dilución madre y se agregan 2 ml de solvente obteniendo la concentración 2: 0,61 g/ml, la tercer dilución se toman 3 ml de la segunda dilución y se añaden 2 ml de extracto y así sucesivamente se realizan las dos siguientes diluciones; los resultados se tabularon en la tabla 4. Tabla 4. Concentración de cada una de las diluciones.

caja 1 concentración Dilución 1: 0.99 g/ml Dilución 2: 0.61 g/ml Dilución 3: 0.36 g/ml Dilución 4: 0.21 g/ml Dilución 5: 0.13 g/ml Control antibiótico

caja 2

caja 3

8.3

METODOLOGÍA

8.3.1 PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Se recolectaron 300 gramos de cola de caballo en el municipio de Barbosa (Santander) a orillas del rio Suarez donde la condición climática favorece su crecimiento, se colocaron a temperatura no mayor de 28 °C y a la sombra durante 8 días con el propósito de deshidratarla.

8.3.2 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS

El material vegetal se llevó al Laboratorio de Espectroscopia y Análisis Instrumental de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, donde se procedió a cortar las hojas de la planta para dejar el tallo limpio, el cual se iba a utilizar, se homogenizó el tamaño de partícula del material vegetal en un molino analítico, seguido a esto se empacaron en papel filtro y se depositó en el cartucho del equipo Soxhlet, en el matraz de un equipo Soxhlet, se utilizó 500 ml de etanol y en el otro equipo 500 ml de metanol grado analítico, y se les realizó proceso de ebullición en calentadores eléctricos a temperatura de 140°C durante un periodo de 6 horas (Nuñez, 2007), (Figura 5-6).

Figura 5. Equipo Soxhlet inicio de preparación.

Figura 6. Equipo Soxhlet 6 horas después.

Obtenido los extractos, se concentraron hasta sequedad en un evaporador rotatorio (Figura 7), los extractos secos se almacenaron en nevera a temperatura inferior a -20°C.

Figura 7. Evaporador rotatorio.

8.3.3 CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS

El trabajo se desarrolló en el laboratorio de Microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, las bacterias Aeromonas spp y S. aureus fueron adquiridas del cepario de la Universidad de Boyacá. Las cepas de Aeromonas spp y S. aureus se cultivaron en caldo Infusión cerebro corazón (BHI), y se incubaron por 24h a 37°C (Figura 8-9)

Figura 8-9. Cultivos BHI

Figura 9

El cultivo se mezcló con igual volumen de glicerol al 10% (v/v), la mezcla homogénea se dispenso en viales a razón de 1ml/vial conservándose a -20°C (Figura 10-12). La pureza de las cepas fue verificada mediante la coloración de gram.

Figura 10. Preparación de la mezcla

Figura 11. Viales para Aeromonas spp.

Figura 12. Viales para Staphylococus aureus.

8.3.3.1 Estandarización del inóculo bacteriano

Para la estandarización de los inóculos bacterianos según la técnica de kirby Bauer, se tomaron los viales las bacterias y se sembraron por aislamiento en estría en agar nutritivo de manera independiente, incubándose por 24 horas a 37°C (Figura 13)

Figura 13. Siembra en agar nutritivo.

Una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se tomaron 4 o 5 colonias y se sembraron en cada tubo con 3ml de soluci贸n salina al 0,85% hasta obtener una turbidez equivalente a escala 0,5 de Mc Farland (Figura 14-15), que representa aproximadamente 1.5x108 UFC/ml (tabla 5).

Figura 14. Turbidez equivalente a escala de Mc Farland

Figura 15. Compuestos qu铆micos Mc Farland

Tabla 5 Escala de Mc Farland.

TUBO

BaCl2 1%

H2SO4 1%

UFC/ml

0,1

9,9

3,0x108

0,2

9,8

6,0x108

0,3

9,7

9,0x108

0,4

9,6

1,2x109

0,5

9,5

1,5x109

0,6

9,4

1,8x109

0,7

9,3

2,1x109

0,8

9,2

2,4x109

0,9

9,1

2,7x109

1,0

9,0

3,0x109

8.3.4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

8.3.4.1 Preparación de las diluciones de los extractos.

En las diluciones de los extractos se agregaron 5 gr del extracto seco en 5 ml del solvente de extracción para obtener la dilución madre, luego se tomaron 3 ml de la dilución madre y se agregaron a un tubo de ensayo que contenía 2 ml de solventes (segunda dilución), y así sucesivamente hasta obtener 5 diluciones (Tabla 4), a las cuales se les determinó la concentración (Figura 16-17).

Figura 16. Preparación de las diluciones

Figura 17. Diluciones en diferentes concentraciones

8.3.4.2 Método de difusión en disco

El inóculo ajustado anteriormente se tomó con un hisopo y se esparció en todas las direcciones sobre el agar Mueller Hinton hasta homogenizarse, luego de 5 minutos se colocaron los sensidiscos con los antibióticos y con las diluciones de los extractos, aplicándolo sobre la superficie desde un centro al otro a una distancia no menor a 24 mm con unas pinzas estériles ejerciendo una ligera presión (Figura 18). Antibióticos: se utilizaron como control positivo para Aeromonas: Oxitetraciclina y para S. aureus: Fosfomicina, incubados por un periodo de 24 horas a 37°C para observar los halos de inhibición. Los controles negativos se prepararon utilizando los mismos solventes empleados para disolver los extractos de las plantas. Cada ensayo se montó por triplicado.

Figura 18. Método de difusión en disco

La lectura de los halos de inhibición de la actividad antimicrobiana se determinó mediante la siguiente fórmula C= A – B (Figura 19) C= tamaño del halo de inhibición (mm) A= tamaño del halo. B= tamaño del disco de papel = 5mm 53

Tamaño halo de inhibicion Sensidisco diametro 5mm

Figura 19. Método de lectura de los halos de inhibición de la actividad antimicrobiana.

Se determinó el porcentaje de inhibición utilizando la siguiente fórmula. % inhibición= dm*100 dc dm= promedio del halo de inhibición de la muestra dc= promedio diámetro del halo de inhibición del control positivo.

8.3.4.3 Concentración mínima inhibitoria (CMI) y porcentaje de inhibición

La concentración mínima inhibitoria es la más baja concentración de extracto que inhibe el crecimiento bacteriano después de 24 horas a 37°C.

8.3.4.4 Determinación del índice de actividad

El índice de actividad de los extractos de las plantas (I.A) es calculado con la siguiente formula: IA= Media de la zona de inhibición del extracto Zona de inhibición obtenida del antibiótico estándar. 54

Análisis de los datos El modelo experimental fue un diseño factorial 22. Se tomaron como variables el solvente utilizado para la extracción, y las bacterias utilizadas, tal como se muestra en la siguiente tabla: Tabla 6. Diseño factorial 22 Microorganismos

Metanol

Etanol

S. aureus

EMSA

EESA

Aeromonas spp

EMA

EEA

Obteniéndose de esta manera 4 tratamientos distintos. Se realizó un análisis de varianza ANOVA, evaluado al 5% de probabilidad (p = 0.05), y un test de Duncan evaluados a la misma significancia.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

HALOS DE INHIBICIÓN En las (Figuras 20-23) se observan los resultados de la lectura de los halos de

DIAMETRO DEL HALO DE INHIBICION mm

inhibición de la actividad antimicrobiana.

Extracto metanolico Staphylococcus aureus.

18 16

16 14 12

10 10 10

10 7

0 0 0

0 1

0.99

0.21 0.13 0.61 0.36 CONCENTRACIONES g/ml CAJA 1

CAJA 2

6 Fosfomicina

CAJA 3

DIAMETRO DEL HALO DE INHIBICION mm

Fgura 20. Diametro del halo inhibitorio del extracto metanolico en S. aureus.

Extracto etanolico Staphylococcus aureus.

20 17

15 10

7 7

6 4

4 4

3 0 0 0

0 1

0.99

0.61

0.21 0.13 0.36 CONCENTRACIONES g/ml CAJA 1

CAJA 2

6 Fosfomicina

CAJA 3

Fgura 21. Diametro del halo inhibitorio del extracto etanolico en S. aureus.

En las figuras 20 y 21 se observa que Staphylococcus aureus presento halos de inhibicion en diferentes concentraciones de los extractos, tan solo en la dilucion 5 en concentracion 0,13 g/ml no hubo inhibicion en ningun extracto, ademas el extracto metanolico posee mayor diametro en halos inibitorios en comparacion al extracto etanolico, el control positivo (fosfomicina) obtuvo mayor actividad hacia la cepa bacteriana.

DIAMETRO DEL HALO DE INHIBICION mm

Extracto metanolico Aeromonas spp. 25 20 20

15 10

12 8

5 0 0 0

0 0 0

0 1

0.21 0.13 Oxitetraciclina 0.61 0.36 CONCENTRACIONES g/ml

0.99

CAJA 1

CAJA 2

CAJA 3

Fgura 22. Diametro del halo inhibitorio del extracto metanolico en Aeromonas spp.

DIAMETRO DEL HALO DE INHIBICION mm

Extracto etanolico Aeromonas spp. 25 20 20 17 17 15

8 5

5 0 0 0

0 0 0

0 1

0.99

0.21 0.13 0.61 0.36 CONCENTRACIONES g/ml CAJA 1

CAJA 2

6 Oxitetraciclin a

CAJA 3

Fgura 23. Diametro del halo inhibitorio del extracto etanolico en Aeromonas spp.

Según las figuras 22 y 23 la cepa de Aeromonas spp, solo presento actividad a los extractos a concentracion de 0,99 g/ml y frente al control positivo (Oxitetraciclina), y mantuvo resistencia a partir de la concentacion 0,61 g/ml, el extracto metanolico presento mayor halo inhibitorio que el extracto etanolico.

Figura 24. HI Extracto metanolico sobre S. aureus Figura 25. HI Extracto metanolico sobre Aeromona spp.

Figura 26. HI Extracto etanolico sobre S. aureus

Figura 27. HI Extracto etanolico sobre Aeromona spp.

En las figuras 24-27 estan las cajas de cultivo bacteriano junto con los sensidiscos impregnados con los extractos en diferente concentracion, y el grupo control en el sensidisco del medio, se alcanza a detallar que los controles positivos tienen mayor actividad. En la revisión de los análisis de varianza, se realizó un ANOVA para revisar los halos de inhibición, producidos por los extractos en concentración de 0.99 g/ml. Se realizó la prueba estadística en esta concentración, por ser la dilución con 58

efecto inhibitorio en ambas cepas bacterianas. Se utilizó, el ANOVA, para interpretar la varianza en: inter-grupos los extractos y las cepas (4), en intragrupos cada extracto en diferentes cepas (9). El resultado muestra que el valor del estadístico de prueba F= 5,780; además presentó la significativa <0,05 por lo tanto se rechaza la hipótesis nula, que explica la no diferencia inter-grupos e intra-grupos.

Tabla 7. ANOVA. Halos de inhibición encontrados con una concentración de 0.99 g/ml. Suma de cuadrados Inter-

Media gl

cuadrática

63.583

21.194

29.333

3.667

92.917

P valor

5.780

0.021

critio 4.066

grupos Intragrupos Total

Según la figura 28 se comparan los resultados por medio del test de Duncan, realizado a ésta variable, en donde se observa que hay significancia entre extractos metanólicos y extractos etanólicos; por otra parte, hay igualdad en medias entre extractos metanólicos y etanólicos en Aeromonas spp y Staphylococcus aureus. Además, los tratamientos EMSA y EMA fueron los más efectivos en comparación con los otros dos tratamientos.

Figura 28. Halos de inhibición, comparados por medio del Test de Duncan. La letra a, en las columnas muestran menor halo de inhibición; la letra b, indica el mayor halo de inhibición, EESA= extracto etanólico en S. aureus, EMSA= extracto metanólico en S. aureus, EEA= extracto etanólico en Aeromonas spp, EMA= extracto metanólico en Aeromonas spp.

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN El porcentaje de inhibición se realizó para cada diámetro obtenido (Tabla 8-11) se aprecia que Staphylococcus aureus presentó porcentajes de inhibición en más concentraciones que Aeromonas spp ya que presenta actividad inhibitoria desde la dilución 4, que es la de concentración de 0,21 g/ml, sin embargo es más alto el porcentaje en Aeromona spp tanto en el extracto etanólico como el metanólico en la dilución madre concentración 0,99 g/ml, además se observa que en la concentración más alta los extractos metanólicos presentan mayores porcentajes inhibitorios que los extractos etanólicos.

Tabla 8. % de inhibición del extracto metanólico

Tabla 9. % de inhibición del extracto metanólico

Aeromonas spp

Staphylococcus aureus caja 1

caja 2 caja 3

concentración Dilución

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución

0.13 g/ml

caja 1

caja 2 caja 3

44,4

62,2

concentración 58,8

62,5

55,5

29,4

62,5

16,7

17,6

43,7

16,7

17,6

43,7

Dilución

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución

0.13 g/ml

Tabla 10. % de inhibición del extracto etanólico

Tabla 11. % de inhibición del extracto etanólico Aeromonas spp

Staphylococcus aureus caja 1

caja 2 caja 3

concentración Dilución

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución 0.13 g/ml

caja 1

caja 2

caja 3

47,1

29,4

concentración 33,3

23,5

28,6

23,5

23,8

17,6

14,3

17,6

Dilución

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución 0.13 g/ml

INDICE DE ACTIVIDAD En las Tablas 12-15 describen los datos del índice de actividad de los extractos de las plantas, Staphylococcocus aureus en diferentes concentraciones, se

evidenció que presentan actividad frente a los extractos, Aeromonas spp solo mostró actividad a la concentración de 0,99 g/ml de extracto, pero el extracto metanólico tiene mayor actividad en la dilución madre en comparacion al extracto etanólico, sobretodo se ve el alto gado de actividad en el extracto metanólico sobre Aeromonas spp a concentración 0,99 g/ml. Tabla 12. IA extracto metanólico

Tabla 13. IA extracto metanólico

Staphylococcus aureus

Aeromonas spp

concentración caja 1 caja 2 caja 3

Dilución

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución

0.13 g/ml

0,6

0,3

0,6

0,2

0,4

0,2

0,4

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución

0.13 g/ml

Tabla 14. IA extracto etanólico

0,4

0,7

0,6

Tabla 15. IA Extracto etanólico

Staphylococcus aureus

Aeromonas spp

concentración caja 1 caja 2 caja 3

Dilución

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución 0.13 g/ml

0,3

0,4

0,2

0,3

0,2

0,1

0,2

0.99 g/ml Dilución

0.61 g/ml Dilución

0.36 g/ml Dilución

0.21 g/ml Dilución 0.13 g/ml

0,5

0,3

CONCENTRACION MÍNIMA INHIBITORIA La concentración mínima inhibitoria es la más baja concentración de extracto que inhibe el crecimiento bacteriano después de 24 horas a 37°C, de acuerdo a los resultados del proyecto descritos en la figura 29 se observa que los extractos etanólico y metanólico en la cepa de S. aureus presentaron concentración mínima inhibitoria en concentración de 0,21 g/ml mientras que Aeromonas spp tuvo resistencias a las concentraciones bajas, obteniendo inhibición de extracto etanólico y metanólico en concentración 0,99 g/ml.

CONCENTRACÍON MÍNIMA INHIBITORIA 1,2 1

0,99

EEA

EMA

CMI (g/ml)

0,8 0,6 0,4 0,21

0,21

EESA

EMSA

0,2 0

Figura 29. Concentración mínima inhibitoria obtenida de los extractos, EESA= extracto etanólico en S. aureus, EMSA= extracto metanólico en S. aureus, EEA= extracto etanólico en Aeromonas spp, EMA= extracto metanólico en Aeromonas spp.

PORCENTAJE DE INHIBICION El porcentaje de inhibicion se evaluó utilizando el porcentaje inhibitorio de la mayor concentración de los extractos, los mayores porcentajes inhibitorios obtenidos fueron los extractos metanólicos para Aeromonas spp y S. aureus, el EMA presento mayor amplitud de datos por el contrario EMSA obtuvo menor amplitud de datos.

Figura 30. Porcentaje de inhibicion utilizando la media de las concentraciones 0,99 g/ml de los extractos, EESA= extracto etanólico en S. aureus, EMSA= extracto metanólico en S. aureus, EEA= extracto etanólico en Aeromonas spp, EMA= extracto metanólico en Aeromonas spp.

En la tabla 16 se observa el análisis de varianza realizado a la variable porcentaje de inhibición encontrado, para una concentración de 0.99 g/ml. El resultado muestra que el valor del estadístico de prueba F = 8.259; adicionalmente la probabilidad (sig.) es menor a 0.05 (P=0.008) rechazando la hipotesis nula, demostrando que no todos los tratamientos surgían el mismo efecto. De acuerdo a la figura 30 se realizo compacion mediante un test de duncan, se observo que los tratamiento EMSA y EMA fueron mejores a los EESA y EEA. Con este test se demuestra que el extracto metanólico fue mas efectivo que el etanólico.

Tabla 16 ANOVA porcentajes de inhibición con concentración de 0.99g/ml.

Inter-

Suma de

Media

cuadrados Gl

cuadrática

2035.123

678.374

8.259 0.008 4.066

657.131

82.141

2692.254

P valor F critico

grupos Intragrupos Total

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE ACTIVIDAD En la figura 31 se observa el índice de actividad teniendo en cuenta la media de los resultados de la concentración 0.99 g/ml, se evidencia que el extracto metanólico presenta mayor actividad en ambas cepas que el extracto etanólico.

INDICE DE ACTIVIDAD 0,7 0,6

0,588235294

0,596491228

0,5 0,4

0,351851852 0,310344828

0,3 0,2 0,1 0

EMSA

EMA

EESA

EEA

Figura 31. Representación gráfica del Índice de actividad, EESA= extracto etanólico en S. aureus, EMSA= extracto metanólico en S. aureus, EEA= extracto etanólico en Aeromonas spp, EMA= extracto metanólico en Aeromonas spp.

10 DISCUSIÓN

Los productos secundarios de las plantas tienen funciones ecológicas, ya sea proporcionándoles color a las flores o frutos, o incluso como repelentes, además cumplen con funciones protectoras frente a patógenos, por ejemplo proporcionándoles sabores amargos inapetentes para depredadores, o actúan como pesticidas por medio de mecanismos defensivos (Avalos & Perez, 2009), por esta razón el uso de plantas posee varias funciones como en el caso de este proyecto cuya finalidad es obtener la función antibacteriana de la cola de caballo. Entre los compuestos de Equisetum arvense están flavonoides como isoquercitrina y equicertina además posee una saponina (equisitonina), según Aricapa, (2009) los flavonoides presentan su actividad antimicrobiana al formar complejos con las proteínas solubles y extracelulares y con la pared bacteriana, no obstante no solo los flavonoides poseen actividades ante microorganismos, los alcaloides presentan mecanismos de acción mediante interacción entre la pared celular y el DNA del microorganismo. En este trabajo se observó diferencia inhibitoria que ejercieron los extractos frente a una bacteria gram negativa y una gram positiva, esta última con mayor inhibición, la gram negativa por el contrario demostró mayor resistencia, puede deberse a la complejidad de la pared celular que posee o a la membrana externa que es impermeable a moléculas como lo describen Asca et al., (2010), además la cepa Gram negativa pudo ser más resistente debido a que, siendo los glicósidos menos lipofílicos, no quedarían atrapados en la barrera lipídica de estos microorganismos (Helander et al., 1998; Arora et al, 2000). Tafur et al., (2008) las bacterias gram negativas como Aeromonas spp tienen βlactamasas tipo AmpC enzima capaz de romper el anillo βlactámico e inactivar este

tipo

antibióticos,

además

poseen

β-lactamasas

espectro

extendido (BLEE) esta enzima les da resistencia a las cefalosporinas de tercera generación, otro mecanismo utilizado por estas bacterias se denomina bomba de salida, se encuentra en la membrana externa, esta toma el antibiótico del espacio periplasmico y lo expulsa al exterior evitando que llegue al sitio de

acción, los resultado obtenidos en este proyecto demuestra que Equisetum arvense es más efectivo a bacterias gram positivas. Ademas de la resistencia demostrada por Aeromona spp en el presente trabajo figura 22 y 23, Garcia et al. ( 2012) evaluaron el aceite escensial de oregano en 7 bacterias, entre las que se ncontraba Aeromonas spp, lo resultados demostraron que todas las cepas presentaron concentracíon mínima inhibitoria a excepción de Aeromonas spp, de igual manera concluyo el trabajo realizado por Magallanes et al, (2003) donde estudiaron el efecto antimicrobiano de 12 microalgas marinas en 7 cepas bacterianas entre estas Aeromonas spp y S aureus, observaron que Aeromonas spp fue la cepa mas resistente de todas las estudiadas y S. aureus fue sensible. Por el contrario Nuñez et al, (2001) determino que el extracto de Eucalyptus spp tuvo actividad en Aeromonas spp demostrando amplio espectro S. aureus presento susceptibilidad en este estudio frente a los extractos obtenidos de la Equisetum arvense, obteniendo 0,21 g/ml de CMI, coincidiendo su efecto en el trabajo realizado por Gurusar et al (2010) quien determinó que el aceite esencial de E. arvense muestra actividad antimicrobiana contra amplia gama de cepas, bacterias: S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. enteritidis; hongos: A. niger y C. albicans. Además

Cehyan et al., (2012)

evaluaron la CMI de ocho plantas entre ellas E. arvense frente a 5 cepas bacterianas incluida S. aureus utilizando como solventes etanol agua y etil acetato como resultados obtuvieron mayor efectividad del extracto etanólico de E. arvense sobre S. aureus dando como CMI 0,78 mg/ml en comparación de las demás plantas. Considerando lo anterior Sanabria et al., (2002), corrobora el dato del efecto de las equisetáceas en bacterias gram positivas, realizaron estudios de extractos etanólicos de siete plantas incluida Equisetum giganteum, demostraron su poder frente a S. aureus ellos comparan su efecto con el de los antibióticos de uso clínico actual, y manifiestan el poder de esta planta a los flavonoides que hace parte de su composición. El mayor halo inhibitorio lo obtuvo el extracto metanólico para ambas cepas bacterianas en comparación al extracto etanólico, de acuerdo a esto se puede 67

asumir que los efectos de los extractos dependen del solvente a escoger, puede deberse principalmente a las reacciones que estos ejercen con las propiedades de los extractos (Valarezo, 2014).

11 IMPACTO

Con los resultados obtenidos en esta investigación observamos que la planta Equisetum arvense, es considerada como una alternativa natural para el desarrollo de la fitoquímica, de acuerdo a los resultados in vitro genera impacto científico aportando información sobre la efectividad frente a S. aureus, bacteria considerada en las últimas décadas como la más resistente a los antibióticos generando grandes pérdidas económicas en el sector pecuario. Es un incentivo para que estudiantes utilicen esta investigación aplicándola in vivo como posibles tratamientos a infecciones bacterianas, particularmente en aquellos sectores donde Staphylococcus aureus se disemina fácilmente y produce enfermedades con grandes morbi-mortalidades. Aunque no hubo mayor respuesta en Aeromonas spp, este trabajo es un avance que promueve la investigación con el fin de lograr encontrar un control positivo a esta bacteria.

12 CONCLUSIONES



Staphylococcus aureus fue la cepa bacteriana más sensible a los extractos obteniendo actividad en diferentes concentraciones, al contrario la cepa de Aeromona spp que presento inhibición solo en la concentración más alta (0,99 g/ml) concluyendo que Staphylococcus aureus es la cepa más sensible y Aeromona spp es la cepa más resistente a los extractos obtenidos de Equisetum arvense.



Equisetum arvense es más efectivo a una bacteria gram positiva que a una bacteria gram negativa.



Mediante el índice de actividad y el porcentaje de inhibición teniendo en cuenta la concentración 0,99 g/ml, el extracto metanólico frente a las cepas bacterianas presento mayor actividad concluyendo así que el extracto metanólico de Equisetum arvense es más efectivo frente a las cepas bacterianas.



Los controles positivos que en este caso fueron Oxitetraciclina para Aeromonas spp y Fosfomicina para S. aureus mostraron se dé mayor halo inhibitorio que las diferentes concentraciones obtenida de los extractos, Oxitetraciclina= 18,5 mm media de halo de inhibición Fosfomicina= 18,2 mm media de halo de inhibición

13 RECOMENDACIONES

Se recomienda determinar la composición química de los extractos y así conocer porque es más eficiente un extracto que otro. Se recomienda ampliar el campo de investigación sobre las especies de plantas usadas como alternativas frente a microorganismos patógenos. Se recomienda identificar, separar y evaluar las moléculas presentes en Equisetum arvense responsables de la actividad antimicrobiana para que a partir de esta fuente de origen natural, genere alternativas para la obtención de nuevos antibióticos. Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la concentración mínima inhibitoria de los extractos de Equisetum arvense con el objetivo de utilizar el producto en la formulación frente a infecciones en medicina veterinaria. Se recomienda la investigación de alternativas naturales en Aeromonas spp con el fin de encontrar un método que contrarreste la problemática asociada a esta bacteria.

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