Evaluación de la actividad antimicótica del extracto by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) SOBRE LA CEPA Saprolegnia spp.

LUIS MIGUEL CASTELLANOS SUAREZ

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) SOBRE LA CEPA Saprolegnia spp.

LUIS MIGUEL CASTELLANOS SUAREZ

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO EN LA MODALIDAD DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR EL TITULO DE MÉDICO VETERINARIO

DIRECTORA LUDY PAOLA VILLAMIL MVZ, MSc Acuicultura CODIRECTORA: CLAUDIA PÉREZ RUBIANO Bióloga MSc Microbiología

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

HOJA DE ACEPTACIÓN

________________________________________________

DIRECTOR:

__________________________________________ MVZ. LUDY PAOLA VILLAMIL

JURADO:

___________________________________________ MV. ROSA MARIA VIVIANA GÓMEZ CARRILLO

JURADO:

___________________________________________ DR. MAURICIO BOYACÁ

DEDICATORIA

Este trabajo se lo dedico primeramente a Dios que me dio la fuerza y la sabidur铆a para la realizaci贸n de este trabajo.

Mi embri贸n vieron tus ojos, Y en tu libro estaban escritas todas aquellas cosas Que fueron luego formadas Sin faltar una de ellas Salmo 139:6 (VRV)

AGRADECIMIENTOS

A Dios por sostenerme durante la carrera y proveyó los recursos para terminarla A mis padres Jorge David Castellanos y Gloria Eugenia Suarez por apoyarme en cumplir mis sueños y mis proyectos A mis Tíos que me apoyaron en tiempos de dificultad A Mónica Vásquez Bióloga marina profesora de la Universidad de los Llanos quien me ayudo aislamiento de la cepa. A la Doctora Ludy Paola Villamil quien me asesoro en la elaboración de este trabajo. A la profesora Claudia Perez que me asesoro y apoyo en el trascurso de trabajo de campo y elaboración del libro.

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….15 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA………………………………………….17 3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN……………………………………………...18 4. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………..19 5. OBJETIVOS………………………………………………………………………..20 5.1

OBJETIVO GENERAL……………………………………………………..20

5.2

OBJETIVOS ESPECIFICOS………………………………………………20

6. MARCO REFERENCIAL…………………………………………………………21 6.1 ESTADO DEL ARTE…………………………………………………………….21 6.2 MARCO TEÓRICO………………………………………………………………25 6.2.1 Saprolegniasis…………………………………………………………………25 6.2.2 CALIDAD DEL AGUA EN ACUARIOS……………………………………...32 6.2.3

MEDIOS DE CULTIVO………………………………………………..36

6.2.4

EXTRACTOS NATURALES………………………………………….37

7.1

MARCO LEGAL…………………………………………………………….43

8. METODOLOGÍA…………………………………………………………………..47 8.1

TIPO DE ESTUDIO………………………………………………………...47

8.2 DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………………………..48 8.2.1 Preparación del material vegetal…………………………………………….48 8.2.2

Elaboración de los extractos…………………………………………48

8.2.3

Proceso de evaporación del etanol………………………………….49

8.2.4

Pruebas microbiológicas……………………………………………...50

8.2.5 Inhibición del crecimiento micelial…………………………………………...51 8.2.6 Método de bloque en agar……………………………………………………51 8.2.7

Evaluación antimicótica……………………………………………….53

8.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO………………………………………………………56 8.4 HIPÓTESIS………………………………………………………………………57 9. RESULTADOS Y ANÁLISIS……………………………………………………..58

9.1 IDENTIFICACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE Saprolegnia spp……………………………………………………………………………………..58 9.2 CRECIMIENTO MICELIAL (Método en bloque en agar)……………………59 9.3 CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA…………………………………..60 9.4 ACCIÓN FUNGISTÁTICA Y FUNGICIDA…………………………………….61 9.5 EFECTO INHIBITORIO…………………………………………………………62 9.5.1 Método de difusión en pozo………………………………………………….62 9.5.2 Método difusión en disco……………………………………………………..64 10. DISCUSIÓN………………………………………………………………………69 11. IMPACTO…………………………………………………………………………72 12. CONCLUSIONES………………………………………………………………..73 13. RECOMENDACIONES………………………………………………………….74 14. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………..75

TABLA DE FIGURAS

Pág. Figura 1.

Micelios de Saprolegnia spp...……………………………………….

Figura 2.

Cassia occidentalis……………………………………………………

Figura 3.

Cymbopogon citratus…………………………………………………

Figura 4.

Preparación del material vegetal………………………………….…

Figura 5.

Elaboración de los extractos…………………………………………

Figura 6.

Proceso de evaporación del etanol………………………………....

Figura 7.

Aislamiento de Saprolegnia spp…………………………………..…

Figura 8.

Preparación de las diluciones……………………………………..…

Figura 9.

Método en bloque en agar…………………………………………...

Figura10.

Preparación del inóculo………………………………………………

Figura 11.

Conteo de esporas……………………………………………………

Figura 12.

Método de difusión en pozo………………………………………….

Figura 13.

Método de difusión en disco…………………………………………

Figura 14.

Características macroscópicas……………………………………… 57

Figura 15.

Características microscópicas………………………………………. 57

Figura 16.

Concentración mínima inhibitoria…………………………………… 58

Figura 17.

Acción fungistática y fungicida………………………………………

Figura 18.

Inhibición del crecimiento micelial…………………………………..

Figura 19.

Inhibición del extracto en pozo………………………………………

Figura 20.

Inhibición del extracto en disco……………………………………...

LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1.

Resultados en método en bloque en agar………………………

Tabla 2.

Resultados de la actividad de los extractos con el método de difusión en pozo……………………………………

Tabla 3.

Estadística descriptiva para método en pozo...…………………

Tabla 4.

Resultados de la actividad de los extractos con el método de difusión en pozo…………………………………….

Grafica 1.

Porcentaje de crecimiento micelial………………………………

Grafica 2.

Diámetro inhibición en pozo………………………………………

Grafica 3.

Porcentaje del efecto inhibitorio en disco………………………

Grafica 4.

Comparación del diámetro de inhibición del de método en pozo y método en disco…………………………

Comparación del diámetro del porcentaje del efecto inhibitorio de los métodos en pozo y método en disco……………………………………………………

Grafica 5.

GLOSARIO

Alcaloides: nombre genérico de diversas sustancias orgánicas de origen vegetal cuyas propiedades fisicoquímicas les permiten formar sales cristalizables en conjunción con ácidos. Bronopol: es un compuesto químico antimicrobiano y antimicótico altamente activo cuya fórmula química es 2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol. Carotenoides: son pigmentos que ocurren naturalmente en las plantas y en algunos productos de origen animal como el salmón y el huevo. Catecol: enzima clave en la degradación de las catecolaminas, cuya interacción con noradrenalina y adrenalina da lugar a la formación de normetanefrina y metanefrina, respectivamente, que después sufren la acción de la enzima monoaminooxidasa (MAO) y da lugar al ácido vanilmandélico. De forma alternativa, la catecol-o-metiltransferasa (COMT) puede actuar sobre el ácido 3,4-dihidroximandélico, que se ha formado previa interacción de la MAO con nordarenalina y adrenalina. Catequinas: constituyente de la sangre que tiene una acción restrictiva sobre una hormona. Citral: es un líquido de color amarillo pálido y su olor se produce en los aceites esenciales de plantas. Es insoluble en agua pero soluble en etanol. Citronelol: es un producto químico de un aceite esencial amarillento destilado de las hojas de alguna de las siguientes hierbas cymbopogon Nardus o Cymbopogon Winterianus. Clorometano: es un líquido incoloro de leve aroma dulce, inflamable que da vuelta rápidamente en un gas en las temperaturas y las presiones atmosféricas estándar. El gas tiene un olor débilmente dulce, no-irritante. Cosmopolita: que suele ser común, hallarse en cualquier parte del mundo. Diásporas: unidades de dispersión de los hongos. Dioicos: hongo fanerógama que posee células masculinas y femeninas en individuos distintos.

Etanol: líquido incoloro e inflamable de olor característico y gusto ardiente. Se obtiene por fermentación alcohólica de azúcares. Es constituyente de todas las bebidas alcohólicas y se emplea como combustible entre otros usos. Eugenol: es un líquido oleoso de color amarillo pálido extraído de ciertos aceites esenciales, especialmente del clavo de olor, la nuez moscada, y la canela. Es difícilmente soluble en agua y soluble en solventes orgánicos. Tiene un agradable olor a clavo. Flavonoides: son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que protegen al organismo de los daños producidos por sustancias o elementos oxidantes como los rayos ultravioleta, la contaminación ambiental y de sustancias nocivas presentes en los alimentos. Galactomananos: se obtienen de las semillas de distintas leguminosas algunos son insolubles en agua. Geraniol: es un monoterpenoide y un alcohol este componente se encuentra mayormente de los aceites esenciales de las rosas. Hidrólisis: es una reacción química entre una molécula de agua y otra molécula, en la cual la molécula de agua se divide y sus átomos pasan a formar parte de otra reacción química. Melaleuca: es un género de plantas en la familia del mirto que contiene propiedades terapéuticas. Microbiota: también conocida como microflora es el conjunto de microorganismos que se localizan de manera normal en distintos sitios del cuerpo. Monoicos: un organismo monoico es aquel en el que las estructuras reproductoras, tanto masculinas como femeninas, se encuentran en el mismo individuo. Un sinónimo usado para animales y plantas es hermafrodita. Mucílago: es un tipo de fibra soluble de consistencia viscosa y cumplen diferentes funciones desde protección de las heridas, germinación de la semilla. Nerol: es un monoterpeno que se encuentra en muchos aceites esenciales como el limoncillo y le lúpulo. Nitrosomonas: son un género de bacterias elipsoidales del suelo y del agua son importantes para el ciclo del Nitrógeno para transformar amonio (NH4) a nitrito (NO2).

Oogonia: célula germinal femenina que representa el primer estadio evolutivo de las células sexuales femeninas y que da lugar al oocito. Pirogalol: compuesto químico aromático como el fenol derivado del benceno. Polifenoles: grupo de sustancias químicas encontradas en las plantas caracterizadas por la presencia de más de un grupo fenol por molécula. Rotaevaporador; equipo usado para separar el solvente del extracto mediante diferentes niveles de presión negativa y temperatura. Salinometro: equipo usado para determinar el contenido de sal. Saprofitos: son hongos que se alimentan de materia orgánica muerta ó en descomposición. Sesquiterpenos: son terpenos de 15 carbonos presentes en los aceites esenciales, son compuestos antibióticos producidos por las plantas en respuesta a la aparición de microbios o herbívoros oportunistas. Sulfihidrilos: es un químico inorgánico que se encuentra en numerosos compuestos orgánicos como aminoácidos y proteínas. Técnica de Soxhlet: equipo usado para extracción de diferentes sustancias mediante solventes como etanol para la elaboración de aceites esenciales, extractos de plantas entre otros. Terpenos: son diversa clase de compuestos orgánicos derivados del isopreno (o 2-metil-1,3-butiadieno), un hidrocarburo de 5 átomos de carbono. Timoquinona: un extracto del aceite de la semilla de Nigella sativa contiene propiedades bloqueando el crecimiento de células y promueve el proceso de muerte celular programada. Tocofenoles: es el nombre de varios compuestos orgánicos conformados por varios fenoles metilados, que forman una clase de compuestos químicos llamados tocoferoles de los cuales actúan como Vitamina E. Toxoalbumina: es la savia que contienen algunas plantas que contienen sustancias toxicas como la urina y crepitina. Xantona: grupo de moléculas biológicamente activo con una estructura anular de 6 carbonos con múltiples uniones dobles posee propiedades fitocéuticas antioxidantes, anti-inflamatorios, antihistamínicos, anti-tumorales etc.). Zoosporas: es una espora asexual motil provista de flagelos para locomoción propios de algunos hongos y algas para propagarse.

RESUMEN

La acuicultura ornamental se ha desarrollado a grandes pasos, provocando la aparición de patologías de diverso origen, llevando a pérdidas económicas que sobrepasan los porcentajes mínimos de morbilidad y mortalidad en las granjas y criaderos de peces. Dentro de los principales problemas relacionados se encuentran los derivados de las malas prácticas acuícolas por las malas condiciones de agua, exceso de comida no consumida, cambios bruscos de pH, condiciones de estrés, que finalizan en enfermedad. La saprolegniasis, es una de las enfermedades más prevalentes en las explotaciones piscícolas, pues afecta toda la cadena productiva en ovas, alevines y peces adultos; como terapeútica se suele utilizar productos sintéticos de alta residualidad y poca efectividad, que paralelamente a su suministro a los animales contaminan el ambiente. Por lo tanto, se propone como objetivo del presente trabajo evaluar la actividad antifúngica del extracto natural de Brusca (Cassia occidentalis) y el Limoncillo (Cymbopogon citratus) en la cepa Saprolegnia spp bajo condiciones de laboratorio. Hojas frescas de Brusca y Limoncillo se usaron para obtener su extracto etanólico, aplicando etanol desodorizado. Asimismo, se aislaron hifas de Saprolegnia spp en medio agar P.D.A (Papa Dextrosa Agar), obtenido previamente por frotis de ovas infectadas, en donde sólo el extracto de limoncillo presento halo inhibición; para el caso de las diluciones ninguna presento efecto para los métodos evaluados. El extracto en método de bloque en agar presento mayor porcentaje de crecimiento micelial con 58.3%, y en el método en disco el efecto inhibitorio fue de 27 y 40% respectivamente, similar a lo observado en el método de pozo con 23% y 30%. A pesar de los efectos antimicóticos atribuidos a las plantas, no se registró en el estudio efectos fungistáticos y fungicidas. PALABRAS Saprolegniasis.

CLAVE:

extractos

naturales,

metabolitos,

oomyceto,

ABSTRACT

Ornamental aquaculture has developed by leaps and bounds, causing the appearance of diseases of diverse origin, leading to economic losses that exceed the minimum rates of morbidity and mortality in fish farms and hatcheries. Among the main problems are the bad practices derived from aquaculture by poor water conditions, excess uneaten food, sudden changes in pH, conditions of stress, illness ending in. The saprolegniasis, is one of the most prevalent diseases in fish farms, affecting the entire production chain in eggs, fry and adult fish is often used as therapeutic synthetic high residual and limited effectiveness, that parallel to its delivery to animals pollute the environment. Therefore, it is proposed aim of this work was to evaluate the antifungal activity of natural extract Brusca (Cassia occidentalis) and Lemongrass (Cymbopogon citratus) in Saprolegnia spp strain under laboratory conditions. Brusca Fresh leaves and lemongrass were used to obtain the ethanol extract, ethanol using deodorized. Also isolated Saprolegnia spp PDA agar medium (Potato Dextrose Agar), previously obtained by swab infected eggs, where only lemongrass extract inhibition halo presented for the case of no dilution effect for the present methods evaluated. The extract agar block method with the highest percentage of mycelial growth with 58.3%, and the disk method inhibitory effect was 27 and 40% respectively, similar to what was observed in the method of well with 23% and 30% . Although antifungal effects attributed to the plants, there was no effect on the study fungistats and fungicides.

KEYWORDS: natural extracts, metabolites, oomycete, Saprolegniasis

INTRODUCCIÓN

La acuicultura moderna ha avanzado en los últimos tiempos, y con ella el desarrollo de múltiples patologías de diverso origen y tratamientos para su control; no obstante, y dentro de la amplia gama terapéutica, se utilizan productos con bases farmacológicas poco degradables o de alta residualidad en carne y agua, provocando subsecuentemente contaminación del ambiente acuático de forma directa o indirecta, tal como lo enuncia Boxall et al.( 2003). Como consecuencia en las granjas de producción de peces de consumo y ornamentales se presentan con frecuencia enfermedades que diezman las poblaciones, unas de mayor morbilidad o letalidad que otras. Al respecto Zaror et al. (2004) reportan a las micosis como la segunda causa de enfermedad, después de las bacterias, debido a que los agentes que forman parte de la microbiota normal del agua, generan patogénesis en los peces ornamentales y de producción cuando las condiciones del agua no son las adecuadas por ejemplo, cuando hay cambios bruscos de pH, de temperatura o cuando no se extraen peces muertos de los estanques y acuarios (Torto- Alalibo et al., 2005). Muchas de las micosis son frecuentemente tratadas con compuestos altamente contaminantes como el verde malaquita, utilizado en bajas dosis solo o mezclado con otros fungicidas; no obstante Torto- Alalibo et al.,(2005) lo reportan como un producto teratogénico y de uso prohibido, según las regulaciones de la cadena alimenticia en la Unión Europea, EEUU y América, estipuladas en el Decreto N° 33720 del 2 de mayo 1978 de la Ley General de la Administración Pública y la Ley N° 8495 del 6 de abril del 2006 de la Ley General de Servicio Nacional de Salud Animal de Costa Rica. Adicionalmente, al producto se le atribuye la generación de alteraciones mutagénicas, carcinogénesis, reducción de la fertilidad y modificación en la replicación génica visible tanto en los peces afectados como en su descendencia (Srivastava , Sinha, y Roy, 2004).

Es así que investigadores como Laca et al., (2008), Parra et al., (2006) y Kamoun, (2003), han desarrollado multiples estudios en torno a los métodos de diagnóstico y tratamiento de las micosis con moléculas bioactivas; muchas de las cuales provienen de fuentes naturales, de alta eficiencia y fácil administración bajo las diferentes condiciones de producción. Dentro de las micosis de distribución cosmopolita, y alta prevalencia (morbilidad y letalidad) en las producciones (ornamental y de consumo), se reporta Saprolegnia spp, dado que se encuentra en una fase latente en el agua y se activa fácil y rápidamente ante las condiciones adecuadas para su desarrollo (Torto- Alalibo et al., 2005), lo que justificaría por ende el desarrollo de trabajos que lograran mejorar su prevención y control.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las micosis son consideradas como una de las causas de morbimortalidades menos estudiadas ictiopatológicamente, que afectan sistemas productivos continentales

oceánicos,

principalmente

sistemas

intensivos

superintensivos. Dentro de las micosis que se consideran más prevalentes y cosmopolitas se incluyen a Saprolegnia spp., de la que se reportan frecuentes brotes, debido a que se encuentra en una fase latente en el agua y se activa fácil y rápidamente ante las condiciones adecuadas para su desarrollo (TortoAlalibo et al., 2005), reportándose mortalidades que sobrepasan el 50% en explotaciones de Salmón coho (Bruno y Wood, 1994) y pérdidas entre 15 a 25 % en sus ovas (Vivar y Bernal, 1998). La acuicultura ornamental ha incrementado notablemente, y con ello los niveles de comercialización hacia otros países representados tan solo en el 2004 en veinte millones de dólares, con destinos hacia EEUU (38%), Unión Europea (24%) y Asia (30%) (Panné y Luchini, 2008). No obstante, el creciente desarrollo propicia la aparición de patologías de diversa índole y relevancia económica, por las mortalidades y morbilidades que provocan en los peces, representadas en mayor porcentaje en las bacterias y como segunda causa a las micosis (Zaror et al.,2004). La acuicultura es un sector de producción ancestral, en el que el control de las patologias es relativamente reciente, dadas las condiciones de manejo que actualmente se utilizan. El desconocimiento de los productores frente a la utilización de la gran variedad medicamentos y su forma adecuada de aplicación han causado repercusiones negativas sobre los animales y los recursos hídiricos en que se disuelven, ocasionando problemas de efectividad y toxicidad debido a la dependencia de los compuestos sobre las propiedades físico-quimicas del agua como temperatura, salinidad, pH y materia orgánica, alterando su accion y efecto (Torto- Alalibo et al., 2005; Prieto, 2004).

Adicionalmente, algunos de los medicamentos pueden durar varios meses en el sedimento de los pozos y dependiendo el tipo de producción que exista, pueden llegar a los ríos, restos de comida no consumida y heces con antimicóticos (Lunestad, 1992; Samuelsen, 1992) que son ingeridos por la fauna silvestre produciendo residualidad en quienes los consumen o beben, y predisponen a la diseminación de enfermedades micóticas o bacterianas (Yndestad, 1992). Existen alternativas para generar nuevos tratamientos a través del uso de plantas con acción farmacológica, y de las cuales poco se ha descrito al respecto. De su terapéutica se ha comprobado que al procesamiento se obtiene de cada planta el 1% de metabolitos activos, dependiendo de su estado vegetativo (Cortes et al. 2003). En Colombia se describen cerca de 35.000 y 50.000 especies de plantas de las cuales 5000 han sido utilizada por indígenas y campesinos para diversas enfermedades (Fonnegra y Jiménez, 2007). De la brusca y limoncillo se reportan efectos antibacterianos y antimicóticos (Vaijayanthimala, 2000; Evans, Aderotimi, y Samuel, 2002; Kiuchi et al., 2002; Chukwujekwu et al. 2006; Santos et al, 2004; Bankole y Joda, 2004; Dutta et al. 2007) encontrándose ambas a nivel cosmopolita principalmente en los trópicos y subtrópicos (Stevens et al. 2001). En Colombia su uso ha sido poco evaluado, caracterizándose como una especie promisoria para su estudio, más aun siendo una especie nativa y adaptada a las condiciones climáticas.

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Los extractos de las plantas Brusca y Limoncillo presentan actividad antimicótica sobre la cepa Saprolegnia spp?

4. JUSTIFICACIÓN

La presencia de enfermedades micóticas en las producciones ocasiona pérdidas por alta mortalidad de ovas que oscilan de 15 a 25% en Chile, y pérdidas anuales que sobrepasan el 50% de peces según Bruno y Wood (1999) por Saprolegnia parasítica, sumado a esto el tiempo que lleva el tratar estas enfermedades, además medicamentos requeridos que en la mayoría de los casos son pocos efectivos, ocasionan efectos severos como el retraso en la ganancia de peso de los animales por inmunosupresión, baja tasa de consumo de alimento y deterioro de la

calidad de agua, por el alimento que

subsecuentemente se desaprovecha, lo que conlleva a la aparición de patologías, según Karouei et al., (2012). La saprolegniasis es una de las enfermedades micóticas más frecuentes en la producción piscícola, que produce altas morbimortalidades en los peces que afecta y sobre la que existen pocos tratamientos efectivos para erradicarla. Usualmente su control genera efectos negativos tanto en los animales expuestos como al ecosistema, y subsecuentemente a la contaminación del agua que genera afecta la flora y fauna. Es por eso que surge la necesidad de buscar alternativas para su tratamiento, uno de estos es la utilización de metabolitos activos obtenidos de los extractos de plantas sobre los que se han encontrado efectos sobre este hongo, generando nuevas opciones de medicamentos compuestos por sustancias naturales, que podrían tener mayor acción y menor tiempo de degradación evitando la resistencia del hongo ante los medicamentos y menor impacto ambiental, protegiendo la flora, fauna y los recursos hídricos. La evaluación de estas sustancias están dando resultados satisfactorios, para las infecciones que aparecen frecuentemente en los peces, así el agua de los contenedores y acuarios estén en óptimas condiciones, y se tomen medidas de profilaxis en la adquisición de peces según Prieto et al., (2005).

5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antimicótica del extracto etanólico de Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) sobre la cepa Saprolegnia spp.

5.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 

Determinar el porcentaje de crecimiento micelial del extracto etanólico de Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus.



Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus sobre la cepa Saprolegnia spp.



Comprobar la acción fungistática y fungicida de las diferentes concentraciones de los extractos etanólicos Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus.



Evaluar comparativamente la respuesta del extracto mediante el método en difusión en disco y difusión en pozo.

6. MARCO REFERENCIAL

6.1 ESTADO DEL ARTE

De manera natural los peces de diferentes medios acuáticos presentan una capa de moco que se encuentra en la epidermis, como su primera línea de defensa

que

contiene

diferentes

enzimas,

proteínas

sustancias

antibacterianas que proporcionan protección y están relacionados con la inmunidad innata del pez (Cole., Peddrick, y Diamond,1996). Este moco de la epidermis descrito por Ourth ( 1980) es producido a nivel de la mucosa, el cual posee diversos compuestos que tienen actividad antifúngica y antibacteriana. El mucus contiene mucina y otros componentes secretorios, y está compuesto por precipitinas inespecíficas, aglutinas, proteínas C-reactiva (CRP) y lisozima y son la primera línea de defensa (Fletcher, White, y Baldo, 1977). Clarke, Saunders, y McCormick (1996) reportan que existen diferencias en cuanto al grosor y el número de células mucosas en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), en comparación con el salmón coho (Oncorhynchus kisutch), y salmón atlántico (Salmo salar), haciéndolos más susceptibles a infecciones y pudiendo provocar resistencia ante los patógenos. Ravindran y Naveenan (2011) encontraron que las diferentes variaciones del pH sobre del hongo Chaetomium globosum, pueden estimular la secreción de sustancias antioxidantes y oxidantes para sobrevivir, confirmando lo referente a que los extractos de hongos pueden ayudar a combatir el estrés oxidativo ocasionado por los cambios bruscos de pH, en donde el pH genera en el pez cambios en la inmunidad y producción de moco de la epidermis (reduce la cantidad de moco) haciéndole susceptible a una infección bacteriana o fúngica. Es así como las enfermedades micóticas pueden presentarse cuando hay inmunosupresión, estrés, cambios bruscos de temperatura, de pH, niveles de

amonio y condición de agua deplorables según lo descrito por Bruno y Stamps (1987). Diversas especies de plantas son usadas para tratamiento de diferentes patologías, debido a que los medicamentos sintéticos están perdiendo su acción contra las bacterias y hongos, estimulando a los múltiples sectores académicos a realizar estudios para encontrar nuevos tratamientos con extractos naturales de manera económica y de fácil degradación (Alvarado y Morini, 2010). Existen diversos métodos para evaluar el efecto de los extractos de plantas sobre hongos, bacterias y pocas diferencias en el procedimiento tanto para la preparación del inóculo, medio de cultivo, tiempo de incubación, temperatura, donde se trabaja con diferentes concentraciones del extracto evaluando su concentración mínima inhibitoria (Shiva, 2007). El uso de las plantas con fines terapéuticos es de gran utilidad, ya que de ellas son obtenidas innumerables sustancias químicas. La investigación, en este sentido, brinda la oportunidad de encontrar nuevos principios activos desde el punto de vista farmacológico, a partir de una materia prima más económica y natural (Alvarado y Morini, 2010). Recientemente a los productos herbarios se les han acreditado sus propiedades medicinales tales como el eucalipto, el árbol de té, citral, extractos en agua y etanol de mangostán (Garcinia mangostana), como tratamientos seguros y asequibles en enfermedades causadas por Saprolegnia spp. Aphanomyces y achyla (Hussein et al., 2000). La

Saprolegniasis ha

sido ampliamente estudiada

en el continente,

particularmente por aquellos sectores en los cuales se manejan sistemas altamente intensivos y sistemas abiertos como es el caso de Chile y Argentina (Blaustein y Kiesecker, 2002). En Colombia, se reporta la presencia del hongo Saprolegnia ferax en el cuerpo de diversas ranas adultas del género Anaxyrus boreas en la zona de

Santander, y en ovas de esta especie. En otras especies como los peces también se reporta la presencia particularmente en ovas de trucha arco iris (Onchorhynchus mykiss) y se sugiere que los peces infectados podrían infectar a los anfibios en diferentes condiciones ambientales (Blaustein y Kiesecker, 2002). Al respecto Panase et al., (2012) evaluó múltiples extractos dentro los que se incluyen Cnidium monnieri, Magnolia officinalis y Aucklandia lappa obtenidos con los solventes: acetato de etilo, metanol, agua y éter de petróleo, obteniendo la mayor eficacia contra Saprolegnia achlya a los extractos de A. lappa obtenidos a partir de éter de petróleo en concentraciones de 11.3 y 26.1 mg/l., con concentraciones mínimas fúngicas de 25, 12.5 y 25 mg/l contra las esporas de Saprolegnia achyla. En estudios realizados por Silva (2011) se demostró que el aceite de maravilla ozonizado (AMO3) posee efecto antifúngico en aislados del hongo Saprolegnia spp. en diluciones de 0.03 – 0.2% produciendo inhibición del 50% al 80%. En estudios realizados por Ghasemi et al., (2009) en el país de Irán utilizando 7 extractos etanólicos de sobre ovas de trucha (Oncorhynchus mykiss), con presencia de Saprolegnia parassitica los extractos que obtuvieron mayor inhibición fueron Tanacetum parthenium con concentración mínima inhibitoria (CMI) > 50% de inhibición de crecimiento a concentraciones de 31.25 y 62.5 μg ml-1 y para el extracto de Menta longifolia concentración mínima letal (CML) > 99.9% de inhibición del crecimiento a concentraciones 600 y 550 mg ml-1, demostrando que los derivados de las plantas medicinales tienen el potencial para tratar las ovas. Existen tratamientos preventivos que se usan en acuicultura ornamental y de producción, con el cloruro de sodio se han realizado baños en ovas con dosis de 5, 25, 30 y 1000 ppm con flujo cerrado en sistemas de incubación artificial dando

como

resultado

mayor

porcentaje

eclosión,

manejando

concentraciones de 25 y 30 ppm por 60 min, como dosis efectivas para

saprolegniasis de tipo parasĂtica y tratamientos de baja toxicidad para el medio ambiente (Froelich y Engelhardt, 1996).

6.2 MARCO TEÓRICO

6.2.1 Saprolegniasis

Este género se clasifica en el Reino Fungi, filogenéticamente más cercano de las algas y el reino vegetal que de los hongos, pero que en virtud del desarrollo de hifas y su crecimiento en medios de cultivos para hongos se cataloga como tal (Guarro, Gené, y Stchigel, 1999), taxonómicamente se reporta como un Oomyceto de la Familia Saprolegniaceae (Figura 1) y subtipo parasítica (Bruno y Wood, 1994) que es reconocido como el principal patógeno secundario relacionado con hongos en peces (Smith et al. 1985). Clasificación Taxonómica de la Saprolegnia spp. La clasificación general se presenta así: Reino: Fungi División: Oomycota Phylum: Heterokonta Clase: Oomycotea Orden: Saprolegniales Familia: Saprolegniaceae parasitica (achlya, pythium, aphanomyces, Subtipos: leptomitus) (Bruno y Wood, 1994)

Figura 1. Micelios de Saprolegnia spp.

leptolegnia,

6.2.1.1

Epidemiología

Todas las especies de agua dulce son susceptibles a esta patología, se presentan frecuentemente en ovas y en peces muertos, con pérdidas parciales relevantes que oscilan entre el 20% al 100%, particularmente en ovas según Torres y Fajardo (2011), y mortalidad de peces en Chile que sobrepasan el 50% según Bruno y Wood (1999), debido a que estas no poseen protección frente a los patógenos, salvo aquellas que tienen cuidado parental. En Colombia se han presentado 8 casos con prevalencia de 0.4% de hongos superficiales, en los departamentos de Cundinamarca, Meta, Vichada, Guainía, Amazonas según Barato et al., (2012). En especies marinas esta infección no se suele presentar, porque el hongo no se desarrolla debido al cloruro de sodio tan abundante en estos medios, aunque se han reportado crecimientos en concentraciones de 1.75%, pero a concentraciones de 3.5% no se reporta desarrollo (Petricini, 2006). 6.2.1.2

Patogenia

La Saprolegnia spp suele ser un patógeno secundario a otras enfermedades presentes en los peces ya sea por factores como inmunosupresión, desnutrición u otras enfermedades. Se reporta mayor susceptibilidad por infección cutánea en peces sexualmente maduros ó en huevos en período de incubación (Southgate, 2000). Saprolegnia spp se presenta con la aparición de placas blancas prominentes de apariencia de masas algodonosas en diferentes zonas de la superficie del pez, que con el tiempo puede cubrir todo el cuerpo, en donde la placa suele además almacenar materia orgánica y sedimentos (Southgate, 2000). Suele aparecer en heridas producidas por transporte, o por otros peces, en las puestas en peces en reproducción si no es tratada puede ocasionar muerte del pez (Zaror et al., 2004).

Dentro de las características frecuentes en su presentación están las lesiones extendidas en el borde de la aleta dorsal y posteriormente aletas pectorales y caudal generando pérdida de la estructura (Southgate, 2000). La infección inicial sucede cuando las esporas llegan a los tejidos donde se produce colonización de la epidermis, el hongo comienza a desarrollarse formando un micelio, y generando nuevas esporas iniciando el ciclo del hongo (reproducción asexuada). Puede suceder por reproducción sexual donde se enlazan las hifas femeninas y masculinas (dioicos), aunque algunos pueden desarrollar hifas masculinas y femeninas (monoicos). Cuando el micelio se desarrolla se puede apreciar macroscópicamente como una placa de algodón que ayuda al diagnóstico, produciendo reacción inflamatoria de tipo mononuclear en la que precipitan linfocitos, monocitos y macrófagos. Muchas veces en esta etapa el pez muere porque el hongo destruye la barrera osmótica, altera la osmorregulación y alteración electrolítica letal. La invasión de los tejidos profundos no suele ocurrir en estas micosis (Roberts, 1981). Algunos hongos que afectan a los peces causan daños a nivel de piel (Willoughby, 1994), mucosas y branquias provocando asfixia y la muerte de los peces afectados, en dónde Neish y Hughes (1980) ) le consideran como un patógeno a la que todas las especies de peces de agua dulce son propensas Su presentación en la fase de incubación suele presentar grandes pérdidas debido a la gran cantidad de ovas no fecundadas y material en descomposición que le sirven como medio de cultivo y rápida replicación (Bruno y Wood,1994). La Saprolegniasis es una enfermedad oportunista, ya que aprovecha el debilitamiento ante situaciones de estrés y cambios de temperatura (Southgate, 2000). 6.2.1.3

Ciclo del hongo

Este hongo posee un ciclo complejo, pues exhibe reproducción sexual y asexual.

reproducción

sexual

hay

producción

anteridium,

gametangios y oogonio que se unen para la fertilización (Pickering y Willoughby

1982; Seymour 1970). El ciclo se inicia con la produccion de oosporas resistentes

que

encuentran

sustrato,

posteriormente

produce

germinación donde se desarrolla el micelio y en ellos se forman los gametangios de los cuales se forman las oogonias y anteridios; la plasmogamia se produce por contacto gametangial (hifas masculinas y femeninas) liberando osporas resistentes e iniciándose de nuevo el ciclo (Alexopoulos y Mims, 1985). Las esporas asexuales son móviles donde se desarrollan para formar las zoosporas secundarias que son activas durante unos minutos antes de enquistarse, germinar y liberar las zoosporas secundarias (Seymour 1970; Willoughby 1994), en estas zoosporas su tiempo de movilidad es mas largo y se consideran la principal fase de dispersión de la Saprolegnia (Beakes et al., 1994; Pickering y Willoughby 1982). La reproduccion asexual se inicia con oosporas resistentes que germinan donde se desarrolla el micelio, en ellos se forman los gametangios, se desarrollan y se producen oogonias y anteridios. La plasmogamia se produce por contacto gametangial (hifas masculinas y femeninas) liberando oosporas resistentes. Donde hay liberación de zoosporas primarias según Bruno y Wood (1994), estas zoosporas están activas por unos minutos antes de enquistarse para formar las zoosporas secundarias las cuales poseen movilidad durante largo tiempo y son la fase de dispersión de la infección. En estudios realizados por Beakes, Wood y Burr (1994), las zoosporas secundarias forman vellosidades para fijarse en materia orgánica en descomposición, en puestas, cadáveres y animales susceptibles. En estudios realizados por Beakes (1982), en muestras recogidas de peces infectados, los hongos cultivados no desarrollan estructuras sexuales, y según Hughes, (1994), su identificación no es fácil en el laboratorio. El modo en que se propaga la infección es por la adquisición de peces infectados y solo si el pez este en estado fisiológico optimo (Neish, 1977). Dentro de las condiciones que favorecen la presentación de la saprolegniasis esta los cambios bruscos de temperatura (Bruno y Wood ,1994), o el estrés,

este hongo presenta un rango de tolerancia a partir de 3º C – 33º C (Pickering y Willoughby,1982). 6.2.1.4

Signos

Inicialmente comienza con la aparición de pequeños filamentos, que forman una masa algodonosa sobre la superficie de peces, puestas, cadáveres y materia orgánica en descomposición que haya en el acuario; a medida que se desarrolla atrapan sedimentos en suspensión en el agua y el color cambia de color café – verdoso. El hongo se establece como un pequeño foco que luego se difunde en los tejidos sanos (Roberts, 1981). 6.2.1.5

Diagnóstico de laboratorio

Para el diagnóstico se utilizan características macroscópicas como su rápido crecimiento en aproximadamente 3 días, formación de gruesas capas de filamentos en forma de placas ó masas algodonosas e hialinas sin pigmento, que microscópicamente se diferencian como hifas cenocíticas de entre 20 a 40 μm de ancho, de ramificación moderada y gemas abundantes con formas piriformes

irregulares,

presentan

terminales

solas

cadenas,

ocasionalmente intercalares, y algunas con zoosporangias u oogonias (Seymour , 1970; Dick, 1973). 6.2.1.6

Profilaxis

Cómo métodos de profilaxis y considerando que los hongos son oportunistas, su diagnóstico se asocia a las malas condiciones de agua, por lo que se puede controlar con un adecuado manejo de cuarentena, limpieza de los utensilios, cambios de agua regulares, limpieza de filtro, oxigenación, y temperaturas constantes y adecuadas (Fernandez, 2006), se recomienda además, realizar cambios parciales del agua, y remoción del exceso de materia orgánica en el fondo del acuario o el estanque. Como medida de control es conveniente realizar cambios de agua parciales cada 3 semanas (Jimenez, 2007).

6.2.1.7

Tratamiento para la Saprolegniasis

Los tratamientos para el control o eliminación del parásito suelen ser medicamentos de amplio espectro farmacológico, o colorantes como el verde de malaquita y azul de metileno, aunque también se incluye en esta gama de sustancias el Permanganato de potasio. Para su control y prevención se suele utilizar el Cloruro de sodio (Chapman, 2000).  Verde de malaquita Aunque es efectivo para controlar la Saprolegniasis, Willoughby (1994) le reporta como una sustancia cancerígena o teratogénica, alcanzando a afectar los niveles de leucocitos en sangre en salmones (Glavolena y Malikova, 1968). Su uso esta prohibido en la Unión europea, Chile y otros países (Frizpatrick, Schreck, y Chitwood, 1995).  Formalina Este producto antifúngico es utilizado frecuentemente en la acuicultura, se usa en soluciones concentradas de 37% de formaldehído (Van y Rogers 1988), su tratamiento se reporta en ovas infectadas de salmón y carpa común, su eficacia como preventivo se utiliza en dosis de 250, 400 y 500 ppm en baños de 30 – 60 minutos.  Sal cloruro de sodio

Este producto ha sido estudiado en ovas de salmónidos (Oncorhynchus spp) y carpa

común

(Ictalurus

punctatus)

han

dado

buenos

resultados

enfermedades fúngicas (Taylor y Bailey, 1979), es asequible para a los productores, pero se requieren cantidades elevadas para su efectividad (Marking, Rach y Schreier, 1994). En estudios realizados en truchas (Schreier, Rach y Howe 1996), salmon Chinook (Waterstrat y Marking, 1995), y carpa común (Ictalurus punctatus) (Phelps y Walser, 1993), realizando baños de ovas con dosis de 5, 25, 30 y 1000 ppm con flujo cerrado en sistemas de incubación artificial, se obtuvo como resultado un mayor porcentaje de eclosión, además

de que a concentraciones de 25 y 30 ppm por 60 min de cloruro de sodio fue más efectiva para saprolegniasis de tipo parasítica, y como tratamiento de baja toxicidad para el medio ambiente (Froelich y Engelhardt, 1996).  Yodo

Es usado frecuentemente en Chile como preventivo, ya que es efectivo como desinfectante, y tiene un pH neutro que no ocasiona daño en las ovas (Quezada, 1997). Posee amplio espectro contra bacterias, hongos y virus (Vega 1999), las concentraciones usadas en Salmones (Salmón salar, Salmon coho y trucha arco iris), son de 100 ppm por 60 min (Walser y Phelps, 1993) y para Galaxias maculatus (Quezada, 1997) concentraciones de 200 ppm en baños por 30 minutos, aumentando el porcentaje de eclosión.  Peróxido de hidrógeno

Este tratamiento genera poco impacto en el ambiente (Bruno y Wood, 1994) es usado en Salmonideas, trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) (Kitancharoen Yamamoto y Hatai, 1998) y Salmon Chinook (Waterstrat y Marking, 1995) aplicado a concentraciones de 500 y 1000 ppm, esta última concentración suele ser efectiva para el tratamiento de hongos debido a que evita la germinación de zoosporas e impide el desarrollo de hifas (Barnes et al. ,1998).

Existen otros productos que son efectivos para el tratamiento de la Saprolegnia como son A-73336, Glutaraldehydo, Eugenol y Melaleuca. Pero son inseguros en el caso de Eugenol y la Thymoquinona que se utilizan como anestésicos en acuicultura son eficaces pero provocan toxicidad en salmones, ciprínidos y producen contaminación del agua según Hussein et al. ( 2000).

 Pyceze

Es un producto recientemente desarrollado por Norvatis y Vaccines (2001) ha sido a probado en países como Suecia, Noruega, Isla Faroe. Su composición es de 50 % p/v de bronopol BP (2-bromo-nitropropano 1,3 diol) y la dosis que se maneja es de 1 ml /10 litro de agua en incubación durante 30 min para el tratamiento y prevención de la Saprolegniasis. Puede ser tóxico para los organismos acuáticos causando efectos adversos a largo plazo en el ambiente.  Saprofin

Es un producto orgánico compuesto por aceites esenciales, se manejan dosis de 30 ml/m3 por una hora, con una efectividad de 20 días en comparación con la formalina y pyceze (Olivares, 2006).  Aceite esencial de timol Este se extrae por destilación del follaje en floración del tomillo. El método de extracción es por arrastre de vapor para no producir alteración de los compuestos por hidrólisis. Para la Saprolegnia spp se realizan baños de tomillo a 400 ppm en ovas de trucha y a 200 ppm para las ovas con ojos (Garcia, 1953).

6.2.2 CALIDAD DEL AGUA EN ACUARIOS

La calidad de agua es imprescindible para cualquier especie acuática, debido a que algunas especies son más susceptibles a cambios bruscos que otras y más aún si se están manejando ciclos reproductivos completos, que afectarían a toda la cadena de reproductores, alevines y juveniles. Los parámetros más relevantes son:

 Luz, temperatura

Casi todos los organismos acuáticos necesitan de la luz, sobre todo aquellos que le necesitan para la fotosíntesis, favoreciendo la producción de OD (Oxígeno disuelto) y glucosa. Su dinámica depende del contenido de partículas orgánicas e inorgánicas, en donde en virtud del aumento de estas aumenta el metabolismo de los peces (Rodriguez y Anzola, 2001).  Oxígeno disuelto (OD)

El oxígeno es el gas más abundante e indispensable para los organismos heterótrofos, de su disponibilidad en los estanques, para el caso de acuicultura depende el bienestar, pues ante una deficiencia en sus concentraciones los organismos cultivados pueden estresarse y, eventualmente, morir. La concentración del oxígeno disuelto en el agua se expresa tanto en partes por millón (mg/litro), como en porcentaje de saturación. Según Vinatea, (2001) "las células fotosintéticas (plantas) ensamblan compuestos orgánicos tales como la glucosa a partir del dióxido de carbono atmosférico y del agua, teniendo como fuente energética a la luz solar. Las células heterotróficas (animales) utilizan los compuestos orgánicos producidos por las células fotosintéticas como combustibles y sillares de construcción; el dióxido de carbono formado como producto final de su metabolismo vuelve a la atmósfera para ser utilizado de nuevo por las células fotosintéticas. La mayor parte de los organismos fotosintéticos producen oxígeno como producto final, que es utilizado a su vez por los heterótrofos para oxidar los combustibles".  Potencial de hidrógeno pH

El pH es muy importante ya que diversos peces de producción y ornamental requieren diferentes niveles de pH para poderse desarrollar bien y criar. Los niveles de iones de hidrógeno van de un rango de 0 al 14 entre más 0 es ácido y cerca de los 14 es básica y neutralidad es 7, algunas especies de peces

requieren un pH 6.5 a 9. Si hay cambios bruscos de pH puede provocar que se altere la inmunidad de los peces, no se alimente adecuadamente y en ocasiones aumento de la mortalidad. También el valor radica del tipo de suelo, los de tipo acido el pH es bajo se toman medidas para cambiarlo por ejemplo con cal ayuda a que el nivel de pH se aumente en acuarios de distintos tipos de sustrato y los ornamentos pueden descender ó aumentar el pH (Arboleda, 2006).  Alcalinidad y dureza

La alcalinidad debe ser medida también porque es el valor de las bases que están en el agua, como el carbonato y el bicarbonato, son sustancias de gran importancia porque funcionan como buffer estos permiten que la variación sea mínima del pH. El agua debe tener una alcalinidad de 20 ppm si este rango es bajo hay cambios bruscos de pH provoca estrés en los peces.

La dureza es la medición de iones de metales o elementos presentes en el agua como es el calcio y el magnesio, los iones estar relacionados con los carbonatos, los valores óptimos son los mismos a la alcalinidad. La dureza influye en el crecimiento de peces y plantas. La dureza del carbonato (KH) es el resultado de los compuestos de calcio y magnesio con ácido carbónico. Esta dureza de carbonatos aglutina ácidos, evitando que el pH caiga bruscamente, el valor ideal es de 5 y 10 ºdKH (grados de dureza carbonatada) (Arboleda, 2006).  Salinidad

Esta mide la cantidad de sales que hay en el agua, esta puede ser medida con el salinómetro. Esta se expresa en ppt es decir en gramos por litro. En agua dulces pueden tener un valor de 0.5 ppt, las aguas salobres desde 15 ppt, y la marinas pueden tener 37 ppt. Estos valores pueden variar si la salinidad baja mayor es el oxígeno disuelto, a mayor salinidad menor oxígeno disuelto varias

especies de peces pueden tolerar la salinidad como los salmones, truchas y tilapias entre otros en especies del ornato los vivíparos unos requieren sal y otros no (Arboleda, 2006).  El carbonato, nitrógeno y fosforo

El carbono puede introducirse en el agua por difusión e influyen en la descomposición de la materia orgánica y en los procesos de respiraciones de los organismos acuáticos, los peces eliminan CO2 que al interactuar con el agua surge el ácido carbónico; este ácido provoca que el pH baje. El carbono actúa con elementos como el carbono de calcio o de magnesio (Arboleda. 2006).

El fósforo es importante, ayuda a que se desarrolle el fitoplancton su fuente principal es la materia orgánica como abonos. Los peces liberan nitrógeno en las heces y también amonio que puede ser de dos formas amonio no ionizado (NH3) y el amonio ionizado (NH4). El NH· es toxico en el agua y produce incremento del pH provocando deterioro del agua (Arboleda, 2006).

El NH3 es transformado por las bacterias Nitrosomonas spp. a nitritos (NO2), que es tóxico para los peces, las bacterias lo transforman a nitrato (NO3) que no es tóxico. En acuarios se presenta que no existe la población adecuada para

convertir los nitritos en nitratos, existen en el mercado diferentes

sustancias que ayudan a que se generen bacterias para degradar los nitritos a nitratos como son Sera® nitrivec que ayudan a limpiar biológicamente el agua del acuario (Anónimo, 2011).

En acuarios la medición se realiza con el test de amonio (NH4) y amoniaco (NH3), si los valores son elevados no hay una buena función de las bacterias limpiadoras. Si el pH del acuario está por encima de 7, el amonio se transforma en amoniaco que es perjudicial porque hay daño en las branquias. Los niveles

de 0.02 mg/l

amoniaco son perjudiciales el valor ideal es de 0.0 mg/l.

(Anónimo, 2011).

6.2.3 MEDIOS DE CULTIVO

Múltiples son los medios en los que se pueden aislar hongos, dentro de los más comúnmente utilizados están: Medio Sabouraud Dextrosa (SAB), Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina (SAB G+C/SABHI G+C), BrainHeart infusión de sangre de carnero (BHI sangre), Papa Dextrosa Agar (PDA), fitolevadura y Sabouraud descritos a continuación siguiendo a Cañedo y Ames (2004).

6.2.3.1

Medio Sabouraud Dextrosa (SAB)

Se le considera el medio para mantener una amplia variedad de hongos para aislamiento y esporulación. Contiene 2 % de glucosa y es ligeramente ácido tiene un pH de 6,9. 6.2.3.2

Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina (SAB G+C/SABHI G+C)

Este medio clásico contiene antibióticos que permite el crecimiento de hongos filamentosos y levaduras e inhibe a una gran mayoría de bacterias. 6.2.3.3

Medio BHI y 10% de sangre de carnero (BHI sangre)

El agar BHI (Brain-Heart infusión), es un medio que viene enriquecido, se utiliza para la conversión hongo-levadura. 6.2.3.4

Papa dextrosa agar (PDA)

Es un medio usado para aislar todo tipo de hongo, contiene papa sin pelar 200g, Dextrosa 10g, Agar 18g, Agua destilada 1 litro. 36

6.2.3.5

Fitolevadura

Este medio se usa para aislar hongos a partir de animales, contiene Dextrosa 20g, extracto de levadura 5g, peptona 5g, Agar 18g, agua destilada 1litro. 6.2.3.6

Sabouraud

Es un medio de cultivo utilizado para aislar hongos de animales. Es un medio de cultivo para observar la morfología típica de los hongos, contiene dextrosa 20g, peptona 10g, agar 18g, agua destilada 1000 ml.

6.2.4 EXTRACTOS NATURALES

La fitoquímica estudia los componentes de las plantas mediante análisis químico cuantitativo y cualitativo, de los constituyentes secundarios elaborados y acumulados en ellos. Este campo evalúa las estructuras moleculares, propiedades

físicas,

propiedades

químicas,

métodos

separación,

purificación, biosíntesis, metabolismo, los cuales contribuyen a determinar la función biológica, farmacológica y la actividad de los metabolitos secundarios (Pedraza, 2000). Los metabolitos secundarios presentes en las plantas, no tienen una función específica en los procesos de fotosíntesis, transporte de solutos, respiración u otras funciones en los vegetales. Se pensaban que eran residuos metabólicos sin función, pero se ha descubierto actualmente que las sustancias halladas son parte de un mecanismo de defensa comparable al sistema inmunitario de los animales (Anaya, 2001), los cuales le brindan protección a la planta, contra agresiones por microorganismos patógenos como hongos, bacterias y virus. Estos compuestos se clasifican en dos grupos: las fitoanticipinas, que están de forma constitutiva en las plantas, las fitoalexinas aumenta cuando hay invasión microbiana (Domingo y López, 2003).

Muchas de las plantas se han aislado presentando cerca de 12.000 compuestos que constituyen solo el 10 % de los metabolitos secundarios, sin contar la gran variedad de plantas que faltan por estudiar (Domingo y López, 2003) y la variedad de sustancias aisladas que ya son usadas a nivel industrial y terapéutico. Como producto de la investigación en fitoquímica se puede realizar una aproximación al descubrimiento de nuevos tratamientos a partir de plantas (Mesa et al., 2006), para uso terapéutico en la prevención y control de estados patológicos y el reconocimiento de las propiedades y la eficacia de los aislados de plantas (Castillo y Martínez, 2007). Los extractos de las plantas son utilizados desde tiempos ancestrales para la cura de diferentes dolencias. Es así como existen diversos métodos para la elaboración de los extractos mediante la identificación y separación de porciones biológicamente activas presentes en hojas, tallos, flores, corteza de estas plantas, mediante el uso de solventes (alcohol, agua, etanol, clorometano, mezclados entre sí, u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción adecuado. Los extractos son una fuente de nuevos compuestos para el desarrollo de medicamentos que no generan contaminación y efectos secundarios a los peces (Pérez, 2011).

6.2.4.1

BRUSCA (Cassia occidentalis)

Es una planta perenne puede alcanzar alturas de 5 a 8 metros, las hojas son compuestas y alternas que varían de cuatro a seis pares, la inflorescencia son pocas por racimos auxiliares de flores con pétales de unos 2 cm de ancho (Figura 2). Las legumbres o vainas son de color marrón ligeramente curvados que pueden medir de 5 a 12 cm, en estos pueden contener hasta 40 semillas de color marrón de forma ovoide y de un tamaño de 4 milímetros (Stevens, 2001).

Clasificación taxonómica se reporta así Reino: Planta División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Rosidae Orden: Fabales Familia: Fabaceae Subfamilia: Cesalpinoideae Género: Cassia Especie: Cassia occidentalis (Cowan, 2012).

Figura 2. Cassia occidentalis

Esta planta suele conocerse con otros nombres como Bicho de café, busca, cafecillo, senna; a las cuales se le reconocen efecto farmacológicos en sus semillas, flores y hojas. Las semillas poseen actividad febrífuga, emenagoga y estomáquica, también posee acción diurética y se usa para tratar la indigestión, dispepsia y enfermedades prostáticas. Las hojas son usadas para la cicatrización de heridas, llagas, picazón, enfermedades cutáneas, fracturas de huesos, fiebre, infección de la garganta, presenta actividad antimicrobianas (antibacterianas y antifúngicas) (Vaijayanthimala et al., 2000).

Las componentes que se han encontrado en las semillas son lípidos, carotenoides, aminoácidos, carbohidratos, alcaloides, saponinas, taninos, mucílago, reina, aloe-emodina, crisofanol, galactomananos, toxoalbumina, xantona (casiolina), entre otros. Se han realizados estudios de los extractos donde se han comprobado efecto antimicótico y antibacteriano (Perumal y Ignacimuthu, 2000).

6.2.4.2

LIMONCILLO (Cymbopogon citratus)

Planta perenne que mide de 60 a 120 cm de altura, tallos muy ramificados de 1 a 2 metros de alto. (Figura 3) Las hojas están agrupadas cerca de la base, lineares de hasta de un 1 metro de longitud posee pequeñas vellosidades y sus bordes pueden ser cortantes es una planta que rara vez florece (Stapf, 2001) su clasificación taxonómica registrada en Plant Name Botany (2012)

Clasificación taxonómica Reino: División: Clase: Subclase: Orden: Familia: Género: Especie:

Plantae Magnoliophyta Liliopsida Commelinidae Poale Poaceae Cymbopogon Cymbopogon citratus (Stapf, 2001)

Figura 3.Cymbopogon citratus

Esta planta se conoce con diferentes nombres como caña santa, hierba de limón, limoncillo, limonaria, limonera, caña limonaria, lemongrass, se ha usado tradicionalmente como antiulceroso y antiespasmódico. Es una planta considerada de importancia económica en la agricultura de Estados Unidos de América y parte de Asia donde son cultivadas para propósitos comerciales como en la industria de cosméticos, insecticidas, jabones, perfumes; es usado en la medicina herbal para tratamientos del nerviosismo y de inflamaciones (Asaolu, Oyeyemi y Olanlokun, 2009). Sus hojas son utilizadas para preparar bebida aromática y té, para aliviar dolores estomacales e intestinales; es un constituyente principal en la cocina por su sabor a limón (Hindumathy, 2011), además de acción antibacteriana y antimicótica (Dutta et al., 2007).

De las partes se han aislados flavonoides, ácido caféico, ácido p-cumárico, fructuosa, sacarosa y compuestos volátiles: terpenos como el geraniol, citronelol y citral. En las hojas se ha encontrado un aceite esencial con los componentes:

aldehídos,

alcoholes,

cetonas,

ésteres,

terpenos

sesquiterpenos, geraniol y nerol. Las hojas contienen también alcaloides, taninos y flavonoides. (Guerra, 2005).

Algunas de las sustancias que contienen estas plantas incluyen a los fenoles y polifenoles, de los cuales el ácido cafeico y el cinámico son representantes de estos grupos, ambos con acción antimicrobiana, antiviral y antifúngica. También se pueden mencionar a los fenoles simples y ácidos fenólicos, catecoles y eugenoles (estos últimos considerados bacteriostáticos). La actividad antimicrobiana del catecol y del pirogalol, está directamente relacionada con el número de grupos hidroxilos que tiene el derivado fenólico. También están las quinonas (como las antraquinonas con acción bactericida y antifúngica para Pseudomonas), flavones, flavonoides, flavonoles y catequinas. Parte de los flavonoides inhiben in vitro el crecimiento de V. cholerae, Streptococcus y otras bacterias y algunos hongos (Yildirim, 2000). Los flavonoides también exhiben actividad antiviral; los taninos presentan actividad astringente. Se considera que la acción de los fenoles y polifenoles

contra los microorganismos se debe a la inhibición enzimática posiblemente por acción sobre los grupos sulfhídricos de sus aminoácidos de cisteína o por medio de reacciones más inespecíficas con proteínas bacterianas. Los compuestos fenólicos que poseen una cadena lateral a nivel de en un bajo nivel de oxidación y que no contienen oxígeno, son clasificados como aceites esenciales y a veces se citan como agentes antimicrobianos bacteriostáticos contra hongos y bacterias (Perez, Isaza y Acosta, 2007), y posiblemente la inhibición enzimática de los compuestos oxidados, mediante reacción de los grupos sulfihidrilo o por interacción con proteínas (Domingo y López, 2003). Las quinonas son anillos aromáticos que tienen alta reactividad, forman aminoácidos hidrofílicos de las proteínas, estas inactivan la proteína y anulando su función. Los compuestos esteroidales pueden ocasionar interferencia en los procesos de síntesis vitales en la célula bacteriana y los triterpenos poseen acción depresora sobra la tensión superficial de la célula bacteriana, alterando su selectividad en la membrana citoplasmática para el intercambio de sustancias (Domingo y López, 2003). Los flavonoides y cumarinas pueden actuar por diversas vías dependen de los grupos sustituyentes que aparecen unidos a su núcleo estructural, son sustancias muy disímiles en cada especie vegetal, debido a que este grupo posee gran variedad de mecanismos de acción contra las bacterias (Cuellar y Hussein, 2009). Los metabolitos secundarios de las plantas poseen estructuras más complejas comparadas con los fármacos sintéticos, y funcionan en combinación para producir un efecto, esto hace que a los patógenos les sea más difícil desarrollar resistencia frente a los extractos vegetales (Cotilla et al., 2007).

7.1 MARCO LEGAL

A continuación contextualizamos la normatividad vigente para el desarrollo de actividades en laboratorio y el compromiso bioético del médico Veterinario en su quehacer dentro de los procesos de investigación y experimentación.

DECRETO 77 DE 1997, CAPITULO II, De la clasificación de los laboratorios clínicos ARTÍCULO 4. Clasificación. Para efectos del presente decreto, los laboratorios clínicos públicos y privados se clasificarán en bajo, mediano y alto grado de complejidad,

acuerdo

con

infraestructura,

el recurso

humano,

administrativo, tecnológico, grado de especialización de las pruebas, exámenes y procedimientos que realicen. Las condiciones que rigen para cada grado se ajustarán a las estipulaciones que para tal efecto se determinen en el Manual de Normas Técnicas, Científicas y Administrativas adoptado por el Ministerio de Salud. Parágrafo. Todos los laboratorios clínicos independiente de su grado de complejidad, deben estar en capacidad de apoyar la vigilancia epidemiológica de la población en su área de influencia y serán identificados específicamente al público, con el nombre o razón social registrada y vigente ante la autoridad competente. CAPITULO X, Del control y vigilancia sanitaria, medidas de seguridad, procedimientos y sanciones ARTÍCULO 33. Objeto de las medidas sanitarias de seguridad. Las medidas sanitarias de seguridad, tienen por objeto prevenir o impedir que la ocurrencia de un hecho o la existencia de una situación determinada, atenten o puedan significar peligro para la salud individual o colectiva.

ARTÍCULO 34. Actuación. Para la aplicación de las medidas sanitarias de seguridad, las autoridades sanitarias competentes podrán actuar de oficio, por conocimiento directo, o por información de cualquier persona. ARTÍCULO 35. Comprobación o verificación. Una vez conocido el hecho, recibida la información o la solicitud, según el caso, la autoridad sanitaria competente procederá a comprobarlo, a evaluar la situación de manera inmediata, y a establecer la necesidad de aplicar una medida de seguridad, como consecuencia de la violación al presente decreto u otras normas sobre la materia, o de los peligros que la misma pueda comportar para la salud individual o colectiva. ARTÍCULO 36. Aplicación de las medidas sanitarias de seguridad. Establecida la necesidad de aplicar una medida sanitaria de seguridad, la autoridad competente, teniendo en cuenta la naturaleza del artículo, producto, o el hecho que origina la violación de las disposiciones del presente decreto y demás normas sanitarias y de la incidencia sobre la salud individual o colectiva, impondrá la medida correspondiente (Forero, 1997). LEY 576 DEL 2000, (febrero 15), Diario Oficial No 43.897, de 17 de febrero de 2000. Código de Ética para el ejercicio profesional de la medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y zootecnia TITULO

I.,

LAS

DISPOSICIONES

GENERALES,

CAPITULO

DECLARACIÓN DE PRINCIPIOS ARTÍCULO 2. Los profesionales a quienes se les aplica esta ley, deben tener presente que son principios éticos y morales, rectores indiscutibles ajenos a cualquier claudicación, entre otros, el mutuo respeto, la cooperación colectiva, dignificar la persona, acatar los valores que regulan las relaciones humanas, convivir en comunidad, cumplir voluntariamente los principios que guían, protegen y encauzan la actitud del hombre frente a sus deberes, obligaciones y derechos.

ARTÍCULO 3. Los profesionales objeto de la presente ley, como integrantes de la sociedad, deberán preocuparse por analizar los diferentes problemas de la vida nacional en el campo de su ejercicio profesional, teniendo la responsabilidad social de contribuir eficazmente al desarrollo del sector agropecuario del país.

ARTÍCULO 4. Los profesionales de la medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y de la zootecnia, son servidores de la sociedad y por consiguiente quedan sometidos a los principios que se derivan de la naturaleza y dignidad humanas, debiendo por tanto conservar una intachable conducta pública y privada. ARTÍCULO 7. Los profesionales sujetos a la presente ley, se vincularán con el desarrollo de estudios relacionados con la conservación de los ecosistemas animales, su entorno de vida y bienestar, sistemas de cofinanciamiento y prácticas de producción animal, frente a los sistemas apropiados de producción y desarrollo tecnológico. Teniendo como objetivo primordial el bienestar del ser humano, dentro de los más altos y sanos principios éticos.

ARTÍCULO 8. El médico veterinario, el médico veterinario y zootecnista y el zootecnista, deberán ejercer su profesión en un todo de acuerdo con lo establecido en la presente ley y en las demás normas legales vigentes sobre la materia. CAPITULO 7, DE LA RELACIÓN DEL MÉDICO VETERINARIO, EL MÉDICO VETERINARIO

ZOOTECNISTA

CON

LAS

ASOCIACIONES PROFESIONALES ARTICULO 53. Es compatible con el buen ejercicio profesional pertenecer o formar parte de asociaciones científicas o gremiales de carácter general o de especialistas, que propendan por el intercambio científico, el desarrollo personal, intelectual y social y la solidaridad de gremio.

ARTICULO 54. Todos los profesionales de las ciencias animales deberán cumplir cabalmente las normas y preceptos establecidos en los estatutos y 45

reglamentos de cada asociación a la que pertenezcan y están obligados a cumplir estrictamente los principios éticos contemplados en esta ley.

ARTICULO 55. Las asociaciones de profesionales de las ciencias animales, tendrán como objetivo, entre otros, elevar el nivel profesional de sus asociados, el fortalecimiento de las instituciones, el incremento del intercambio técnico científico para mejorar la calidad de servicio, el engrandecimiento de la profesión y velar por el cumplimiento de lo establecido en esta norma Congreso de la Republica.

8. METODOLOGÍA

8.1 TIPO DE ESTUDIO

Este trabajo se circunscribe como experimental, correlacional cuantitativo ya que los métodos y variables serán evaluadas acorde a lo descrito así: 

Experimental:

Permite establecer causación o relación de causa y efecto de un fenómeno a través de procedimientos controlados donde de manipulan y controlan las variables que ejercen incidencia sobre el fenómeno (Grajales, 2000). 

Cuantitativo:

El paradigma donde se recoge y analiza datos sobre variables y estudia las propiedades y fenómenos cuantitativos que son medibles. (Herrera, 2008). 

Correlacional:

Es el tipo de estudio que persigue medir el grado de relación existente entre dos o más variables o describe relaciones entre dos o más variables en un momento determinado (Vera, 2011)

8.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

8.2.1 Preparación del material vegetal

Se recolectaron 300 gramos de cada planta en el municipio de San Mateo (Boyacá) vereda Monterredondo situada a 6 grados, 24 minutos y 29 segundos de latitud norte, 72 grados, 33 minutos y 37 segundos de longitud oeste, con una altitud de 2300 metros sobre el nivel del mar. Se lavaron con abundante agua destilada y se deshidrataron por 8 días a las sombra en un lugar seco (Figura 4).

Figura 4. Plantas deshidratadas Brusca (derecha) y limoncillo (izquierda)

8.2.2 Elaboración de los extractos

Las hojas de las plantas deshidratadas se trituraron, pesaron y se empacaron en tela con malla, luego en un frasco de 4 litros de capacidad se realizó un proceso de maceración en frio con etanol desodorizado, agitándolo y dejando en reposo por 72 horas, manteniéndolos protegidos de la luz directa (Figura 5).

Figura 5. Proceso de extracción de las plantas Limoncillo y Brusca.

8.2.3 Proceso de evaporación del etanol

Los extractos de brusca y limoncillo contenidos en los frascos fueron filtrados y colocados en frascos de vidrio de 50 ml, para luego someterlos a evaporación a baño maría a una temperatura de 35ºC, añadiendo 20 ml de los extractos cada 24 horas, durante un mes y se conservaron a nevera a 4ºC protegidos de la luz (Figura 6).

Figura 6. Brusca y Limoncillo (Flechas negras)

8.2.4 Pruebas microbiológicas

Este trabajo se desarrolló en el laboratorio de Microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos. 8.2.4.1 Aislamiento de Saprolegnia spp. Antes del aislamiento se lavaron las ovas con agua destilada estéril (secuencia figura 7), seguidamente se realizó raspado de las ovas del pez Escalar infectadas con el hongo en el laboratorio de microbiología del Instituto de Acuicultura de los Llanos en Villavicencio (Meta) tal como lo describe Silva (2011); los micelios fueron sembrados en agar PDA (Agar Papa Dextrosa) e incubados a 26º C por 72 horas. Se tomaron muestras del hongo de las ovas en cubreobjetos, se fijaron con azul de lactofenol y se observaron al microscopio

registrando

características

macroscópicas

microscópicas

siguiendo a Lizarazo, (2011) y Parra et al., (2008). Una vez aislado el microorganismo en el PDA, se tomaron trozos de agar con el micelio y se colocaron en tubos tapa rosca con 5 ml de agua destilada estéril para su conservación, en el laboratorio de Microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos (Figura 7).

Ovas con hongo

Microscópica

Lavado

Tinción

Siembra

Montaje hongo

PDA Figura 7. Proceso de aislamiento del patógeno. 50

Macroscópica

Conservación

8.2.5 Inhibición del crecimiento micelial

8.2.5.1 Preparación de las diluciones de los extractos. Para realizar las diluciones se agregó un 1 gramo del extracto puro más 9 ml de agua peptonada al 0,1% para tener la dilución 10-1, del tubo anterior se tomó 1 ml para adicionarlo en un tubo que contenía 9 ml de agua peptonada al 0,1% y se obtuvo la dilución 10-2, y de este se tomó 1 ml y se pasó a un tubo que contenía 9 ml de agua peptonada (dilución 10-3) (Figura 8). Se realizaron dos diluciones seriadas para cada extracto.

10-1 10-2

10-3

10-1 10-2 10-3

Figura 8. A. Preparación del agua peptonada al 0.1% para las diluciones. B. Diluciones del extracto de Brusca. C. Diluciones del extracto de Limoncillo.

8.2.6 Método de bloque en agar Las diluciones de los extractos 10-1, 10-2 y 10-3 se mezclaron con agar fundido PDA a 45ºC, y se sirvieron en las cajas de Petri de manera independiente, a cada caja se le colocó en el centro de la caja un bloque de 5 mm de agar con crecimiento micelial del hongo Saprolegnia spp (Figura 9), estos se incubaron a 17ºC por 7 días, el testigo absoluto se inoculó sobre agar PDA sin extracto (Control negativo).

10-3

10-2

10-1

Puro

-1

-2

-3

Figura 9. Montaje de las cajas con agar, bloque con micelio puro y diluciones 10 10 y 10

La inhibición de crecimiento radial se calculó con base al diámetro del crecimiento radial (medido en mm) del hongo sin el efecto del extracto, menos el diámetro en mm del hongo influenciado por el extracto expresado en porcentaje siguiendo a Patiño y Rodríguez (2001) así: %IM = CML-CMI x 100 CML Dónde: %IM: Porcentaje de inhibición crecimiento micelial CML: Crecimiento micelial libre CMI: crecimiento micelial influenciado 

Prueba de acción fungistática o fungicida

Esta se determinó a partir de las cajas con inhibición con extracto. Se tomaron muestras con asa micológica y fueron sembradas en agar sin extracto y se incubaron a 17ºC por 7 días.

8.2.7 Evaluación antimicótica

8.2.7.1 Método de difusión en pozo



Preparación de la suspensión de esporas

La suspensión de esporas se obtuvo de un cultivo de Saprolegnia spp. previamente establecido; la remoción de las esporas se realizó mediante asa micológica hacia un tubo con 1 ml de agua destilada estéril (Figura 10)

Figura 10. Inóculo preparado con agua destilada.

Se ajustó el inóculo hasta obtener una concentración de 1X106 esporas/ml realizando el recuento en la cámara de Neubauer aplicando la siguiente fórmula:

Conidios/ ml= N x Diluciones de la cámara x Factor de la cámara.

Figura 11. Presencia de esporas teñidas con azul de lactofenol en la cámara de Neubauer.



Montaje de la técnica: Esta se realizó mediante siembra masiva del hongo

Saprolegnia

spp.

partir

solución

esporas

(1X106esporas/ml). En cajas de petri con agar P.D.A (10 con su respectivo control) previamente preparados, se realizaron dos pozos, mediante pitillos estériles, a los cuales se le adiciono 25 µl puro y de cada dilución de los extractos de Brusca y Limoncillo (10-1, 10-2 y 10-3). En una de las cajas se colocó agua destilada esteril como control negativo (Figura 12) y como control positivo se utilizó Nistatina y Ketoconazol, se incubaron a 17ºC por 7 días (Patiño y Rodríguez 2001). Al día 7 de incubación se midió el diámetro del halo de inhibición en cada cultivo y de los controles.

-1

Figura 12. Caja con los pozos que contienen la dilución 10 extractos de brusca (B) y limoncillo (L).

8.2.7.2 

Método de difusión en disco

Montaje de la técnica: En este método se utilizaron sensidiscos de papel de filtro de 5 mm de diámetro esterilizados (Figura 13). Se realizó siembra masiva de la suspensión de esporas en agar PDA, y se colocaron dos sensidiscos impregnados con el extracto puro y con las diferentes diluciones, como control positivo se utilizó ketoconazol y nistatina en presentación liquida, el control negativo disco impregnado con agua destilada esteril, las cajas se incubaron por 7 días a temperatura 17 ºC después de este tiempo se tomaron medidas de las cajas que presentaron halos de inhibición.

A partir de las diferentes diluciones de cada extracto se determinó la concentración mínima inhibitoria, observado el efecto a los 7 días. La concentración mínima inhibitoria se tomó como la más baja concentración que inhibe el crecimiento fúngico en los cultivos. El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente fórmula según Martínez (1996), teniendo en cuenta la inhibición en el método en pozo y en disco. %efecto Inhibitorio

diámetro halo de inhibición del extracto *100 Diámetro halo de inhibición control positivo

Figura 13. A. Disco impregnado con el extracto puro B. Cajas que contienen el extracto puro y -1

diluciones (10 ) de brusca y limoncillo.

8.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para el análisis de los datos se realizó análisis descriptivo. Teniendo en cuenta las réplicas para cada tratamiento sobre la cepa micótica obteniéndose como medidas de tendencia central y de dispersión, los datos se consolidaron en Microsoft Excel 2010. La comparación de los métodos en disco y en pozo se realizaron con base a la fórmula según Martínez (1996).

8.4 HIPÓTESIS

Ho: Ninguna de las diluciones de los extractos obtenidos de las especies Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus presenta actividad antimicótica frente a Saprolegnia spp.

Ha: Las diluciones de los extractos obtenidos de las especies Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus presentan actividad antimicótica frente a Saprolegnia spp.

9. RESULTADOS Y ANÁLISIS

9.1 IDENTIFICACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE Saprolegnia spp.



Características

macroscópicas:

micelio

presentó

textura

aterciopelada y algodonosa, de color brillante y blanco inicialmente, que con el tiempo se tornó amarillo, presentó esporas visibles tal y como lo reporta Lizarazo (2011) en sus observaciones (Figura 14 y 15).

Figura 14. Características macroscópicas del hongo Saprolegnia spp.

Características microscópicas: Se observaron hifas cenocíticas ramificadas y zoosporas tal y como lo describe Parra et al., (2008) HC Z

Figura 15. Características microscópicas se observa hifas cenocíticas (HC) y zoosporas (Z).

9.2 CRECIMIENTO MICELIAL (Método en bloque en agar)

En las mediciones realizadas bajo este método se observó a los 7 días de incubación (ver tabla 1) que el extracto de limoncillo tuvo efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial de Saprolegnia ssp (ver figura 16 a.), mientras que el extracto de brusca presento crecimiento masivo de hongo, tal y como se observa en la figura 16b. Las medidas realizadas se calcularon según la fórmula de Patiño y Rodríguez (2001), (Tabla 1) (Gráfica 1).

Figura 16. a). Inhibición de crecimiento micelial del efecto del extracto puro de limoncillo b). Desarrollo micelial del hongo con el extracto puro de Brusca.

En la tabla 1 y gráfica 1 se muestran los datos obtenidos calculando el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (%IM) para cada extracto; el extracto puro de limoncillo presentó un IM de 58.3% y brusca un 6.25%, las diluciones evaluadas no evidenciaron efecto inhibitorio. El control negativo presento un desarrollo masivo de los micelios del 100%, considerando que la caja medida tenía un diámetro de 96 mm.

Tabla 1 Resultados de la actividad de los extractos con el método de bloque en agar.

METODO EN BLOQUE EN AGAR PORCENTAJE DE INHIBICION DE CRECIMIENTO MICELIAL DILUCIONES

EXTRACTOS

CONTROL NEGATIVO

BRUSCA

LIMONCILLO

AGUA DESTILADA

(%)

(mm)

PURO

6.25

58.3

10¯¹

10¯²

10¯³

porcentaje de crecimiento micelial 70

Porcentaje

60 50 40 30

Limoncillo

Brusca

10 0 Puro

10¯¹

10¯²

10¯³

Tratamiento

Gráfica 1. Porcentaje de crecimiento micelial del extracto de Brusca y Limoncillo.

9.3 CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA

A la evaluación de los extractos no se registró respuesta con la concentración mínima inhibitoria, debido a que se evidenció crecimiento micelial en todas las cajas con el extracto puro y las diluciones propuestas para los diferentes métodos (Figura 17). No se observó halos de inhibición.

10-3

10-1

10-3

10-2

Figura 17. A. Método de difusión en disco con extracto de Brusca (B) y limoncillo (L) B. Método de difusión en pozo C. Método en bloque en agar sin presencia de efecto inhibitorio -3

sobre Saprolegnia spp. para la dilución 10 . D. Métodos pozo y disco sin inhibición para la -1

-2

diluciones (10 , 10 ).

9.4 ACCIÓN FUNGISTÁTICA Y FUNGICIDA

No se evidencio acción fungistática y fungicida sobre Saprolegnia spp, encontrándose crecimiento micelial abundante (Figura18). B

Figura 18. Desarrollo micelial sin acción fungistática y fungicida para en los métodos en disco (A) y en pozo (B).

9.5 EFECTO INHIBITORIO

9.5.1 Método de difusión en pozo

El extracto de limoncillo mediante el método de difusión en pozo presento halo de inhibición con el extracto puro, para el caso de las

diluciones ninguna

registro halo. En relación al extracto de brusca no hubo inhibición (figura 19) en ninguno de los casos puro y diluciones, las medidas del crecimiento micelial y porcentaje del efecto inhibitorio se observan Tabla 2 y Tabla 3. A K

N C-

Figura 19. Inhibición del extracto en pozo A. presencia de halo de inhibición alrededor del pozo con el extracto puro de limoncillo (L), y crecimiento de la Saprolegnia spp. sobre el pozo con extracto de Brusca (B) sin efecto. B. control positivo

con halos de inhibición con el

medicamento ketoconazol (K) C. halos inhibición con la nistatina D. control negativo con agua destilada esteril con desarrollo del hongo.

En la tabla 2 se observan los valores obtenidos para el extracto puro de limoncillo (L1) en relación al porcentaje del efecto inhibitorio frente a la nistatina de 24% con un halo de 25mm; en la contra muestra de limoncillo (L2) se registra un efecto inhibitorio de 27% con un halo de 22 mm; con respecto al limoncillo frente al ketoconazol, el L1 presento un 35% con un halo de 17mm, en el caso de L2 reportó un 46% con un halo de 13 mm. El extracto de brusca (B1) y duplicado (B2) no tuvo efecto para el puro y las diluciones. Tabla 2. Resultados de la actividad de los extractos con la prueba del método de difusión en pozo.

DILUCIONES

EXTRACTOS B1 B2 L1 L2 % % % % PURO 0 0 24 27 DUPLICADO 0 0 35 46 10¯¹ 0 0 0 0 10¯² 0 0 0 0 10¯³ 0 0 0 0

METODO DE DIFUSION EN POZO PROCENTAJE DE EFECTO INHIBITORIO CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO NISTATINA KETOCONAZOL AGUA DESTILADA (mm) (mm) (mm) 25 17 95 22 13 -

Los resultados obtenidos en la tabla 3 muestran las medias y desviación estándar de los resultados obtenidos con el extracto puro de Cymbopogon citratus a los 7 días de incubación, calculado con la fórmula de porcentaje de efecto inhibitorio para el método en pozo mostrando una media 40,5 ± 5,5, desviación estándar 7.778167459 y varianza 60.5 estos valores dieron altos debido a que se obtuvieron dos datos en este método y las diluciones evaluadas no presentaron inhibición sobre el hongo Saprolegnia spp. Tabla 3. Estadística descriptiva para método en pozo

EXTRACTO/MEDICAMENTOS

DESVIACIÓN ESTANDAR

NISTATINA

2,121320344

4,5

25,5± 1,5

KETOCONAZOL

7,778167459

60,5

40,5 ± 5,5

VARIANZA

ERRORMEDIA

9.5.2 Método difusión en disco

En la gráfica 2 se observa como el diámetro de inhibición del extracto puro de Limoncillo (6 mm), fue menor comparado a los dos medicamentos con un halo de inhibición de 22 mm en Nistatina y 15 mm de Ketoconazol. Además se observa una diferencia comparativa entre los controles con el mayor efecto inhibitorio en Nistatina.

Diametro de inhibición 25 20 15 10

Limoncillo

NISTATINA KETOCONAZOL

Grafica 2. Diámetro de inhibición en disco.

Utilizando el método de difusión en disco se observó mayor efecto inhibitorio del crecimiento del hongo con el extracto de limoncillo frente al extracto de brusca que no tuvo respuesta evidente presentando crecimiento del hongo similar al observado en el control negativo (Figura 20 A y C), a los 7 días de incubación se tomaron medidas del crecimiento micelial, los datos obtenidos se calcularon según la formula porcentaje del efecto inhibitorio enunciada por Martínez (1996) que da como resultado para el extracto puro de limoncillo un 27% y un 40% para cada caja evaluada (Tabla 4), (Gráfica 3). Los datos del efecto inhibitorio de los extractos frente a los controles positivos se presentan en la tabla 4, permitiendo establecer que el extracto de limoncillo

(L1) y duplicado (L2) frente a Nistatina tuvo un efecto inhibitorio del 27% con 22 mm de halo de inhibici贸n, frente a Ketoconazol de 40% con 15 mm de halo. El extracto de Brusca (B1) y duplicado (B2) no tuvieron efecto tanto para el puro como para las diluciones.

C-

Figura 20. A. Efecto inhibitorio del hongo con el extracto puro de limoncillo alrededor del disco y duplicado B. Acci贸n de los medicamentos control con mayor halo de inhibici贸n para la nistatina (N) y menor halo para el ketoconazol (K) C. Control negativo.

Tabla 4 Resultados de la actividad de los extractos con la prueba método de difusión en disco.

METODO DE DIFUSIÓN EN DISCO PORCENTAJE DE EFECTO INHIBITORIO DILUCIONES

EXTRACTOS

CONTROL POSITIVO

CONTROL NEGATIVO

B1 B2 L1

NISTATINA

KETOCONAZOL

(mm)

AGUA DESTILADA (mm)

PURO

DUPLICADO

10¯¹

10¯²

10¯³

Efecto inhibitorio extractos Vs medicamentos 45 Porcentaje de inhibición

40 35 30 LIMONCILLO, KETOCONAZOL

25 20

LIMONCILLO, NISTATINA

15 10 5 0 LIMONCILLO, KETOCONAZOL

LIMONCILLO, NISTATINA

Extractos patron

Grafica 3. Porcentaje del efecto inhibitorio en disco de los extractos con los medicamentos

En la gráfica 4 se muestran los resultados obtenidos en los dos métodos y al compararlos no hubo diferencias en cuanto al extracto puro de limoncillo presentado un halo de 6mm para los dos métodos.

Diametro de inhibición 30 25

20 15

Nistatina

Limoncillo Ketoconazol

Disco

10¯³

10¯²

10¯¹

Puro

KETO.

NISTA.

10¯³

10¯²

10¯¹

Puro

KETO.

NISTA.

Pozo

Grafica 4 Comparación diámetro de inhibición del método en disco y método en pozo del extracto de limoncillo.

En la gráfica 5 se muestran los resultados de los dos métodos. En difusión en disco hay mayor porcentaje de inhibición obtenido por el extracto puro de limoncillo (40%) con respecto al ketoconazol. En pozo el porcentaje extracto de limoncillo con una media 40.5%, siendo mayor en el ketoconazol En cuanto al porcentaje de nistatina con el extracto hay mayor acción en el método en disco (27%) comparado con la media de la nistatina 25,5% en el método en pozo. En cuanto a la comparación de los métodos, ambos presentan comportamientos similares con el extracto y halos de los medicamentos.

Efecto inhibitorio de los extractos vs medicamentos

Porcentaje de inhibici贸n

45 40 35 Limoncillo, Ketoconazol 30

limoncillo, Nistatina

25 20 KETO.

NISTA.

Difusion en disco

KETO.

NISTA.

Difusion en pozo

Grafica 5 Comparaci贸n del porcentaje del efecto inhibitorio de los m茅todos en pozo y en disco con el extracto de limoncillo.

10. DISCUSIÓN

Las plantas con acción fúngica tienen en común metabolitos activos como flavonoides, esteroides y triterpenoides según García, Correa y Rojas (1996); tal y como lo reportan Curifura et al., (2012) y Sanabria (1983) en sus estudios. No obstante para el caso de Limoncillo y la Brusca, en virtud de su composición química no se evidencio la actividad antimicótica esperada. Para el caso de la Saprolegnia spp. se reportan extractos con efectos fungistáticos y fungicidas como el aceite esencial de Cymbopogon citratus (Mishra y Dubey, 1994), Citrullus colocynthis (Gholampuor et al., 2012), Aceite ozonizado de Maravilla (Silva, 2012) y esencia de Eugenol sp (Mortada et al., 2000). Para el caso Cymbopogon citratus de Alzate et al., (2009) le reporta como una especie a partir de la cual el metabolito como el citral de pueden inhibir el crecimiento del hongo C. acutatum bajo condiciones in vitro, atribuible a que afecta la pared de la célula fúngica, alterando completamente la esporulación y la germinación de las esporas. Adicionalmente Garcia et al., (2008) reportan que el citral y el citronelal inhiben la germinación de la conidias y crecimiento micelial de Colletotrichum musae lo que se confirmaría que por sus propiedades el efecto inhibitorio del limoncillo es la esporulación y germinación de Saprolegnia spp, pudo haberse atribuido a los metabolitos anteriormente descritos. Mishra y Dubey (1994) a su vez reportan que el extracto de Limoncillo mostró un máximo de inhibición de 52%

sobre Aspergillus flavus con una

concentración minima inhibitoria de (CMI) 500 ppm. Contrario a lo observado en este estudio donde no se evidenció CMI con las diluciones evaluadas presentando crecimiento del hongo Saprolegnia spp. Según reportes de Caruana et al., (2012) evaluaron los extractos de las plantas Atractylodes macrocephala, semilla Zingiber officinale, crisantemo y yuca sobre Saprolegnia australis, las cuales tuvieron el mismo efecto al verde malaquita en

concentraciones de 10 ppm, con el método de difusión en agar. Este mismo método usado por Nguefack et al., (2004) reporta que el aceite esencial de Cymbpogon citratus redujo hasta un 0.64% el crecimiento micelial de A. flavus y máximo potencial antifúngico a concentraciones de 1000 ppm. Mishra y Dubey (1994) reportan que el extracto de Cymbopogon citratus redujo crecimiento micelial de F. moniliforme de 64% a concentración de 200 ppm, reducción de A.flavus y A. fumigatus de 48% y 77% a concentraciones de 300 ppm, e inhibición total a concentraciones de 1200 ppm. En este estudio este valor se acerca al obtenido con el extracto puro de Limoncillo que presentó inhibición de 58.3% sobre el hongo con el mismo método. Según reportes de Ghasemi et al., (2004) evaluaron los extractos de Mentha logifolia y Satureja bachtiarica y Hyssopus officinalis sobre Saprolegnia parassitica obteniendo porcentajes de crecimiento de inhibición 81.1% y 77.4% con el extracto de M. logifolia a concentraciones de 500 y 250 µg ml-1, con el extracto de S. bachtiarica 82.8% y 68.9% con las concentraciones de formalina de 10 µl ml-1 y con Hyssopus offcinalis 40.5% y 38.3% con las concentraciones de 500 y 250 µg ml-1, demostrando que están plantas tienen alto efecto sobre ovas infectadas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) con Saprolegnia spp. Moreno et al., (2011) reporta la actividad del extracto de Larrea tridentata sobre Aspergillus flavus y Penicillium spp. obteniendo halos de inhibición de 5 mm para aspergillus, y 6 mm para Penicillium spp. Mediante el método de difusión en pozo; en este estudio esta medición es la misma obtenida con el extracto puro de Cymbopogon citratus sobre Saprolegnia spp con halos de inhibición de 6mm con el mismo método. Estudios realizados por Gholampuor et al., (2012) evaluaron extractos metanólicos, alcohólicos y agua de Citrullus colocynthis en Saprolegnia parassitica, encontrando que mediante el método de difusión en disco el extracto que presentó mayor sensibilidad fue el metanólico, y reportaron que la concentración mínima fungicida (CMF) y concentración mínima inhibitoria (CMI)

fue de 25 x 10mg/ml y 625 x 10 mg/ml respectivamente; demostrando que el extracto de C. colocynthis es efectivo para la saprolegniasis y puede sustituir al verde malaquita. Metin et al., (2013) realizando el mismo estudio in vitro e in vivo con el mismo método con el extracto de Satureja cunifolia a concentraciones de 250 µg ml-1 y CMI 50 µg ml-1 reportaron que es efectiva para Saprolegnia parassitica, en el estudio in vivo se manejaron diferentes concentraciones por 21 días, logrando mayor porcentaje de eclosión con las concentraciones de 5 y 10 ppm. En la comparación del método en disco y en pozo los datos netos obtenidos para disco (27%, 40%) y para pozo el promedio de los halos fueron 23% y 30% del porcentaje del efecto inhibitorio, no se evidencia diferencias en los datos siendo útil cualquiera de los dos métodos para evaluar la efectividad de los extractos para este estudio. Según López et al., (1997) evaluando el extracto alcohólico de pino macho (Pinus caribacea) en Microsporum canis utilizando como control positivo la nistatina obteniendo halo de 2.0 cm igualando la acción del extracto igualado. Cerca al obtenido en este estudio con halo de 22 mm con el mismo medicamento.

11. IMPACTO

Utilizando nuevas alternativas para tratar y prevenir enfermedades micóticas con extractos naturales se demostraría que existen otras opciones para tratar estas infecciones y con posteriores estudios in vivo, se lograría mejorar la producción, comercialización y mejoramiento de peces ornamentales y de producción sin generar tanto impacto en al ambiente acuático y evitando de que los organismos generen resistencia ante los tratamientos.

12. CONCLUSIONES



Para el método de bloque en agar, el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (%IM) del extracto etanólico puro de Cassia occidentalis fue de 6.25% comparado con Cymbopogon citratus que presentó un 58.3%, las diluciones evaluadas no evidenciaron efecto inhibitorio.



En este estudio no presentó concentración mínima inhibitoria frente a Saprolegnia spp, y se podría determinar manejando metabolitos activos para detectar su efecto, debido a que hay reportes en donde se ha evidenciado respuesta frente a este hongo.



La acción fungistática y fungicida no se evidenció con el extracto etanólico de limoncillo, se podría determinar con otros medios de extracción como aceite esencial, éter de petróleo, metanol, alcohol.



Los métodos difusión en pozo y en disco evaluados no presentan diferencias en cuanto al efecto del extracto, siendo útiles para la evaluación del efecto inhibitorio para este estudio.



La evaluación de la actividad antimicótica del extracto etanólico de cassia occidentalis (brusca) y cymbopogon citratus (limoncillo) no presento efecto sobre la cepa Saprolegnia spp,

13. RECOMENDACIONES



Es necesario recopilar información sobre plantas que hayan sido estudiadas, debido a que hay un alto porcentaje por explorar y que no se conocen sus efectos ante hongos acuáticos.



Durante

transcurso

del

trabajo

campo

presentaron

inconvenientes en cuanto a la disponibilidad de material de laboratorio se recomienda que se dote instrumental, habrán convenios con otras universidades e incentivar a los estudiantes para que realicen sus trabajos de campo en los laboratorios de la universidad. 

Debido a que el extracto de limoncillo presentó una baja inhibición, es necesario evaluar otras plantas que tengan mayor efecto ante este patógeno.



Es necesario continuar en busca de plantas que tengan acción fúngica para esta patología, debido a que no hay tratamientos sintéticos efectivos que tengan acción fungicida.



Evaluar metabolitos como el citral de esta planta, que inhiben la germinación y esporulación de Saprolegnia spp., mediante diferentes métodos de extracción y a diferentes concentraciones.

14. BIBLIOGRAFIA

ALEXOPOULUS & MIMS. (1985). Introducción a la Micologia. omega. EDS., Universidad de Barcelona. Barcelona. 650p ALVARADO,

V.,

& MORINI,

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