Evaluación de la concentración letal 50 y los efectos histopatológicos de lorsban® a 96 horas en ded by Medicina Veterinaria JDC

-EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL 50 Y LOS EFECTOS HISTOPATOLÓGICOS DE LORSBAN® A 96 HORAS EN DEDINOS DE CARPA KOY (Cyprinus carpio) BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO

Modalidad Investigación

HOLMAN ROLANDO GAMBOA PEÑA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2014 1

EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL 50 Y LOS EFECTOS HISTOPATOLÓGICOS DE LORSBAN® A 96 HORAS EN DEDINOS DE CARPA KOY (Cyprinus carpio) BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO

HOLMAN ROLANDO GAMBOA PEÑA

Director: LUDY PAOLA VILLAMIL MORENO MVZ, M. Sc. en Acuicultura

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2014

Nota de aceptaci贸n: __________________________________ __________________________________ __________________________________ __________________________________ __________________________________ __________________________________

__________________________________ Firma del Director del Proyecto

__________________________________ Firma del Jurado

Tunja, 29 de Agosto de 2014

DEDICATORIA

En primera instancia a Dios, quien es el que me ha permitido llegar a este punto y me dio la sabiduría y paciencia para vencer aquellos obstáculos que en momentos querían truncar el camino. A mi Padre Hernán Gamboa y Madre Luz Estella Peña, fundamentalmente por su gran amor, apoyo, comprensión y confianza que día a día fortalecieron mis ganas de seguir adelante; a quien jamás encontraré la forma de agradecer sus sacrificios para que hoy pueda alcanzar esta gran y anhelada meta. A mis hermanos Sebastián y Esteban Gamboa, por su paciencia y apoyo incondicional, ellos son uno de mis mayores motivos de superación, para que este logro les sirva de ejemplo para el cumplimiento de sus innumerables metas en un futuro, y de quienes tengo la hermosa ilusión de ver felices y realizados. A mis abuelitas María Buitrago y María Antonia Alfonso, y a toda mi familia, los cuales creyeron y confiaron en mí, y siempre esperaron la conclusión de esta etapa con ansia. También a todos mis profesores y amigos que de una u otra manera contribuyeron con este triunfo, dejando siempre una enseñanza para mi vida personal y profesional.

GLOSARIO

Acetilcolina: neurotransmisor ampliamente distribuido en el sistema nervioso central y en el sistema nervioso periférico. La acetilcolina está formada por dos componentes acetato y colina, los cuales se unen mediante la acción de la acetilcolina transferasa, esta reacción tienen lugar en su mayor parte en las terminales nerviosas más que en otras regiones neuronales. Acetilcolinesterasa: enzima que se encuentra en los tejidos nerviosos y los glóbulos rojos, cuya función se realiza mediante la unión a sus receptores, permitiendo así que las sinapsis colinérgicas transmitan los impulsos nerviosos. Aclimatación: es el proceso en que un organismo se adapta fisiológicamente a los cambios en su medio ambiente, que en general tienen relación directa con el clima. Los seres vivos pueden ajustar sus rasgos morfológicos, etológicos, físicos y/o bioquímicos en respuesta a cambios en su entorno. Agroquímico: sustancia que tiene como objetivo controlar, prevenir o destruir cualquier tipo de plaga, y en su clasificación encontramos insecticidas, fungicidas, acaricidas, herbicidas entre otros. Bioacumulación: es el proceso de acumulación de sustancias químicas en organismos vivos de forma que estos alcanzan concentraciones más elevadas que las concentraciones en el medio ambiente o en los alimentos.

Biomagnificación:

aumento

progresivo

concentración

contaminante tóxico en los organismos vivos, a medida que se transfiere a través de la cadena alimenticia.

Contaminación ambiental: presencia en el ambiente de cualquier agente (físico, químico o biológico) o bien de una contaminación de varios agentes en lugares, formas y concentraciones tales que sean o puedan ser nocivos para la salud, la seguridad o para el bienestar de la población y que puedan ser perjudiciales para la vida vegetal o animal.

Concentración letal 50: la concentración que es letal para el 50% de los organismos de prueba. Este valor generalmente se usa cuando se hace referencia la toxicidad de una sustancia para los organismos expuestos a través de una matriz como el agua.

Clorpirifos: es un insecticida organofosforado cristalino que inhibe la acetilcolinesterasa.

Desove: es el acto de expulsar los huevos y esperma en peces, con fines reproductivos.

Disruptor endocrino: es una sustancia química capaz de alterar el equilibrio hormonal, pudiendo provocar diferentes efectos adversos sobre la salud de los animales, estas sustancias pueden ser causa de daños para la salud como el cáncer, alteraciones del comportamiento y anomalías reproductivas.

Dosis letal 50 (DL50): se refiere a la dosis de una sustancia que resulta mortal para la mitad de un conjunto de animales de prueba. Los valores de la DL50 son usados con frecuencia como un indicador general de la toxicidad aguda de una sustancia, generalmente se expresa en mg de sustancia tóxica por kg de peso del animal.

Dosis sub-agudas: son dosis toxicológicas donde sus concentraciones son más baja que la dosis letal 50. 6

Dosis subletales: dosis de una sustancia potencialmente letal que no es capaz de producir la muerte.

Dureza: la dureza del agua se expresa normalmente como cantidad equivalente de carbonato de calcio y se calcula partir de la suma de las concentraciones de calcio y magnesio existentes (miligramos) por cada litro de agua; que puede expresarse en concentración de CaCO3. Ecosistemas acuáticos: son sistemas termodinámicamente abiertos que reciben del exterior (sol, materia orgánica) y las transmiten a los ecosistemas vecinos a través de los flujos de materias o los movimientos de individuos (migraciones).

Efecto Teratogénico: malformaciones anatómicas macroscópicas, anomalías del desarrollo, el retraso del desarrollo intrauterino, alteraciones conductuales, muerte intrauterina y otras deficiencias funcionales.

Embriotoxicidad: capacidad de una sustancia para producir efectos tóxicos en la progenie durante el periodo de la preñez, desde la concepción al estado fetal, estos efectos pueden incluir malformaciones, disfunciones, alteraciones del crecimiento, muerte prenatal y funciones posnatales alteradas.

Escorrentía: corriente de agua de lluvia que circula libremente por la superficie de un terreno.

Fotolisis: es la ruptura de enlaces químicos por causa de energía radiante. Se llama fotólisis o fotodescomposición a la disociación de moléculas orgánicas complejas por efecto de la luz, y se define como la interacción de uno o más fotones con una molécula objetivo. 7

Fungicidas: son sustancias tóxicas que se emplean para impedir el crecimiento o eliminar los hongos y mohos perjudiciales para las plantas o animales, por más eficaz que sea, si se utiliza en exceso puede causar daños fisiológicos a la planta. Herbicidas: sustancias utilizadas para eliminar plantas indeseadas, algunos actúan interfiriendo con el crecimiento de las malas hierbas y se basan frecuentemente en las hormonas de las plantas. Hipertrofia: aumento de tamaño de un órgano debido a un aumento de la masa protoplasmática, y por eso el órgano hipertrofiado tiene células mayores más no nuevas. Inmunosupresión: inhibición de uno o más componentes del sistema inmunitario adaptativo o innato (la inflamación), que puede producirse como resultado de una enfermedad subyacente o de forma intencional mediante el uso de medicamentos (llamados inmunosupresores). Insecticidas: compuestos químicos utilizados para la eliminación de insectos. Larvas: fases juveniles de los animales con desarrollo indirecto (con metamorfosis) y que tienen una anatomía, fisiología y ecología diferente del adulto. Lixiviación: desplazamiento de sustancias solubles o dispersables (arcilla, sales) causado por el movimiento de agua en el suelo, y es, por lo tanto, característico de climas húmedos. Esto provoca que algunas capas del suelo pierdan sus compuestos nutritivos, se vuelvan más ácidas y a veces, también se origine toxicidad. Núcleos picnóticos: retracción del núcleo con condensación de la cromatina y se observa de cierta forma como núcleo puntiforme.

Organoclorado: compuesto químico orgánico, es conformado por un esqueleto de átomos de carbono, en el cual, los átomos de hidrógeno unidos al carbono, han sido reemplazados por átomos de cloro.

Organofosforados: son un grupo de sustancias químicas, están conformadas por un átomo de fósforo unido a 4 átomos de carbono o en algunas sustancias a 3 de oxígeno y uno de azufre, muy tóxico para los peces.

pH: (potencial de hidrógeno), es una medida de acidez o alcalinidad de una disolución, indica la concentración de iones de hidrogeno [H3O+] presentes en determinadas sustancias.

Signo Patognomónico: signo o síntoma característico de una enfermedad o trastornó que permiten dar un diagnóstico certero.

Sinápsis: unión intercelular especializada entre neuronas o entre una neurona y una célula efectora (casi siempre glandular o muscular). En estos contactos se lleva a cabo la transmisión del impulso nervioso.

Toxicología ambiental: efectos tóxicos producidos por los contaminantes ambientales sobre la atmosfera, agua y suelo, y también el efecto de los residuos tóxicos de los alimentos.

Toxicología: ciencia que estudia el origen, naturaleza y propiedades de los tóxicos, su comportamiento cinético, sus efectos sobre los organismos vivos, las manifestaciones clínicas de la intoxicación, los procedimientos adecuados de prevención y tratamiento.

Vitelogenina (vtg): es una proteína precursora de la formación del huevo, en las hembras de peces tropicales es común hallarla antes de la época de reproducción.

Xenobiótico: es todo compuesto químico que no forme parte de la composición

los

organismos

vivos.

Suelen

ser

contaminantes

(concentración en exceso) de determinados ambientes y generalmente ejercen algún tipo de efecto sobre los seres vivos, aunque no tengan toxicidad aguda.

RESUMEN

Los organofosforados son compuestos tóxicos clasificados como los de mayor peligrosidad y toxicidad para las especies de vida acuática que producen efectos embriotóxicos, teratogénicos y cancerígenos. El objetivo de esta investigación fue determinar la concentración letal 50 y los efectos histopatológicos de Lorsban® a 96 horas en dedinos Carpa (Cyprinus carpio) bajo condiciones de laboratorio, en este estudio se emplearon 72 peces de la especie Carpa koy (C. carpio), con condiciones fisiológicas similares (peso y longitud), distribuidos aleatoriamente a una densidad de seis peces por acuario (60 litros de agua) y contando con un periodo de aclimatación de 15 días; todos los peces fueron alimentados mañana y tarde a saciedad y según su biomasa, al momento de su llegada se les midió el peso y longitud. Se evaluaron tres tratamientos a diferentes concentraciones y un tratamiento control con sus respectivas replicas así: Tratamiento 1: 0.025 mg/l, Tratamiento 2: 0.1 mg/l y Tratamiento 3: 0.15 mg/l. A las 0, 12, 24, 48, 72 y 96 horas post exposición, se observaron los cambios de comportamiento, piel, calidad de agua y mortalidad; se tomó una muestra de sangre de cada pez por tratamiento para analizar la morfología celular y posteriormente se realizó la extracción de los tejidos de cerebro, hígado y branquias bajo el protocolo de necropsia, utilizando formol buferado al 10% para su conservación. Una vez que los animales fueron expuestos al Lorsban® los cambios en el comportamiento y piel se evidenciaron a partir de la hora 24 para el T1, 2 y 3 con alteraciones en el nado, apetito, pérdida de pigmentación, brillo y moco corporal; la concentración letal 50 evaluada correspondió al T3 a las 90 horas post exposición, además se observaron cambios en la morfología de las células rojas en los tres tratamientos, registrando mayor severidad en el T3 con anisocitosis alta, pérdida de la continuidad de la membrana eritrocitaria, células pequeñas, citoplasma espumoso y anormalidades en los núcleos. En el análisis histológico, se observó que en el tejido cerebral y branquial

del T3, exhibió lesiones más severas en comparación con los otros tejidos estudiados.

Palabras Clave: agroquímico, comportamiento, clorpirifos, intoxicación, organofosforados, peces.

ABSTRACT

Organophosphates are toxic compounds classified as the most dangerous and toxic to aquatic life species that produce embryotoxic, teratogenic and carcinogenic effects. The objective of this research was to determine the lethal concentration 50 and histopathological effects of Lorsban 速 at 96 hours dedinos carp (Cyprinus carpio) under laboratory conditions, in this study 72 fish species koy carp (C. carpio), were used with similar physiological conditions (weight and length), randomly distributed six fish per tank with a capacity of 60 liters of water and having an acclimatization period of 15 days; the fish were fed to satiation morning and evening and by biomass, upon arrival, they measured the weight and length. Three treatments at different concentrations and control treatment and their replicas were evaluated: Treatment 1: 0.025 mg/l, Treatment 2: 0.1 mg/l Treatment 3: 0.15 mg/l. At 0, 12, 24, 48, 72 and 96 hours post exposure, behavioral changes, skin, water quality and mortality were observed, a sample of blood from each fish per treatment volume to analyze cell morphology and subsequently extraction of brain tissue, liver and gills on the autopsy was performed, using formalin bufferado 10% for conservation at the end of the experiment. Once the animals were exposed to Lorsban 速 changes in behavior and skin were evident from the time 24 for T1, 2 and 3 with alterations in swimming, appetite, loss of pigment, shine and body mucus; 50 evaluated the lethal concentration corresponded to T3 at 90 hours post exposure, further changes were observed in the morphology of the red cells in the three treatments, recording in the greater severity T3 with high anisocytosis, loss of continuity of the erythrocyte membrane, small cell foamy cytoplasm and abnormal nuclei. On histological analysis, it was observed that in brain tissue and gill T3, exhibited more severe lesions compared with the other tissues studied. Keywords: Agrochemical, behavior, chlorpyrifos, poisoning, organophosphate, fish.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

3. JUSTIFICACIÓN

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

5. MARCO REFERENCIAL

5.1. ESTADO DEL ARTE

5.2. MARCO TEÓRICO

5.2.1. Carpa (Cyprinus carpió)

5.2.2. Plaguicidas

5.2.3. Organofosforados

5.2.3.1. Mecanismo de acción

5.2.4. Clorpirifós

5.2.4.1. Propiedades físico – químicas

5.2.4.2. Reconocimiento de la peligrosidad de los Clorpirifós

5.2.5. Lorsban®

5.2.5.1. Propiedades físico – químicas

5.3. MARCO GEOGRÁFICO

5.3.1. Límites del Municipio

5.4. MARCO LEGAL

5.4.1. Productos Químicos y Sustancias Tóxicas

5.4.2. Uso de los Plaguicidas

5.4.3. Calidad de Agua y Datos Sobre la Calidad del Medio Ambiente

5.4.4. Consideraciones Éticas con Animales de Investigación

6. DISEÑO METODOLÓGICO

6.1. TIPO DE ESTUDIO

6.2. POBLACIÓN EXPERIMENTAL

6.3. DISEÑO

6.3.1. Calidad del agua

6.3.2. Cambios en tegumento

6.3.3. Extracción y procesamiento de tejidos

6.3.4. Análisis de datos

7. HIPÓTESIS

8. RESULTADOS

8.1. ANALISIS DE LA MORTALIDAD (peces expuestos)

8.2. CAMBIOS EN TEGUMENTO

8.3. COMPORTAMIENTO

8.4. CALIDAD DE AGUA

8.5. ANÁLISIS MICROSCOPICO DE CÉLULAS ROJAS

8.6. HALLAZGOS MACROSCÓPICOS

8.7. HALLAZGOS HISTOLÓGICOS

9. DISCUSIÓN

10. IMPACTO

11. CONCLUSIONES

12. RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Plaguicidas utilizados para análisis en laboratorios

Tabla 2. Concentración letal 50 de Clorpirifos reportadas por diferentes autores 34 Tabla 3. Clasificación taxonómica de la carpa

Tabla 4. Plaguicidas de mayor interés

Tabla 5. Persistencia de plaguicidas en los suelos

Tabla 6. Receptores de la acetilcolina

Tabla 7. Mortalidad durante las 90 y 96 horas de estudio

Tabla 8: Revisión de la calidad del agua durante el experimento

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Carpa

Figura 2. Formula médica

Figura 3. Estructura química del Clorpirifos

Figura 4. Presentación de Lorsban®.

Figura 5. Geografía de Boyacá

Figura 6. Diseño del Experimento

Figura 7. Cambios en la piel

Figura 8. Cambios en el comportamiento

Figura 9. Características morfológicas celulares de los peces del T1

Figura 10. Características morfológicas celulares de los peces del T2

Figura 11. Características morfológicas de los peces del T3

Figura 12. Hallazgos a la necropsia

Figura 13. Análisis del tejido cerebral del T1

Figura 14. Análisis del tejido Branquial del T1

Figura 15. Análisis de hígado del T1

Figura 16. Análisis del tejido cerebral del T2

Figura 17. Análisis del tejido Branquial del T2

Figura 18. Análisis del hígado T2.

Figura 19. Análisis del tejido cerebral del T3

Figura 20. Análisis del tejido Branquial del T3

Figura 21. Análisis del hígado del T3

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Proceso de aclimatación

Anexo 2. Elementos utilizados

Anexo 3. Normas de bioseguridad

Anexo 4. Efectos del Lorsban®

Anexo 5. Proceso de sacrificio

Anexo 6. Toma de muestras

Anexo 7. Disposición final de los animales

Anexo 8. Mortalidad a las 0 horas

Anexo 9. Mortalidad a las 12 horas

Anexo 10. Mortalidad a las 24 horas

Anexo 11. Mortalidad a las 48 horas

Anexo 12. Mortalidad a las 72 horas

Anexo 13. Mortalidad a las 96 horas

Anexo 14. Pigmentación, moco y brillo por hora y tratamiento

Anexo 15. Comportamiento de los peces durante el experimento

Anexo 16. Respuesta del comité de bioética

101

INTRODUCCIÓN

En el ecosistema se pueden ver afectadas las especies acuáticas debido a la utilización de productos químicos para labores de manejo agrícola, que incluyen compuestos tóxicos como los organofosforados, organoclorados, fungicidas, herbicidas entre otros, que se aplican en épocas de invierno y generan efectos negativos en las plantaciones y por ende en el hábitat de los peces (Chen, 2008). Los agroquímicos usualmente son sustancias que se disuelven muy fácilmente en agua o en gases a través del vapor, se adhieren al polvo disponible en el suelo y se trasladan a grandes distancias llegando asi a las nubes para así volver a bajar en forma de lluvia, que serán consumidos por diferentes organismos (plancton, peces, hombre) y así iniciar una cadena alimentaria y ciclos de contaminación a corto y largo plazo (Alpuche, 1990).

Los compuestos organofosforados, son utilizados hoy en día como insecticidas de mayor eficacia y efectividad en diferentes cultivos, su alta concentración en los suelos son extremos con una alta bioacumulación que causan toxicidad en los peces (Geneva, 2000). Estos contaminantes se van acumulando lentamente en los diferentes tejidos diana y en pequeñas cantidades a medida que ingresan, ya sea por consumo de agua o comida contaminada, concentrándose principalmente en tejidos grasos, branquias y también en la sangre, produciéndose así efectos negativos los cuales perjudicaran el nado del pez y demás aspectos que disminuyen su desarrollo en el medio acuático en el cual habitan (Wang et al., 2011).

Tóxicos como el Lorsban® (Clorpirifos), cuyas características se evidencian por la gran cantidad de tiempo en que pueden perdurar dentro de un medio acuático, ocasionan mortalidades y enfermedad en los peces, produciendo alteraciones en

la piel como descamación, despigmentación e irritación y cambios en sus comportamientos, alteraciones del metabolismo hepático, disminución en el peso corporal y embriotoxicidad (Gallardo, 2005).

La Carpa koy (Cyprinus carpio) es un tipo de especie que comúnmente habita en lagos, estanques y ríos de corrientes lentas, con fondos arenosos, ricos en vegetación, su fácil adaptabilidad a diferentes ambientes, particularmente aquellos con un alto deterioro en calidad de agua o con problemas de contaminación debido al mal manejo de xenobióticos, como los organofosforados, ponen en riesgo las poblaciones de peces, la macrobiota asociada y la salud humana cuando se consumen; eso sin considerar el recurso hídrico en el que se pesca en las regiones del altiplano boyacense, que sirven como distrito de riego para las poblaciones aledañas (Petrelli, 2000), motivo por el cual se evaluó la concentración letal 50 de Lorsban® en esta especie, en donde se observo y se analizo los cambios de comportamiento, piel, agua e histológicamente en los tejidos de cerebro, hígado y branquias e incluso las mortalidades que se presentaron en cada uno de los tratamientos pos exposición.

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Hoy en día la falta de control y uso indiscriminado de los agroquímicos por parte de los agricultores al momento de eliminar cualquier tipo de plaga o enfermedad en sus cultivos, está generando un vertiginoso deterioro medio ambiental con efectos nocivos o incluso letales en poblaciones expuestas tanto animales como humanas (EPA, 2002). Los organofosforados son compuestos tóxicos clasificados como los de mayor peligrosidad y toxicidad para especies de vida acuática, ya que se disuelven fácilmente en el agua, se bioacumulan y persisten durante largos períodos en los ecosistemas donde se depositan (Rodríguez, 2006). El Lorsban®, es un tipo de xenobiótico con graves efectos negativos sobre los animales acuáticos, ya que al ingresar a través de la piel o mucosas en su organismo (Dreisback y Robertson, 1988), generan estados de hiperactividad, rapidez en sus movimientos operculares, un aumento considerable en la respiración y nado en espiral, debido a la inhibición a nivel de la acetilcolinesterasa en el punto de las terminaciones nerviosas colinérgicas y en caso de que la intoxicación pudiese ser severa cursaría con inactividad e incluso un alto grado de mortalidad (Carr y Chambers, 2001).

Adicionalmente al producto se le atribuyen efectos desencadenantes sobre los procesos de estrés oxidativo, debido a la sobrecarga de radicales libres los cuales no son correctamente compensados por los mecanismos de defensa antioxidante del pez, que serán los responsables de problemas mutagénicos y carcinogénicos (Ochoa, 2008).

Todos estos problemas ocasionados por la exposición de este agroquímico, también involucran a la cadena alimentaria, debido a que el consumo de peces en 21

mal estado producirán efectos nocivos en los seres humanos, ocasionando asi problemas de cáncer en la piel, labio, estómago y desordenes reproductivos. El uso de estos insecticidas destruirán también las vegetaciones y los animales se verían afectados por el deterioro de los recursos naturales en lugares donde se están usando estos productos (Corvalán, 2006).

2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

Existen múltiples reportes de CL50 de clorpirifos en peces, con amplios intervalos que oscilan entre 4.0 mg a 0.0013 mg/l. Su reporte se asocia a especies más sensibles que a cortas exposiciones reaccionan letalmente, no obstante se encuentran reportes para la misma especie con valores disimiles, lo que da paso al deficiente manejo e interpretación de la información para su distribución, comercialización y efecto en cultivos agrícolas. Por lo que se plantea: ¿Cuál es la CL50 y los efectos histopatológicos de Lorsban® a 96 horas en dedinos de Carpa Koy (Cyprinus carpio) bajo condiciones de laboratorio?

3. JUSTIFICACIÓN

De acuerdo con los datos obtenidos a través del Sistema de Vigilancia Epidemiológica en Centroamérica, los doce plaguicidas que están relacionados con el mayor número de intoxicaciones agudas en animales acuáticos y humanos son: paraquat, fosfato de aluminio, metil-paratión, metamidofós, monocrotofós, clorpirifós, terbufós, endosulfan, carbofurán, metomil y aldicarb (OMS, 1990).

Idrovo (2010), afirmó que Colombia es uno de los países que debido a los tratados de libre comercio está permitiendo el ingreso de compuestos tóxicos como los organofosforados

los

departamentos

Antioquia,

Boyacá,

Caldas,

Cundinamarca, Quindío y Santander; con destino a la agricultura debido a sus grandes extensiones agrícolas, reportándose altos índices de contaminación en los ecosistemas acuáticos. Entre los compuestos más tóxicos esta el Lorsban® (Clorpirifos) de uso agrícola para la erradicación de enfermedades y plagas como insectos de suelo que presenta una alta solubilidad y bioacumulación en el medio donde se riega (AgroSciences, 2012).

La Carpa Koy es una especie que habita en lagos y estanques, encontrándose rodeados de zonas ricas en vegetación (Petrelli, 2000) y grandes extensiones de cultivo de papa, cebolla, alverja y otros productos que utilizan grandes cantidades de agroquímicos derivados del fósforo, los cuales se disuelven rápidamente. Su uso produce exacerbado crecimiento de algas, disminución de la radiación ultravioleta, la temperatura y el oxígeno del agua; convirtiéndose en un agente químico contaminante de los ecosistemas acuáticos con el riesgo de causar intoxicaciones agudas o crónicas (Henry, 1996).

Se han reportado daños en los animales que han estado expuestos a este tipo de tóxicos organofosforados, ocasionando una disminución en la capacidad reproductiva, bajas en la supervivencia, cambios genéticos (Pastor, 2002); bajas en el crecimiento y defectos en órganos como en el cerebro, observándose alteraciones degenerativas (Rajeswary y Ramudu, 2005).

Suárez (2013), reportó que las concentraciones utilizadas de 0.002, 0.02 y 0.2 mg/l resultaron ser muy tóxicas para la Carpa dorada (Cyprinus carpio) en 48 horas, afectando además los parámetros de calidad de agua e histológicamente observándose lesiones en órganos como cerebro e hígado, por tal motivo se originó este estudio con el fin de evaluar la concentración letal 50 de Lorsban® a 96 horas y los efectos histológicos a concentraciones inferiores a 0.2 mg/l en la especie de Carpa Koy (Cyprinus carpio), bajo condiciones de laboratorio en la Clínica Francisco de Asís en el municipio de Soracá – Boyacá.

4. OBJETIVOS

4.1.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la concentración letal 50 y los efectos histopatológicos de Lorsban® a 96 horas en dedinos de carpa koy (Cyprinus carpio) bajo condiciones de laboratorio

4.2. -

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Analizar las características macroscópicas en piel y comportamiento pos exposición a las diferentes dosis subagudas aplicadas de Lorsban®.

Establecer los cambios del estado de agua pos exposición de los diferentes tratamientos aplicados de Lorsban®.

Determinar histológicamente las características morfológicas de cerebro, branquias e hígado en cada tratamiento.

5. MARCO REFERENCIAL

5.1 ESTADO DEL ARTE

En muchos lugares del mundo los plaguicidas hacen parte esencial y fundamental de la agricultura, ya que han servido de gran ayuda en el intento de erradicar diferentes tipos de plagas para la protección de cultivos y plantaciones. Sin embargo, cuando el uso de estos compuestos es exagerado o no se fijan en el ambiente pueden producir daños que comprometerían suelo, agua y generarían graves problemas de salud pública y de contaminación a muchos ecosistemas tanto terrestres como acuáticos (ONU, 2010).

En Colombia, los problemas de contaminación por plaguicidas son cada vez más graves, debido a la cantidad y diversidad, como por la resistencia que adquieren algunos organismos expuestos, según la EPA (2002), lo que está obligando a usar grandes cantidades de más compuestos tóxicos agresivos que van a afectar la flora y fauna destruyendo la diversidad natural y las regiones donde se usan (Rodríguez. 2006). Córdoba (2008), afirmó “que el mayor uso de estos compuestos organofosforados está asociado a la actividad agrícola, principalmente en los países del tercer mundo, ya que son capaces de combatir plagas que otros insecticidas no han logrado, lo anterior hace prever su permanencia prolongada en el mercado mundial. Estos insecticidas son poco persistentes, lo que implica que sea necesario aplicarlos con mayor frecuencia para lograr una mejor acción.”

Fátima et al., (2007), demostraron que una mezcla de herbicidas, probada en peces, genera un bloqueo del sistema de defensa antioxidante enzimático, lo cual 27

interfiere con la actividad fagocítica y la actividad lisosómica, generando inmunosupresión.

Elandalousi et al., (2008) y Chen et al., (2008), describierón los efectos de los herbicidas sobre ecosistemas acuáticos y los peces a exposiciones de estos productos a niveles por debajo de las concentraciones ambientales, que comprometen la supervivencia, reproducción y desarrollo del zooplancton, así como de algunos anfibios; atribuido principalmente a un bajo nivel de pH en el agua

La OMS (2005), clasifica los insecticidas organofosforados como moderadamente peligrosos que se han asociado a varios casos en países europeos de intoxicaciones dentro de los cuales se registran intoxicaciones agudas causadas por plaguicidas en seres humanos en diferentes partes del mundo, con un promedio anual entre 500.000 y 1.528.000 casos y entre este rango 28.000 muertes anuales, para el caso de los países asiáticos los casos oscilaron entre 1.500.000 y 2.000.000 intoxicaciones con cerca de 40.000 muertes anuales.

Algunos de los efectos de esta contaminación se producen por la aparición de organismos resistentes, persistencia ambiental de residuos tóxicos o degradación de la flora y fauna, ya que estos compuestos químicos se acumulan en tejidos de peces que a su vez, estarían poniendo en riesgo la salud y vida de sus consumidores llegando a provocar la muerte de peces tanto en agua dulce como de mar (Kavitha y Rao, 2007).

Una vez que son absorbidos y distribuidos en el organismo de los peces, los insecticidas organofosforados son metabolizados principalmente en el hígado, distribuyéndose en el organismo presentando una vida media en el plasma y un elevado volumen de distribución en los tejidos. Los organofosforados son metabolizados por enzimas (esterasas, enzimas microsomales, transferasas), 28

fundamentalmente en el hígado, sufriendo una serie de transformaciones químicas, las cuales tienden a aumentar la hidrosolubilidad del insecticida y por consiguiente facilitan su excreción, la cual se da a nivel renal (Eddleston y Hillips, 2008).

Según Sapozhnikova (2004), se realizó un estudio en el mar de Salton en California (USA), donde se reportó las siguientes concentraciones de plaguicidas organofosforados de Dimetoato <0.12- 2.1, Disulfotón 0.5-54.6, Malatión 1.1-29.9 y Clorpirifos <0.18-3.0 expresados en ng/g en peso húmedo, encontradas en diferentes tejidos de peces curvina (Cynoscion xanthulu).

Según De Silva y Samayawardhena (2005), el organofosforado Clorpirifos es el insecticida más aplicado en Colombia, con un volumen de producción de 776.824 kg, y un tiempo de degradación y vida media en el agua de 53 días, puede afectar de forma crónica a los peces en etapas de reproducción. Gul (2005), afirmó que la sensibilidad de las diversas especies acuáticas a los clorpirifos es muy variable y los estudios que se han realizado a nivel mundial para determinar sus efectos negativos son escasos, donde se han centrado más que todo en investigaciones sobre intoxicación aguda en larvas de tilapia (Oreochromis sp) y guppy (Poecilia reticulata).

cerebro

primer

órgano

blanco

afectado

por

los

insecticidas

organofosforados, ya que los clorpirifos interfieren con la actividad de enzimas como la acetilcolinesterasa, provocando una inhibición progresiva (Córdoba, 2008).

Rajeswary y Ramudu (2005), realizarón estudios en peces juveniles de tilapia común (Oreochromis mossambicus), utilizando dosis subletales entre 34 y 100 ug/l por un período de siete días, relacionando estas alteraciones en cerebro en forma directa con la dosis utilizada, adicionalmente reportaron que a exposiciones 29

subagudas a 96 horas de Clorpirifos los principales órganos que se ven afectados en los peces son el encéfalo (tectúm óptico) observándose alteraciones degenerativas y una proliferación de los astrocitos en el sistema nervioso central; en el riñón una nefrosis vacuolar e hiperplasia glomerular y en hígado la presencia de gránulos eosinófilos.

El tectúm óptico de los peces es un centro que orienta patrones de respuesta que incluye los movimientos coordinados de la musculatura axial, aletas y ojos, las cuales corresponden a respuestas naturales de los peces (Cerdá et al., 2008).

Entre los productos químicos más utilizados y considerados como disruptores endocrinos

mamíferos,

peces

insectos,

están

los

insecticidas

organofosforados, los cuales inhiben la enzima acetilcolinesterasa al producir su fosforilación, causando una acumulación del neurotransmisor acetilcolina en las sinapsis mediadas por éste, con la consecuente aparición de un cuadro colinérgico (Córdoba, 2008).

De Silva y Samayawardhena (2005), reportaron que a la aplicación de dosis bajas de clorpirifos 0.002 μg/l–2 μg/l en la especie guppy (Poecilia reticulata), se detectaron efectos negativos en el comportamiento como nado errático e hiperactividad y bajas en la supervivencia.

Las especies acuáticas son particularmente vulnerables a los químicos disruptores endocrinos, debido a que sus ecosistemas reciben una amplia variedad de contaminantes. Este es el caso de animales acuáticos tratados con Clorpirifos, donde se han hallado peces machos con altos niveles de vitelogenina (vtg), lo que ha producido peces hermafroditas, donde aparentemente este efecto es producido por este tipo de contaminantes organofosforados depositados en el agua (Canapa et al., 2007).

Méndez (2013), afirmó que el uso inadecuado y descontrolado de triclorfón genera una contaminación en las fuentes hídricas por medio de procesos de escorrentía y lixiviación, afectando a especies acuáticas, por tal motivo determinó la concentración letal 50 (CL50) de triclorfón a 96 horas usando la cachama blanca (Piaractus brachypomus). Para este estudio evaluó cuatro concentraciones de triclorfón (0.01, 0.1, 0.25, 0.5 mg/L) y un grupo control, cada grupo experimental constó de 8 animales, provenientes de un mismo desove, con un peso de 2.5g, distribuidos al azar. Los peces expuestos al tóxico evidenciaron nado errático y pérdida parcial del eje de nado durante las primeras 24 horas de exposición, comparado con el grupo control, donde posteriormente se calculo la CL 50 de 0.18 mg/L.

García (2013), reportó que los organofosforados de tipo oxón (Clorpirifos), debido a las malas prácticas en el uso de estos agroquímicos representan un problema de contaminación para los ecosistemas acuáticos, posteriormente se evaluó la respuesta oxidativa de la cachama blanca (Piaractus brachypomus) por medio de un estudio, expuestos a tres concentraciones subletales del organofosforado de 4.6875, 0.46875, 0.046875 ng/L y un grupo control, con sus respectivas replicas, durante 50 días, con un recambio de agua diario del 25%. Cada tratamiento constituyó de 80 alevinos (8±2 g), hospedados en tanques y se realizaron muéstreos de cuatro animales cada 10 días, con extracción de sangre para evaluar la actividad respiratoria, arrojando como resultado un aumento en la actividad oxidativa de la concentración en los animales expuestos al tóxico durante los primeros 20 días.

Ocampo (2013), determinó por medio de un estudio la concentración letal 50 (CL50) de pesticidas tipo oxón (Clorpirifos) a 96 horas en alevinos de cachama blanca (Piaractus brachypomus), utilizando 88 animales distribuidos en 7 grupos de tratamiento y un grupo control, expuestos a concentraciones de 0.015, 0.02, 0.07, 0.09, 0.13, 0.15 y 1.5 pg/L de Clorpirifos, posterior a esta exposición los 31

peces presentaban nado errático con movimientos rápidos en forma de temblores, los cuales hacían que perdieran el eje de nado hasta quedar inmóviles y finalmente morir, determinando asi el valor de la CL50 de 0.11 pg/L. Weylet et al., (1996), reportó que a una dosis de 0,4 ml/l de 2-fenoxietanol a 25 °C era suficiente para inducir una pérdida total del equilibrio en peces de colores en un periodo de 15 minutos.

Corredor (2013), describió que en animales adultos de la especie mojarra (Astyanax gr. bimaculatus) y mochoroca (Aequidens metae), capturados en un río de la Orinoquia Colombiana, se analizó muestras de branquias e hígado que fueron extraídas inmediatamente después de la captura, previa anestesia e insensibilización, para ser procesadas para su estudio histológico, posteriormente se observó lesiones de hiperplasia lamelar e interlamelar, fusión lamelar y desprendimiento del epitelio lamelar en branquias y en el hígado, se observó una vacuolización, esteatosis, congestión, presencia de núcleos picnóticos y centros melanomacrófagos, lo cual se concluyo que debido a la mezcla de contaminantes que se incrementan a lo largo del río produce evidentes alteraciones morfológicas en peces expuestos a estas condiciones.

Por medio de un estudio en juveniles de bagre negro (Rhamdia quelen), se identificarón los marcadores histopatológicos, expuestos a 96 horas a una dosis subletal de 44 mg/L de Pb (N03)2, empleando un grupo control (GC) (n= 10) y un tratamiento (n= 32), donde se muestrearon branquias, hígado, bazo y riñón a las 24, 48, 72 y 96 horas de exposición utilizando 8 ejemplares diarios, observándose en branquias un incrementó del espacio interlaminillar a las 24 y 48 horas, asociado a un aumentó del espesor de la laminilla, en hígado se observó un incremento en el área ocupada por lípidos en hepatocitos respecto al GC a las 24 horas y un descenso brusco a las 48 horas, en el riñón un porcentaje de túbulos renales con lesiones que se incrementó progresivamente desde las 24 hasta las 32

96 horas y en el bazo la superficie ocupada por elementos linfoides se redujo significativamente a las 96 horas, donde se estableció un cuadro patognomónico de los efectos del plomo sobre esta especie (Muñoz, 2012).

Generalmente los efectos observados en todos los experimentos de toxicidad incluyen una disminución en la supervivencia de los animales, o un aumento en el número de muertes, como también una reducción en el crecimiento y alteración en el desarrollo, complementada con una reducción en la capacidad reproductiva y cambios genéticos. También, se presentan cambios en los sistemas corporales incluyendo el comportamiento. Cualquiera de estos efectos puede influenciar la habilidad de las especies para adaptarse y responder a otros factores estresantes del ambiente. Los siguientes plaguicidas (Tabla 1) son comúnmente utilizados en estudios de laboratorio según la Universidad de Antioquia y CORPOURABA en 1999.

Tabla 1. Plaguicidas utilizados para análisis en laboratorios

Nombre Genérico

Grupo Químico

Actividad Biológica

Clorpirifos

Organofosforado

Inseticida

Etoprop

Organofosforado

Nematicida e Inseticida

Diazinon

Organofosforado

Inseticida

Terbufos

Organofosforado

Nematicida e Inseticida

Fuente: EXTOXNET, 2012 (pesticide information, Cornell University)

Estudios reportados por diferentes autores como se describe en la tabla 2, sobre las diversas especies y concentraciones letales a 96 horas de clorpirifos, ponen en

duda su veracidad y uso con la proporción de sustancia utilizada para el control tradicional de los cultivos en el altiplano colombiano: Tabla 2. Concentración letal 50 de Clorpirifos reportadas por diferentes autores Especie

Concentración

T.E*

Fuente bibliográfica

Cachama blanca

0.11 pg/l

96 horas

Ocampo, 2013

Pez Agalla Azul

2-10 μg/l

96 horas

Farmex, 2013

Trucha Arco Iris

7-51 μg/l

96 horas

Farmex, 2013

Trucha Arco Iris (salmo gairdneri)

0.03 mg/l

96 horas

Cheminova, 2013

0.46 mg/l

96 horas

Basf, 2010

Carpa (Cyprinus carpio) Varias especies

Toxicidad aguda: 0.0013 – 0520 mg/l Pez Luna de Agallas Azules

0.002 – 0.010 mg/l

96 horas

Tradecorp, 2010

96 horas

Clorpirifos, 2007

96 horas

AgroSciences, 2003

0.003 mg/l

96 horas

Oirsa, 2003

Trucha Arco Iris (salmo gairdneri)

48 μg/l

96 horas

Semarnat; 1997

Trucha Arco Iris

0.002 - 0.010 ; 0.007 – 0.051 mg/l

96 horas

Eurorubicon, 1993

Especies más Sensibles

1 y 10 mg/l

Trucha Arco Iris

*Tiempo de exposición

5.2 MARCO TEÓRICO 5.2.1 Carpa Koy (Cyprinus carpio) Son originarios de Asia oriental desde el mar de Aral hasta el mar Caspio, es una variedad seleccionada de la carpa común y dependiendo del medio donde viva puede alcanzar los 30 años de edad, según su clasificación (Tabla 3), hace que esta especie este incluida como una de las especies exóticas invasoras del mundo y de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (Taylor y Mahón, 1977). Tabla 3.Clasificación taxonómica de la carpa

Carpa koy (Cyprinus carpio) Reino Filo Clase Orden Familia Genero Especie Nombre Científico Subespecies

Animalia Chordata Actinopterygii Cypriniformes Cyprinidae Cyprinus C.carpio Cyprinus carpio(Linnaeus, 1758) Cyprinus carpio Carpio, Cyprinus carpio, Haematopterus, Cyprinus carpio, Viridiviolaceus. Fuente: Taylor y Mahón, 1977 (Clasificación de la carpa)

Como características generales más importantes tenemos que la carpa koy (Cyprinus carpio) es una especie omnívora y pacifica que pueden compartir acuario y estanques con otras especies, pueden llegar a medir de 60-90 cm de largo con un peso de 10 kg. Esta especie es típicamente fusiforme con sección redondeada, presentando aletas robustas bien equilibradas con dos pares de barbillones en los externos próximos a la comisura de la boca muy bien desarrollados que al momento de escarbar les facilita la búsqueda de alimento, al 35

momento de su nacimiento su coloración es similar a la de la carpa común y a partir de los tres meses de edad se comienzan a observar múltiples coloraciones combinando el rojo con el negro sobre fondo blanco, hasta tonos azules acerados, anaranjados, amarillos, grises, plateados y dorados y algunos pueden presentar escamas ribeteadas y otros no (Fig. 1). Son resistentes a bajas temperaturas entre 2 - 25 °C con un pH normal de 6.5 - 7.5 y una dureza de 4 - 10° (GH) en el agua (Ranier y Pauly, 2004).

Figura 1. Cyprinus carpio (Fuente: Carpa Koy, 2010)

5.2.2 Plaguicidas

En la tabla 4, se relacionan los plaguicidas con mayor énfasis para el control de contaminación en el medio ambiente acuático, según una metodología elaborada por el Ministerio del Medio ambiente durante el año de 1996, para adelantar programas de seguimiento y monitoreo de plaguicidas y en la cual se tienen en cuenta criterios como toxicidad, persistencia, bioacumulación, solubilidad en agua y clasificación química (Arias, 1997).

Tabla 4. Plaguicidas de mayor interés

Plaguicida

Toxicidad

Persisten cia

Bioacumulación Solubilidad en el agua

Clasificación química

Insecticidas Carbaril II y III (+) M Si No C Clorpirifos III (++) M Si No F Carbofurán I (++) M No Si C Dimetoato I (++) B No Si F Metil paration I (++) M No Si F Monocrotofos I (+) B No Si F (+) moderadamente tóxico para peces; (++) altamente tóxico para peces B: baja; M: media; A: alta; C: Carbamato; F: Fosforado; C: Organoclorado. Fuente: Arias, 1997 (Ministerio del Medio ambiente).

La persistencia se mide por medio de la CL50 (Tabla 5), entendido éste como el tiempo que toma un pesticida para descomponerse en la mitad de la cantidad inicial; también CL50: Tabla 5. Persistencia de plaguicidas en los suelos

Clasificación

Vida media (días)

Baja Persistencia

Moderada Persistencia

30 a 100

Alta Persistencia

Mayor de 100

Fuente: EXTOXNET, 2012 (pesticide information, Cornell University)

5.2.3 Organofosforados

Los organofosforados son clasificados químicamente como ésteres, amidas o tioles que son derivados del ácido del fósforo, fosfónico y fosfortoico (Saleh, 1994). Estos son compuestos que se descomponen con mayor facilidad y se van degradando por oxidación e hidrólisis y asi poderse disolver con mayor facilidad en el agua (OMS, 1993).

Estos compuestos son sustancias orgánicas de síntesis, conformadas por un átomo de fósforo unido a cuatro átomos de oxígeno o en algunas sustancias a tres de oxígeno y uno de azúfre (Fig. 2), se caracterítizan por su alta toxicidad y baja estabilidad química (Alpuche, 1990).

Figura 2. Formula médica (Fuente: Fórmulas básicas de las más importantes familias de POF)

La estabilidad de los organofosforados depende del pH del medio; cuando su pH es fuertemente alcalino se descomponen, lo que pone en riesgo la estabilidad de los ecosistemas acuáticos (López, 1993).

5.2.3.1 Mecanismo de acción

Los organofosforados desarrollan su toxicidad a través de la fosforilación de la enzima acetilcolinesterasa en las terminaciones nerviosas, reaccionan con la zona esterásica de la enzima colinesterasa formando una unión estable que si no se rompe mediante el tratamiento, se hace irreversible, quedando la enzima inhabilitada para su función normal (Eddleston y Hillips, 2004).

La pérdida de la función de la enzima permite la acumulación de acetilcolina en las uniones colinérgicas neuroefectoras (efectos muscarinicos), en las uniones mioneurales del esqueleto y los ganglios autónomos (efectos nicotínicos) y en el sistema nervioso central (Eldefrawi y Eldefrawi, 2003).

En la tabla 6 se observa la interacción de la acetilcolina interactúa con dos tipos de receptores postsinápticos, nicotínicos y muscarinicos, siendo responsable de la transmisión fisiológica del impulso nervioso: Tabla 6. Receptores de la acetilcolina Receptores Nicotínicos

Receptores Muscarinicos

Las neuronas preganglionares a las Las postganglionares

los

nervios

motores

parasimpáticas al

colinérgicas

sistemas postganglionares

parasimpático y simpático Los

fibras

simpáticas a

las

células

músculo efectoras

esquelético

Fuente: Eldefrawi y Eldefrawi, 2003

Una vez es liberada y ha interactuado con su receptor, la acetilcolina es destruida mediante la acción de la enzima acetilcolinesterasa, la cual reacciona con el neurotransmisor hidrolizándolo y produciendo colina y ácido acético (Guyton y Hall, 2006).

5.2.4 Clorpirifós

Son insecticidas organofosforados que según su estructura química (Fig. 3), se utiliza para el control de las plagas de insectos y a la vez inhibe la acetilcolinesterasa. La EPA (2005) clasifica a este tóxico como categoría II por su 39

moderada toxicidad y a la exposición crónica que se relaciona a trastornos neurológicos del desarrollo y autoinmunes (Whyatt, 2004).

Figura 3. Estructura química del Clorpirifos (Fuente: Muller, 2000)

5.2.4.1 Propiedades físico-químicas

Los Clorpirifos son relativamente estables a la hidrólisis en un pH natural y soluciones acuosas ácidas, su estabilidad disminuye a medida que aumenta el pH (Legaspy, 1986). La estabilidad hidrolítica, combinada con la fotólisis acuosa con una vida media de 30 días, la baja volatilización y degradación bajo condiciones aeróbicas, pueden ser indicativos de que los clorpirifos persistan por largos periodos de tiempo en los ecosistemas acuáticos (NMFS, 2008).

5.2.4.2. Reconocimiento de la peligrosidad de los Clorpirifós

La Agencia de Protección Ambiental (EPA) llevo a cabo la prohibición de la manipulación de clorpirifos en Estados Unidos, debido a que es un viejo y riesgoso pesticida, con más de 50 años de uso y que había llegado el momento de tomar acciones para proteger a los niños de la exposición a este químico, ya que se conocía claramente su potencial riesgo sobre la salud humana (Sabbatella, 2011).

5.2.5. Lorsban® Es un insecticida de amplio espectro utilizado para el control de plagas en diferentes cultivos, viene en presentación en polvo homogéneo (Fig. 4), con olor a mercaptano y puede mezclarse con fosfato de amonio y urea.

Figura 4. Presentación de Lorsban®. (Fuente: AgroSciences, 2012).

Composición: 

Clorpirifos: 0,0 dietil 0-(3,5,6-tricloro- 2-piridinil)



fosforotioato CAS# 002921-88-2 2,50%

AgroSciences (2012), describió que al haber un contacto con éste tóxico puede causar efectos como dolor e irritación en ojos, a exposiciones prolongadas puede ocasionar irritaciones en la piel, no causa cáncer, defectos en el nacimiento, dificultad en el nado y no interfiere en la fertilidad en investigaciones de reproducción con animales objeto de estudio a largo plazo bajo condiciones de laboratorio.

5.2.5.1 Propiedades físico-químicas - Punto de ebullición: No aplicable - Presión de vapor: Muy baja - Densidad del vapor: No aplicable - Solubilidad en agua: 7 días (168 horas) - Densidad aparente: 0,656 - Apariencia: Polvo homogéneo verde - PH: 9,0 (10% suspensión en agua desionizada)

5.3 MARCO GEOGRÁFICO

Esta investigación se realizó en el laboratorio de Ictiopatología de la Clínica Francisco de Asís en la Fundación Universitaria Juan de Castellanos ubicada en el municipio de Soracá del departamento de Boyacá, contaba con agua limpia para los acuarios llevada desde la ciudad de Tunja, luz 12 horas al día, oxigenación constante mediante motores de dos salidas con piedras difusoras para cada uno de estos y ruidos minimizados para evitar el estrés de los peces.

El territorio del municipio se halla sobre el ¡Error! Marcador no definido. y es conocido por los cultivos de clima frío como la papa y el ganado vacuno. Distancia 7 km de la ciudad de Tunja, capital del departamento.

El municipio de Soracá pertenece a la cordillera Oriental de los Andes colombianos y se encuentra ubicada en las estribaciones del altiplano Cundiboyacense. El clima del territorio la hace adecuado para la producción de papa, trigo, frutales y pastos para el mantenimiento de la ganadería.

5.3.1 Límites del Municipio Al NORTE con el Municipio de Chivatá, ORIENTE, con Municipios de Siachoque, Viracachá y Ramiriquí, SUR, con el Municipio de Boyacá (lleva el mismo nombre del departamento), OCCIDENTE, con el municipio de Tunja (Fig. 5). Cuenta con una extensión total de 57 km², población de 5,805, cabecera de 722, densidad de población de101, 8 hab/km² y una temperatura media de 12°C (Gobernación de Boyacá, 2003).

Figura 5. Geografía de Boyacá (Fuente: Gobernación de Boyacá, 2003)

5.4. MARCO LEGAL

Para la normatividad hay diversidad de leyes relacionadas con la conservación y protección de los ecosistemas

acuáticos. Para el tema que nos ocupa en el

Decreto 1594 de 1984 y Ley 99 de 1993 regula lo relacionado a permisos de

vertimientos, estándares de calidad y niveles máximos de vertimientos para numerosas sustancias contaminantes. 5.4.1 Productos Químicos y Sustancias Tóxicas

Según el artículo 32 el deterioro ambiental o daño en la salud del hombre y de los demás seres vivientes, se establecerán requisitos y condiciones para la importación, la fabricación, el transporte, el almacenamiento, la comercialización, el manejo, el empleo o la disposición de sustancias y productos tóxicos o peligrosos.

5.4.2 Uso de los Plaguicidas

Son las autoridades competentes las que deberán cumplir con la normatividad para el uso de estos compuestos tóxicos, algunas de estas son:  Nacional: Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible y Policía Ambiental  Regional: Corporaciones Autónomas Regionales y Desarrollo Sostenible.  Municipios o Distritos: Autoridades Ambientales Locales Urbanas.  Entes territoriales delegatarios de las Corporaciones.  Distritos Turísticos y Ambientales.

5.4.3 Calidad del Agua y Datos Sobre la Calidad del Medio Ambiente

El Decreto No. 1594 de 1984 establece los criterios de calidad admisibles para la destinación del recurso para preservación de flora y fauna, en aguas dulces, frías o cálidas y aguas marinas o estuarinas.

Por otra parte, el Decreto 475 del 10 de marzo de 1998 promulgado por el Ministerio de Salud y modificatorio del Decreto 2105 de 1983, establece las concentraciones máximas admisibles para los plaguicidas en el agua potable de la siguiente manera:  Valor Máximo Admisible 0.0001 mg/L, para Plaguicidas de Categoría Toxicológica I (altamente tóxicos), sustancias cancerígenas, mutagénicas y/o teratogénicas, y/o cuyos valores LD50 oral más bajos sean menores o iguales a 50 mg/kg. La suma total de las concentraciones de plaguicidas y demás sustancias, podrá ser de 0.001 mg/L. como máximo; en ningún caso podrán ser excedidos los valores individuales.  Valor Máximo Admisible 0.001 mg/L, para Plaguicidas Categorías toxicológicas II y III (mediana y moderadamente tóxicos), y/o cuyos valores LD50 oral más bajos se encuentren entre 51 y 5000mg/kg. La suma total de las concentraciones de plaguicidas y demás sustancias, podrá ser de 0.01 mg/L. como máximo, en ningún caso podrán ser excedidos los valores individuales.  Valor Máximo Admisible 0.01 mg/L, para los plaguicidas y otras sustancias clasificadas en la categoría toxicológica IV (baja toxicidad) y/o cuyos valores LD50 oral más bajos se encuentren entre 5001 y 15000 mg/kg. La suma total de las concentraciones de plaguicidas y demás sustancias, podrá ser de 0.1 mg/L como máximo.

5.4.4 Consideraciones Éticas con Animales de Investigación RESOLUCIÓN Nº 008430 DE 1993 En toda investigación en la que los animales sean sujeto de estudio deberán tenerse en cuenta, además de las disposiciones determinadas en la Ley 84 de 1989, las siguientes:

 La experimentación en animales solamente se debe realizar después de estudiar su importancia para la salud humana o animal y para el avance del conocimiento biológico.  Los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad apropiada, y utilizar el mínimo número requerido para obtener resultados científicamente válidos.  Solamente se emplearán animales adquiridos legalmente y se mantendrán en condiciones adecuadas.  Los investigadores y demás personal nunca deben dejar de tratar a los animales como seres sensibles y deben considerar como un imperativo ético el cuidado y uso apropiado y evitar o minimizar el disconfort, la angustia y el dolor.  Los investigadores deben presumir, qué procedimientos que causarían dolor en seres humanos también causen dolor en otras especies vertebradas, aún cuando todavía falta mucho por saber sobre la percepción del dolor en los animales.  Todo procedimiento, que pueda causar en los animales más que un dolor o una angustia momentánea o mínima, debe ser realizado con sedación, analgesia o anestesia apropiada y conforme con la práctica veterinaria aceptada. La eutanasia de los animales se efectuará con anestésicos apropiados.  Al final del experimento, o cuando sea apropiado durante el mismo, los animales que puedan sufrir dolor crónico o severo, angustia, disconfort o invalidez que no pueda ser mitigada, deben ser sacrificados sin dolor.  Los animales mantenidos con propósitos biomédicos deben tenerse en las mejores condiciones de vida, de ser posible bajo la supervisión y aprobación de veterinarios con experiencia en animales de laboratorio, como se observa en el anexo 16.

6. DISEÑO METODOLÓGICO

6.1. TIPO DE ESTUDIO

Esta investigación es de tipo experimental, ya que se evaluó y se analizó la exposición de una población a un agente tóxico (Lorsban®) en un periodo de 96 horas bajo condiciones de laboratorio, en donde el factor de estudio correspondiente a la concentración L50 fue manipulada por el investigador, y los peces expuestos se distribuyeron aleatoriamente dentro de cada acuario (Fletcher, 1998).

6.2. POBLACIÓN EXPERIMENTAL

En este estudio se emplearon 72 peces dedinos de la especie Carpa Koy (Cyprinus carpio) provenientes de Acuagranja S.A en Bogotá. Todos los animales fueron pesados (1.2 ± 2.9 g) y medidos en longitud notocordal (3.7 ± 5.9 cm) y total (4.5 ± 6.4 cm) y posteriormente fueron revisados para descartar animales lesionados o enfermos.

6.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

Para el estudio se emplearon 12 acuarios de 60 litros de agua cada uno, durante 15 días para el proceso de aclimatación de los peces; posteriormente se distribuyeron seis peces por acuario al azar, manteniendo una oxigenación constante (7mg/l), en cada acuario, previa biometría de cada ejemplar.

Todos los peces fueron alimentados según biomasa dos veces al día (mañana y tarde), con concentrado comercial con proteína del 42%.

Como sustancia organofosforada se utilizó el producto Lorsban® (Clorpirifos), que viene en presentación en polvo a una concentración del 2.5% (25 g/kg), clasificada como insecticida de uso agrícola y catalogada como ligeramente peligroso por los efectos que produce ya descritos anteriormente.

Se evaluaron cuatro tratamientos incluyendo el grupo control, con dos replicas cada uno, tomando como base a la concentración letal 50 máxima de 0.46 mg/l de Lorsban® reportada por BASF, 2010 y mínima de 0.2 mg/l de Lorsban® descrita por Suárez (2013) (Fig. 6). Constantemente y desde las 0, 12, 24, 48, 72 y 96 horas post exposición, se observaron los cambios en el comportamiento de los peces, piel, calidad de agua y la mortalidad.

Se utilizaron las siguientes concentraciones de Lorsban® para el desarrollo de este experimento:  Tratamiento 1: 0.025 mg/l (1/1.25 CL50)  Tratamiento 2: 0.1 mg/l (1/5 CL50)  Tratamiento 3: 0.15 mg/l (1/7.5 CL50)  Tratamiento 4: Grupo Control (Sin producto)

Figura 6. Diseño del Experimento

Dentro de uno de los tratamientos administrados en el estudio y según el reporte del Ministerio de Agricultura (2008), se estableció que las especies acuáticas son muy sensibles a una concentración letal 50 de 0.1 mg/l, por lo que no se podría establecer un rango letal con solo dos tratamientos si se considera que las concentraciones letales reportadas anteriormente presentan amplios rangos de toxicidad entre concentración y concentración para las diferentes especies, pues no es claro, en que especie hay mayor sensibilidad y a que condiciones de exposición han sido administradas.

6.3.1. Calidad del agua

Antes, durante y después de la aplicación de las concentraciones de Lorsban® en cada tratamiento y hasta terminar el experimento, se evaluó el pH, amonio, 49

temperatura y dureza del agua de cada uno de los acuarios, se utilizaron reactivos del kit recomendados por el laboratorio Merk para el análisis de la calidad del agua.

Los análisis se realizaron teniendo en cuenta que el Lorsban® diluido en agua modifica los parámetros de pH, no obstante su exposición a diferentes concentraciones es la que induce a la letalidad, además de que a través de las necropsias se podrá llegar a un diagnóstico para poder diferenciar si las lesiones que se presentaron fueron producto al cambio del pH del agua o a la exposición del tóxico.

6.3.2. Cambios en tegumento

Se observó y se registró cambios macroscópicos en piel en la pigmentación (normal, perdida, pálido total), moco (normal, disminuido, pérdida total) y brillo (normal, disminuido, opaco) a medida que se aplicaron las diferentes concentraciones de Lorsban® por cada tratamiento durante las 96 horas de experimento.

6.3.3. Extracción y procesamiento de tejidos

Una vez finalizado el experimento de las 96 horas a los peces del T1, 2 y 3 se les insensibilizo mediante shock térmico y tomo una muestra de sangre para su observación en frotis; colocando una gota sobre la lámina y luego preparándola con tinción de Wright para dar color, y de buffer de Giordano para darle contraste, y asi poder observar microscópicamente los cambios en su morfología celular.

Posteriormente los animales fueron procesados según lo propone Reimschuessel et al., (1988) así: tres peces por acuario fueron sacrificados mediante shock térmico, momento en el cual se procedió a la extracción de las muestras de 50

cerebro, hígado y branquias conservándolas en formol buferado al 10%, para su procesamiento histológico bajo el método de tinción de Hematoxilina- Eosina (H-E) (7µm).

6.3.4. Análisis de Datos Los datos que se obtuvieron una vez finalizó el experimento fueron registrados en Excel 2007.

7. HIPÓTESIS

Hipótesis Nula: La administración de Lorsban® en un periodo de 96 horas, no presentó mortalidad del 50% en la población de la Carpa koy (Cyprinus carpio) bajo condiciones de laboratorio. Hipótesis Alternativa: La administración de Lorsban® en un periodo de 96 horas, presentó mortalidad del 50% en la población de la Carpa koy (Cyprinus carpio) bajo condiciones de laboratorio.

8. RESULTADOS

Una vez finalizadas las 96 horas pos exposición de Lorsban® bajo condiciones de laboratorio, los datos obtenidos de mortalidad, piel, comportamiento y calidad del agua se registraron de acuerdo a cada tratamiento con sus respectivas replicas.

8.1. ANALISIS DE MORTALIDAD (peces expuestos) La supervivencia de los peces se observó y se registró en las 0,12, 24, 48, 72 y 96 horas (Anexos 8, 9, 10, 11, 12 y 13); donde la mortalidad más alta se presento en el T3 a las 90 horas, correspondiente al 50% de la población y registrándose como la concentración letal 50 estudiada dentro este tratamiento (Tabla 7). En el T1 y 2 se obtuvo un 25 y 40% respectivamente y en el Grupo Control 0% durante todo el experimento. Tabla 7. Mortalidad durante las 90 y 96 horas de estudio Tratamiento

Mortalidad

T.E*

Peces

Porcentaje Total

Tratamiento 1 (0,025mg/l)

25%

96 horas

Tratamiento 2 (0.1mg/l)

40%

96 horas

Tratamiento 3 (0,15mg/l)

50%

90 horas

Grupo Control

96 horas

*Tiempo de exposición

8.2. CAMBIOS EN TEGUMENTO Las anormalidades en piel se evaluaron una vez que los animales fueron expuestos al Lorsban® (Anexo 14), registrando a la hora 0 y 12 la pigmentación, el moco y el brillo en los cuatro tratamientos en aparente normalidad, los cambios se 53

empezaron a evidenciar a partir de la hora 24 y 48 en el T1, T2 y T3 cuando hubo pérdida de la pigmentación con tonalidades mas pálidas y comenzó a disminuir el moco y brillo, a las 72 y 96 horas en el T3, los peces presentaron una apariencia totalmente pálida o blancuzca en su anatomía corporal, con opacidad en su brillo, en comparación a las concentraciones utilizadas en el T1 y T2 donde los cambios inicialmente registrados se mantuvieron durante todo el tiempo de exposición. En el grupo control se observaron los peces con sus colores normales y brillantes características típicas de esta especie tal y como se observa en la figura 7.

Figura 7. Cambios en la piel. a. peces con disminución en su tonalidad. b. pez con pérdida total de su coloración. c. colores normales de la especie Carpa koy.

8.3. COMPORTAMIENTO Los peces expuestos a las diferentes concentraciones de Lorsban® durante el T1, 2 y 3 a partir de las 24 horas exhibían dificultad en el nado, a las 48, 72 y 96 horas su comportamiento empezó a cambiar (Anexo 15), ya que los peces pasaron de estar en un nado horizontal y vertical en la columna de agua a solo nado horizontal en el fondo del acuario, comenzaron a agruparse al lado de la piedra aireadora limitando su alimentación pues no subían a la parte superior del acuario a comer sino que esperaban que la comida descendiera para poder hacerlo, también presentaron nado errático y dificultad en el equilibrio. En el Grupo Control su comportamiento y su alimentación era normal como se observa en la figura 8. 54

Figura 8. Cabios en el comportamiento. a. nado boca abajo y pérdida del eje del nado. b. peces letárgicos en la parte inferior. c. peces con conductas normales.

8.4. CALIDAD DE AGUA Los valores de la calidad del agua se midieron constantemente a las 0, 12, 24, 48, 72 y 96 horas durante todo el experimento, en la tabla 10, se puede observar los valores de pH eran de 7 para el T1 y T2. En el T3 inicialmente presentaba un pH de 7.0 y a partir de la hora 48 hasta finalizar el estudio se registró un pH de 7.5 y una dureza de 6 ppm, valores con tendencia a la alcalinidad. El amonio y temperatura en los tres tratamientos permanecían estables y no se mostraban cambios significativos en sus medidas, en el caso del Grupo Control sus valores medidos en las horas de revisión eran iguales.

Tabla 8. Revisión de la calidad del agua durante el experimento PARÁMETROS

G.C.

7.5

Amonio

Dureza (ppm de CaCO3) Temperatura (ºC)

8.5. ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE CÉLULAS ROJAS Al momento de la insensibilización de los animales mediante shock térmico bajo el protocolo de Reimschuessel et al., (1988), se procedió a tomar una muestra de sangre de un animal por tratamiento para comparar las características morfológicas de sus células rojas donde se observó microscópicamente que en el T1 se presentaba una anisocitosis, anisocariosis , microcariosis, trombocitopenia, núcleos desnudos, también se evidencia citoplasma de apariencia espumosa y una membrana difusa e incompleta como se observan en la figura 9.

Figura 9. Características morfológicas celulares de los peces del T1 a una concentración de 0.025 mg/l. a. anisocitosis (flecha azul), anisocariosis (flecha roja), microcariosis (flecha verde) y

membrana difusa (flecha negra). b. citoplasma espumoso (cabeza de flecha), núcleos desnudos (flecha azul) y microcariosis (flecha verde).

En el T2 las características que se encontraron fue una anisocitosis y una anisocariosis leve, trombocitopenia, células sin núcleo y pérdida de la continuidad de la membrana eritrocitaria como se observa en la figura 10.

Figura 10. Características morfológicas celulares de los peces del T2 a una concentración de 0.1 mg/l. a. anisocitosis leve (flecha roja) y pérdida de la continuidad de la membrana eritrocitaria (flecha negra). b. anisocariosis leve (flecha azul) y células sin núcleo (flecha negra).

En el T3 en donde la concentración fue la más alta y donde se presentó una gran mortalidad de animales, se evidenció más alteraciones en comparación con los otros tratamientos, donde se observó una anisocitosis alta, células pequeñas, eritrocitos redondos, pérdida de la continuidad de la membrana eritrocitaria, citoplasma espumoso, trombocitopenia y algunos núcleos excéntricos y otros con figuras mitóticas como se observan en la figura 11.

Figura 11. Características morfológicas celulares de los peces del T3 a una concentración de 0.15 mg/l. a. anisocitosis (flecha verde), c. pequeñas (flecha negra), eritrocitos redondos (flecha roja) y núcleos excéntricos y con figuras mitóticas (flecha azul).b. perdida de la continuidad de la membrana eritrocitaria (flecha azul), citoplasma espumoso (flecha verde) y eritrocitos redondos (flecha roja).

8.6. HALLAZGOS MACROSCÓPICOS A la necropsia se observaron lesiones en la piel como despigmentación, pérdida del brillo y sus aletas de aspecto deshilachado. Posteriormente, cuando se realizó la incisión de los peces algunos presentaban líquido en la cavidad abdominal y hemorragias, la vejiga estaba pletórica y sus órganos presentaban adherencias. Las lesiones encontradas en el T3 eran más severas que las del T1 y T2 ya que los animales presentaban exoftalmias, las branquias se observaban de coloración rojo oscuro y petequias alrededor del parénquima branquial, el hígado presentaba diferentes tonalidades, la vesícula biliar estaba pletórica con contenido más espeso verdoso, los intestinos se encontraban vacios y traslucidos con gran cantidad de líquido en la luz intestinal como se observa en la figura 12.

Figura 12. Hallazgos a la necropsia. a. aletas (flecha naranja), cavidad abdominal (flecha azul), piel (flecha negra). b. exoftalmia (flecha naranja), parénquima branquial (flecha azul), c. intestino (flecha naranja), vesícula biliar (flecha azul), hígado (flecha negra). d. vejiga (flecha azul).

8.7. HALLAZGOS HISTOLÓGICOS Se analizaron los cortes histológicos de cerebro, hígado y branquias; donde se observó que en el tejido cerebral y branquial del T3, presentaron lesiones más severas en comparación con los otros tejidos estudiados.

En el tejido cerebral del T1 a una concentración de 0.025 mg/l, se exhibió un leve incremento de las células nerviosas, vacuolización, leve congestión, núcleos de las neuronas con cambios picnóticos y la presencia de núcleos en una misma célula y anormales como se muestra en la figura 13.

Figura 13. Análisis del tejido cerebral del T1. a. Leve incremento de células nerviosas (asterisco), vacuolización (flecha verde) y congestión (flecha azul). b. Núcleos anormales (flecha roja) y núcleos en una misma célula (flecha negra). Objetivo 40x.

En el tejido branquial, se observaron lesiones como atrofia y ausencia lamelar, pérdida de la continuidad del tejido branquial, hiperplasia general y ligera de la región interfilamental, acúmulo y fusión de células hiperplasicas en las lamelas, cambios en la arquitectura celular del epitelio lamelar, células fusionadas y desprendimiento de las células epiteliales (Fig. 14).

Figura 14. Análisis del tejido Branquial del T1. a. Tejido branquial normal. b. Hiperplasia ligera (flecha roja), ausencia lamelar (flecha verde), atrofia lamelar (flecha azul), acumulo y fusión de células hiperplasicas (asterisco blanco) e hiperplasia general (asterisco amarillo). c. Pérdida del tejido branquial (flecha negra), atrofia lamelar (flecha azul), hiperplasia general (asterisco amarillo), desprendimiento celular (cabeza de flecha), fusión de células (flecha verde) y arquitectura celular (flecha roja). Objetivo 10x.

En el hígado, se presentó una vacuolización lipídica citoplasmática, variación en el tamaño de los hepatocitos, tumefacción de hepatocitos y cambios nucleares (Fig. 15).

Figura 15. Análisis de hígado del T1. a. Vacuolización (flecha azul) y variación del tamaño de los núcleos (flecha verde). b. Células sin núcleo (cabeza de flecha), fusión de células (flecha azul) y acumulo de núcleos en una célula (flecha verde). Objetivo 40 y 10x.

En el tejido cerebral del T2 a una concentración de 0.1 mg/l, se identificó vacuolización, gliosis difusa del tectúm en zona gris, congestión, apoptosis, agrupamiento de células en el tejido cerebral, núcleos anormales, núcleos de las neuronas con cambios picnóticos y cambios de tamaño en las neuronas (Fig. 16).

Figura 16. Análisis del tejido cerebral del T2. Vacuolización (flecha verde), apoptosis (flecha roja), congestión (flecha negra), núcleos con figuras mitóticas (cabeza de flecha), agrupamiento de células (flecha azul) y gliosis difusa (asterisco amarillo). Objetivo 40x.

En el tejido branquial, se observó atrofia lamelar, ausencia e hiperplasia moderada de la región interfilamental, acúmulo de células epiteliales e hiperplasicas, desprendimiento de las lamelas branquiales y cambios en la arquitectura de las células epiteliales (Fig. 17).

Figura 17. Análisis del tejido Branquial del T2. a. Acumulación de las células epiteliales (flecha azul), desprendimiento del tejido branquial (flecha negra) y cambios en la arquitectura de las células (flecha naranja). b. Atrofia lamelar (flecha azul), ausencia región interfilamental (flecha negra) e hiperplasia (flecha roja) y acúmulo de células hiperplasicas (flecha verde). Objetivo 40 y 10x.

En el hígado, se evidenciaron núcleos de diferente tamaño, vacuolización, binucleación de hepatocitos y acúmulo de núcleos en los hepatocitos (Fig. 18).

Figura 18. Análisis de hígado del T2. Acumulación de núcleos (flecha azul), binucleación de hepatocitos (flecha naranja), vacuolización (flecha negra) y tamaño diferente de los núcleos (flecha verde). Objetivo 40x.

En el tejido cerebral del T3 a una concentración de 0.15 mg/l, exhibió un incremento en las células nerviosas, núcleos de gran tamaño característicos de una inflamación crónica en el tejido cerebral, núcleos fusionados, células sin núcleo y vacuolización, núcleos de las neuronas con cambios picnóticos y muerte neuronal (Fig. 19).

Figura 19. Análisis del tejido cerebral del T3. Incremento de células nerviosas (flecha roja), vacuolización (flecha naranja), núcleos de gran tamaño (flecha negra), núcleos fusionados (flecha verde) y células sin núcleo (flecha azul). Objetivo 40x.

En el tejido branquial, se observó una separación del tejido branquial, perdida de la continuidad del epitelio branquial, hiperplasia moderada de la región interfilamental, incremento y desprendimiento de las células epiteliales de las lamelas branquiales, células por fuera del epitelio lamelar, formación de un quiste en la región interfilamental entre las lamelas branquiales, infiltrado moderado focal de eritrocitos y edema como se observa en la figura 20.

Figura 20. Análisis del tejido Branquial del T3. a. Quiste (flecha negra), separación del tejido branquial (flecha azul) y edema (flecha verde). b. separación del tejido branquial (flecha azul), perdida del epitelio (flecha roja), hiperplasia moderada (flecha verde), incremento de células epiteliales (cabeza de flecha), desprendimiento de células (flecha negra), células por fuera del epitelio (asterisco amarillo). Objetivo 10x y 40x.

En el hígado, se observó pérdida de arquitectura del tejido hepático, disminución de los hepatocitos con degeneración grasa citoplasmática que consiste en una gran vacuola grasa que rechaza el núcleo hacia la periferia, fusión de núcleos, infiltrado focal leve de eritrocitos (Fig. 21).

Figura 21. Análisis de hígado del T3. Disminución de hepatocitos (flecha azul), hepatocitos con degeneración grasa (flecha negra), fusión de núcleos (flecha verde), perdida de arquitectura del tejido hepático (asterisco rojo). Objetivo 40x.

9. DISCUSIÓN

La literatura reporta cambios en los peces que han sido expuestos a diferentes concentraciones bajo condiciones controladas (Tabla 2), pero poco es lo que se sabe sobre su distribución en ambientes abiertos y los efectos reales que producen estos tóxicos a largo plazo, debido a que los modos de acción son amplios, ya sea por su carácter lipofilico, aumento en la solubilidad de las membranas o los efectos Xenobióticos en las poblaciones expuestas (Stentiford et al., 2003). Para el caso de las concentraciones letales 50 de clorpirifos a 96 horas, registradas y evaluadas por diferentes autores se refieren efectos letales que varían entre sí ampliamente, y ponen en duda su uso o validez como valores de referencia para el control gubernamental medioambiental, particularmente en sistemas y especies acuáticas de agua dulce ó salada, tal es el caso de la trucha Arco Iris (Salmo gairdneri) que reporta valores de 0.002, 0.003, 0.007 hasta 0.03 mg/l (Cheminova y

Eurorubicon, 2013), en la Carpa (Cyprinus carpio)

mortalidades a una concentración de 0.46 mg/l (Basf, 2010), en varias especies de 0.0013 hasta 0.0014 mg/l (Tradecorp, 2010), en el Pez Luna de Agallas Azules de 0.002 – 0.010 mg/l (Clorpirifos, 2007), en especies más sensibles con valores de 1 y 10 mg/l (AgroSciences, 2003) y en alevinos de Carpa a una concentración de 0,2 mg/l mortalidades del 100% en las primeras 48 horas de estudio (Suárez, 2013). Por tal motivo se manejaron concentraciones inferiores a las ya descritas, determinando así que a la hora 90 de éste estudio y a una concentración de 0.15 mg/l produjo una mortalidad del 50% con alteraciones macroscópicas en dedinos de Carpa, lo cual se demostró la alta peligrosidad y toxicidad para la vida acuática.

Los clorpirifos son compuestos organofosforados responsables de daños en sistema nervioso central, hígado, riñones y de comportamiento debido a su

mecanismo de acción (Córdoba, 2001). En éste estudio se observó congestión en el tejido cerebral de los T1 y T2, apoptosis en el T2, un incremento de las células nerviosas en el T3 que se pueden asociar a una inflamación crónica y vacuolización para los T1, T2 y T3; concordantes a las descritas por Wilhelm et al., (2005). Cengiz y Ünlü (2003) y Córdoba (2008); reportaron que estas lesiones en el sistema nervioso central se deben a su mecanismo de acción, ya que clorpirifos interfieren en la actividad de enzimas como la acetilcolinesterasa inhibiendo la acetilcolina, la cual está situada en el sistema nervioso central; ocasionando daños a nivel del encéfalo (tectúm óptico) como alteración degenerativa y una proliferación de los astrocitos en el sistema nervioso central. Por tal motivo en este estudio se observó que el Lorsban® tanto en concentraciones bajas como altas aplicadas en los T1, T2 y T3, afectó el cerebro lo cual llevo a daños a nivel del sistema nervioso central y de ahí los cambios en el comportamiento observados como los movimientos involuntarios, el nado sobre su propio eje, errático y pérdida del equilibrio. Además se observó que la exposición al Lorsban® genera a partir de las 24 horas de estudio alteraciones comportamentales en el nado y equilibrio, acompañadas de letargo y disminución del apetito en los T1, T2 y T3; lo que concuerda con lo descrito por De Silva y Samayawardhena (2002), quien afirma que el agroquímico genera un bloqueo a nivel del sistema antioxidante, causando daño celular, bioquímico y un estrés oxidativo, que inhiben la capacidad de los mecanismos de defensa, y disminuyen a su vez la supervivencia de los animales expuestos, para lo que Hofer et al., (2000) e Iregui et al., (2004) registran que a exposiciones con Lorsban® se presenta una secuencia de cambios en el comportamiento como en el nado errático, excitación, bloqueo, convulsión y muerte. Por otro lado, Park et al., (2007) y Gallardo (2005) coinciden en que la exposición a organofosforados provocan una disminución en el apetito y por ende retraso en

el desarrollo y crecimiento de los peces, ya que se convierten en factores nocivos y estresantes para su ambiente.

La aplicación del Lorsban® en el agua de los acuarios genero una coloración gris y el olor aromático característico de este agroquímico, concordante a lo descrito por Córdoba (2006), que registra un enturbiamiento del agua que impide que la luz penetre hasta el fondo del acuario y que genera disminución en la producción de oxígeno libre, aumentando la actividad metabólica consumidora de oxígeno y así alterando los parámetros de pH y dureza. Durante el experimento el pH evaluado en los T1, T2 y GC fue de 7, valor normal para la especie Carpa, para lo que Hodgsón (1969) reporta que al haber cambios en estos valores se produce un cuadro de estrés causado por la exposición de este tóxico; en el estudio a partir de las 48 horas el T3 presentó un pH de 7.5 y dureza de 6 cambios que se pueden relacionar directamente con las alteraciones encontradas en los peces evaluados durante las 96 horas de estudio según Legaspy (1986), no obstante Ranier y Pauly (2004) describen estos cambios en los valores de pH y dureza como normales para la especie ya que están dentro del rango de 6.5 a 7.5 y 4 a 10° respectivamente.

Voto (2002), describió que la piel del pez es una envoltura del cuerpo que le brinda protección, convirtiéndose así en un mecanismo de defensa ante cualquier enfermedad y exposición ambiental como los tóxicos; en éste estudio se evidenciaron cambios severos en la piel de los peces a partir de la hora 72 y 96 en el T3 con palidez, pérdida y opacidad total en sus tonalidades normales típicas de esta especie, efectos que concuerdan con lo descrito por Bartón et al., (2000), que reporta a exposiciones a corto o largo plazo de clorpirifos en la Carpa (Cyprinus carpio), daños en la piel asociados a una disminución del color, despigmentación y

escamas superpuestas y perforadas, que afectan la anatomía corporal de la especie.

Otros hallazgos observados y encontrados en la necropsia de los peces pos exposición, fue la presencia de líquido y hemorragias en la cavidad abdominal, vejiga pletórica, petequias en el branquias, vesícula biliar pletórica e intestinos traslucidos con gran cantidad de liquido en la luz intestinal que comparados por los de Ramírez (2009), se asemejan ante la exposición de organofosforados como el Lorsban®; que provoca una irritación en los vasos sanguíneos y órganos.

Las branquias de los peces expuestos a clorpirifos,

histológicamente se

observaron afectados debido al aumento del grosor de la mucosa así como infiltración leve de células mononucleares acompañada de infiltración en la región interfilamental, congestión, hemorragias y edemas subepiteliales leves (Szarek et al., 2000). La ruptura del epitelio branquial se puede dar ante la exposición de agroquímicos o de compuestos irritantes (Ramírez et al., 2008); como se observó en el tejido branquial del T2 y T3 exhibiendo células hiperplasicas y en el T3 donde se evidenció edema, congestión y pérdida de la arquitectura del epitelio branquial. Estos daños en las branquias hacen que los peces disminuyan el intercambio gaseoso según Lin y Randall (1995), ya que se podría provocar un desbalance electrolítico debido a la gran permeabilidad de las branquias, produciendo así una acidosis metabólica; de ahí los hallazgos microscópicos encontrados en éste estudio como la disminución de los eritrocitos, pérdida parcial de su membrana, deformación de las células rojas, núcleos con características difusas y trombocitopenia para los T1, T2 y T3; estos daños en sangre no solamente se pueden relacionar con las lesiones en branquias sino también por las observadas en el hígado según lo descrito por Silveira et al., (1996).

Vázquez (2005), afirma que los cambios en la morfología de las células rojas en los peces son ocasionados por la exposición a productos tóxicos; además Prieto et al., (2008) y Valenzuela et al., (2006), encontraron que la disminución de eritrocitos en sangre de la Carpa (Cyprinus carpio), son provocados por condiciones de estrés por cambios ambientales y presencia de contaminantes. La anemia es un signo que interfiere en el estado fisiológico de un animal, determinado por los cambios en los valores de hemoglobina y del conteo eritrocitario (Schmalz et al., 2002). La disminución de los eritrocitos en este estudio y las diferencias en su morfológica celular se puede relacionar con una anemia o el estrés producido por el Lorsban®; Svoboda (2001) afirma, que cuando hay deformaciones en los eritrocitos, o estos son bajos, se exhiben problemas de tipo nutricional o anemia; como se observó en las concentraciones utilizadas en los T1, T2 y T3 de esta investigación donde los peces presentaron una disminución del apetito. El desarrollo de una anemia es debido a la exposición de un insecticida organofosforado el cual produce alteraciones en las membranas de las células por hidrólisis de la acetilcolina (Tolga y Konen 2007).

Bernet (2004), reportó que en el hígado de Carpa (Cyprinus carpio), expuestas durante 5 días a un organofosforado, fueron encontrados cambios subcelulares como tumefacción mitocondrial, congestión, daños en los núcleos, degeneración grasa de los hepatocitos así como necrosis de coagulación, presencia de grandes gotas de lípidos y gránulos pigmentarios biliares, los que fueron atribuidos al daño del insecticida sobre los organelos responsables de la síntesis proteica y de la producción de energía. Lesiones que son semejantes con los hallazgos microscópicamente encontrados en el tejido hepático de éste estudio, donde se evidenció en los tres tratamientos un daño en los núcleos como fusión y variación en el tamaño, congestión en los tejidos del T1 y T3 y la presencia de hepatocitos con degeneración grasa citoplasmática para el T3.

Los cambios observados y ocasionados por los agroquímicos como el Lorsban®, afectan directamente la vida de la Carpa (Cyprinus carpio), debido a las alteraciones o cambios en su comportamiento, piel, agua, sangre y tejidos diana de principal funcionamiento como el cerebro, branquias e hígado; considerándose así como un tóxico altamente peligroso para las especies acuáticas.

10. IMPACTO

Con el presente estudio se pretendió evidenciar que debido a altas exposiciones de compuestos organofosforados como el Lorsban®, se ven afectados los órganos de los peces como el cerebro, branquias e hígado alterando su funcionamiento fisiológico normal, también produciéndose efectos negativos los cuales afectan el nado del pez y demás aspectos que disminuyen su desarrollo en el medio acuático abierto o cerrado en el cual habitan.

Adicionalmente las Concentraciones Letales 50 reportadas por Basf (2010) y Xing et al. (2010 - 2012) registran concentraciones de 0.46 mg/l en Carpas (Cyprinus carpio) y 0.4 mg/l a las 96 horas respectivamente, no obstante en los estudios realizados por Suárez en el 2013, se observó que a la exposición de 0,2 mg/l se obtienen mortalidades del 100% a las 48 horas, lo que ponen aún más en duda el uso y veracidad de las concentraciones del agroquímico recomendadas por la literatura y los laboratorios que lo distribuyen.

En este estudió se determinó que la

administración de compuestos

organofosforados como el Lorsban®; pueden producir efectos nocivos para la salud de los peces bajo condiciones controladas, donde se pudo evidenciar los efectos letales que se presentaron en los T1, T2, T3, la severidad de las lesiones en los tejidos cerebral, hepático, branquial o como también los cambios en el comportamiento, agua e incluso de la piel. Además la Carpa al ser pescada y comercializada en éste estado, puede generar grandes riesgos de salud para la vida humana a través de la cadena alimentaria.

11. CONCLUSIONES

La literatura reporta diferente información sobre las concentraciones letales 50 de clorpirifos a 96 horas en diversas especies acuáticas, las cuales no son claras y ponen en duda su veracidad, efectividad y uso en cuanto a la proporción de sustancia utilizada en estudios realizados con anterioridad. El Lorsban® es un agroquímico que afecta directamente la vida de las especies acuáticas, ocasionando altas mortalidades en cortos periodos de tiempo y presentando lesiones severas en sus principales

órganos en funcionamiento

como cerebro, hígado y branquias. La concentración utilizada en el Tratamiento 3 de 0.15 mg/l, fue letal para el 50% de la población estudiada presentándose a las 90 horas antes de finalizar el estudio y por ende considerándola como la concentración letal 50 para la Carpa Koy (Cyprinus carpio) bajo condiciones de laboratorio. Los cambios observados como en el nado errático, pérdida del equilibrio, exoftalmia, opacidad de la piel, deshilachamiento de las aletas caudales y la acumulación de líquido a nivel de la cavidad abdominal son características indicativas de una intoxicación aguda o subaguda por clorpirifos. Las concentraciones de Lorsban® utilizadas y evaluadas dentro del estudio, presentaron cambios en los parámetros de la calidad del agua en cuanto a pH y dureza; lo cual se puede relacionar con los daños observados en los peces. El análisis hematológico es un método diagnóstico útil para el estado de salud particularmente en peces que han sido expuestos a sustancias tóxicas, por los daños que estos causan directa o indirectamente en los procesos fisiológicos o nutricionales de cada organismo, en los cuales se encuentran dependiendo del tiempo y la concentración, donde se encontro anormalidades morfológicas en las células

rojas

como

anisocitosis,

anisocariosis, 76

microcariosis,

citoplasma

espumoso, anormalidades en los núcleos y pérdida de la continuidad de la membrana eritrocitaria. Las lesiones severas encontradas en el tejido cerebral, hepático y branquial del T3, se relacionan con los graves inconvenientes que tuvieron los animales al momento de la excreción de este tipo compuestos tóxicos, lo que sería un efecto secundario del toxico por el daño efectivo en cerebro, branquias, hígado y otra serie de procesos fisiológicos que conllevaron a una disminución en su crecimiento normal e incluso del haber provocado la muerte de los peces.

12. RECOMENDACIONES

Realizar nuevas investigaciones de toxicidad en los ecosistemas acuáticos, principalmente en las zonas de mayor producción agrícola como en el altiplano boyacense, donde se utilicen químicos como el Lorsban® u otro tipo de insecticidas organofosforados. Brindar mayor información a los trabajadores agrícolas sobre riesgos que se presentan en la salud humana como animal al manejar este tipo de sustancia toxicas. Realizar nuevos estudios donde se evalué la concentración letal 50 de Lorsban®, en diferentes especies acuáticas y periodos de tiempo bajo condiciones controladas. Realizar pruebas histológicas, ya sea en animales experimentales o en los ecosistemas acuáticos, las cuales sean diferentes a las realizadas en este estudio, como en el riñón, intestino, vejiga y bazo; para poder evaluar y diferenciar las lesiones encontradas con las ya estudiadas con anterioridad y que se puedan relacionar con un proceso de intoxicación.

BIBLIOGRAFĂ?A

AgroSciences.

(2003).

Disponible

en:

http://msdssearch.dow.com/PublishedLiteratureDAS/dh_0098/0901b8038009863e. pdf?filepath=co/pdfs/noreg/013-00087.pdf&fromPage=GetDoc. consultado 9 de marzo de 2014. 1 - 6 .

Alpuche, G (1990). Los plaguicidas, el ambiente y la salud. Mexico: Centro de Ecodesarrollo.

Arias, D (1997). MetodologĂa para adelantar programas de seguimiento y monitoreo de plaguicidas. Ministerio del Medio Ambiente. , 50 - 75.

Barton BA, Bolling H, Hauskins BL, Jansen CR (2000). Juvenile pallid (Scaphirhynchus albus) and hybrid pallid shovelnose (S. albus platorynchus) sturgeons exhibit low physiological responses to acute handling and severe confinement. Comp Biochem Physiol Part A. , 126: 125-34.

Basf

(2008).

Basf

(The

Chemical

Company)

2008.

disponible

en:

http://www.basf.cl/sac/web/chile/es_ES/function/conversions:/publish/content/chile/ agro/productos/documentos/hojas_seguridad/clorpirifos_s_480.pdf. consultado 9 de marzo de 2014. 1 - 15.

Bernet D, Schmidt-Posthaus H, Wahli T, Burkhardt-Holm P (1999). Histopathology in fish: proposal for a protocol to asess aquatic pollution. Fish Dis, 25 - 34.

Bernet D, Schmidt-Posthaus H, Wahli T, Burkhardt-Holm P (2004). Evaluation of two monitoring approaches to assess effects of waste water disposal on histological alterations in fish . Hydrobiologia , 524:53-66.

Boyacá, G (2013). Boyacá, disponible: http://www.gobernaciondeboyaca.gov. consultado 25 febrero de 2014. S.p.

Boyacá.,

(2012).

Tunja,

Boyacá.

disponible:

http://www.tunja-

boyaca.gov.co/informacion_general.shtml#geografia. consultado 25 febrero de 2014. Geografia de Boyacá, 1 - 5.

Canapa A, B, M, (2007). Vitellogenin gene expression in males of the Antarctic fish Trematomus bernacchii from Terra Nova Bay (Ross Sea): A role for environmental cadmium. . Chemosphere , 1270 - 1277.

Carr, R. S (1995). Inhibition and aging of channel catfish brain acetylcholinesterase following exposure to two phosphorothionate insecticides and their active metabolites. J. Toxicol Environ. Health., 325-336.

Cengiz, E Y Ünlü, E (2003). Histopathology of gills in mosquitofish, Gambusia affinis after long-term exposure to sub-lethal concentrations of Malathion. J. Environ. Sci. Healt B , 38(5): 581-589.

Cerdá JM, M, B, (2008). A cytoarchitectonic study of the brain of a perciform species, the sea bass (Dicentrarchus labrax): The midbrain and hindbrain. . Acta Histochemica , 10 - 18.

Cheminova

(2013).

disponible

en:

http://www.cheminova.es/sites/default/files/CHAS%205G%20MSDS%20CLP_0.pdf . consultado 9 de marzo de 2014. 1 - 10.

Chen CY, H, K (2008). Multiple stressor effects of herbicide, pH, and food on wetland zooplankton and a larval amphibian. Ecotox Environ Safety, 209 - 218.

Clorpirifos

(2007).

disponible

en:

http://www.sprl.udl.cat/export/sites/Sprl/camp/Fitxes_seguretat/CLORPIRIFOS_25 PM_R0-FDS.pdf. consultado 9 de marzo de 2014. 1 - 4.

Colombia,

(2010).

Carpa

Plateada:

disponible:

http://www.lacarpaplateada.com. consultada 20 de febrero de 2014. 1-5.

Córdoba, D (2001). Toxicología. Bogotá: 4ta. Ed. Colombia: Manual Moderno.

BIBLIOGRAPHY \l 9226

Cordoba, J (2006). Calidad de agua: su papel en la

producción acuícola. I Curso – Seminario Internacional de Patología y Sanidad Piscícola. Bogotá (Colombia) , 5 - 16.

Córdoba, D (2008). Toxicología.México: Manual Moderno. 5a. Edicion.

Corredor, S W-C-S (2012). Grupo de Investigación sobre Reproducción y Toxicología de Organismos Acuáticos - GRITOX, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, Universidad de los Llanos, Villavicencio, 2012. 59.

De Silva PMCS, Samayawardhena LA (2002). Low concentrations of Lorsban in wáter result in far reaching behavioral an histological effects in earty life stages in guppy. Ecotoxicol Environ Saf , 53: 248, 254.

De Silva PMCS, Samayawardhena LA (2005). Effects of clorpirifos on reproductive performances of guppy (Poecilia reticulata). Chemosphere , 1293 - 1299.

Dreisback, R (1988). Manual de toxicología clínica, prevención, diagnóstico y tratamiento.El Manual Moderno 12 Edición. p. 95-105.

Eddleston M, Hillips M (2006). Self Poisoning with Pesticides.l. . British Medical Journa, 328-342.

Eissa BL, Ossana NA, Ferrari L, Salibian A (2010). Quantitative behavioral parameters as toxicity biomarkers: fish responses to waterborne cadmium. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 58(4): 1032-2039.

Elandalousi LM, L, R (2008). Effects of herbicide Roundup® on Perkinsus olsen in vitro proliferation and in vivo survival when infecting a permissive host, the claim Ruditapes decussatus. . Bull Environ Contam Toxicol , 512-515.

Eldefrawi M E y Eldefrawi A (2003). Neurotransmitter Receptors as Targets of Pesticides. Journal of Environmental Science and Health , 18:65-88.

BIBLIOGRAPHY \l 9226 EPA (2002). Attributes of fish that make them desirable components of biological assessments and monitoring programs. disponible en: http: // www.epa.gov. Consultado 23 de marzo de 2014.

EPA (2005). Compilations of EPA’S sampling and analysis methods. Edited by Lawrens, Keith. P 1696. 2nd Edition.

Eurobicon

(1993).

Eurorubicon,

1993.

disponible:

http://eurorubicon.com/producto/clorpirifos-25-sp-es. consultado. 9 de marzo de 2014. 1 - 6.

Farmex

(2013).

disponible

en:

.http://www.farmex.com.pe/docs/hojas_tecnicas/Clorfos_1.5_G.swf. consultado. 9 de marzo de 2014. 1- 8.

Fatima M, M, S (2007). Combined effects of herbicides on biomarkers reflecting immune-endocrine interactions in goldfish immune and antioxidant effects. 159167. Mexico.: Aquat Toxicol.

Fletcher RH, F, S (1998). Epidemiología clínica. Barcelona.: 2ª ed. MassonWilliams &Wilkins. .

Gallardo, S (2005). Los peces y los efectos de las sustancias toxicas. 15 - 20

Garcia Ubire F. Vargas Morales JA, C, R (2013). Grupo de Enfermedades Neurodegenerativas - END, línea Inmunotoxicología, Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad del Tolima, Ibagué,. SP.

Geneva, L (2000). orld Health Organization (WHO). Public Health, S.p.

Gul, A (2005). Investigation of acute toxicity of clorpirifos–metyl on Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.) larvae. . Chemosphere , 163 - 166 Guyton A y Hall J. (2006). Textbook of Medical Physiology. Eleventh Edition , 752.

Henry, V (1996). Feeding strategies form pollution control in pig production. Proceedings of the 14th. Pig Veterinary Society Congress, 21 - 23.

Hofer R, Jeney Z, Bucher F

(2000). chronic effects of linear alkylbenzene

sulfonate (LAS) and ammonia on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fry at water criteria limits. Wat Res, 29: 2725-2729.

Hodgson, L (1969). Effects of Temperature on the Growth and Development of Lemna minor, under Conditions of Natural Daylight. Scotland –Inglaterra: Scottish Horticultural Research Institute, Dundee. p 1-3.

ICA, (2000). Comercializacion de plaguicidas: importacion, produccion, ventas y exportaciones en 1998. División de Insumos Agrícolas. Colombia.: Produmedios. Primera Edición.

Idrovo, J (2010). Intoxicaciones masivas con plaguicidas en Colombia. Biomédica;. Biomedica., 67 - 76.

Iregui CA, Hernández E, Jiménez A, Pulido A, Rey AL, Comas J (2004). Primer Mapa Epidemiológico de las Enfermedades de los Peces en Colombia. Bogota D.C: Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Grupo de Fisiopatología veterinaria. Ministerio de Agriculturay Desarrollo Rural.

Kavitha, P (2008). Toxic effects of chlorpyrifos on antioxidant enzymes and target enzyme acetylcholinesterase interaction in mosquito fish, Gambusia affinis., 192– 198. Environ.Toxicol. Pharmacol. , 192 - 198.

Legaspy, U (1986). Intoxicación por plaguicidas organofosforados y carbamatos. . IMSS. Mexico, D.F., 20 - 42 .

Lin H, Randall D (1995). Proton pumps in fish gills. En: Wood C, Shunttleworth T, editors. Cellular and molecular approaches to fish ionic regulation, 14. San Diego: Academic Press (Elsevier) , 229-255.

López, C (1993). Exposicion a plaguicidas organofosforados. Perspectivas en Salud Publica N. 18. Mexico: Instituto Nacional de Salud Publica, S.p.

Mendez, M; G-N-B (2013). IV Conferencia Latinoamericana sobre Cultivo de Peces Nativos Latin American and Caribbean Aquaculture 2013 LACQUA2013 XIX Jornada de Acuicultura y el VI Foro Regional de Acuicultura., (pág. SP).

Muñoz Vigiliano FA, C, M (s.f.). Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - CONICET, Argentina. 3Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad Federal de Santa María, Brasil. 24,48,72 Y 96.

NMFS (2008). National Marine Fisheries Service Endangered Species Section 7 Consultation Biological Opinion. EPA Registration of Pesticides Containing Chlorpyrifos,

Diazinon,

and

Malathion.

disponible:

http//www.nmfs.noaa.gov/pr/pdfs/pesticide_biop.pdf. National Marine Fisheries Service.

Ocampo Millan LM, M, M (2013). Grupo de Enfermedades Neurodegenerativas END, línea Inmunotoxicología, Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad del Tolima, Ibagué,. 58,59.

Ochoa, D (2008). Oxidative stress and changes in plasma transaminases in juveniles of White cachama (Piaractus brachypomus) and yamu (Brycon amazonicus) acutely exposed to sublethal concentrations of glyphosate . Roundup, S.p.

Oirsa

(2003).

disponible

en:

http://www.oirsa.org/aplicaciones/subidoarchivos/BibliotecaVirtual/MuestreoControl CalidadPlaguicidas.pdf. consultado 9 de marzo de 2014. 1 - 12.

OMS (2005). Guías para la Calidad del Agua Potable. Ginebra. S.p.: Volumen 1. Recomendaciones. Segunda Edicion.

OMS (1990.). Centro Panamericano de Ecología Humana y Salud. Serie Vigilancia. Plaguicidas organoclorados. México., S.p.

OMS (1993). Centro Panamericano de Ecología Humana y Salud. Serie Vigilancia, Plaguicidas organoclorados. México, S.p.

ONU (2010). Alimentos para siempre: Consultado el 21 de septiembre de 2010. Plaguicidas, S.p.

OPS (2000 - 2010). Plan Nacional de Salud Ambiental: 2000-2010. Minsalud. Bogotá. Direccion General de Salud Pública., S.p.

BIBLIOGRAPHY \l 9226 Park CB, Takemura A, Aluru N, Park YJ, Kim Bh, Lee CH (2007). Specific suppression of strogen, androgen and glucocoticoide receptor gene expressionin feral vitellogenic male in tilapia. Efectes of toxicity for insecticides organophosporate. 69:32.

Pastor, S (2002). Biomonitorización citogenética de cuatro poblaciones agrícolas europeas, expuestas a plaguicidas, mediante el ensayo de micronúcleos. . Tesis Doctoral. Facultat de Ciencies. Departament de Genetica I de Microbilogia. Grup de Mutagenesi Universitat Autonoma Barcelona (España). 10.

Petrelli G, F-T (2000). “Reproductive male-mediated risk: spontaneus abortion among wives of pesticide applicators”. Eur J. Epidemiol., 391-394.

Prieto, Zulita y otros (2008). “Efecto Genotóxico del Dicromato de Potasio en Eritrocitos de sangre periférica de Oreochromis Niloticus (Tilapia)”. Rev. perú. med. exp. salud pública , 25(1): 51-58.

Rajeswary S, R, K (2005). Studies on toxicological effects of Chlorpyrifos in the brain of freashwater fish, Oreochromis mossambicus (Peters) under subletal exposure. . Environmental crisis and Security in the new millennium., 241 - 248.

Ramirez-Duarte WF, Rondon-Barragan IS, Eslava-Mocha PR (2008). Acute toxicity and histopathological alterations of Roundup® herbicide on “Cachama Blanca” (Piaractus brachypomus). Pesquisa Veterinaria Brasileira , 28(11): 547-554.

Ramírez-Duarte WF, Rondon-Barragan IS, Eslava-Mocha PR (2009). Toxicidad aguda y lesiones Histopatológicas en cachama blanca (Piaractus brachypomus) expuestas a la mezcla de herbicida Roundup® más surfactante Cosmoflux® 411f. Rev.MVZ Córdoba , 14(1):1563-1575.

Ranier F Y Pauly D (2004). Cyprinus carpio. FishBase. Consultada en Septiembre de 2004. . FishBase, S.p.

Reimschuessel R, M, E (1988). Necropsy examination of fish. Vet Clin North Amer Trop Fish Med. Small Anim Pract, 427 - 433.

Rodriguez, A, G (2006). Toxicidad por Metales Pesados en Capitanes de la Sabana Provenientes de la Cuenca Alta del Río Bogotá. Fundacion al Verde Vivo., S.p.

Sabbatella (2011). Latinoamérica Ante la Crisis Ecológica Global. Medio Ambiente. S.p. .

Saleh, A (1994). Pesticides: a review article. J Environ Pathol Toxicol Onco, 151 161.

Sapozhnikova, Y., Bawardi, O., & Schlenk, D (2004). «Pesticides and PCBs in sediemnts and fish from The Salton Sea, California, USA». . Chemosphere, 797 809.

Semarnat

(1997).

disponible:

http://sinat.semarnat.gob.mx/dgiraDocs/legamb/Clorpirifos%20480.pdf. consultado 9 de marzo de 2014. 1 - 10. 88

Silveira R, Y Venjoy y A Prieto (1996). Los análisis hematológicos como sistemas de diagnostico en Orechromis aureus de cultivos en Cuba. Rev. Latin. Acuicultura , 36:4-6.

Schmalz W F, Hernández A D, Weis P (2002 ). Hepatic histopathology in two populations of the mummichog, Fundulus heteroclitus . Mar. Environ. Res. 54:539– 542.

BIBLIOGRAPHY

\l 9226

Stentiford GD, Longshaw M, Lyons BP, Jones G,

Green M, Feist SW (2003). Histopathological biomarkers in estuarine fish species for the assessment of biological effects of contaminants. Mar Environ Res , 55: 137-159.

Svoboda, M ; V Lusková, J Drastichová and V Jlábek (2001). “The effect of diazinon on haematological indices of common carp (Cyprinus carpio L.)”. Acta Vet. Brno , (70): 457-465.

Szarek J, Siwicki A, Andrzejewska A, Terech-Majewska E, Banaszkiewiez T (2000). Effect of the herbicide RoundUp on the ultrastructural patter of hepatocytes in carp (Cyprinus carpio). Marine Environ Res , 50:263-266.

Taylor, J (1977). Hybridization of Cyprinus carpio and Carassius auratus, the first two exotic species in the lower Laurentian Great Lakes. Environmental Biology of Fishes, 205 - 208.

Tradecorp

(2010).

disponible

en:

http://www.tradecorp.es/sites/default/files/hoja_de_seguridad/sds_piritec5gr_2013. pdf. consultado. 9 de marzo de 2014. 1 - 9 .

Thophon S, Kruatrachue M, Upatham S, Pokethitiyook P, Sahaphong S, Jaritkhuan S (2003). Histopathological alterations of white seabass, Lates calcarifer, in acute and subchronic cadmium exposure. Environ Pollut , 121:307-320.

Tolga C y Konen S (2007 ). Detection of cytogenetic and DNA damage in peripheral erythrocytes of goldfish (Carassius auratus) exposed to a glyphosate formulation using the micronucleus test and the comet assay. Mutagenesis , 22(4):263-268.

Urabá, U. (1999). Eje Bananero. U. de A. . Facultad Nacional de Salud PúblicaCorpourabá, S.p.

Valenzuela, A E.; V M Silva and A E; Klempau (2006). “Qualitative and quantitative effects of constant light photoperiod on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) peripheral blood erythrocytes”. Aquaculture , 251(2-4): 596-602.

BIBLIOGRAPHY \l 9226 Vásquez, Rosa; Asmine Bastardo e Inés K Mundarain (2005). “Ensayo de toxicidad aguda CL50-96 h con acetato de cadmio y parámetros hematológicos en el híbrido cultivado Colossoma macropomum x Piaractus brachypomus”. Zootecnia Tropical , 23(3): 247-257.

Voto J (2002). Piscicultura Amazonica con species nativas. Tratado de Cooperacion Amazonica. Sao Paulo, Brasil. Secretaria Pro-tempore. 350 p.

BIBLIOGRAPHY \l 9226 Want X, Xing H, Li X, Xu S, Wang X (2011). Effects of atrazine and chlorpyrifos on the mRNA levels of IL-1 and IFN-Y2b in immune organs of cammon carp. Fish Shellfish Immunol. 31(1) 126-33.

Weyl, O, Kaiser, H and Hecht, T (1996). On the efficacy and mode of action of 2phenoxyethanol as an anaesthetic for goldfish, Carassius auratus (L.), At different temperatures and concentrations. Aquaculture Research 27, 757-764.

Wilhelm M, Silver R, Silverman AJ (2005). Central nervous system neurons acquire mast cell products via transgranulation. Eur J Neurosci , 22:2238-2248.

Whyatt, R (2004). Environmental Health Perspectives. Contaminaci贸n ambiental., 1125 - 1132.

ANEXOS

Anexo 1. Proceso de aclimatación

Proceso de aclimatación de los acuarios antes y después de la llegada de los peces de Acuagranja S.A en Bogotá hasta Tunja y posteriormente al laboratorio de Soracá (Boyacá).

Anexo 2. Elementos utilizados

Elementos utilizados para medir, pesar, administrar y evaluar la calidad del agua antes y durante del experiment贸.

Anexo 3. Normas de bioseguridad

Normas de bioseguridad como bata, guantes, gorro, gafas y tapabocas al momento de la manipulación del Lorsban®.

Anexo 4. Efectos del Lorsban®

Efectos del LorsbanÂŽ en los peces durante el estudio, donde se observo cambios en su piel, comportamiento e incluso mortalidad. Anexo 5. Proceso de sacrificio

Proceso de sacrificio mediante shock tĂŠrmico para la posterior toma de muestras.

Anexo 6. Toma de muestras

Toma y envió de muestras de cerebro, hígado y branquias de los peces expuestos al Lorsban® al laboratorio histológico, utilizando formol bufferado al 10%. Anexo 7. Disposición final de los animales

Disposición final de los animales intoxicados una vez culmino el experimento.

Anexo 8. Mortalidad a las 0 horas Tratamiento

Peces

Anexo 9. Mortalidad a las 12 horas Tratamiento

Peces

Anexo 10. Mortalidad a las 24 horas Tratamiento

Peces

Anexo 11. Mortalidad a las 48 horas Tratamiento

Peces

Anexo 12. Mortalidad a las 72 horas Tratamiento

Peces

Anexo 13. Mortalidad a las 96 horas Tratamiento

Peces

* La mortalidad del T3 se dio a las 90 horas y la del T1 y T2 a las 96 horas una vez finalizado el estudio Anexo 14. Pigmentaci贸n, moco y brillo por hora y tratamiento Hora

Tratamiento

Pigmentaci贸n

Moco

Brillo

Normal

P茅rdida

Disminuido

Pérdida

Disminuido

Pérdida

Disminuido

Normal

Hora

Tratamiento

Pigmentación

Moco

Brillo

Pérdida

Disminuido

Pérdida

Disminuido

Pérdida

Disminuido

Normal

Pérdida

Disminuido

Pérdida

Disminuido

Pálido Total

Pérdida Total

Opaco

Normal

Pérdida

Disminuido

Pérdida

Disminuido

Pálido Total

Pérdida Total

Opaco

Normal

Revisión de los cambios en la piel como la pigmentación, moco y brillo durante las 96 horas de estudio. Anexo 15. Comportamiento de los peces durante el experimento Hora

Tratamiento

Alterado

No alterado

12 Hora 12

Tratamiento

Alterado

No alterado

GC 48

GC 72

GC 96

Revisi贸n de los cambios en el comportamiento, evalu谩ndolo como alterado y no alterado durante las 96 horas de estudio.

100

Anexo 16. Respuesta del comité de bioética

101