Evaluación de la sensibilidad y especificidad de una técnica de campo para diagnóstico de hipocalcem by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE UNA TÉCNICA DE CAMPO PARA DIAGNÓSTICO DE HIPOCALCEMIA EN VACAS PREPARTO Y POSTPARTO EN LA FINCA ARBOSTO DEL MUNICIPIO DE SIACHOQUE (BOYACÁ)

PEDRO NEL QUIROGA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE UNA TÉCNICA DE CAMPO PARA DIAGNÓSTICO DE HIPOCALCEMIA EN VACAS PREPARTO Y POSTPARTO EN LA FINCA ARBOSTO DEL MUNICIPIO DE SIACHOQUE (BOYACÁ)

PEDRO NEL QUIROGA

Director Esp. MAURICIO BOYACÁ Médico Veterinario

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

Nota de Aceptación

__________________________________ __________________________________ __________________________________ __________________________________ __________________________________

__________________________________ Director

__________________________________ Jurado

Tunja, 11 de agosto de 2014

A Dios y a la Virgen por permitirme culminar una etapa más de mi vida académica y crecer como persona.

A mis padres, hermanos y sobrinos, gracias a ellos pude alcanzar una meta más y de quienes siempre he recibido su apoyo incondicional.

AGRADECIMIENTOS

Al director del laboratorio clínico-veterinario Microzoo, doctor Mauricio Boyacá Quintana, médico veterinario y zootecnista, por toda su ayuda, apoyo y colaboración en el desarrollo de la investigación, al igual que la doctora Olga Torres por su colaboración y tesón con las actividades extracurriculares.

A las directivas de nuestra Institución en cabeza del señor Rector, Pbro. Luis Enrique Pérez; al señor Vicerrector Académico, Ph. D., Oswaldo Martínez Mendoza; a la doctora María del Carmen Rodríguez, Vicerrectora Administrativa, por hacer de este Claustro Académico uno de los mejores, con pujanza formativa, empresarial y académica.

GLOSARIO

ABSORCIÓN: es la operación unitaria que consiste en la separación de uno o más componentes de una mezcla gaseosa con la ayuda de un solvente líquido, con el cual se forma una solución (un soluto A, o varios solutos, se absorben de la fase gaseosa y pasan a la líquida). El calcio dietético se absorbe en una gran proporción en el duodeno y el yeyuno de la mayoría de los animales, esta absorción se lleva a cabo por transporte activo y pasivo.

ANTICOAGULANTE: es una sustancia endógena o exógena que interfiere o inhibe la coagulación de la sangre, creando un estado antitrombótico o prohemorrágico. Se distinguen sustancias endógenas, producidas por el propio organismo y sustancias exógenas.

ATONIA: también puede referirse al estado paralizado o muy relajado de los músculos esqueléticos en sueño de movimiento ocular rápido (sueño REM) en la mayoría de los animales de sangre caliente.

CALCIO: es un elemento químico, de símbolo Ca y de número atómico 20. Se encuentra en el medio interno de los organismos como ion calcio (Ca2+) o formando parte de otras moléculas; en algunos seres vivos se halla precipitado en forma de esqueleto interno o externo. Los iones de calcio actúan de cofactor en muchas reacciones enzimáticas, intervienen en el metabolismo del glucógeno, y junto al potasio y el sodio regulan la contracción muscular. El porcentaje de calcio en los organismos es variable y depende de las especies, pero por término medio representa el 2,45% en el conjunto de los seres vivos;

CALCITONINA: es una hormona peptídica lineal compuesta por 32 aminoácidos que interviene en la regulación del metabolismo del calcio y del fósforo.

EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE: es un proceso complejo en el cual participan múltiples órganos para mantener relativamente constantes una serie de balances interrelacionados, tales como: pH, equilibrio eléctrico, equilibrio osmótico y volemia. Si se producen cambios en alguno de estos elementos, la respuesta del organismo será tratar de volverlos a sus límites normales, afectando en un mínimo a otros equilibrios.

ESPECIFICIDAD: la especificidad diagnóstica es la probabilidad de que un paciente sin la enfermedad que se indaga tenga un valor dentro del rango de referencia. Cuando la afección está presente en una población sin la misma.

HEMOTERAPIA: es la parte de la medicina que se ocupa del tratamiento de diferentes cuadros clínicos mediante el empleo de sangre o sus derivados como medio terapéutico.

HIPOCALCEMIA PUERPERAL (HP): fiebre de la leche o parecía puerperal es una enfermedad metabólica-nutricional caracterizada por un momentáneo desequilibrio en la regulación de la concentración del calcio (Ca) en sangre durante el periparto, (48 horas antes hasta 72 horas después del parto) no siendo verdaderamente una deficiencia del mineral.

MACROMINERALES: son sustancias inorgánicas pertenecientes al grupo de los minerales, cuyo origen son las rocas y los metales. Se encuentran en los alimentos, tanto vegetales como animales. Este tipo de nutriente tiene que ser extraído durante el proceso de la digestión, de otro modo, sería expulsado sin más por el organismo.

PUERPERIO: es el período que inmediatamente sigue al parto y que se extiende el tiempo necesario (usualmente 6-8 semanas) o 40 días para que el cuerpo materno —incluyendo las hormonas y el aparato reproductor femenino— vuelvan

a las condiciones pregestacionales, aminorando las características adquiridas durante el embarazo.

PLASMA: es la fracción líquida y acelular de la sangre, es decir, se obtiene al dejar a la sangre desprovista de células como los glóbulos rojos y los glóbulos blancos.

PROTOCOLO: está compuesto por un conjunto de acciones, procedimientos y exámenes

auxiliares

solicitados

para

paciente

con

características

determinadas.

PARATHORMONA o PARATOHORMONA: también denominada hormona paratiroidea, PTH o paratirina, es una hormona proteica secretada por la glándula paratiroides que interviene en la regulación del metabolismo del calcio y del fósforo.

RAQUITISMO: es una enfermedad carencial de animales jóvenes caracterizada por una tendencia hacia la formación de epífisis dilatadas de los huesos largos y una curvatura de sus diáfisis causada por un déficit de Vitamina D, fósforo, calcio y carencia de luz solar.

SENSIBILIDAD: es la probabilidad diagnóstica de que un paciente con la enfermedad tenga un resultado positivo indicativo de su presencia en una población conocida por su padecimiento.

TERAPIA: es una herramienta terapéutica basada en la reposición de fluidos y electrolitos,

cuyo

único objetivo

es recuperar y mantener el equilibrio

hidroelectrolítico del organismo.

URGENCIA: es, en general, lo que urge, que no puede esperar, que no admite espera; la obligación de cumplimiento inmediato.

RESUMEN

Dentro de la práctica veterinaria con bovinos en campo, especialmente en aquellos animales de alta producción, es frecuente encontrar, una entidad denominada síndrome de la vaca caída, esta es una enfermedad metabólica que afecta las vacas de alta producción en etapa de preñez entre la las semana 32, 36 de gestación y primera postparto que se caracteriza por una depresión de las funciones corporales, problemas como disminución de la temperatura corporal, coma y muerte. Es considerado un desorden metabólico que normalmente se presenta dentro de las 24 horas previas al parto (12% de los casos), durante el parto (7% de los casos) y hasta 72 horas después del mismo (75% de los casos), así mismo existen otros que no se relacionan con el parto(Ceballos ,1997).

Este trabajo pretende contribuir con el diagnóstico temprano en campo del síndrome de vaca caída, al crear una herramienta diagnóstica que sea práctica, económica y útil para identificar el estado de hipocalcemia en la vaca postrada, el cual demanda un rápido y efectivo tratamiento, que hasta el momento es un desafío complejo debido a las múltiples causas que pueden dar origen a esta enfermedad, entre las cuales se encuentran: la edad de la vaca- número de partos, obesidad, presentación de la enfermedad en partos anteriores-alta producción, nutrición inadecuada durante el periodo seco, perdida excesiva de calcio en el calostro, deterioro en la absorción del calcio en el intestino delgado, insuficiente movilización a partir de su reserva ósea, y el gran número de tratamientos. La formulación de una prueba rápida al lado del paciente, que oriente al clínico en el diagnóstico y el tratamiento de manera que se eviten accidentes farmacológicos y pérdidas económicas lo que puede ser de gran beneficio. el test evaluado está diseñado solo para diagnóstico de hipocalcemia en las situaciones antes mencionadas. Dicho test fue comparado con los resultados de la prueba de espectrofotometría, teniendo en cuenta los rangos de referencia de calcio sérico total (7.9 a 10 mg/dl ó 1.98/2.5 mmol/l. adicionalmente se calculó el índice de kappa, el cual indicó una baja correlación entre los resultados arrojados por espectrofotometría y los de la técnica de campo. De la misma forma esta última, mostro ser poco sensible y especifica. Una revisión de la

concentración, volumen del quelante y de la muestra de sangre, fueron recomendadas. Adicionalmente se hace necesaria la revisión de otros aspectos importantes tales como: pipeteo, tiempo de reacción, temperatura de reacción, componentes sanguíneos y demás puntos críticos que intervienen en la reacción de quelación del calcio.

PALABRAS CLAVE: bovinos, mineral, hipocalcemia, deficiencia, calcio, diagnostico

ABSTRACT Within the daily casuistry of veterinary professionals on fieldwork with bovine high milk production, It found the cowdowner syndrome.This Metabollic Disease affects high production cows in preñes stage, between 32 and 36 gestation weeks and first postpartum week. It is characteraized by depression corporal funtions, problems such as decrease in body temperatura, comatoso stage and death. This metabolic disorder is present inside 24 hours before delivery(12% cases), during delivery (7% cases) and up to 72 hours after birth. At same there are others no related with the cowbirth (Ceballos 1997) This work intents to contribute with the early diagnosis on downercow síndrome field, by the urgency hipocalcemic stage on the postrated cow. Which become more complex because the inmediatly treatment needs with the purpose to provide a very rapid, easy and economic tool. This challenge become difficult by the multi-causality, those of which found: the edge, deliverys amount, obbesity, presentation of the desease in previous deliveries, inadequate nutrition during dry periods, escessive loss of calcium in calustrum, déficit absortion of calcium in the small intestine. insuficiency of movement depending its bone resource and the variety of treatments, which demands the formulation of a very rapid test close to the pacient. Which guide the clinician to the right diagnostic and treatment in order to prevent pharmacologicals accidents and economics loss. The evaluated test is designed only for diagnosis of hipocalcemia in the above situations. which It was compared with the spectrophotometry results, having in mind the rages; reference serum total calcium (7.9 to 10 mg/dl or 1.98/2.5 mmol/L. we found the kappa index, which indicate low correlation between the results obtained by spectrometry and the field tecnics, as same form the lattest one is low sensible and specific. Therefore it is recommendeble to check the concentration, chelating volumen, at same time volume of blood example, futher others criticals points (pippeting, reaction time, reaction temperatura, blood components that interview in the chelating calcium reaction). Main words: bovines, mineral, hypocalcemic, defficit, calcium.

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA

2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

3. OBJETIVOS

3.1 GENERAL

3.2 ESPECÍFICOS

4. JUSTIFICACIÓN

5. MARCO DE REFERENCIA

5.1 ESTADO DEL ARTE

5.2 MARCO TEÓRICO

5.2.1 Fisiología del calcio

5.2.2 Funciones de los minerales

5.2.3 Relación calcio – magnesio

5.2.4 Relación calcio fósforo

5.2.5 Composición hueso adulto

5.2.6 Hormona paratiroidea

5.2.7 La fiebre de leche

5.2.8 Signos clínicos y diagnóstico diferencial

5.2.9 Prueba diagnóstica

5.2.10 Técnica de espectrofotometría

5.2.11 Tratamiento de la fiebre de leche

5.3 MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

5.4 MARCO LEGAL

5.4.1 Ley 576 de 2000

5.4.2 Estatuto Nacional de Protección Animal Ley 84 del 27 de noviembre de 1.989

6. DISEÑO METODOLÓGICO

6.1 METODOLOGÍA

6.1.1 Tipo de estudio

6.1.2 Muestra

6.1.3 Técnica en campo

6.1.4 Fases de la investigación

6.1.5 Métodos

6.1.6 Técnica de campo

6.2 ANÁLISIS EN EL LABORATORIO

6.3 ANÁLISIS DE RESULTADOS

6.3.1 Análisis estadístico

6.4 ANÁLISIS DE RESULTADOS

6.4.1 Análisis estadístico

7. DISCUSIÓN

8. IMPACTO

9. CONCLUSIONES

10. RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFÍA

INFOGRAFÍA

ANEXOS

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Metabolismo general del calcio, fósforo y magnesio

Figura 2. Diagrama del metabolismo total del calcio

Figura 3. Metabolismo óseo-control hormonal de la transformación ósea.

Figura 4. Mecanismo homeostático para el calcio con intervención de la

paratohormona, calcitonina y vitamina D

Figura 5. Municipio de Siachoque

Figura 6. Reactivos de Laboratorio para desarrollo de la Técnica

espectrofotométrica.

Figura 7. Elementos para medir volúmenes de solución

Figura 8. Elementos para realizar la prueba de campo

Figura 9. Equipos para procesamiento de muestras

Figura 10. Muestras de sangre entera y con reactivos.

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Frecuencia de muestras positivas y negativas para diagnóstico de

hipocalcemia usando espectrofotometría y el método de campo propuesto

Tabla 2. Concordancia entre los resultados positivos y negativos para

hipocalcemia obtenidos con las dos técnicas comparadas.

Tabla 3. Interpretación Kappa

LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo A. Formato anamnesis pacientes

Anexo B. Elección de pacientes para análisis de la muestra

Anexo C. Elementos y materiales necesarios para la toma, recolección y

transporte de la muestras hacia el laboratorio

Anexo D. Equipos, Elementos, Materiales y Reactivos utilizados para el procesamiento de las muestras

INTRODUCCIÓN

El éxito del ciclo productivo de una vaca está determinado por la calidad en el nivel nutricional del periodo pre y posparto, la recuperación de la función reproductiva posparto y la ausencia de alteraciones metabólicas y patológicas. Por lo cual es esencial minimizar los desórdenes nutricionales al parto y a las semanas posteriores, con el fin de alcanzar; el máximo nivel de producción y de ingestión de materia seca, buenos parámetros sanguíneos (ácidos grasos no esterificados [AGNE], cuerpos cetónicos) que permitan una alta producción de leche y excelente salud de la vaca en la primera semana posparto. Los anteriores son buenos indicadores de la calidad de la lactación que inicia, esto quiere decir que una buena lactación requiere necesariamente de un buen programa de manejo y alimentación preparto, situación que algunas veces no se lleva a cabo, como son la depresión de funciones corporales, problemas musculares, postración, disminución

de la temperatura corporal, pérdida de apetito, atonía muscular,

shock y la muerte.

En el periodo de transición tienen lugar una serie de cambios importantes, por su naturaleza como por su magnitud, y que no son más que procesos de adaptación del sistema digestivo y del metabolismo a una nueva situación productiva. El fracaso en el proceso de adaptación resulta en una serie de alteraciones productivas y patológicas que se manifiestan como enfermedades metabólicas o trastornos pre y posparto, entre las que se incluyen la hipocalcemia o "fiebre de la leche" que se presenta en el periparto. (Ceballos, 2006).

La hipocalcemia es una enfermedad metabólica más común del ganado vacuno, especialmente las vacas productoras de leche, entre los cinco y diez años de edad, entre el tercero y séptimo parto, con mayor frecuencia 24 horas antes del parto, con tendencia a ser recurrente en partos posteriores hasta tres días postparto, está causada por una incapacidad para equilibrar la demanda de calcio

por la producción de leche. El defecto bioquímico básico de la fiebre de leche es una depresión de los niveles de calcio en sangre, es importante recalcar que los niveles de calcio disminuyen en todas las vacas adultas al momento del parto debido al inicio de la lactación, siendo los niveles normales de calcio ionizado en sangre de vaca 5.1 a 4.3 mg/dl; en hipocalcemia ligera, los niveles son de 3.2 a 4.3 mg/dl; en la hipocalcemia moderada es de 2.0 a 3.2 mg/dl y en la grave son inferiores a 2.0 mg/dl. Sin embargo, es difícil medir el calcio iónico, siendo más común la determinación de calcio total, cuyo valor de referencia está entre 8 y 10 mg/dl. No existe una causa única para la presentación de la fiebre de leche ya que son variados los agentes desencadenantes del proceso y que pueden ser de tipo hormonal, mineral, estrés y otros relacionados con el animal (Ceballos, 2011).

El tratamiento de la hipocalcemia consiste en la administración de calcio por vía endovenosa para mantener la vaca en pié hasta que pueda recibir el calcio necesario de la dieta, sin embargo, a pesar de la facilidad del tratamiento, algunas vacas mueren y las que se salvan suelen ser susceptibles a otras afecciones como placenta retenida y mastitis por coliformes, de modo que es importante prevenir esta afección. Las vacas "caídas" son en realidad la punta del "iceberg", la parte manifiesta del problema. Los mecanismos de prevención mejoran las posibilidades del bovino, pero para situaciones de emergencia el diseño de un protocolo para su aplicación en el momento requerido, la conformación de un kit básico como herramienta indispensable para atender al animal proporciona mecanismos de corrección eficaces al presentarse estos síntomas, criterios para tomar decisiones clínicas en el instante que se suceda la emergencia. (Ceballos, 2011).

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA

La ganadería representa para el departamento de Boyacá uno de los renglones importantes en el desarrollo de las comunidades rurales. Se encuentra en grande o pequeña escala. Existen en el departamento diversidad de razas bovinas, sobresalen: la Holstein, Pardo Suizo, Normando y Jersey (Secretaria de Fomento Agrícola y Ganadero de Boyacá 2010).

La alimentación de estas razas, se hace por pastoreo, concentrados, suministro de sales minerales; encontrándose que los suelos de la región cundiboyacense por estar ubicados, en una región tropical, no ofrecen los suficientes complementos de minerales qué puedan suplir la deficiencia de estos para el desarrollo de sus tejidos y formación ósea, por lo que deben ser adicionados y suministrados en la ración diaria.

Boyacá, pertenece a una región de trópico alto y bajo, donde la cultura campesina ha establecido, diferentes técnicas y formas de alimentación para las vacas, por la versatilidad que estas tienen en el consumo de alimentos, por ejemplo, mediante consumo directo de residuos de las cosechas, como maíz, caña, fríjol, papa, o las mezclas de estos, mas pastoreo tradicional o rotacional, donde los pastos contienen diferentes nutrientes en calidad y cantidad, incurriendo en desbalances por sobre consumo de unos minerales y escasez de otros, descuidando el suministro de las cantidades necesarias y suficientes tanto de los macro como de los

microminerales

que

puede

generar

enfermedades

carenciales

intoxicaciones, que es común que se presente en las fincas de

pequeña

producción, que es caso de en la mayoría de las fincas pequeñas de Boyacá, pues los campesinos no tienen las herramientas necesarias para suministrar cantidades suficientes de minerales a sus animales.

las

En situaciones donde se suministra más cantidad de calcio en las dietas suplementarias, puede suceder que aumente la presentación de cuadros de hipocalcemia en lugar de prevenirla, por ello se le debe suministrar al animal las sales minerales preparto con el fin de mantener los niveles adecuados del mineral.

En las vacas gestantes y en el posparto durante las primeras 48 horas, se ha observado que presentan deficiencias especialmente en calcio y fósforo, muestran síntomas como postración, decaimiento, falta de apetito y algunas veces la muerte. A pesar de encontrarse estos signos, no se puede afirmar que sea falta de calcio, fósforo u otro mineral, por lo que es necesario realizar de inmediato exámenes de laboratorio para determinar los niveles séricos de calcio, con el fin de actuar con mejor certeza y prescribir el tratamiento adecuado.

En las observaciones realizadas durante las experiencias prácticas de la carrera, de veterinaria, relacionados con la falta de suplementos, se ha encontrado que las vacas presentan deficiencia de calcio, fósforo, yodo, sodio, cobre entre otros. Los bovinos requieren de

quince elementos minerales como mínimo para su

desarrollo, es así como debe existir un buen manejo en el suministro de la cantidad necesaria

de estos, según los requerimientos del animal. (Ceballos

2004).

De acuerdo con lo anterior, es eminente el riesgo de encontrar vacas caídas, por cualquiera de las deficiencias por lo tanto es necesario determinar los niveles séricos y relacionarlos con la salud física del animal en campo, por lo que se propone

evaluar un protocolo de campo para

diagnosticar oportunamente la

causa de la vaca caída, pues hasta ahora no hay oportunidad de hacerlo en forma inmediata al lado de la vaca.

2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál es el nivel de confiabilidad del protocolo de campo para determinar hipo calcemia en vacas preparto y postparto?

3. OBJETIVOS

3.1 GENERAL

Evaluar la confiabilidad de una técnica de campo para diagnosticar los niveles séricos de calcio en vacas periparto.

3.2 ESPECÍFICOS Evaluar la sensibilidad de la técnica de campo para diagnóstico de vacas en etapa preparto y posparto. Evaluar la especificidad de la técnica de campo para diagnóstico de vacas en etapa preparto y posparto.

4. JUSTIFICACIÓN

En las diferentes regiones de Colombia, uno de los problemas hallados en el ganado bovino, especialmente en las vacas lecheras es la deficiencia de minerales, preponderantemente de calcio, fósforo, potasio y magnesio. Los pastos por si solos no suministran estos nutrientes, necesarios e indispensables, no solamente por ser importantes en el desarrollo del organismo del animal, especialmente para la transformación de los alimentos, sino también como elementos indispensables para la producción de leche.

La importancia de esta investigación radica en un aporte práctico y útil como herramienta que se pueda implementar como ayuda diagnóstica en una enfermedad típica de vacas de alta producción de leche en etapas comprendidas entre la 32 y 36 semanas preparto y la primera, donde se puede presentar dicha patología. Por lo cual, es esencial la existencia de un test de campo para implementarlo con su debida estandarización para los profesionales de la salud animal al servicio de pequeños y grandes productores.

Económicamente la implementación de un protocolo o test de campo para diagnóstico de hipocalcemia en vacas caídas, contribuye a disminuir pérdidas económicas, por enfermedad, tratamientos y muerte de los animales, perjudicando especialmente a los pequeños productores, dada la crisis del campo en el ámbito Nacional frente a los Tratados de Libre Comercio.

5. MARCO DE REFERENCIA

5.1 ESTADO DEL ARTE

En relación al problema de las vacas caídas, se han realizado estudios que aportan conocimientos importantes para el manejo de

estos pacientes por

deficiencia de calcio, el aporte de minerales generalmente se da en el forraje, el cual es consumido mediante el pastoreo. Cuando además se le suministran adicionalmente suplementos de minerales, las concentraciones en sangre aumentan lo que permite lograr una concentración dentro del rango referencial (Ceballos 2009)

La hipocalcemia es una enfermedad metabólica y puede estar relacionada con otros problemas del animal. Al identificar algún síntoma es necesario administrar calcio vía oral, cuando todavía la vaca continúa de pie. Resalta que los signos más importantes de hipocalcemia en vacas alrededor del parto son; Signos tempranos sin postración que pueden pasar desapercibidos por ser transitorios y de difícil identificación. La vaca puede estar excitable, nerviosa o débil. En cada caso propone el tratamiento de suplemento de calcio preferiblemente vía oral, pero no descarta el suministro por vía endovenosa (Garrett, 2007).

Otros estudios (Willwer, 2010). En los estudios realizados en el año 2003, consideraron que el síndrome de la vaca caída no es fácil de identificar y por tal razón fue necesario agrupar las causas de la siguiente manera: metabólicas, sépticas, alteraciones del útero, traumas, partos distócicos (Kronfeld, 1998), siendo los problemas metabólicos uno de los factores que desencadenan la hipocalcemia; cuya patología es la parecía puerperal o fiebre de leche, cetosis o acetonemia, tetania del pastoreo o hipomagnesemia, y hemoglobinuria puerperal. Stobery Dirksem (1980),afirman que el 80-90% de las vacas que permanecen en decúbito, alrededor del parto, indican un cuadro de fiebre de leche. De estas, el

70-80% responden muy bien al tratamiento de calcio sin complicaciones, el resto no responden por causa de otras complicaciones (Willwer, 1980).

Generalmente el síndrome de vaca caída corresponde al animal que se le ha diagnosticado Hipocalcemia y que posterior a los tratamientos continúa postrada.

Los diversos metabolitos sanguíneos, están relacionados con el metabolismo mineral. Los minerales evaluados fueron calcio, fósforo, magnesio, cobre y zinc. El estudio

lo realizaron en cuatro zonas geográficas de Colombia, las cuales

incluyeron

a zona norte,

departamento

Córdoba,

zona centro sur,

departamentos de Cundinamarca, Valle del Cauca, Tolima Risaralda y Cauca, zona Magdalena Medio, departamentos de Sur del Cesar, Santander, Antioquia, Caldas y Boyacá, zona Llanos Orientales departamento del Meta; en los resultados de la investigación, resaltan el desequilibrio caracterizado por exceso de fósforo y zinc. Deficiencias en cobre. El magnesio en una concentración en el límite inferior. (Villa, 2010).

Igualmente Salamanca (2010),señaló que las deficiencias de minerales en suelos y su relación con las plantas y los animales. Expresa que en las sabanas inundables del departamento de Arauca, están cubiertas de pastos nativos, en los cuales los niveles de calcio y fósforo con muy bajos, por lo cual no alcanzan a llenar los requerimientos del animal. Los otros minerales como el magnesio, zinc, cobre, son deficientes pero en menor grado, también se encontró que en la mayoría de las veces los ganaderos de la región suministran suficiente cantidad de minerales pero sin embargo, se sigue presentando deficiencias: Ocurre por la interferencia entre diferentes factores como es que un mineral pueda interferir en el metabolismo de otro mineral, haciendo que el mineral no pueda ser utilizado por el organismo del animal. Generalmente estas interferencias se presentan en el suelo, en la planta, en los alimentos y en el animal. Dicha investigación concluyó que la mayoría de los pastos cultivados en subsuelo del trópico son deficientes en

minerales útiles para la alimentación de los animales pero una forma económica de superar estas deficiencias de minerales es importante suministrar sales mineralizadas, remezclas o suplementos de minerales.

Es de resaltar es que el desequilibrio de minerales en los suelos y en los forrajes producen efectos negativos en los procesos reproductivos de los rumiantes lo que se refleja en el incremento de la mortalidad y disminución de la natalidad, Bedoya (2010), realizó un estudio basado en los sistemas de producción, hizo énfasis en la ganadería lechera del municipio de Susacón, con el fin de identificar la sostenibilidad y poderla aplicar en otras zonas ganaderas de la montaña, al mismo tiempo reconocer la insostenibilidad para tenerla en cuenta y ajustarla de acuerdo al sistema de producción.

A la vez el estudio realizado por Velásquez

(2010), confirma que el ciclo

reproductivo es un indicador importante porque está relacionado con la perdida de nutrientes y la búsqueda de insumos externos para mantener la fertilidad del suelo. La combinación de las diferentes formas de alimentación animal contribuye a mantener el equilibrio mineral en los animales entre las que se encuentra el pastoreo, árboles en el potrero, empleo de bueyes en la preparación de la tierra, el aprovechamiento de los residuos de la cosecha, pastoreo de ganado en socas de maíz, fríjol, rotación de pastos por cultivos y la asociación árbol pasto, entre otros.

5.2 MARCO TEÓRICO

5.2.1 Fisiología del calcio. El calcio ionizado desempeña un papel importante en numerosos procesos vitales, excitabilidad neuromuscular, conducción de impulsos nerviosos, contracción muscular coagulación sanguínea (Kaune, 2006).La vitamina D y sus metabolitos activos, las hormonas paratiroideas y calcitonina, la concentración de calcio sérico se mantiene ajustado a la absorción intestinal, excreción renal y la movilización de calcio disponible en las reservas óseas.

El calcio está presente en el suero en tres formas distintas, ionizado formando complejos y fijado a proteínas, constituye entre el 40-60%, unión a proteínas entre el 40-50%, equilibrio ácido básico ejerce una influencia complementaria sobre la cantidad de calcio ionizado y fijado a proteínas. La alcalosis reduce el calcio ionizado y fijado a proteínas, en tanto la acidosis ejerce el efecto contrario.

Los grandes aumentos o disminuciones en la concentración de calcio sérico son fallas en los mecanismos normales de homeóstasis del calcio, esto se da con cierta frecuencia en animales domésticos y particularmente en ganado de leche de alta producción. En esta especie la concentración sérica de calcio normalmente disminuye por debajo de 8 mg/dL por el estrés del parto y el comienzo de la lactancia.

La mayoría de los animales con niveles por debajo de 8 mg/dL o menos están postrados, se puede registrar casos de muerte cuando el nivel se sitúa por debajo de 4 mg/dL. La tetania de los pastos se asocia a hipomagnecemia significativa e hipocalcemia leve.

En los tejidos animales y en los alimentos se encuentran cuarenta y cinco elementos, en concentraciones y cantidades muy variables. Siete elementos se encuentran en el organismo en alta concentración; más o menos 70mg por kg peso vivo, son los llamados macro minerales: calcio fósforo, magnesio, sodio, potasio, cloro y azufre (Bondi, 2010).

El organismo animal contiene cantidades muy bajas de aproximadamente cuarenta elementos minerales, menos 70 mg por kg de peso vivo, de los cuales quince elementos han demostrado realizar funciones fisiológicos en el organismo entre los que se encuentran: hierro, cobre, cobalto, manganeso, zinc, yodo, selenio, molibdeno, cromo, flúor, estaño, vanadio, silicio, níquel y arsénico(Church, 2006).

La prueba de que un determinado mineral es esencial, se basa en experimentos realizados en animales. Es así como los síntomas de deficiencia en animales jóvenes y adultos son indicadores de cambios bioquímicos en sus tejidos. Además de los quince micro minerales esenciales, están los siete macro minerales y otros veintitrés elementos en pequeñas cantidades, presentes en los alimentos de los cuales no se les ha asignado funciones vitales.

5.2.2 Funciones de los minerales. Los minerales tienen tres funciones generales: el calcio y el fósforo, componentes estructurales de huesos, dientes, rigidez y dureza (figura 1); El magnesio, flúor, silicio, están presentes en los huesos dientes colaborando con la estabilidad mecánica del cuerpo; calcio magnesio y fósforo en pequeñas fracciones. El sodio, potasio y cloro, se encuentran como electrolitos en los líquidos orgánicos y tejido blandos, lo que contribuye al balance electrolítico, acido-básico y presión osmótica (Bondi, 2010).

Figura 1. Metabolismo general del calcio, fósforo y magnesio

Fuente: BONDI, 2010

Los elementos traza esenciales, son componentes integrales de ciertas enzimas y otros compuestos biológicamente importantes, como hierro en la hemoglobina, cobalto en la vitamina B12, yodo en la hormona tiroxina, funcionando como activadores de enzimas.

Las sales de la saliva, jugos gástricos e intestinales, líquido ruminal, proporcionan al tracto gastrointestinal el medio adecuado para la activación de enzimas y crecimiento de microorganismos.

Los elementos traza esenciales son componentes integrales de ciertas enzimas y otros compuestos biológicamente importantes como hierro, en la hemoglobina, cobalto en la vitamina B12, todo en la hormona tiroxina. Estos funcionan como activadores de enzimas, las concentraciones de calcio y fósforo son de orden 2-3 m mol/L y 1-3 mmol/L.

La obtención de estos minerales se puede dar en la ración como forrajes, concentrados, suplementos minerales, agua de bebida y fuentes adicionales; dichos contenidos dependen de factores como la especie vegetal, composición del suelo, fase de madurez, condición climática, fruto agrícola, cereales y subproductos,

semillas

oleaginosas,

leguminosas,

valor

nutricional

del

concentrado.

El lugar de la absorción de estos iones hasta la circulación sanguínea son el intestino delgado, porción anterior del intestino grueso y en los rumiantes se realiza en la pared del rumen así como su excreción se lleva a cabo en las heces, la orina y sudor.

Su utilización y absorción de iones minerales, elementos contenidos en los alimentos, suplementos minerales depende del contenido absoluto, magnitud de la absorción y utilización por las especies, la determinación de la digestibilidad aparente, reabsorción de minerales, saliva, jugos gástricos (Donald, 2006).

El desequilibrio, deficiencias y los trastornos de la nutrición oscilan desde la deficiencia mineral grave o la intoxicación; la importancia nutritiva del calcio y fósforo en el organismos e encuentra en los huesos (estructura, estabilidad,

electrolitos) y dientes. El resto se distribuye en tejidos blandos y líquidos orgánicos.

5.2.3 Relación calcio – magnesio. El magnesio guarda mucha relación con el calcio y el fósforo del organismo, aproximadamente el 70% del magnesio del organismo se localiza en el esqueleto. Representa del 0.5 al 0.7% de las cenizas de los huesos en todos los animales; la relación calcio – magnesio en los huesos es de aproximadamente 55:1, alrededor de la tercera parte del magnesio está unido al fosfato y el resto se absorbe sobre la superficie de la estructura mineral. El 30% del magnesio existente en el cuerpo se distribuye en los tejidos blandos y líquidos; un 75% del magnesio de la sangre se encuentra en los eritrocitos, el suero sanguíneo contiene entre 2-4 mg. ionizado por 100 ml de sangre, así con menores cantidades de magnesio ligado a proteínas (Montero, 2006).

El magnesio es necesario para la fosforilación oxidativa que conduce a la formación de ATP por consiguiente participa en el metabolismo de los carbohidratos y lípidos y en la síntesis de proteínas, el magnesio se absorbe en el intestino delgado y grueso, en los rumiantes principalmente a través del retículo rumen; la absorción del magnesio de estas fuentes minerales es de aproximadamente el 70% para los rumiantes. La diferencia de magnesio se caracteriza por un descenso en la concentración del mismo en el líquido céfalo raquídeo

suelo,

con

trastornos

neuromusculares

agudos

con

hiperirritabilidad, incoordinación muscular y convulsiones.

En condiciones prácticas, en el ganado vacuno se presentan dos tipos de deficiencias en magnesio, la primera tiene lugar en los terneros alimentados exclusivamente con leche durante periodos prolongados de tiempo; la segunda denominada tetania de la hierba es propia de las vacas lecheras (CHURCH et.al, 2006).

5.2.4 Relación calcio fósforo. Al administrar suplementos de calcio al ganado es importante tener en cuenta la relación calcio fósforo de la ración, se considera que la relación más adecuada para los animales explotados por el hombre, a excepción de las aves, oscila entre 1:1 y 2:0 (figura 2) En relación con las necesidades de calcio y fósforo de los rumiantes, en la publicación de “Agricultura and feed research council’s technical comité en responses nutrients”, indica que en determinadas circunstancias las necesidades del fósforo pueden ser superiores que las de calcio (Bondi, 2010).

Figura 2. Diagrama del metabolismo total del calcio

Fuente: CHURCH y POND, 2010

5.2.5 Composición hueso adulto Agua

45%

Cenizas 25% (calcio 36%, fósforo 17%, magnesio 8%) Proteína 20% Grasa 10%

Fase Cristalizada Hueso Hidroxiapatita. Ca(PO4)6 (OH)2 Fase amorfa. Ca3(PO4)2 CaCO3 Mg3(PO4)2 Pequeñas cantidades de citrato de Na, K, F,Cl Proteínas colágeno

Dientes 5% agua – 3.5% materia orgánica una cantidad de flúor se encuentra en la apatita Ca10(PO4)6F2 El plasma sanguínea contiene 9-11 mg/Ca/100 ml; en las gallinas 20-30 mg/Ca/100 ml. El calcio en el plasma de los mamíferos se encuentra en un 50% y en forma de iones libres, un 45% ligado a proteínas del plasma y un 5% en forma de citratos y fosfatos, la sangre completa tiene un 35-45 mg de fósforo x ml en forma de ortofosfato HPO-24 – H2PO4Niveles de fósforo inorgánico en el plasma es de 4-9 mg x 100 ml parte del fosfato en el plasma está ionizado, una cantidad se encuentra formando complejos con proteínas, lípidos y carbohidratos. El hueso no es un depósito estático de minerales que sirven únicamente para función estructural, y se encuentra en estado

dinámico,

magnitud

del

intercambio

puede

determinarse

por

administración parenteral de calcio, este intercambio es más rápido en la zona esponjosa de los huesos (trabéculas) difiere de la que tiene lugar en el hueso compacto (corteza).

Los elementos metabolizados son absorbidos llegando a la sangre que actúa como intermediario para el intercambio de Ca, Mg, P, entre los diversos órganos. La concentración de Ca, P en sangre se mantiene a nivel constante por la acción de la hormona PARATIROIDEA, CALCITONINA, CALCITRIOL (metabolitos activos de la Vitamina D), al igual que otras hormonas como: somato-tropina, insulina, hormonas sexuales, tiroides.

5.2.6 Hormona paratiroidea. El principal órgano implicado en el control del metabolismo del calcio y del fósforo es la glándula paratiroidea, la mayoría de los animales domésticos tienen cuatro pares de glándulas paratiroideas que suelen localizarse en los extremos de los dos lóbulos de la tiroides.

La síntesis de la hormona paratiroidea es similar a la de otras hormonas proteicas, el efecto de la PTH es aumentar las concentraciones de calcio y disminuir la de los fosfatos en los líquidos extracelulares. Además, ejerce efectos directos sobre el metabolismo del calcio en el hueso y los riñones, e indirecto sobre el mismo en el tracto gastrointestinal. En el hueso especialmente estimula la transferencia de calcio a través de la membrana osteoblasto-osteocitaria. Tiene efectos adicionales sobre el hueso estable lo que tiene como consecuencia la reabsorción renal de fosfato; también participa en la activación de la vitamina D en el riñón, a través de la cual medía la absorción del calcio desde el intestino.

La secreción de PTH está controlada por las concentraciones de calcio libre (ionizado) en la sangre, niveles bajos estimulan la secreción hormonal e incrementan la de calcio mediante el recambio óseo. La adrenalina estimula la secreción de PTH a través de los receptores gb-adrenérgicos, y el magnesio lo hace de la misma manera que el calcio (Cunninghan, 2008).

5.2.7 La fiebre de leche. Trastorno de leche que puede presentarse poco antes del parto y después del mismo y se caracteriza por una severa hipocalcemia, hipofosfatemia y parálisis muscular, en los casos graves coma y muerte del animal. La hipocalcemia es causada por un desequilibrio entre el egreso de calcio en el calostro en relación con las reservas extracelulares con una inadecuada respuesta por parte de los tejidos a la acción de las hormonas, reguladoras del metabolismo de calcio. Las dietas ofrecidas en Colombia son en su mayoría altamente cargadas con cationes, ya que la concentración del potasio del calcio hace que la dieta sea altamente positiva, por lo anterior, el uso de sales aniónicas

en Colombia, no ofrecerían una alternativa adecuada para la prevención de la parecía puerperal (Ceballos et., al, 2004).

La hipocalcemia se presenta con grandes aumentos o disminuciones en la concentración de calcio sérico debido a fallas en los mecanismos normales de homeóstasis del Ca, se suele presentar con frecuencia en animales domésticos y particularmente en ganado de alta producción de leche. En esta especie la concentración normalmente disminuye por debajo de 8 mg/dL por estrés del parto y el comienzo de la lactancia.

La mayoría de los animales con niveles por debajo de 6 mg/dL, o menos están postrados, se puede registrar casos de muerte cuando el nivel se sitúa por debajo de 4 mg/dL.

Las causas infrecuentes: toxemia aguda, hiperparatiroidismo, rabdomiolisis por ejercicio, hipertermia maligna, enfermedad pancreática, toxicidad por

oxalato,

administración de tetraciclinas, administración de furosemida, alcalosis por administración excesiva de bicarbonato.

5.2.8 Signos clínicos y diagnóstico diferencial. Los signos clínicos típicos de la fiebre de leche, entre los que se incluyen depresión, anorexia, baja producción de leche, atonía músculo-esquelética y del músculo liso, excitación, hipotermia, flacidez, dilatación pupilar, ruidos cardiacos débiles, postración y cuyos diagnósticos diferenciales pueden ser luxación coxofemoral, cetosis, torsión uterina,

desnutrición,

metritis

séptica,

mastitis,

hidramnios,

tetania

hipomagnesémica, lesiones de nervios, luxación, fracturas sacro-iliacas (Ceballos, 1997).

5.2.9 Prueba diagnóstica. Se basa en la anamnesis, los síntomas, ayudas paraclínicas como la medición sérica del

calcio mediante la técnica de

espectrofotometría, y también, la técnica semicuantitativa del calcio sérico (donde se mezcla una cantidad de sangre con un volumen de solución a una concentración de un quelante), en caso de producirse coagulación, la calcemia se encuentra subnormal; como se describe en el presente trabajo.

La ventaja de la prueba de espectrofotometría es que se puede medir el calcio sérico y determinar los niveles dentro del rango estandarizado, y la semi cuantitativa es un poco menos confiable que la anterior, pero en campo dicho test nos puede ayudar en el diagnóstico de la fiebre de leche según la anamnesis y los signos clínicos.

5.2.10 Técnica de espectrofotometría. Se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra en función de longitud de onda, cada componente

de solución tiene su patrón de absorción de luz característico,

comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz, de una muestra vs. Solución estándar; es posible, determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra. Tiene ventaja esta técnica sobre otros métodos analíticos de laboratorio, por su rapidez, precisión, versatilidad, facilidad de uso y eficiente en costo.

Esta técnica por los avances en tecnología de los equipos, es indispensable en la química analítica, y tiene aplicaciones en análisis cuantitativo y cualitativo, estandarización de colores, determinación de trazas entre otros usos básicos. En general los espectrómetros miden el porcentaje de transmitancia (t) y absorbancia (a) el porciento de transmitancia, se refiere a la cantidad de radiación, que pasa a través de la muestra y alcanza el detector, una solución limpia, no absorbente, mostrará una lectura de 100% de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado, las unidades de absorbancia, va de 0 a 2, la absorbancia, se relaciona con la transmitancia (Coley Parmer. 2010).

5.2.11 Tratamiento de la fiebre de leche. El tratamiento de la fiebre de leche debe instaurarse lo más rápido posible y el objetivo es elevar la calcemia y mantenerla hasta que la vaca esté en condiciones de adaptarse a su nueva condición. Administrar el equivalente a 3.3 g. Ca/100 kg de peso vivo y administrar vitamina D (Ceballos, 2007).

Figura 3. Metabolismo óseo-control hormonal de la transformación ósea

Fuente:KAUNE, 2006

Las bajas concentraciones de calcio en el plasma sanguíneo estimulan la actividad de la glándula paratiroides y la secreción de PTH, esta determina la elevación de la calcemia por la movilización

de calcio y la mayor producción de la forma

hormonal de la Vitamina D. La PTH realiza un importante papel en la conversión de la vitamina D (figura 4), metabolito activo 1,25 (OH)2 estimulando a su vez la absorción de Ca-P con un efecto favorable sobre dos procesos contrarios(figura 3): formación de hueso y resorción del mismo, la PTH influye de modo importante en la regulación de la calcemia (Wasserman, 1977).

Figura 4. Mecanismo homeostático para el calcio con intervención de la paratohormona, calcitonina y vitamina D

Fuente: WASSERMAN, 1977

Pequeñas cantidades de calcio 1% y fósforo 20% en tejidos blandos y líquidos orgánicos controlan la excitabilidad de los nervios y músculos, coagulación normal de la sangre encontrándose en la transformación de protrombina en trombina, activación de ciertas enzimas como la tripsina y la adenosinutrifosfatasa.

El fosfato tiene como funciones en el organismo animal el metabolismo energético (ATP, ADP) reacciones metabólicas de los carbohidratos, proteínas, lípidos además forma parte de los fosfolípidos, membranas celulares (RNA,DNA), síntesis

proteica, forman parte de enzimas como carboxilasa y NAD, en la leche y yema del huevo (caseína, vitelina).

El calcio tiene funciones vitales, como la activación de la cascada de la coagulación,

contracciones

musculares,

adecuado

funcionamiento

interacción activa y miosina, estructura y estabilidad ósea, liberación de los neurotransmisores (acetilcolina).

El magnesio se distribuye ampliamente en el cuerpo y con excepción del calcio y del fósforo, se halla en mayor cantidad que cualquier otro mineral. La mitad del magnesio corporal, aproximadamente, se halla en el hueso a una concentración del 0.5% al 0.7% de la ceniza ósea, en los tejidos blandos se halla en las células, la mayor concentración se halla en el hígado y músculo esquelético. (Wacker y Vallee, 2011).

El magnesio se distribuye así, aproximadamente el 75% en glóbulos rojos - 6 meq/lt y 25% en el suero - 1.1 a 2.0 meq/lt. del magnesio del suero alrededor del 36% se halla ligado a proteínas en los mamíferos y las aves, aun cuando el magnesio total es variable entre las especies.

El magnesio tiene como funciones activar enzimas, en los sistemas que tiene el pirofosfato de tiamina como cofactor, reduciendo las fosforilación oxidativa en la eficiencia del magnesio, activador esencial de los fosfatos, transferasas (creatinina, quinasa), activa pirobatocarboxilasa, pirobatooxilasa, resulta esencial para el eficiente metabolismo para los carbohidratos y lípidos, interviene en la respiración, reacciones celulares, formando complejos tridimonofosfatos con la adenosina, formación de AMP cíclico y otros mensajeros secundarios que necesitan del magnesio.

Los iones de magnesio moderan la actividad neuromuscular y al ligarse con el fosfolípido participan en la integridad de la membrana celular (Wacker y Vallee, 2011). El magnesio reabsorbe en el intestino delgado y en el intestino grueso en los animales mono gástricos, sus necesidades son cubiertas normalmente por las harinas de cereales y hojas de las raciones, en los rumiantes la absorción es baja debido a que el potasio reduce la eficiencia de la absorción al inhibir los dos sistemas de transporte activo de la pared del rumen.

Su metabolismo es complejo y variado, la absorción en el conducto gastrointestinal ocurre en su mayor parte en el íleon, no se conoce ningún trasportador para su absorción, no se ha demostrado que la vitamina D participe en dicho trasporte.

La excreción del magnesio se hace por medio del excremento y de la orina, alrededor del 55 al 60% del magnesio que se ingiere se absorbe, la cantidad absoluta absorbida es proporcional a la ingestión dietética; su excreción urinaria da cuenta de alrededor del 95% de las pérdidas de magnesio absorbido y la excreción fecal explica la mayor parte del resto (Bondi, 2006).

Producto de la deficiencia del magnesio tenemos la hiperirritabilidad y convulsiones, anorexia, tetania hipomagnesémica, mientras que la elevación del calcio renal en la deficiencia de magnesio se acompaña de una disminución del magnesio sérico total.

En el cerdo la deficiencia de magnesio resulta en patas débiles y torcidas, renuencia para permanecer de pie, tetania y muerte; en los terneros en dietas sustituidas puede presentarse cuando es bajo el contenido de magnesio y en los animales rumiantes grandes se presenta la tetania hipomagnesémica.

Los síntomas clínicos de la enfermedad pueden provocarse por factores como tiempo frío, lluvioso y ventoso. Los niveles normales de magnesio en el suero sanguíneo del ganado vacuno se sitúan en el intervalo de 17 a 40 mg/Lt., aunque pueden darse en niveles inferiores a 17 sin presentarse los signos de la enfermedad; cuando se presenta la tetania, los niveles pueden llegar a 5 mg/Lt. (Aron, 2006).

Entre las fuentes de magnesio están: salvado de trigo, levadura desecada, tortas de semillas de algodón y linaza, tréboles, óxido de magnesio mineral.

5.3 MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

El estudio fue realizado en el municipio de Siachoque en el departamento de Boyacá tiene una extensión de 167 km2, altura 2.700 m.s.n.m, una temperatura promedio 13ºC, cuenta con una población según el censo de 2005 de 7.630 habitantes,

distribuidos

en la cabecera municipal 1.120 y en

área rural

6.510.(Ver figura 5).

El Municipio

dista de la capital del departamento 20 km. hacia el oriente,

geográficamente ubicado en la provincia del Centro, Limita con los municipios de Toca, Rondón, Viracacha , Soracá y Chivata.

Existen factores limitantes como la deficiencia de agua, heladas ocasionales, suelos superficiales, moderadamente profundos, con niveles tóxicos de aluminio, con un buen uso para la ganadería extensiva, cultivos comerciales y de subsistencia, su uso superficial podría ser la ganadería intensiva y semi-intensiva con pastos moderados, cultivos comerciales de papa y hortalizas.

En las recomendaciones sugeridas a los labriegos está el riego por aspersión, uso de correctivos y fertilizantes; en la parte de ganadería evitar el sobrepastoreo,

hacer rotación de potreros, establecer sistemas de drenaje, arar en dirección transversal, encalar y fertilizar (IGAC, 2005).

El relieve es variado con pendientes y valles, suelos superficiales ilimitados, nivel freático alto, pobremente drenados, reacción química muy fuerte y ácida, saturación de bases, fertilidad natural.

Figura 5. Municipio de Siachoque

Fuente: www.siachoque-boyaca.gov.co

5.4 MARCO LEGAL

5.4.1 Ley 576 de 2000. “Por el cual se expide el código de ética para el ejercicio profesional de la Medicina Veterinaria, la Medicina Veterinaria y Zootecnia y la Zootecnia”.

5.4.2 Estatuto Nacional de Protección Animal Ley 84 del 27 de noviembre de 1.989. El capítulo VI , DEL USO DE ANIMALES VIVOS EN EXPERIMENTOS O

INVESTIGACIÓN, este Estatuto, establece que los animales

dedicados a la

realización de experimentos, o investigación, serán objeto de protección y cuidados previstos en la normatividad vigentes y se regirán por las normas éticas establecidas en el presente Estatuto.

Los animales requeridos para estos fines, serán tratados de acuerdo a las normas vigentes y por lo tanto quien las incumpla se les aplicara las sanciones correspondientes de acuerdo a lo establecido para tal fin en la Ley 84 de 1.989

La misma Ley establece que todo animal que vaya a ser utilizado para fines de experimentación o investigación deberá tener la autorización del Comité de Ética, el cual es reglamentado por las instituciones dedicadas a la docencia y /o a la investigación, en este caso particular, por el Comité de Ética de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos.

6. DISEÑO METODOLÓGICO

6.1 METODOLOGÍA

6.1.1 Tipo de Estudio. Para el desarrollo de la investigación se planteó realizar un estudio de tipo descriptivo exploratorio, es un primer nivel de investigación el cual no pretende comprobar hipótesis por razones de estructura metodológica pues no tiene validez necesaria para rechazarla o comprobarla. Estos estudios dan pautas para conclusiones importantes que deben estar basadas en comparaciones y relaciones entre variables.

6.1.2 Muestra. El tamaño de la muestra fue de cincuenta vacas de las cuales se tomó la muestra a diez en etapa preparto, en las semanas comprendidas entre la 32 y 36 de preñez, y cuarenta vacas en las primeras 72 horas después del parto, aparentemente sanas (Anexo A vacas preparto, vacas postparto).

Las vacas a las cuales se les tomó la muestra de sangre, no fueron sometidas a ningún tratamiento médico, terapia medicamentosa, nutricional o manejo distinto al que cotidianamente se realiza en la finca, suministro de pasto a voluntad, sales minerales y concentradas, este último para las vacas lactantes. A estos pacientes se les realizó además de la anamnesis se examinaron sus constantes fisiológicas (Anexo B).

La sangre completa usada para la medición de la cantidad de calcio por espectrofotometría,

fue

recolectada,

tubos

vacutainer,

identificados,

refrigeradas, empacadas para su transporte y su análisis en el laboratorio.

Para aplicar la técnica de campo, cada vaca, se le tomó 4 ml de sangre con un jeringa de 10 cm y aguja de 18 x 1 ½ pulgada y se depositó en 4 tubos numerados del 1 al 4, con volumen de 50,60, 70 y 80µl de quelante respectivamente. A cada

uno de los tubos del test se adiciono un 1 ml de sangre, se esperaron 5 minutos, luego de lo cual se evaluó si había coagulación o anti coagulación.

6.1.3 Materiales y métodos Luego de tomar la muestra en tubo tapa roja 2 mL se llevó al laboratorio, allí se procedió a centrifugar sin anticoagulante, se separó el suero obtenido, depositándolo en un vial, según protocolo del laboratorio, para la medición de la concentración de Ca por espectrofotometría. Las muestras del test (los 4 tubos) fueron analizadas según coagulación para someterlos a comparación, entre el volumen de solución, cantidad de sangre y la concentración de calcio hallado por espectrofotometría. Siempre se tuvo la certeza de realizar las pruebas y procedimiento de igual forma para todos los pacientes y muestras.

6.1.4 Materiales Tubos vacutainer tapa roja Tubos de ensayo de 4 cm Tubos de ensayo de fondo cónico Pipeta Pasteur Micro pipetas automáticas Gradillas Jeringa de 50 ml Frasco de vidrio de 100 ml Reactivos Centrífuga automática Espectrofotómetro automático

Balanza electrónica.

A continuación se muestran algunas figuras de los materiales, equipos y reactivos que se utilizaron para la realización del protocolo de campo aplicado para la determinación de los niveles séricos de calcio y la técnica de espectrofotometría utilizada en el laboratorio clínico.

Composición del Azul de metiltimol: A Reactivo. Cianuro potásico 7.7 mmol/l.; etanolamina 1.5 mol/l. B Reactivo. Azul de metiltimol de 0.1 mmol/l.; ácido clorhídrico 10 mmol/l.; 8 hidroiquinoleína 17 mmol/l. Preparación: el patrón o suero debe estar listo para su uso. Mezclar volúmenes iguales de reactivo A y B, adicionar suero que corresponde a la muestra. EDTA 5% LAB SAR. Calcio sérico bio system calcium mtb Reagents&instrumens

Figura 6. Reactivo para espectrofotometría

Fuente: Autor

Figura 7. Elementos para medir volúmenes de solución Micropipetas

Medición de reactivos

Fuente: Autor

Figura 8. Elementos para realizar la prueba de campo

Tubos vacutainer para muestras

Tubos con soluciones

Fuente: Autor

Figura 9. Equipos para procesamiento de muestras Centrífugas

Balanza electrónica Espectrofotómetro

Fuente: Autor

Figura 10. Muestras de sangre entera y con reactivos

Muestra de sangre sin anticoagulante

Muestra de sangre con anticoagulante

Muestras de sangre con formación de cóagulo

Fuente: Autor

6.1.5 Métodos. El experimento se realizó teniendo en cuenta la coagulación de la sangre en los tubos con solución quelante y la concentración de calculada por estequiometria.

6.1.6 Técnica de campo. Los pasos para la prueba o test de campo para determinar la hipocalcemia, se llevaron a cabo de la siguiente manera. Tubo con 50 mcl de solución quelante. Depositar 1 ml de sangre. Mezclar suavemente Dejar reposar por un tiempo mínimo de 5 minutos Observar si hay o no formación de coágulos Evaluar resultados

Resultados: La solución no coagula: La cantidad de calcio estará por debajo del nivel de referencia (8 a 10mg/dL). Si la solución coagula: El valor del calcio está entre el rango de referencia.

El Calcio presente en la muestra reacciona con el azul de metiltimol en medio alcalino

originando

complejo

coloreado

que

puede

cualificarse

espectrofotométricamente. La presencia de hidroxiquinoleína en el reactivo evita la interferencia del magnesio.

6.2 ANÁLISIS EN EL LABORATORIO Centrifugar la muestra sin anticoagulante Separar el suero

Mezclar y homogenizar la solución a leer con reactivo A y B Dejar reposar por 2 minutos Limpiar o lavar el espectrofotómetro Hacer lectura de las muestras o soluciones Tabular información

6.3 RESULTADOS Y ANÁLISIS.

Los valores de calcio sanguíneo de las vacas sometidas al estudio se encuentran en la tabla 1, tanto las calculadas por espectrofotometría como los resultados obtenidos en la prueba de campo, 4 volúmenes diferentes de quelante y el ponderado de los 4 tubos. Todos los animales muestreados, presentan constantes fisiológicas normales, y las muestras se procesaron en condiciones adecuadas.

6.3.1 resultados

Tabla 1. Frecuencia de muestras positivas y negativas para diagnóstico de hipocalcemia usando espectrofotometría y el método de campo propuesto HIPOCALCEMIA MÉTODO

POSITIVO

NEGATIVO

ESPECTROFOTOMETRÍA

50 + 1ml de sangre

60 + 1ml de sangre

70 + 1ml de sangre

80 + 1ml de sangre

50-80 + 1ml de sangre*

MÉTODO DE CAMPO

Fuente: Autor *se considera positivo para hipocalcemia si no hay coagulación en ninguno de los volúmenes utilizados.

6.4 ANÁLISIS DE RESULTADOS

6.4.1 Análisis estadístico. El procesamiento de la información, se hizo mediante utilización método INDICE DE KAPPA, teniendo en cuenta el resultado de las pruebas de campo, de laboratorio clínico, realizado a los pacientes, objeto de la muestra, donde para el volumen 50ml +1ml de sangre y 60 ml + 1ml de sangre se obtuvo un índice de Kappa corregido de 0,0964, y 0,082 respectivamente, lo que quiere decir que la

concordancia entre las dos pruebas es insignificante; los

volúmenes 70 y 80 +1ml de sangre sus índices calculados fueron de -0,01227 y 0,11, que indica que no hay acuerdo entre la espectrofotometría y la técnica evaluada, esto quiere decir que cuando una técnica encuentra hipocalcemia la otra no y lo contrario.

Para el obtener los resultados obtenidos con los dos métodos se evaluó presencia o ausencia de hipocalcemia utilizando los siguientes criterios: Espectrofotometría. presencia de hipocalcemia en pacientes con valores de concentración de Calcio inferiores a 8mg/dl Método de campo. presencia de hipocalcemia si no hay coagulación a un determinado volumen.

Considerando lo anterior, las frecuencias obtenidas para cada método y volumen pueden observarse en la tabla 1, la cual muestra que el calcio sérico determinado por

espectrofotometría

indica que hubo 31 vacas con hipocalcemia y 19

negativas.

De otro lado, con el fin de determinar la especificidad y sensibilidad de la prueba en campo, se construyeron tablas de concordancia entre los resultados de la espectrofotometría y los de cada volumen utilizado. La especificidad se refiere a la

capacidad de la prueba en campo de detectar casos negativos que concuerden con los negativos encontrados por espectrofotometría, mientras la sensibilidad se refiere a la concordancia entre los resultados positivos encontrados por las dos técnicas (Tabla 2).

Es importante identificar el grado de concordancia entre las dos técnicas evaluadas: espectrofotometría y método de campo. Para ello se calculó un índice de concordancia que expresa el porcentaje de acuerdo en la detección de casos positivos y negativos con los dos métodos. Éste índice se obtiene de la suma de las coincidencias dividido entre el número total de muestras analizadas.

IC = coincidencias positivas + coincidencias negativas/ número de muestras

50 + 1ml de sangre : 7+ 16 / 50 = 0,46 60 + 1ml de sangre :17+ 10 / 50 = 0,54 70 + 1ml de sangre :26+ 2 / 50 = 0,56 80 + 1ml de sangre : 28+ 1 / 50 = 0,58 50-80 + 1ml de sangre : 5+ 18 / 50 = 0,46

Estos valores pueden interpretarse como el porcentaje de coincidencia, siendo entonces el volumen de 80+1ml de sangre el que coincide con el análisis por espectrofotometría en un 58% de los resultados.

Tabla 2. Concordancia entre las dos técnicas comparadas y valores de Sensibilidad y Especificidad para cada volumen empleado en el método de campo.

Fuente: Autor

El problema del índice de concordancia calculado anteriormente es que parte de esa coincidencia en los resultados puede deberse al azar. Para solventar este problema se utilizó el índice Kappa de Cohen, el cual relaciona el acuerdo que exhiben los dos métodos, más allá del azar, con una medida de acuerdo esperada también más allá del azar. Básicamente el índice Kappa es el cálculo de la diferencia entre la proporción de acuerdo observado y la proporción de acuerdo esperado por el azar; si esta diferencia es igual a cero, entonces el grado de acuerdo o concordancia que se ha observado puede atribuirse completamente al

azar; si la diferencia es positiva hay un acuerdo mayor al esperado por azar y un valor de 1 corresponde a un acuerdo o coincidencia total entre los dos métodos (Thompson &Walters, 1998).

Para el cálculo del índice Kappa de Cohen se utilizaron las tablas de concordancia presentadas anteriormente (Tabla 2) y las siguientes fórmulas:

Donde Po es la proporción de concordancia observada y calculada anteriormente (índice de concordancia) y Pe es la proporción esperada donde f1 es el total de la fila 1, c1 es el total de la columna 1 y así sucesivamente.

En caso de que las proporciones marginales (totales de filas y columnas) sean asimétricas (desiguales) se recomienda hacer una corrección del índice Kappa. Esta corrección se obtiene del cociente entre el K obtenido y el valor máximo de K. Este K máximo es la suma de las proporciones mínimas en cada caso (total de fila y total de columna) sobre el número total de muestras (Kramer&Feinstein, 1981). Todos los cálculos necesarios para la obtención del índice fueron ejecutados en hojas de cálculo de Microsoft Excel. Para la interpretación de la medida de acuerdo o concordancia entre los dos métodos según el índice Kappa se utilizaron los márgenes propuestos por Landis y Koch (1977 En: Kramer&Feinstein, 1981).

Tabla 3. Índice Kappa obtenido al comparar el resultado de cada uno de los volúmenes usando en el método de campo, con los resultados obtenidos con la espectrofotometría. VOLUMEN

Indice Kappa

50 + 1ml de 0,0559

Kappa

máximo

corregido

Acuerdo

0,58

0,0964

Insignificante

0,86

0,082

Insignificante

0,52

-0,01227

Sin acuerdo

0,46

-0,11

Sin acuerdo

0,5

0,17

Insignificante

sangre 60 + 1ml de 0,071 sangre 70 + 1ml de -0,0638 sangre 80 + 1ml de -0,052 sangre 50-80 + 1ml 0,086 de sangre* Fuente: Autor

En los resultados obtenidos no se presenta concordancia entre el diagnóstico emitido por la técnica de espectrofotometría y el del método de campo (Tabla 3).

7. DISCUSIÓN

De acuerdo con los datos arrojados por las formulas estadísticas, en primer lugar, se ha encontrado que especificidad

espectrofotometría,

existe una relación inversa entre la sensibilidad y la prueba

campo,

comparación

con

ya que a medida que aumenta su capacidad de detectar

casos verdaderos positivos (sensibilidad) es decir vacas hipocalcemicas se reduce la de identificar verdaderos negativos las no hipocalcemicas o con niveles de calcio normales. En efecto, los volúmenes más sensibles son a la vez los menos específicos y al contrario.

De acuerdo con lo anterior, es necesario revisar y mejorar puntos críticos del de la técnica de campo con el fin de aumentar su

especificidad y sensibilidad. Sin

embargo, aunque no se obtiene un valor importante de concordancia, sí puede considerarse confiable el resultado positivo emitido por el volumen de 80+1ml de sangre, dada su elevada sensibilidad, es decir que con este volumen la prueba evaluada tiene buenas posibilidades de encontrar vacas hipocalcemicas, así como el valor negativo obtenido por la coagulación en los cuatro volúmenes (50 – 80) según indica su alta especificidad, que quiere decir que estos volúmenes tienen mayor posibilidad de encontrar vacas negativas a las que tienen niveles séricos normales de calcio.

De acuerdo con el índice Kappa donde la técnica detecta hipocalcemia cuando no existe o no la detecta cuando si existe, puede llevar a una decisión terapéutica equivocada, lo cual puede poner en grave riesgo la salud del paciente. Por esta razón, se utiliza un análisis que permite evaluar la coincidencia de las técnicas en cada resultado del diagnóstico (positivo o negativo) para cada tubo con los diferentes volúmenes de quelante probado, y no una comparación generalizada de las proporciones que pueda llevar a

sobre-estimación de la eficiencia del

método de campo. En efecto es necesario evaluar otros factores, como tiempo de

reacción, temperatura ambiental de reacción, concentraciones de reactivos y volúmenes, pH de reactivos, que puedan generar modificaciones en la calidad o velocidad de coagulación o anticoagulación, para evitar que la prueba detecte hipocalcemia en vacas que no la tienen o no la detecte en vacas que la tienen.

Adicionalmente como se ha hallado una sola referencia a nivel de comentario sobre la utilización de quelantes para el cálculo estequimetrico de calcio, (Carmona 2006), la cual dice que se obtienen buenos resultados usando 0.8ml de quelante mezclándolo con 2ml de sangre, anticoagularia si esta tiene menos de 1.5 mmol de Ca/L, es decir 6mg/dl de Ca. En efecto, no hay concordancia, pues el presente estudio usa varios volúmenes en los cuales no se obtienen resultados parecidos.

8. IMPACTO

Los hallazgos de esta investigación, serán base para que se establezcan otros trabajos que profundicen en cada uno de los aspectos y pasos de la prueba de campo para hacerla más precisa y así atender de manera oportuna y eficaz, los problemas

de Hipocalcemia en las vacas

durante

periodo de gestación y

posparto.

Se facilitaría el diagnostico aproximado de hipocalcemia de una manera rápida a nivel de campo, con el fin de mitigar las perdidas por muertes debido a la enfermedad.

Los resultados del presente trabajo constituyen un desarrollo de nuevo conocimiento en beneficio de la salud de los bovinos.

9. CONCLUSIONES

Los resultados muestran que existe una relación inversa entre la sensibilidad y la especificidad de la prueba en campo, ya que a medida que aumenta su capacidad de detectar casos positivos reales (sensibilidad) se reduce la de identificar negativos reales (ver resultados del volumen 80+1ml de sangre por ejemplo). De esta forma, los volúmenes más sensibles son a su vez los menos específicos y viceversa. En otras palabras, la técnica muestra una relación inversa entre la detección de vacas hipocalcemicas y no hipocalcemicas, pues a medida que aumenta la capacidad de detectar vacas con hipocalcemia, reduce la de detectar normales y viceversa.

En los resultados obtenidos no se presenta concordancia entre el diagnóstico emitido por la técnica de espectrofotometría y el del método de campo. Éste resultado hace necesaria la revisión y mejoramiento del protocolo que puede incrementar la especificidad y sensibilidad del método. Sin embargo, aunque no se obtiene un valor importante de concordancia, sí puede considerarse confiable el resultado positivo emitido por el volumen de 80+1ml de sangre, dada su elevada sensibilidad, así como el valor negativo obtenido por la coagulación en los cuatro volúmenes (50 – 80) según indica su alta especificidad. Sin embargo es necesario seguir profundizando en el perfeccionamiento de esta herramienta diagnostica sin tener en cuenta la prevención, incidencia o prevalencia del síndrome de hipocalcemia.

10. RECOMENDACIONES

Se hace necesaria la revisión y mejoramiento del protocolo de manera que se puede incrementar la especificidad y sensibilidad del método.

Es necesario evaluar el tiempo de reacción en el método de campo, pues los 5 minutos escogido por el autor pueden ser insuficientes, este tiempo es el tiempo mínimo de coagulación normal de la sangre de bovino cuando este posee normo calcemia.

La temperatura de reacción puede ser un punto crítico, pues las reacciones se realizaron con las muestras a temperatura de refrigeración.

Será necesario evaluar si la temperatura ambiente (13 a 18°c), es suficiente para el perfecto funcionamiento de los reactantes.

El volumen de la sangre (1ml), será sometido a ajustes, con el fin de evaluar si es necesario aumentarlo o disminuirlo.

Se necesita corregir el volumen de la solución quelante, pues debe ser proporcional al volumen de la sangre.

Es necesario revisar el esquema de pipeteo, para hacer más precisos los volúmenes de reactantes utilizados.

Es necesario evaluar las proteínas de trasporte del calcio, pues se debe conocer si hay interacción con el quelante que pueda variar el proceso de quelación del calcio y la cantidad.

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ANEXO A FORMATO ANAMNESIS PACIENTES

Fecha:______________________ Municipio:__________________________ Vereda:_____________________ Finca:_____________________________ Propietario:________________________________________Cel: _____________ Raza:_________________________ Edad:__________ Nº partos_____________ Preparto:______________________ Posparto:___________________________ Pruebas de laboratorio: SÍ____ NO___ Peso________ FC______ FR_______ TCC______ Tº_______ Pulso______ Anamnesis:________________________________________________________ Fármacos suministrados: ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________

Posología: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Profesional y Técnico:

ANEXO B ELECCIÓN DE PACIENTES PARA ANÁLISIS DE LA MUESTRA

Vaca yersi en la semana 34 de gestación

Vaca en etapa de Post parto tercer día

Vaca en etapa de Preparto – semana 34.

ANEXO C ELEMENTOS Y MATERIALES NECESARIOS PARA LA TOMA, RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRAS HACIA EL LABORATORIO

Nevera para almacenamiento de las muestras, transporte y conservación en cadena de frío

Gel refrigerante para ubicar en Nevera

Tubos tapa Roja con solución de EDTA con diferente volumen ubicados en su porta tubos

Toma de muestra en vena yugular

Muestras tomadas para ubicación en porta tubos

ANEXO D EQUIPOS, ELEMENTOS, MATERIALES Y REACTIVOS UTILIZADOS PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Separación de la muestra (Plasma del Suero)

Adición de la muestra a las soluciones