Evaluación de la seroconversión de leptospira interrogans en dos fincas lecheras by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LA SEROCONVERSIÓN DE Leptospira interrogans EN DOS FINCAS LECHERAS DEL MUNICIPIO DE VENTAQUEMADA (BOYACÁ)

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO (Modalidad de Investigación)

PRESENTADO POR: ELIANA YOHANNA SIERRA MORA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2012 1

EVALUACIÓN DE LA SEROCONVERSIÓN DE Leptospira interrogans EN DOS FINCAS LECHERAS DEL MUNICIPIO DE VENTAQUEMADA (BOYACÁ)

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO (Modalidad de Investigación)

PRESENTADO POR: ELIANA YOHANNA SIERRA MORA

Director: Giovanni Moreno F. MV. MS.c, PhD. Anastasia Cruz MV. MS.c, PhD.

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2012 2

NOTA DE ACEPTACIÓN

______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________

DIRECTOR:

______________________________________ DR. GIOVANNI MORENO F.

COODIRECTOR

_____________________________________ DRA. ANASTASIA CRUZ CARRILLO

JURADO:

_____________________________________ DR. CARLOS EDUARDO DÍAZ DÍAZ

DEDICATORIA

A Dios. Por brindarme la fuerza para seguir el buen camino y ayudarme en momentos difíciles. A mi tío Edgar. A quien ya partió a la presencia del altísimo, dedicarle este presente trabajo. A mi madre. A quien le debo la vida, por brindarme la fuerza necesaria para continuar con mi carrera y momentos de ánimo así mismo ayudarme en los momentos difíciles. A mi hermana y familia. Por su apoyo incondicional en poder lograr mis metas y objetivos propuestos durante mi carrera. A mi esposo. Quien me brindo su amor, cariño y su apoyo constante. A mis hijos. Que han sido mi fortaleza y principal motivo para salir adelante. A mis maestros. Gracias por su tiempo, por su apoyo así como por los conocimientos que me transmitieron a lo largo de mi formación académica, en especial: al Dr. Giovanni Moreno y Dra. Anastasia Cruz, por haberme apoyado y guiado en la culminación de mi carrera. A mi compañera Milena. Por haber compartido momentos de conocimiento y por su apoyo incondicional en el desarrollo de mí trabajo. 4

AGRADECIMIENTOS

El autor de este trabajo manifiesta sus agradecimientos a todas a aquellas personas que de alguna manera contribuyeron a la realizaci贸n de este estudio:

A mi madre y hermana, por su confianza y apoyo incondicional en mi carrera.

Al Dr. GIOVANNI MORENO y la Dra. ANASTASIA CRUZ, por su buena disposici贸n y tiempo, su valiosa orientaci贸n, desde sus especialidades enriquecieron mi trabajo y lo hicieron posible.

A mi amiga Milena, por su colaboraci贸n y apoyo durante el desarrollo de mi trabajo.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO

OBJETIVO GENERAL

OBJETIVOS ESPECIFICOS

I. MARCO REFERENCIAL

1.1 ESTADO DEL ARTE

1.2 MARCO TEÓRICO

1.2.1 Etiología

1.2.2 Epidemiología

1.2.3 Patogénesis

1.2.4 Signos clínicos

1.2.5 Métodos Diagnósticos

1.2.5.1 Prueba de aglutinación microscópica (MAT)

1.2.6 Control y tratamiento

1.3 MARCO GOEGRÁFICO

1.4 MARCO LEGAL

II. METODOLOGÍA

2.1 TIPO DE ESTUDIO

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

2.2.1 UNIVERSO, POBLACIÓN Y MUESTRA

2.2.1.1 Selección de predios

2.2.1.2 Animales de Experimentación

2.2.1.3 Toma y envió de muestras

2.2.1.4 Pruebas de laboratorio

2.2.2 DISEÑO METODOLÓGICO

2.2.3 DISEÑO O ANÁLISIS ESTADISTICO

III. RESULTADOS

3.1 RESULTADOS

3.1.1 Prevalencia de Leptospira spp en 2012

3.1.2 Prevalencia por serovar

3.1.3 Presencia de seroconversión total de Leptospira spp

3.1.4 Presencia de seroconversión por serovar

3.1.5 Cambios en el estado inmunológico

3.1.6 Relación entre el serovar y el grupo etáreo

3.1.7 Relación entre el serovar con el número de días abiertos

3.1.8 Relación entre el serovar y abortos

3.2 ANALISIS Y DISCUSIÓN

3.2.1 Prevalencia de Leptospira spp en 2012

3.2.2 Prevalencia por serovar

3.2.3 Presencia de seroconversión total de Leptospira spp

3.2.4 Presencia de seroconversión por serovar

3.2.5 Cambios en el estado inmunológico

3.2.6 Relación entre el serovar y grupo etáreo

3.2.7 Relación entre el serovar y el número de días abiertos

3.2.8 Relación entre el serovar y abortos

IV. CONCLUSIONES

V. IMPACTO

VI. RECOMENDACIONES

VII. BIBLIOGRAFÍA

LISTA DE FIGURAS

FIGURA N°. 1: Mapa del municipio de Ventaquemada con sus veredas y límites geográficos

FIGURA N°. 2: Animales de experimentación

FIGURA N° 3: Prevalencia Leptospira spp en 2011 y 2012 en el municipio de Ventaquemada

FIGURA N°. 4: Seroprevalencia anterior y actual de Leptospira spp

FIGURA N°. 5: Porcentaje de seroconversión de Leptospira spp

FIGURA N°. 6: Porcentaje de seroconversión general Leptospira spp

FIGURA N°. 7: Seroconversión por serovares de L. interrogans

FIGURA N°. 8: Porcentaje de animales que cambian su estado inmunológico

FIGURA N°. 9: Relación entre el serovar y el grupo etáreo para los serovares estudiados

FIGURA N°. 10: Relación entre el serovar y el número de días abiertos para los serovares estudiados

FIGURA N°. 11: Relación entre el serovar y número de abortos para los serovares estudiados

LISTA DE CUADROS

Cuadro N°. 1: Animales muestreados según grupo etáreo

GLOSARIO

ABORTO: Interrupción precoz de la gestación, espontánea o inducida, seguida por la expulsión del producto gestacional por el canal vaginal.

ADN: (Ácido desoxirribonucleico) es un ácido nucleico ubicado en el núcleo de las células, responsable del código genético, que determina en gran medida las características de los seres vivos al nacer. Está formado por una doble cadena de biopolímeros unidades estructurales que se repiten, compuestos por bases nitrogenadas, un grupo fosfato y una desoxirribosa (azúcar).

ARN: (Ácido ribonucleico) es un ácido nucleico formado por una cadena sencilla

de biopolímeros (compuesto químico formado por unidades

estructurales que se repiten), constituido por bases nitrogenadas, un grupo fosfato y una ribosa (azúcar).

ANTICUERPO: Son moléculas producidas en el organismo como parte de la inmunidad humoral, específicas contra antígenos que hacen parte de los mecanismos de defensa.

ANTÍGENO: Sustancia capaz de desencadenar la producción de anticuerpos (inmunoglobulinas).

BACTERIA: microorganismo unicelular, capaz de reproducirse por sí mismo. Las bacterias pueden ser o no patógenas y estar en el origen de gran cantidad de enfermedades infecciosas. Se clasifican por sus propiedades de crecimiento (aerobias, anaerobias), por su capacidad de teñirse con colorantes especiales 10

(gram positivas o gram negativas), según su forma (bacilos, cocos, espiroquetas, etc.).

CENTRÍFUGA: es un dispositivo móvil que pone en rotación una muestra para acelerar la sedimentación de sus componentes o fases, en función de su densidad.

DÍAS ABIERTOS: Días transcurridos entre el parto y la siguiente gestación.

ESTUDIO SEROLÓGICO: Estudio que permite comprobar la presencia de anticuerpos en sangre, tiene como fin conocer la exposición o presencia previa de un microorganismo patógeno en particular.

GRUPO ETÁREO: Grupos de edad en que se divide una población, esto se hace para hacer la simplificación de los grupos y características similares.

HEMATURIA: Presencia de sangre en la orina.

HEMOGLOBINURIA: Presencia de hemoglobina en la sangre, generalmente debido a hemólisis.

ICTERICIA: Coloración amarillenta de la piel y de las mucosas debido a un incremento de bilirrubina que se acumula en estos tejidos.

INFECCIÓN: Invasión y multiplicación de microorganismos en tejidos corporales, en especial aquellos que causan herida celular local, debido a un metabolismo competitivo, toxinas, repliegue intracelular o respuesta antígenoanticuerpo.

INFERTILIDAD: dificultad de fecundar o para llevar a término una gestación. 11

INMUNOGLOBULINA: Proteína plasmática sintetizada por los linfocitos y las células plasmáticas, en respuesta a la estimulación por un antígeno, y que actúa como anticuerpo, para la defensa especifica del organismo.

LEPTOSPIREMIA: Presencia de leptospiras en sangre, fase inicial de la infección.

LEPTOSPIROSIS: Enfermedad de curso agudo, generalizada y cosmopolita, cuyos agentes etiológicos son los serovares patógenos de la bacteria Leptospira interrogans.

LEPTOSPIURIA: Presencia de leptospiras en la orina, fase posterior a la leptospiremia.

MICROAGLUTINACIÓN: Es la técnica, serovar-especifico, de elección para determinar la cinética de anticuerpos.

MORTINATO: Animal que nace muerto, llegando a término la gestación.

PREVALENCIA: Número de casos de una enfermedad o evento en una población y en un momento dado.

SEPTICEMIA: Presencia de bacterias en la sangre que a menudo ocurre con infecciones graves.

SEROCONVERSIÓN:

Demostración

presencia

anticuerpos

específicos para un antígeno concreto en el suero sanguíneo como resultado de una infección o inmunización.

SEROPOSITIVO: Animal cuyas manifestaciones resultan positivas frente a un examen serológico, es decir, aquel animal con anticuerpos séricos detectables frente a un microorganismo particular.

SEROVAR: grupo de microorganismos estrechamente relacionados que se distinguen por un conjunto de características de los antígenos.

SUERO SANGUÍNEO: Líquido sanguíneo que queda tras eliminar los elementos formes de la sangre y el fibrinógeno.

ZOONOSIS: es cualquier enfermedad que puede transmitirse de animales a seres humanos.

RESUMEN

La leptospirosis es una enfermedad zoonótica y de alta incidencia a nivel mundial, de frecuente presentación en la población bovina, causando manifestaciones clínicas con repercusiones reproductivas y económicas, que hacen necesario, establecer medidas de control, duraderas y confiables para el futuro. En algunas de las enfermedades infecciosas presentes en los animales y humanos, se ha reportado la presencia de seroconversión y tal es el caso de la letospirosis, a pesar de que a nivel mundial son pocas las evidencias que permiten identificarlas. En Colombia, se han desarrollado trabajos que determinan la prevalencia de la bacteria en varias regiones del país, en diferentes especies de animales e incluso en el hombre; sin embargo,

estudios que permitan confirmar la presencia de

seroconversión no se reportan a nivel nacional. Es así como en el municipio de Ventaquemada (Boyacá), a pesar de ser una importante zona de producción de leche, si bien se ha estudiado la prevalencia de la enfermedad, se han identificado los factores de riesgo y se ha asociado con la presencia de problemas reproductivos, se desconoce si se presenta seroconversión. Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó un estudio con el fin de determinar si se ha producido seroconversión en hembras bovinas de las cuales se tiene información sobre su estado inmunitario en el año anterior. Se realizó muestreo en las hembras bovinas adultas con diferente número de lactancias, estudiadas por Moreno (2011), bajo un diseño un muestreo por conveniencia, seleccionando dos fincas lecheras localizadas en el municipio de Ventaquemada, de las cuales fueron muestreadas 35 animales divididos en dos grupos etáreos: novillas y vacas. Las muestras se evaluaron por la técnica microaglutinación (MAT). Se obtuvo una prevalencia de Leptospira spp 25,7%, con base en la cual se determinó que 6,13% de los animales hicieron seroconversión respecto a los resultados del año anterior. Se 14

concluye que en la zona de estudio se evidenció la presencia de seroconversión aunque esta fue baja, lo que hace pensar que la bacteria está circulando en el medio, favorecida por la presencia de factores de riesgo.

Palabras Clave: Bovinos, leptospirosis, reinfección, inmunología

ABSTRACT

Leptospirosis is a zoonotic disease and of high incidence on a global level, of frequent submission in the bovine population, causing clinical manifestations with reproductive and economic impact, which make it necessary, establish control measures, durable and reliable for the future. In some of the infectious diseases present in the animals and humans, it has been reported the presence of seroconversion and such is the case of the letospirosis, despite the fact that at the global level are few evidence that identify them. In Colombia, work has been done to determine the prevalence of the bacteria in several regions of the country, in different species of animals, and even in the man; however, studies to confirm the presence of seroconversion is not reported at the national level. t is as well as in the municipality of Ventaquemada (Boyaca), in spite of being an important zone of production of milk, while we have studied the prevalence of the disease, have been identified the risk factors and has been associated with the presence of reproductive problems, it is not known whether presents seroconversion. Taking into account the above, a study was conducted to determine whether seroconversion has occurred in bovine females of which has information on their immune status in the previous year. Sampling was conducted in the adult bovine females with a different number of lactations, studied by Moreno (2011), under a design a convenience sampling, selecting two dairy farms located in the municipality of Ventaquemada, of which 35 were sampled animals divided into two age

groups:

heifers

and

cows.

The

samples

were

evaluated

the

microagglutination technique (MAT). There was a prevalence of Leptospira spp. 25.7 %, on the basis of which it was determined that 6.13 % of the animals made seroconversion with respect to the results of the previous year. It is concluded that in the study area showed the presence of seroconversion although this was low, 16

suggesting that the bacterium is when driving in the middle, favored by the presence of risk factors.

Key Words: Bovine, leptospirosis, reinfection, inmunology

INTRODUCCIÓN

La leptospirosis es una enfermedad zoonótica infectocontagiosa de epidemiología compleja y de amplia distribución mundial, identificada y diagnosticada en Colombia. Es producida por microorganismos del género Leptospira, de la cual se conocen dos especies, L interrogans, que incluye todas las leptospiras patógenas y la L. biflexa, especie en la que se engloban todas las saprofitas aisladas del medio ambiente. (Rodríguez, 2000). Los serovares de mayor importancia en Colombia son, para los bovinos L. hardjo, en caninos L. canicola, en cerdos L. Bratislava y Pomona y en roedores L. icterohaemorragiae (Moles, 1998), a pesar del desconocimiento de la situación epidemiológica no es una enfermedad de notificación obligatoria.

Dentro de los eventos inmunológicos ocurridos con diferentes agentes infecciosos, se describe el proceso de la seroconversión, que consiste en la demostración de la presencia de anticuerpos específicos para un antígeno, en el suero de un individuo

que

previamente

sido

diagnosticado

como

negativo.

consecuencia, cuando los animales hacen seroconversión los resultados de las pruebas serológicas cambian de negativo a positivo, producto de la presencia actual de anticuerpos respecto a muestreos previos (Marco, 2004). La presencia de seroconversión en una población, puede explicarse por diferentes factores como la entrada de dichos agentes al entorno, como resultado de una vacunación, por el ingreso de animales nuevos a un predio o por reinfección en lugares donde la enfermedad fue erradicada, entre otros (Torres et al., 2003).

Las condiciones del ecosistema son determinantes para la supervivencia de la bacteria en el medio, y en el proceso de transmisión de la misma, participan de manera importante algunos animales domésticos y silvestres que pueden actúan 18

como portadores asintomáticos. Por lo anterior, su presencia en las ganaderías constituye un factor socio-económico y sanitario importante en razón a las pérdidas económicas que genera (Sánchez, 2011). Es así como el diagnóstico de las enfermedades infecciosas en los hatos debe ser periódico, recomendándose hacer muestreos de los mismos animales de un predio, en periodos no mayores a un año, con el fin de hacer seguimiento de la dinámica de ciertas enfermedades, lo que constituye una herramienta de valoración, para determinar si las medidas de control están funcionando o si por el contrario la incidencia de la misma ha aumentado.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar la existencia de seroconversión a L. interrogans, en hembras bovinas de dos fincas lecheras en el municipio de Ventaquemada (Boyacá).

OBJETIVOS ESPECIFICOS  Determinar si los serovares encontrados en el estudio coinciden con aquellos identificados el año anterior  Establecer si los animales identificados como seronegativos el año anterior, actualmente presentan títulos de anticuerpos contra los serovares de L.interrogans  Determinar los cambios en los títulos de anticuerpos de los animales que fueron identificados como seropositivos en el primer estudio  Establecer

los porcentajes de positividad en novillas y en vacas con

diferente número de lactancias  Relacionar la positividad actual a L. interrogans con la presencia de problemas reproductivos en dos fincas lecheras en el municipio de Ventaquemada (Boyacá).

I. MARCO REFERENCIAL

1.1 ESTADO DEL ARTE

Se ha mencionado, que la existencia de estudios de investigación que busquen evaluar la presencia de seroconversión en bovinos es escasa y en algunos casos, nula, sin embargo en otras enfermedades se reportan trabajos que permiten entender los cambios serológicos a través del tiempo constituyendo una valiosa guía para el desarrollo de este trabajo

Un estudio realizado en varios municipios del departamento de Boyacá determinó la prevalencia de varias enfermedades infecciosas con efectos reproductivos, dentro de las que se incluyeron varios serovares de Leptospira interrogans. El estudio indica que en el municipio de Vetaquemada, fue

L. hardjo 19,9%, L.

pomona 3,1%, L. bratislava 0,7%, L. copenhageni 0%, L. grippothyphosa 0,9%, L. canicola 5,6% y L. tarassovi 0,4% (Moreno, 2011).

En el oeste de Canadá se realizaron dos estudios de la prevalencia de Leptospira spp, en ganado de carne, con intervalo de un año entre un estudio y otro. Considerando todos los resultados obtenidos, el grupo de investigadores concluye que 11,3% de las vacas vacunadas y 2,3% de las no vacunadas, tuvo un aumento en los títulos de anticuerpos, entre el primero y el segundo estudio y además encontraron cierta relación de esto, con la época del año en la que se hizo el muestreo (Leanne et al., 2011).

En un estudio realizado en el municipio de Monagas en Venezuela, se tomaron 469 muestras pareadas de suero sanguíneo, y fueron analizadas mediante la técnica de microaglutinación con antígenos vivos. Los resultados mostraron una prevalencia de 48%, siendo los serovares de mayor predominancia L. hardjo (80%), L. wolffi (60%) y L. hebdomadis (51%). El análisis comparativo de las muestras señala reacciones de seroconversión (30%), aumento de títulos (60%) e infecciones pasadas (78%) en las fincas evaluadas (Alfaro, 2004).

En un estudio de casos y controles realizado en España, se determinó la seroprevalencia de L. interrogans serovar brastilava en la población ganadera. Se obtuvo 25,4% de vacas positivas en la prueba de microaglutinacion; 8,2% de L. hardjo, 7,7% de L. pomona, 0,7% L. autumnalis y 0,1% L. copenhageni. La seroprevalencia fue mayor en vacas que habían abortado (69%) aparentemente como consecuencia de la infección (Atxaerandio et al., 2005).

Se realizó estudio en el Valle de Toluca (México), para el cual se tomaron 416 sueros de hembras bovinas y se analizaron mediante una prueba de aglutinación microscópica. Los resultados mostraron que 10,33% (43/416), tenían títulos de anticuerpos que van desde 1:100 a 1:1600 y que los principales serotipos detectados en las pruebas fueron L. interrogans, serovares: L. hardjo, L. canicola (León, et al., 2008).

Córdova et al (2005), realizaron un estudio para identificar serovares de L. interrogans en el municipio del estado de Campeche, México. Analizaron 203 muestras, de las cuales la frecuencia de seropositividad a una o más serovariedades fue de 75,5%. Los mayores porcentajes de reacción fueron 66% para L. wolffi y 58% para L hardjo. Los sueros evaluados, fueron positivos a 12 de los 13 serovares analizados con títulos que estuvieron entre 1:100 (21,3%) y 1: 6400 (0.73%). El trabajo concluye que la seropositividad de los sueros fue alta en comparación con otros estudios. 22

En la provincia de Puno (Perú) se determinó la prevalencia de leptospirosis en 103 bovinos (98 hembras y 5 machos). Las muestras de sangre se recolectaron durante los meses de febrero y marzo (época de lluvia) y los sueros fueron enfrentados a una batería de referencia de 4 serovares de L. interrogans mediante la prueba de aglutinación microscópica (MAT). Anticuerpos leptospirales en títulos de 1:100 y 1:200 fueron detectados en tres animales, representando una prevalencia

2,9%,

siendo

serovar

involucrado

Leptospira

icterohaemorragiae (Cachata et al., 2008)

Se realizó una investigación para determinar la presencia de leptospirosis en los Llanos Centrales de Venezuela, para lo cual se tomaron en cuenta 3264 sueros de bovinos procedentes de 246 fincas. Estas muestras fueron procesadas por la técnica MAT, encontrando 850 sueros positivos que representan el 26% de los animales, en 70% de las fincas estudiadas. Los serovares predominantes fueron: L. hardjo (64,47%), L. hebdomadis (22,48%), L. icterohaemorragiae (4,47%), L. canicola (3,85%), L. pomona (3,11%), L. grippotyphosa (1,37%) y L. pirógenos (0,25%) (Molina et al., 2010).

En un estudio realizado en el municipio de Monge en Venezuela, se tomaron 103 muestras de bovinos procedentes de ocho fincas de doble propósito. Se determinó, mediante la técnica de microaglutinacion con antígenos vivos, la presencia de animales positivos. La prevalencia general fue 48%, distribuida en 5,8% para L. icterohaemorragiae, 0,97% para L. canicola, 10,6% para L. grippotyphosa, 25,2% para L. hebdomadis y 4,8% L. hardjo (Sandoval et al., 2010).

En Colombia se realizó un estudio serológico para analizar la prevalencia de la leptospirosis bovina en la zona rural del municipio de Pereira. Fueron evaluados mediante la técnica de aglutinación microscópica con antígenos vivos, 1789 animales, procedentes de 158 predios ganaderos. Los resultados muestran una 23

prevalencia global de leptospirosis del 16,4% en los animales de estudio, 32,5% de granjas positivas. El serovar predominante fue el L. hardjo con el 45,7% y los títulos de anticuerpos encontrados estuvieron en niveles muy bajos entre 1:50 (51,5%) - 1:100 (45.3%) (Zuluaga, 2009).

Se estudió la asociación serológica de anticuerpos a Leptospira spp en trabajadores, en porcinos y roedores capturados en una granja en Villavicencio. Se utilizo la técnica de Elisa indirecta en los sueros humanos y en los porcinos y roedores la prueba de aglutinación microscópica. La reactividad serológica en los porcinos fue L. bratislava (91%), L. canícola (64%), L. australis, (55%), L. autummalis (55%), L. copenhageni (46%), L. icteroahemorragiae (18%) y L. hardjo pratjino (9%), no se encontraron reactores al serovar L. pomona. En los roedores se encontró reactividad serológica a L. bratislava (100%), L. canícola (42.8%), L. pomona (7.1%), no se encontró reactores al serovar L. icterohaemorrhagiae. (Morales, 2007).

En cuatro fincas lecheras en la Sabana de Bogotá, se tomaron muestras de 78 animales, divididos en tres grupos etarios, vacas, novillas y terneras. La prueba diagnóstica utilizada fue microaglutinación (MAT), realizando el seguimiento serológico durante un año. La prevalencia encontrada fue de 31,74%, siendo 12,7% para L. hardjo y para L. icterohaemorragiae, 29%. En el grupo de novillas se

reportó mayor prevalencia de L. icterohaemorragiae (16.5%) (Díaz, et al.,

2007).

Se realizó un estudio en Toca (Boyacá), para determinar la prevalencia de leptospira, mediante la prueba de microaglutinacion (MAT). Se eligieron 6 fincas lecheras para tomar muestras a 133 hembras bovinas holstein y normando, de las cuales 64 (48,1%) mostraron títulos compatibles con leptospirosis, 11,3% a L. icterohemorragiae, 13,5% a L. pomona, 6,0% a L. hardjo, 8,3% a L. canicola, 24

8,3% a L. automnalis. Se observó la prevalencia más alta a L. Pomona (Andrade et al., 2007).

1.2 MARCO TEÓRICO

1.2.1 Etiología

leptospirosis

causada

por

bacterias

que

pertenecen

orden

Sprirochaetales, familia Leptospiraceae y género Leptospira, que comprende dos especies, L. biflexa y L. interrogans, cada una de las cuales incluye un gran número de tipos serológicos. La primera es saprofita y se encuentran por lo común en el suelo y el agua, teniendo alrededor de 60 serovares. L interrogans son patógenas y/o de vida parasitaria tanto para los animales domésticos como silvestres (McDonough, 2001).

El método tradicional de clasificación dividió a las leptospiras en aproximadamente 200 serovares basados en diferencias antigénicas (serológicas), la clasificación serológica depende de la diversidad estructural del lipopolisacarido (LPS) (De la Peña et al., 2001). Estas bacterias son filamentosas, de 10 a 20 m de longitud, flexibles, helicoidal enrollada, gran negativa y aerobia obligada (Veloso, et al., 2000; Dutta & Christopher, 2005).

1.2.2 Epidemiología

La enfermedad es de distribución mundial, ha sido identificada en distintos ecosistemas, por lo que las condiciones medioambientales son determinantes para la bacteria, destacándose la variación de las condiciones del suelo y del agua contaminada, por ser muy susceptible a la desecación y a los cambios de pH que 25

se alejan de la neutralidad de la alcalinidad moderada. Un pH inferior a 6 o superior a 8 la inhibe, igualmente temperaturas inferiores a los 7°C o superiores a 34°C afectan su supervivencia (Gasque, 2008). Los estanques y charcos, que frecuentemente se forman en los potreros, permiten que las leptospiras sobrevivan durante varias semanas. Durante la época de lluvia las inundaciones favorecen notablemente la diseminación de la bacteria, aumentando la incidencia,

leptospirosis (Torres et al., 2003).

Las leptospiras se transmiten entre animales por contacto directo o indirecto. La transmisión directa ocurre principalmente con la entrada de las leptospiras por vía inhalatoria o conjuntival, procedente de gotas formadas por dispersión de la orina de animales infectados (Lomar et al., 2000; Alonso et al., 2001); a si mismo, través del contacto con descargas uterinas, restos de placenta (después de aborto), y apareamiento por vía transplacentaria. Los animales que se recuperan excretan en microorganismo por la orina en forma intermitente durante meses después de la infección. Las leptospiras no se replican una vez se hallan fuera del hospedador (Alonso et al., 2001).

El otro tipo de transmisión, la indirecta juega un papel muy importante en las infecciones esporádicas que ocurre cuando hay exposición a un ambiente contaminado que permita la sobrevivencia fuera del huésped.

Su transmisión

ocurre por contacto de la piel o mucosas con materiales contaminados con orina infectada (Laguna, 2000); exposición de animales susceptibles a fuentes de agua, suelo, alimentos contaminados. Su transmisión puede aumentar cuando los factores ambientales que favorecen la supervivencia de leptospira sean óptimos (Greene, 2000).

1.2.3 Patogénesis

La infección se inicia cuando la leptospira atraviesa las mucosas, principalmente de los ojos, tracto respiratorio alto y tracto genital; aunque también puede atravesar la piel con abrasiones o bien, cuando ha sido suavizada por contacto prolongado con el agua. La enfermedad clínica aguda se relaciona con el daño a la glándula mamaria que pueden causar la mayoría de las cepas; el hígado y el riñón no se ven afectados por la serovariedad hardjo. La enfermedad crónica, que produce problemas reproductivos, es el resultado de la capacidad de las leptospiras para atravesar la placenta e infectar al feto, generando un aumento en el número de abortos y mortinatos en el hato. Las leptospiras normalmente se localizan y mantienen en el riñón, siendo excretadas a través de la orina. También pueden localizarse en el tracto genital, tanto del macho como de la hembra, lo que representa una fuente potencial de diseminación y en consecuencia causar infertilidad (Torres et al., 2003).

1.2.4 Signos Clínicos

En la mayoría de las especies animales, incluyendo al hombre, tiene un amplio rango de manifestaciones sintomatológicas que pueden varias desde eventos febriles hasta cuadros multisistémicos que incluyen trastornos a nivel hepático, renal, neurológico y sobretodo reproductivo (Luna et al., 2005).

Las infecciones son en gran porcentaje subclínicas, aunque eventualmente se dan casos de enfermedad grave. Se puede observar ictericia, hemoglobinuria, hematuria, daño renal, meningitis y la mortalidad. La pirexia continua puede causar el aborto a hembras preñadas. La producción láctea se ve afectada, y prácticamente desaparece y esta puede contener coágulos de sangre y el recuento de células blancas es muy alto. En las infecciones crónicas hay 27

infertilidad, abortos, mortinatos, nacimiento de terneros prematuros, retención de placenta e incluso esterilidad, en casos extremos (Alonso et al., 2001).

Las infecciones casi siempre están relacionadas con L. hardjo y en algunos casos con L. pomona sin manifestación clínica. Caracterizada por la aparición de abortos en el último trimestre de gestación, los terneros infectados en el útero durante las fases terminales pueden nacer débiles o muertos. Los animales infectados pueden eliminar el organismo en su orina durante un periodo de 28 a 40 semanas (Rebhun, 1999).

En los animales adultos, las lesiones se localizan en los riñones. También, se pueden encontrar lesiones en el hígado, útero, placenta y, en algunos casos, en pulmones y bazo. Y en los terneros, la enfermedad es más severa, al inicio presenta fiebre de 41°C, anorexia, depresión, ictericia, septicemia, anemia hemolítica, hemoglobinuria, meningitis, alta mortalidad, así como retraso en el crecimiento.

1.2.5 Métodos Diagnósticos

El diagnóstico representa ciertas dificultades. Desde el punto de vista clínico se debe diferenciar de cualquier enfermedad que ocasione alteraciones en la conducta reproductiva. Siempre es importante contar con los resultados de laboratorio para confirmar las observaciones de campo (Torres et al., 2003). Se han utilizado técnicas de: microaglutinación (MAT), prueba de aglutinación microscópica con antígenos muertos (MSAT), aglutinación macroscópica, prueba hemolítica, fijación d complemento, ensayo inmunoenzimatico (ELISA), y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Sandow & Ramirez, 2005).

Las pruebas serológicas constituyen el medio más ampliamente utilizado para el diagnóstico de la leptospirosis, y la prueba de aglutinación microscópica (MAT) es la prueba serológica estándar. Los anticuerpos de las leptospiras aparecen a los pocos días del comienzo de la enfermedad y persisten durante semanas o meses y en algunos casos por años (De Azevedo et al., 2004).

En Colombia, la leptospirosis es una zoonosis rara vez diagnosticada, probablemente por falta de conocimiento de la enfermedad o ausencia de los métodos diagnósticos por Leptospira (Nájera et al., 2005). El Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), es el encargado de diagnosticar y notificar la presencia de leptospirosis bovina en Colombia.

1.2.5.1 Prueba de Aglutinación Microscópica (MAT)

La prueba MAT es la prueba más ampliamente utilizada. En la prueba se emplean antígenos vivos de las cepas. Para obtener una sensibilidad óptima deben emplearse antígenos representativos de todos los serogrupos conocidos que existen en la región en la que se han encontrado los animales y, preferiblemente, cepas que representen a todos los serogrupos conocidos. También hay reportes de una sensibilidad y especificidad de MAT hasta 92% y 95%, respectivamente, con un valor predictivo positivo de 95% y negativo de 100% (OIE, 2004).

Normalmente los anticuerpos frente a otras bacterias no dan reacción cruzada con Leptospira de manera significativa. Sin embargo, existe reacción cruzada serológica significativa entre las serovariedades de Leptospira y es probable que un animal infectado con una serovariedad tenga anticuerpos frente a la serovariedad infectante que dé reacción cruzada con otras serovariedades (normalmente a un nivel más bajo) en la MAT. Además, los animales que han sido 29

vacunados contra la leptospirosis pueden tener anticuerpos frente a las serovariedades presentes en la vacuna utilizada.

Las estirpes seleccionadas deben cultivarse en Tween 80 BSA o en un medio comercial adecuado a 29 ± 1°C y el cultivo debe tener al menos 4 días, pero no más de 8. La transmitancia del antígeno debe ser del 60–70% utilizando un espectrofotómetro con un filtro de 400 nm o tener un valor de 25 en una lectura en un nefelómetro. El número de antígenos que se utilizan es determinado, y se puede realizar una selección con una dilución del suero de 1/50 (o una dilución de inicio diferente basada en el objetivo de la prueba). A cada pocillo se añade un volumen de cada antígeno, igual al volumen del suero diluido, para hacer una dilución final del suero de 1/100 en la prueba de selección. Las placas de microtitulación se incuban a 29 ± 1°C durante 2-4 horas, y se examinan mediante microscopía de campo oscuro. El grado de reacción se interpreta mediante la estimación del porcentaje de leptospiras que se aglutinan. Si se aglutinan el 100% de las leptospiras, la reacción es 4+; 3+ equivale aproximadamente al 75% de aglutinación; 2+ equivale al 50%; y 1+ equivale a menos del 50%. Si se realiza una prueba de selección, cualquier suero que dé una reacción 2+ a una dilución 1/100 se titula a punto final, empleando diluciones al doble del suero empezando en una dilución final de 1/100 hasta 1/12.800 o mayor. El título de punto final es la inversa de la dilución más alta con una reacción 2+ o mayor.

Debe comprobarse de forma regular la pureza de los antígenos utilizados en la MAT mediante el cultivo en agar sangre y en caldo de tioglicolato. Los cultivos base de antígenos se pueden almacenar a –70°C o en nitrógeno líquido. Puede que después de la liofilización haya una tasa de supervivencia baja de leptospiras. El pase repetido de antígenos en medio de cultivo da lugar a una pérdida de antigenicidad. En este caso, se debe hacer un nuevo cultivo líquido a partir del cultivo base. 30

Como una prueba en un animal aislado, la MAT es muy útil en el diagnóstico de la infección aguda; tiene valor diagnóstico la demostración de un aumento de cuatro veces en los títulos de anticuerpos en muestras de pares de sueros procedentes de animales enfermos agudos y convalecientes. La prueba tiene limitaciones en el diagnóstico de la infección crónica en animales aislados tanto en el diagnóstico de abortos como en la identificación de portadores renales o genitales. Esto es particularmente cierto en las infecciones por leptospiras adaptadas al hospedador, por ejemplo, la infección por la serovariedad hardjo en el ganado vacuno.

Puesto que la leptospirosis es un problema de rebaño, la MAT tiene un uso mucho mayor como una prueba de rebaño. Para obtener información útil, Cole et al., sugirieron que se tomaran muestras de al menos diez animales o del 10% del rebaño, la que mayor sea. En un estudio de la infección por hardjo en el ganado vacuno, Hathaway et al., encontraron que normalmente una muestra de diez vacas indicaba la presencia o ausencia de infección en un rebaño. El incremento en el tamaño de la muestra mejoraba notablemente la información epidemiológica, las investigaciones de la enfermedad clínica y los rastreos retrospectivos de salud pública.

1.2.6 Control y Tratamiento

El objetivo de la terapéutica para la leptospirosis es controlar la infección antes de que se presenten daños irreparables en el hígado y riñones. Los antibacterianos más recomendados son dihidroestreptomicina, estreptomicina, oxitetraciclina, tetraciclina. La terapéutica no previene la reinfección, por lo tanto, cuando se utiliza como parte de un programa de control, debe aplicarse a todo el hato o únicamente a los animales que se encuentren en cuarentena antes de ser incorporados al hato (Torres et al., 2003).

La vacunación, es solamente una medida de control, pues la defensa contra la leptospirosis depende principalmente de una respuesta celular (glóbulos blancos) y muy poco de anticuerpos. Por esta razón, los títulos de anticuerpos pueden ser confusos cuando se va a interpretar el estatus de la enfermedad. También explica porque las vacunas contra la enfermedad presentan más dificultades en términos de eficacia.

Las vacunas en el mercado son inactivadas, por lo cual tienen un corto período de protección. La eficacia de la vacuna depende del tipo de serovar que incluya y del que esté presente en la finca. Si el problema de la finca es de un serovar que no está incluido en la vacuna su eficacia es prácticamente nula. Muchas de las vacunas no tienen incluidos todas las serovariedades.

En el plan de vacunación establecido por fedegan, se debe realizar de tres meses en adelante en hembras y machos para reproducción, un mes después de la primera dosis, se continua anualmente. Su aplicación se debe realizar previa al diagnóstico de la enfermedad en el predio.

Para que las medidas a tomar sean efectivas para el control de la enfermedad en cuestión, es imprescindible la identificación de los posibles animales infectados, así como el serogrupo o serovar actuante. Desde el punto epidemiológico, la leptospira es una enfermedad difícil de controlar ya que el microorganismo se puede albergar en el riñón y ser eliminado por la orina, perpetuándose el estado de portador. El control de la enfermedad tiene como objetivo el prevenir la manifestaciones clínicas y reducir las pérdidas económicas ocasionadas por problemas reproductivos y la reducción de la producción.

1.3 MARCO GEOGRÁFICO

Los predios seleccionados en este estudio para realizar el muestreo de los animales se encuentra ubicado en el municipio de Ventaquemada, que se encuentran en el centro del departamento de Boyacá.

Descripción Física:

Este municipio, tiene una extensión total de 159.329 Km2, de la cual 0.502 Km2 es extensión urbana y 158.827 Km2 de extensión urbana; se encuentra a 2630 m.s.n.m y tiene una temperatura que oscila entre 8°C y 14°C. Limita al norte con los municipios de Tunja y Samacà; Por el oriente con Boyacá, Jenesano y Nuevo Colón; Por el sur con Turmequé y Villapinzón; y por el occidente con Guachetá, Lenguazaque y Villapinzón (Figura 1) (POT, 2012). El municipio está conformado por 22 veredas, cuenta con una topografía de relieve ondulado, quebrado (80%) y plano (20%). Esta característica se presenta puesto que la cordillera oriental atraviesa el municipio de sur a norte.

1.4 MARCO LEGAL

La Ley 84 del 27 de Diciembre de 1.989, por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales. El capítulo VI, en su artículo 23 indica “en toda investigación en la que los animales sean sujeto de estudio deberán tenerse en cuenta lo siguiente: los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad apropiada y utilizar el mínimo numero requerido para obtener resultados científicamente validos”. “Los experimentos que se lleven a cabo con animales 33

vivos, se realizaran solo cuando tales actos sean imprescindibles para el estudio y avance de la ciencia, siempre y cuando este demuestre: que los resultados experimentales no se puedan obtener por otros procedimientos o alternativas; que las experiencias son necesarias para el control, prevención, diagnostico o el tratamiento de las enfermedades que afecten al hombre o al animal”. Es de aclarar que los procedimientos realizados para llevar a cabo este proyecto, como es la muestras de sangre, no atenta de ninguna manera contra la integridad de los animales, así como no ocasiona ningún tipo de dolor por ser un procedimiento de rutina en grandes y pequeños animales, poco invasivo, que se debe realizar bajo condiciones correctas de manejo y asepsia.

San Antonio

Casa blanca

Figura 1. Mapa del municipio de Ventaquemada con sus veredas y límites geográficos

II. METODOLOGÍA

2.1 TIPO DE ESTUDIO

El presente estudio por sus características, realizó un muestreo por conveniencia ya que el monitoreo de anticuerpo se realizó únicamente en los animales sobre los cuales ya se tenía información serológica para la bacteria y no se incluyeron animales que no habían sido valorados el año anterior igualmente dependió de la voluntad de los propietarios para el permiso de muestreo. Teniendo en cuenta que el objetivo no es determinar la prevalencia, la población evaluada correspondió a aquellos animales que los propietarios permitieron muestrear y como ya se dijo, de los cuales se tenía información.

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

2.2.1 UNIVERSO, POBLACIÓN Y MUESTRA

Como se dijo anteriormente los predios incluidos en este estudio se encuentran ubicados en el municipio de Ventaquemada.

2.2.1.1 Selección de Predios

Antes de iniciar la fase experimental, específicamente la toma de muestras, el investigador hizo una visita a los predios a los cuales se había tenido acceso en la investigación realizada por Moreno (2011). Se acordó una cita con sus propietarios 35

o encargados de los mismos, para luego obtener el permiso de entrada para el muestreo de los animales.

De los predios visitados se obtuvo el permiso en dos fincas lecheras para el desarrollo del trabajo, ya que otras de las fincas muestreadas el año anterior, los propietarios reportaron que habían vendido los animales por prevención y otros no permitieron la toma de las muestras por varias razones. Los predios que entraron al estudio se consideraron como criterios de inclusión, que fueran fincas lecheras con animales de razas holstein y normando y que tuvieran hembras en diferentes edades.

Con base en lo anterior la distribución de los predios quedó así:

Finca 1: 19 animales Finca 2: 16 animales

Los animales que se utilizaron en el estudio se encontraban ubicados en dos fincas lecheras del municipio de Ventaquemada, distribuidas en dos veredas, que cuentan con un terreno quebrado, con un sistema de rotación de potreros. Se mantienen con pasto kikuyo, sal, agua a voluntad y las hembras de producción reciben concentrado durante el ordeño y de acuerdo a la etapa reproductiva en que se encuentren.

2.2.1.2 Animales de Experimentación

Las fincas lecheras incluidas en el estudio para el muestreo, todos los animales del mismo, fueron bovinos de las razas holstein y normando.

*Novillas (N), corresponde a animales de primer parto con edades entre los 36-48 meses que pueden estar vacías en producción o periodo seco.

*Vacas (V), corresponde a animales en producción o periodo seco, con varios partos con edades entre los cinco y siete años.

El manejo de los animales en los predios de estudio se hace bajo un sistema de pastoreo con rotación de potreros. En todos los casos se tiene en pastoreo de pasto kikuyo, con sal y agua a voluntad y las hembras en producción reciben entre uno y dos kg de concentrado, durante el ordeño, de acuerdo con la etapa reproductiva en que se encuentren. Dentro del plan sanitario, los animales son vacunados contra fiebre aftosa y brucella y desparasitados periódicamente con albendazol en dosis según el peso corporal y se controlan ectoparásitos con baños insecticidas.

La mayoría de las hembras son nacidas y criadas en las fincas y esporádicamente se traen animales de otros predios. Se hace inseminación artificial.

Figura 2. Animales de experimentación (Autor) 37

2.2.1.3 Toma y Envió de Muestras

Para la identificación de serovares objeto de estudio se tomaron muestras de sangre por punción en la vena caudal o coccígea hasta obtener 8-10 ml de sangre. La sangre fue tomada por vacutainer y pasada a tubos tapa roja, para ser inmediatamente centrifugada a 2500 Rpm, durante 5 minutos. Posteriormente, se separó el suero y se envasó en tubos Ependorf que resisten la congelación, para mantenerlos en un congelador a -20oC hasta el momento de hacer las pruebas. El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en el Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario (LNDV) del ICA.

2.2.1.4 Pruebas de Laboratorio Para el diagnostico de L Interrogans serán estudiados los serovares hardjo, Pomona, bratislava, copenhageni, canicola, tarassovi donde se utilizará la prueba reina de micro aglutinación (MAT). Cada suero problema será procesado por duplicado y en diluciones 1:25; 1:50 y 1:100, siendo enfrentados con cada uno de los antígenos (serovares) de referencia e incubados a temperatura de 37°C por dos horas. Para cada uno de los serovares se incluirá un tubo control. Se realizarán diluciones dobles partiendo de la dilución original del suero 1:25. Luego de diluir el suero, se agregará el mismo volumen de antígeno vivo (0,2 mL) a cada uno de los tubos, obteniendo las siguientes diluciones finales: 1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1600; 1:3200; 1:6400 y 1:12800. Si alguno de los sueros presenta el 50% de aglutinación en la última dilución (1:12800) con cualquiera de los antígenos, se repetirá el proceso efectuando diluciones adicionales del suero. Se incubarán los tubos a temperatura de 37oC por dos horas, procediéndose a la lectura. (Van Balen. et al 2009).

2.2.2 Diseño Metodológico

Como se dijo anteriormente, el diseño escogido para el cumplimiento de los objetivos de este estudio fue por conveniencia debido a que el monitoreo de anticuerpos se hizo únicamente en los animales sobre los cuales se tiene información serológica para la bacteria. Es así como este tipo de estudios tienen la ventaja de ser útiles para estudiar los procesos de seroconversión en enfermedades poco frecuentes y de curso prolongado, así como de poderse desarrollar en corto tiempo. Fue así como se escogieron las dos fincas lecheras, en las que se muestrearon la totalidad de los animales.

El total de los animales muestreados fue de 35, distribuidos en diferentes grupos etareos (Cuadro 1).

Grupo etareo

Numero de animales

Hembras <5 años

Hembras > 5 años

TOTAL

Cuadro 1. Animales muestreados según grupo etáreo (Autor)

2.2.3 Diseño o Análisis Estadístico

En razón a los objetivos planteados en este estudio y a los resultados obtenidos en el mismo, el análisis estadístico se hizo mediante diseños diferentes, según la variable a estudiar. Las variables estudiadas fueron:

* Prevalencia general, esto es, la prevalencia considerando todos los serovares sin distinción, para los animales muestreados en 2012. Este resultado se comparó con la prevalencia de 2011

* Prevalencia para los serovares, la cual se determinó para cada uno de los siete serovares estudiados en 2012. De manera similar al dato anterior, éstas se compararon con los resultados obtenidos en 2011

* Presencia de seroconversión total y Presencia de seroconversión para cada serovar. En ambos casos, los resultados fueron analizados mediante una prueba de X2 (Chi2), para determinar si hay diferencias entre la cantidad de casos que no presentaron seroconversión y los que si presentaron seroconversión.

* Cambios en el estado inmunológico. Buscando facilitar el análisis del proceso de seroconversión, ocurrido durante el periodo 2011-2012, se determinaron cuatro estados inmunológicos así.  Negativo – Negativo: cuando los animales negativos en 2011 siguieron negativos en 2012  Positivo – Positivo: cuando los animales positivos en 2011 siguieron siendo positivos en 2012  Negativo – Positivo: cuando los animales negativos en 2011 fueron positivos en 2012  Positivo – Negativo: cuando los animales positivos en 2011, fueron negativos en 2012 Esta variable también fue analizada mediante una prueba de X 2, buscando determinar si existió diferencia significativa entre un caso y otro * Relación entre el Serovar y el grupo etáreo, que para los intereses del presente estudio fue novillas y vacas 40

* Relación entre el Serovar y el Número de Días Abiertos

* Relación entre el Serovar y Abortos

Las tres últimas variables fueron analizadas mediante la prueba de Fisher, para determinar la existencia de relación entre el serovar con cada uno de los parámetros indicados.

III. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

3.1 RESULTADOS

Inicialmente se presentarán los resultados de manera descriptiva para la enfermedad de estudio en cada una de las variables consideradas.

3.1.1 Prevalencia de Leptospira spp en 2012

La prevalencia de Leptospira spp, en los animales muestreados en el municipio de Ventaquemada en 2011, fue de 34,3% (12 individuos), mientras que la prevalencia actual (para el 2012), en los mismos animales fue de 25,7% (9 individuos) (Figura 3).

Figura 3. Prevalencia de Leptospira spp en 2011 y 2012, en el municipio de Ventaquemada (Autor) 42

3.1.2 Prevalencia por Serovar.

De manera complementaria a la prevalencia total, se determinó la prevalencia para los siete serovares, fue así como con los resultados obtenidos en este estudio, se encontró mayor prevalencia para L.hardjo, de manera similar a lo encontrado el año anterior, sin embargo el número de animales positivos a esta fue menor. Se identificaron anticuerpos contra otros serovares que no se habían encontrado en el estudio realizado en 2011, por lo que se interpretan como nuevos positivos. A pesar de haber incluido la identificación de anticuerpos contra L. tarassovi, no se encontraron en ninguno de los dos estudios (Figura 4).

Figura 4. Seroprevalencia anterior y actual de L. interrogans (Autor)

3.1.3 Presencia de Seroconversión Total de Leptospira spp

Con relación a la presentación de seroconversión de los bovinos de estudio, a Leptospira spp, en las dos fincas lecheras, se identificaron animales en los que no se encontró seroconversión 93,87% y otros en los que sí la hubo, 6,13%. Se interpreta como ausencia de seroconversión aquellos animales que mantuvieron su estado inmunológico (positivo ó negativo) de un año a otro y el animal que hace seroconversión, es aquel que siendo positivo ó negativo en 2011, presentó el resultado contrario, en el muestreo actual (Figura 5).

Figura 5. Porcentaje de seroconversión de Leptospira spp. (Autor)

Dentro de los animales en los que no hubo seroconversión, 226 permanecieron negativos a la enfermedad y 4 permanecieron positivos a la misma. Por su parte, los casos en los que la seroconversión fue evidenciada, 7 animales pasaron de ser positivos a negativos, y, 8 de ser negativos pasaron a positivos, entre un muestreo y otro (Figura 6). 44

Figura 6. Porcentaje de seroconversión general de Leptospira spp. (Autor)

3.1.4 Presencia de Seroconversión por Serovar.

Teniendo en cuenta a los animales que hicieron seroconversión, se encontró que la mayoría de estos mostró el paso de un estado de seronegatividad a uno de seropositivdad para todos los serotipos excepto para L. hardjo con la cual se observó la seroconversión contraria (Figura 7).

Figura 7. Seroconversión por serovares de L. interrogans (Autor) 45

3.1.5 Cambios en el Estado Inmunológico.

De acuerdo con los cuatro estados inmunológicos planteados para determinar los cambios ocurridos entre 2011 y 2012, se encontró mayor porcentaje de animales que siendo negativos en 2011, así se mantuvieron en 2012, para todos los serovares estudiados; algunos mantuvieron su estado de positividad, otros pasaron de positivos a negativos y la minoría pasó de negativo a positivo (Figura 8).

Figura 8. Porcentajes de animales que cambió su estado inmunológico (Autor)

3.1.6 Relación entre el Serovar y Grupo Etareo

En el presente estudio los únicos animales que hicieron seroconversión fueron las vacas y en ningún caso las novillas (Figura 9).

Figura 9. Relaci贸n entre la presencia de seroconversi贸n y el grupo et谩reo para los serovares esutidiados (Autor) 47

3.1.7 Relacion Entre el Serovar y el Número de Días Abiertos

Al relacionar el reporte de días abiertos con la presencia de seroconversión para cada uno de los serovares estudiados, se encontró que 1% de los animales que hicieron seroconversión para L. hardjo, L. bratislava, L. grippotyphosa y L. canicola tuvieron días abiertos dentro del parámetro normal para la raza (90 días o menos); mientras que 1% de los animales que hicieron seroconversión mostraron días abiertos por encima de lo esperado (Figura 10).

Figura 10. Relación entre el serovar y el número de días abiertos para los serovares estudiados (Autor) 48

3.1.8 Relaci贸n entre el Serovar y Abortos

Se encuentra que hay reporte de aborto tanto en las hembras que hicieron seroconversi贸n como en las que no (Figura 11).

Figura 11. Relaci贸n entre el serovar y el n煤mero de abortos para los serovares estudiados (Autor)

3.2 ANALISIS Y DISCUSIÓN

3.2.1 Prevalencia de Leptospira spp en 2012

Buscando determinar si existe diferencia significativa entre el porcentaje de animales positivos Leptospira spp y el de los negativos, se plantearon las siguientes hipótesis:

* Hipótesis Nula (Ho): la cantidad de individuos infectados es igual a la de no infectados con L. spp (p≥0.05).

* Hipótesis Alterna (Ha): la cantidad de individuos infectados no igual a la de no infectados con L. spp (p<0.05). Aplicada la prueba de X2, se encuentra que el número de individuos infectados (12indiv=34.3%) es estadísticamente igual a la de no infectados (23indiv=65.7%) (p=0.0630, p≥0.05; chi2=3.46), aunque, los no infectados fueron la mayoría de los individuos.

Se realizó la misma prueba para determinar si hay diferencia significativa entre la prevalencia actual y la encontrada el año anterior, encontrando que hay diferencia estadísticamente significativas (p=0.0041; p<0.05; chi2= 8.28), siendo en este estudio, el número de animales no infectados, mayor al de individuos infectados, se puede afirmar que la prevalencia disminuyó de manera significativa.

Los resultados encontrados en este estudio fueron similares a los reportados por Angelosante et al, quienes en el 2001, encontraron una positividad de 21,6% para los animales muestreados, con lo que determinaron que no existían diferencias significativas entre la prevalencia de los rebaños y las fincas. 50

La prevalencia aquí encontrada fue menor a la reportada por Moles et al (2002), quienes encontraron una seroprevalencia en México de 31,1% para Leptospira spp, mientras 35% fue lo encontrado por Torres (2000), en el mismo país. Por otra parte, Sandoval en el 2010, encontró positividad del 48% y en Pereira (Risaralda), Zuluaga (2005), reportó una prevalencia del 16,4% más baja que la reportada en este trabajo.

3.2.2 Prevalencia por Serovar

Tal como se mencionó anteriormente, se observó que la prevalencia al serovar hardjo disminuyó, sin embargo la positividad a otros serovares aumentó, lo que significa que en el presente estudio hubo positividad a un mayor número de serovares que el año anterior.

Estos resultados pueden ser respaldados por lo indicado por Van Balen et al (2009), quienes haciendo un estudio de sueros entre los años 1998 y 2001, afirman que hay movilidad de algunos serovares en los hatos lecheros, mostrando mayor prevalencia de L. hardjo e L .icterohaemorrhagiae, de manera similar a lo encontrado en este trabajo; igualmente Zuluaga (2005), encuentra como serovar más prevalmente el de L. hardjo, seguido por L. griphotiphosa y Moles et al (2002) también encontraron como bacteria más seroprevalente a L. hardjo. Es así como con los diferentes estudios reportados, se observa que existen diferencias entre los serovares identificados. Por otra parte, los hallazgos de este estudio demuestran, la necesidad de realizar estudios periódicos en las diferentes zonas del país, ya que hay diferencias entre las prevalencias y los serovares de un período a otro, igualmente, en países con estaciones también se reportan diferencias en la prevalencia a leptospiras de una estación a otra.

3.2.3 Presencia de Seroconversión Total de Leptospira spp

Buscando determinar si existe diferencia significativa entre el porcentaje de animales que presentaron seroconversión a Leptospira spp y los que no la presentaron se plantearon las siguientes hipótesis:

* Hipótesis Nula (Ho): la cantidad de animales que presentaron seroconversión es igual a los que no presentaron (p≥0.05)

* Hipótesis de Alterna (Ha): la cantidad de animales que presentaron seroconversión no es igual a los que no la presentaron (p<0.05) Una vez aplicada la prueba X2, se encontró que la frecuencia de presentación de seroconversión (6,13%), es estadísticamente diferente (p=6.1928E-43; p<0.05; chi2=188.67), a la de no presentación de la misma (93,87%).

De los 35 animales estudiados, 7 de los de los que en el estudio anterior fueron negativos en el actual son positivos y 8 de los positivos pasaron a ser negativos. La presencia de nuevos casos de seropositividad a Leptospira en los animales estudiados confirma la exposición y posible circulación del agente etiológico. A pesar de la importancia que reviste el fenómeno de la seroconversión y que algunos artículos de revisión reportan la presentación de ésta para Leptospira spp, no se encuentran estudios de investigación que indiquen los porcentajes de presentación de la misma o las características de ésta.

De los pocos trabajos reportado, Alfaro et al en Venezuela (2004). Realizó un análisis comparativo de muestras demostrando reacciones de seroconversión (30%) y aumento de los títulos (60%) de las fincas respectivamente, lo que indicó una infección activa, por cuanto los animales no han estado expuestos a vacunación contra leptospira. 52

Con estudios realizados con otros agentes infecciosos, ha sido demostrada, la existencia de seroconversión; tal es el caso del virus de la diarrea viral bovina, para el cual Jayashi et al, en el 2005 reportaron variabilidad en los títulos de anticuerpos, en cuatro muestreos realizados en un periodo de 12 meses, encontrando disminución de la prevalencias, siendo éstas de 80,8%, 56,3%, 50% y 22,9% en el primero, segundo, tercero y cuarto periodo de muestreo, bajo un esquema de eliminación de animales positivos. Igualmente, Solorio et al (2010) demuestran la presencia de seroconversión para Brucella abortus en hatos lecheros de un estado de México, de un año a otro, encontrando una incidencia acumulada de seroconversión de 2,34%, con una probabilidad de presentación 8,5 veces mayor en hatos infectados que en los no infectados.

Desde el punto de vista teórico la presencia de nuevos casos de positividad en los hatos, se debe a que comúnmente los valores de prevalencia son mayores que los de las incidencias (Levett, 2001).

Es así como, Zuluaga en 2005, encontró que la presencia de anticuerpos contra L. interrogans demostró la influencia que tienen los roedores, otros animales domésticos y silvestres en la transmisión. Es así como, lo descrito en otras investigaciones sobre los factores de riesgo, tales como la presencia de roedores, zonas de clima húmedo y presencia de humedales en potreros; y la presencia en las fincas junto al ganado de otras especies animales son fuentes de diseminación de la enfermedad.

3.2. 4 Presencia de Seroconversión por Serovar

De acuerdo con los resultados encontrados en este estudio, se evidenció seroconversión únicamente para L. hardjo, lo que indica que es el serovar de más frecuente presentación. En consecuencia, los resultados encontrados en este 53

trabajo, muestran relación con lo reportado por Alfaro en el 2004, quien señala que el L. hardjo fue el serovar con mayor porcentaje de presentación sobre los demás serovares estudiados. Así mismo, estos resultados guardan relación con investigaciones de Moles et al., (2002) y de Segura-Correa et al., (2003), donde indican la presencia de L. hardjo como principal serovar involucrado con leptospirosis bovina.

3.2.5 Cambios en el Estado Inmunológico

Buscando determinar el número de individuos en los que cambió el estado inmunológico, respecto a cada uno de los serovares estudiados, se aplicó la prueba de chi2 para determinar si la cantidad de individuos que permanecen en un estado inmunológico (negativo o positivo) es igual a la cantidad de individuos que mostraron seroconversión. Buscando facilitar este análisis, se determinaron cuatro posibilidades para cada serovar, así:

*Animales negativos (en 2011) que se mantuvieron negativos (en 2012) *Animales positivos (en 2011) que se mantuvieron positivos (en 2012) *Animales negativos (en 2011) que se hicieron positivos (en 2012) *Animales positivos (en 2011) que se hicieron negativos (en 2012)

* Hipótesis Nula (Ho): La cantidad de animales que mantuvo su estado inmunológico para cada serovar es igual a la cantidad de animales en los que cambión el mismo.

* Hipótesis Alterna (Ha): La cantidad de animales que mantuvo su estado inmunológico para cada serovar no es igual a la cantidad de animales en los que cambión el mismo. 54

La prueba indica (p=1.52E-23; p<0.05; chi2=100), que para cada serovar la cantidad de individuos que permanecen en el mismo estado inmunológico es diferente, a la cantidad de individuos que tienen seroconversion. La permanencia de la condicion negativa es mayor al 60% en cada serovar; la permanencia de la condicion positiva solo se da en L. hardjo y es 11,4%; la seroconversion para cada serovar es: L.hardjo: 37,1%, L.grippotyphosa 5,7%, L. pomona: 2,9%, L.bratislava: 2,9%, L. copenhagheni: 2,9%, L. canicola: 2,9%.

Bajo el concepto de seroconversión, también se incluyen los cambios en la positividad frente a serovares distintos a los cuales hubo respuesta inmunológica en estudios previos y a este fenómeno se le denomina reacción cruzada. Es así como Carvajal et al., (2012),

demostró que un alto número de animales que

tenían una reacción de seropositividad para uno o mas serovares, podrían ser animales portadores a la infección mixta o deberse a una reacción cruzada entre varias serovariedades de Leptospira. Estas reacciones son bien conocidas, especialmente cuando hay una pronta respuesta inmune, puesto que los anticuerpos de la serovariedad infectante pueden tener reacción con otros serovares, aunque con presentación de títulos bajos (Levette, 2003; Scanziani et al., 2002).

Desde el punto de vista teórico y con lo similitudes reportadas por Balen et al en el 2009, que el porcentaje de animales serorreactores a seis serovares utilizados en la prueba MAT es alto (> 30% por serovar). Estos bovinos son seroreaccionantes, es decir poseen anticuerpos circulantes, contra uno o varios serovares, como consecuencia de una vacunación o a un contacto reciente con uno o varios serovares de leptospira spp. También es posible que un animal pueda reaccionar y/o resultar positivo a más de un serovar debido a que existe la posibilidad de reacciones cruzadas con otros serovares (Bolín, 2003) .

Los resultados reportados por Solórzano en el 2003, señalan que de los 217 bovinos positivos a Leptospira interrogans, 17,74% reaccionaron a uno, dos o tres serotipos en forma simultánea, mientras que el 3,22% de los sueros fueron capaces de reaccionar con cuatro serovariedades y el 1,84% con cinco. Este fenómeno de serorreacción y/o seropositividad a más de un serovar, tal y como se observo en este estudio de Van et al en 2003 es similar a lo reportado en el estudio realizado en el 2012. Por lo tanto, si al realizarse la prueba de MAT más de un serovar da títulos los suficientemente altos para ser considerados positivos (signo de infección), el serovar con los títulos más altos deberá ser considerado como el serovar causante del cuadro infeccioso (Bolín, 2003).

Finalmente, los resultados de este trabajo, también coinciden con los reportados por Oliveira et al que en el 2001, reportaron la presencia de anticuerpos contra uno o varios serovares de leptospira de 39% en las muestras analizadas, siendo hardjo el serovar predominante.

3.2.6 Relación Entre la Presencia de Seroconversión y el Grupo Etáreo

Para determinar la relación existente entre la presencia de seroconversión y el grupo etáreo se plantearon las siguientes hipótesis:

*Hipótesis Nula (Ho): La relación entre la seroconversión y el grupo etáreo es igual (p≥0.05)

*Hipótesis Alterna (Ha): la relación entre la seroconversión y el grupo etáreo no es igual (p<0.05)

Aplicada la prueba se observa que la presencia de L. interrogans es estadísticamente igual (p≥0.05) en los dos grupos etáreos considerados en el 56

estudio (novillas y vacas); lo anterior significa que la presencia de seroconversión no está influida por la edad del animal, por lo menos en los rangos considerados en el estudio.

A pesar de lo encontrado en este trabajo, Rodríguez en 2010, observó que a mayor edad existe una mayor seroprevalencia; igualmente Mateu (1991), cita que a mayor edad existe mayor posibilidad de contraer leptospirosis por existir una mayor exposición y coincide tambien con lo descrito por Guerreiro et al, en el 2002 en el sentido de que la edad es un factor predisponente para la adquisicion de la enfermedad.

Se ha dicho que no existen de serconversión desarrollados con Leptospira spp, por lo que puede ser útil hacer referencia al virus de la diarrea viral bovina (VDVB), sobre el cual se ha demostrado la existencia de dicho fenómeno. Es así como Segura et al., en el 2010, demostraron la existencia de seroconversión para el VDVB, encontrando variabilidad en la edad de presentación de la enfermedad, mostrando altos porcentajes de seronconversión en animales jovenes, siendo éstos mas suceptibles que los adultos a la infección.

3.2.7 Relación entre el Serovar con el Número de Días Abiertos

Para determinar la relación existente entre la presencia de seroconversión con el número de días abiertos se plantearon las siguientes hipótesis:

*Hipótesis Nula (Ho): La relación entre el serovar con la duración de los días abiertos es igual (p≥0.05)

*Hipótesis Alterna (Ha): la relación entre el serovar con la duración de los días abiertos no es igual (p<0.05) 57

Se observa que aplicada la prueba Fischer, para cada serovar, las proporciones fueron estadísticamente iguales (p≥0.05) en individuos que presentaron días abiertos mayores, menores o iguales a 90 días, lo que se interpreta que para las condiciones de este estudio, no existe relación entre el serovar y la duración de los días abiertos.

Por otra parte esta investigación no concuerda con lo dicho por Díaz et al en 2007 donde si hubo relación entre los valores de días abiertos e intervalos de partos, en promedio se encontraron aumentados ya que para días abiertos fue de 238,64 días y para los intervalos entre partos 522,78 días.

3.2.8 Relación entre el Serovar y Abortos

Para determinar la relación existente entre la presencia de seroconversión con el número de abortos se plantearon las siguientes hipótesis:

*Hipótesis Nula (Ho): la relación entre la presencia de abortos y el tipo de serovar, es igual (p≥0.05)

*Hipótesis Alterna (Ha): la relación entre la presencia de abortos y el tipo de serovar, no es igual (p<0.05)

El análisis determinó que no hay diferencia significativa entre la presenciaausencia de abortos con los serovares valorados. Es así como se puede afirmar que bajo las condiciones planteadas en este estudio, el tipo de serovar no influye en la presentación de abortos.

Con respecto a un estudio hecho por Van et al en el 2009 se encontró que 266 animales (98,5%) reportaron abortos, como la principal causa de sospecha de 58

leptospirosis bovina; al realizar pruebas de laboratorio confirmaron que 132 animales (49,5%) resultaron positivos a uno o más serovares de leptospira. Dichos abortos es posible que fueran causados por otros agentes infecciosos (Brucella, Neospora, VDVB, Campylocacter, etc.), causas físicas (traumas) o desbalances hormonales (David, 2001). También importante resaltar que la leptospirosis bovina ocasiona otras alteraciones desde el punto de vista reproductivo, tales como: muerte embrionaria, repetición de celos, nacimiento de crías débiles, todos estos signos reportados en la literatura (Givens, 2006).

Otro estudio realizado por Zambrano et al (2009), reportó que las vacas que conciben más temprano durante la lactancia (30-60 días) tenían un riesgo alto de abortar en comparación con las vacas que conciben después del día 60. Thurmond et al (2005) y Hanson et al (2003) indicaron que este fenómeno ha sido estadísticamente significativo, y se podría especular que el efecto mismo de la concepción temprana en el hato sobre las tasas de totales de abortos es probablemente muy pequeño. De lo contrario, la incrementación de de tasas de preñez después de un pico de lactancia, no daría lugar a una disminución perceptible en las tasas de aborto total del hato.

IV. CONCLUSIONES

Se presento una disminución en la prevalencia de Leptospira spp en los animales objeto de estudio entre 2011 y 2012. Se presentó seroconversión y presencia de serovares que no se habían dado en el estudio del 2011.

Se encontró relación entre la presencia de la enfermedad según la edad encontrándose mayor presencia en las hembras adultas.

En el caso de los días abiertos en los animales positivos a los serovares de L. interrogans, tuvieron mayor número de días abiertos y esto no puede ser indicativo que pueda interferir en el estado reproductivo.

De acuerdo con los resultados la presencia o ausencia d abortos es independiente de la presencia o ausencia de L. interrogans.

Con este estudio se demostró que se deben tener en cuenta los métodos de diagnóstico para poder así implementar medidas efectivas de bioseguridad en los hatos para mantener un control adecuado de la diseminación de la bacteria.

Por otra parte es necesario realizar nuevos estudios de seroconversión para identificar animales positivos y hacer seguimiento para implementar planes de erradicación o control de la enfermedad.

V. IMPACTO

Con esta investigación se dio a conocer la importancia que tienen los monitoreos periódicos y el diagnóstico serológico de las enfermedades infecciosas que son desconocidas para los ganaderos y acerca de la amplia gama de enfermedades que afectan los hatos lecheros. El presente estudio sirve como trabajo piloto a la hora de conocer la situación sobre la incidencia de seroconversión de anticuerpos contra Leptospira.

Esta enfermedad es causante de pérdidas a nivel reproductivo y productivo, y teniendo en cuenta que no es de notificación obligatoria en Colombia y no son incluidas en los diagnósticos realizados para la erradicación y control de estas cabe agregar su importancia y necesidad de implementar pruebas serológicas para su detección.

Con los resultados obtenidos de esta investigación acerca del tema los pequeños y grandes productores puede incluir estrategias de control y prevención para minimizar los riesgos de diseminación de la bacteria en los hatos, generando la necesidad de implementar planes de vacunación, monitoreo periódico de la población en riesgo, dando así un control efectivo y duradero y con ello disminuir el impacto en la salud pública.

VI. RECOMENDACIONES

Es necesario que en el departamento de Boyacá y en el país, se realicen estudios de este tipo que permitan establecer y definir, el aislamiento bacteriano y métodos serológicos, de los serotipos circulantes en las zonas y los grupos de animales sanos y enfermos, con el fin de verificar el impacto de las condiciones ambientales sobre la transmisión de la leptospirosis y sobre la salud de los habitantes de la zonas.

La presentación de anticuerpos contra Leptospira en los animales no vacunados puede significar una exposición de la bacteria, por lo cual el animal responde inmunológicamente. Se ha demostrado que los títulos contra Leptospira varían en un animal expuesto, en razón al tiempo o a estados de reinfección, por lo que es necesario conocer la dinámica real de la enfermedad en los hatos, en tal sentido, los animales infectados, pueden desarrollar seroconversión, aumento de los títulos de anticuerpos. Por lo anterior para determinar el estado de los hatos de un predio respecto a la presencia de la enfermedad, se recomienda la realización de monitoreos periódicos para conocer con certeza el estado sanitario de un hato.

Realizar estudios similares que permitan establecer un mejor control y manejo de los animales y así conocer con claridad el comportamiento de la enfermedad para así implementar las normas de bioseguridad, sino también un aumento en la producción ganadera.

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