Evaluación de los niveles de isoprostanos f2 by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE ISOPROSTANOS F2 EN ORINA DE PACIENTES CLÍNICAMENTE SANOS EN LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMEDICA

JOSÉ OLIVERIO LÓPEZ BAUTISTA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2015 1

EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE ISOPROSTANOS F2 EN ORINA DE PACIENTES CLÍNICAMENTE SANOS EN LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMEDICA

MODALIDAD INVESTIGACIÓN

JOSÉ OLIVERIO LÓPEZ BAUTISTA

Directora: ANA CONSUELO GONZÁLEZ MVZ, Esp.

Codirector: GUILLERMO ENRIQUE GRANADOS MVZ, Esp.

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2015 2

NOTA DE ACEPTACIĂ&#x201C;N

____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ ___________________________________________

_________________________________________ Firma del Jurado

GLOSARIO

ÁCIDO ARAQUIDÓNICO: es un ácido graso esencial,omega-6 formado por una cadena de 20 carbonos con cuatro dobles enlaces (ácido eicosatetraenoico) en las posiciones 5,8,11 y 14, por esto es el ácido 20:4(5,8,11,14).

ANTIOXIDANTES: Son compuestos que detienen el ataque y la formación de radicales libres dentro de la célula.

APOPTOSIS. Autodestrucción de las células de forma programada, codificada genéticamente. Diversos factores modulan la inducción de la apoptosis, entre los que se encuentran factores de crecimiento, mediadores intracelulares de transducción de señales y proteínas nucleares reguladoras de la expresión genética, la replicación del DNA y el ciclo celular.

BIS: presencia de dos grupos complejos idénticos, pero separados, en una molécula.

CAROTENOIDES: son pigmentos orgánicos del grupo de los isoprenoides que se encuentran de forma natural en plantas y otros organismos fotosintéticos como algas, algunas clases de hongos y bacterias. Se conoce la existencia de más de 700 compuestos pertenecientes a este grupo.

CATALASA: La catalasa es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. Esta enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso

CATECOLAMINAS: son neurotransmisores que se vierten al torrente sanguíneo. Son un grupo de sustancias que incluyen la adrenalina, la noradrenalina y la 4

dopamina, las cuales son sintetizadas a partir del aminoácido tirosina. Contienen un grupo catecol y un grupo amino.

CIS: forma de isomerismo en la que grupos funcionales similares están unidos al mismo lado del plano que incluye dos átomos de carbono fijos adyacentes.

CITOCROMO P-450: es el principal responsable del metabolismo oxidativo de los xenobióticos. No se trata de un único enzima, sino que en realidad es una familia de hemoproteínas presentes en numerosas especies, desde bacterias a amíferos, y de las que ya se han identificado más de 2000 isoformas diferentes.

ELISA: La técnica ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones

ENZIMAS: son proteínas que catalizan todas las reacciones bioquímicas

ESTRÉS OXIDATIVO: es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rápidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante.

FOSFOLÍPIDOS: son un tipo de lípidos anfipáticos compuestos por una molécula de glicerol, a la que se unen dos ácidos grasos, un grupo fosfato y un grupo x, presentes en la membrana celular.

GERONTE: término usado para referirse a los pacientes en estado de vejez o todo lo relacionado con ellos.

ISÓMEROS: son compuestos con la misma fórmula molecular pero diferentes fórmulas estructurales.

ISOPROSTANOS: son compuestos similares a las prostaglandinas producidas principalmente a partir de ácido araquidónico, son considerados los mejores biomarcadores disponibles del estado de estrés oxidativo.

LÍPIDOS: son un conjunto de moléculas orgánicas.

LIPOPROTEÍNAS: son complejos macromoleculares compuestos por proteínas y lípidos que transportan masivamente las grasas por todo el organismo.

MIELOPEROXIDASA: está presente en los fagosomas de los neutrófilos y de los monocitos. Es responsable de la actividad microbicida contra un amplio espectro de organismos. En los PMN estimulados, la MPO cataliza la producción ácidos hipohalogenosos, principalmente ácido hipocloroso, y otros intermedios tóxicos que aumentan poderosamente la actividad microbicida.

MONOOXIGENASAS: Las monooxigenasas son enzimas que incorporan un grupo hidroxilo en sustratos en muchas rutas metabólicas.

OXIDACIÓN: es un proceso bioquímico de pérdida de electrones siempre asociado a otro de captación que se denomina reducción.

OXIDASAS: es una enzima que cataliza una reacción de oxidación/reducción empleando oxígeno molecular (O2) como aceptor de electrones. En estas reacciones el oxígeno se reduce a agua (H2O) o a peróxido de hidrógeno (H2O2). Las oxidasas son una subclase de las oxidorreductasas. PATOGÉNESIS: describe el origen y evolución de una enfermedad con todos los factores que están involucrados en ella. 6

PEROXIDACIÓN LIPÍDICA: hace referencia a la degradación oxidativa de los lípidos. Es el proceso a través del cual los radicales libres capturan electrones de los lípidos en las membranas celulares. Este proceso es iniciado por un mecanismo de reacción en cadena de un radical libre.

PICOGRAMO: es una unidad de masa del Sistema Internacional de Unidades (SI), equivalente a la billonésima parte de un gramo. Se representa con el símbolo pg

PROSTAGLANDINA: Las prostaglandinas son un conjunto de sustancias de carácter lipídico derivadas de los ácidos grasos de 20 carbonos (eicosanoides), que contienen un anillo ciclopentano y constituyen una familias de mediadores celulares, con efectos diversos, a menudo contrapuestos.

PRUEBA DE KRUSKAL-WALLIS: es una prueba usada en estadista, es un método no paramétrico para probar si un grupo de datos proviene de la misma población.

RADICAL LIBRE: átomo o molécula que contiene un electrón desapareado en su orbital exterior.

SUPERÓXIDO DISMUTASA: es una enzima que cataliza la dismutación de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Debido a esto es una importante defensa antioxidante en la mayoría de las células expuestas al oxígeno.

TRANS: forma de isómero en la cual átomos fijados a dos átomos de carbono unidos mediante un doble enlace están en lados opuestos de la molécula.

RESUMEN

El estrés oxidativo (EO) es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rápidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. Este estrés oxidativo se produce constante y permanente en los organismos de los animales generándose así radicales libres causando diversos problemas a nivel celular alterando la morfología de la misma. El objetivo de este estudio fue analizar y comparar los resultados de la concentración de isoprostanos F2 en orina como indicadores de estrés oxidativo en 28 pacientes caninos menores de 7 años clínicamente sanos usando el snap ELISA (oxiSelect kit ELISA 8-isoprostaglandina F2) y relacionarlos con resultado en pacientes gerontes y pacientes que presentan alguna patología en la Clínica Veterinaria Zoomedica de la ciudad de Tunja, arrojando como resultado un intervalo en los niveles de isprostanos un valor mínimo de 97.44 IsoPs pg/ml y un valor máximo de 135.77 IsoPs pg/ml. Finalmente este estudio abre una nueva posibilidad en la valoración objetiva del EO; puesto que los isoprostanos tienen una gran actividad biológica, y la opción de ser medidos en diferentes fluidos corporales como suero y orina entre otros, permiten su aplicabilidad como herramienta complementaria en la evaluación cuantitativa de los estados de EO y la posibilidad de ser incluidos en aproximaciones multimodales en el monitoreo y pronóstico en diferentes enfermedades que dentro de su fisiopatología se ha descrito al EO como un componente importante o perpetuador de la enfermedad.

PALABRAS

CLAVE:

Especies

reactivas

ciclooxigenasa, isoprostanos, estrés oxidativo.

oxígeno,

prostaglandinas,

ABSTRACT

Oxidative stress (OS) is caused by an imbalance between the production of reactive oxygen species and the ability of a biological system rapidly detoxify the reactive intermediates or repair the resulting damage. This oxidative stress is constantly and continuously produced in organisms of animals thus generating free radicals causing various problems at the cellular level by altering the morphology of the same. The aim of this study was to analyze and compare the results of the concentration of F2 isoprostanes in urine as indicators of oxidative stress in canine patients under 28 clinically healthy 7 years using the snap ELISA (ELISA kit oxiSelect 8-iso-prostaglandin F2 and relate resulting in the elderly patients and patients with pathology in veterinary clinical zoomedica city of Tunja, yielding results in a range in levels of isprostanos a minimum value of 97.44 IsoPs pg / ml and a maximum value of 135.77 IsoPs pg / . ml Finally, this study opens a new possibility in objective assessment of OS, since isoprostanes have high biological activity, and the option to be measured in different body fluids such as serum and urine among others, allow its applicability as a complementary tool in quantitative evaluation of the states of OS and the possibility of being included in multimodal approaches in monitoring and prognosis in different diseases within its pathophysiology described the OS as an important component or perpetuating the disease.

KEYWORDS: reactive oxygen, prostaglandins, cyclooxygenase, isoprostanes, oxidative stress Species.

ABREVIATURAS

EO: Estrés oxidativo. ROS: Siglas en inglés, especies reactivas de oxígeno. ERO: Siglas en español, especies reactivas de oxígeno. IsoPs: Isoprostanos. SOD: Superoxido dismutasa. CAT: Catalasa. COX: Ciclooxigenasas. ECOP: Examen clínico orientado a problemas. PG o PGs: Prostaglandinas. CD: Dienos conjugados. PV: Índice de peróxidos. . GPx: Glutatión peroxidasa. H2O: Agua. O2: Oxígeno. H: Hidrogeno. GTP: Glutatión peroxidasa. DNA: Ácido desoxirribonucleico. MPO: Mieloperoxidasa PMN: Polimorfonucleares

TABLA DE CONTENIDO . INTRODUCCIÓN

2 MARCO DE REFERENCIA

2.1. ESTADO DEL ARTE

2.2. MARCO TEORICO

2.3. MARCO LEGAL

2.4. MARCO GEOGRAFICO

2.5. TRATAMIENTO – PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

4. DISEÑO METODOLOGICO

4.1.TIPO DE ESTUDIO

4.2.HIPOTESIS

4.3.METODOLOGÍA

4.3.1. Universo, población, muestra y unidades experimentales

4.3.2. Materiales y métodos de investigación

4.4.

TRATAMIENTO - PROCESAMIENTO DE LA INFORMACION

5. RESULTADOS

5.1.

CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA

5.2.

NIVEL DE ISOPROSTANOS EN CANINOS CLÍNICAMENTE SANOS, GERIATRICOS Y CON DIFERENTES PATOLOGIAS

5.3.

INFLUENCIA DEL GENERO SOBRE EL NIVEL DE ISOPROSTANOS

5.4.

INFLUENCIA DE LA EDAD EN LA CONCENTRACIÓN DE ISOPROST

6. DISCUSION

7. IMPACTO

8. CONCLUSIONES

9. RECOMENDACIONES

10. LITERATURA CITADA

LISTA DE TABLAS

Tabla 1: Tabulación de datos de los pacientes

Tabla 2: Preparación de la curva 8-iso-PGF2 a Standard

Tabla 3. Resultados obtenidos sin la fórmula (BLANCO)

Tabla 4: Resumen descriptivo de la concentración de Isoprotanos en los Grupos de caninos sanos, geriátricos y patológicos

Tabla 5: Resumen del análisis descriptivo del nivel de Isoprostanos F2 en Hembras y machos clínicamente sanos

Tabla 6: Resumen del análisis descriptivo del nivel de Isoprostanos F2 en Caninos clínicamente sanos de 1 a 7 años de edad.

Tabla 7: Resultados de la prueba pareada de Mann Withney mostrando Que no hay diferencias significativas entre grupos etarios.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Sistema de trasporte de electrones

Figura 2: Formula química del ácido úrico

Figura 3: Cascada del ácido araquidónico

Figura 4: Mapa de Boyacá y su capital

Figura 5: Clínica veterinaria zoomedica

Figura 6 El anticuerpo Anti-8-iso-PGF2a

Figura 7: A, B conjugado conjugado 8-iso-PGF2a-HRP y el conjugado 1:80 con el diluyente muestra.

Figura 8: A, Solución del sustrato

Figura 9: Proceso de hidrólisis a la muestra

Figura 10. Lavado con solución buffer para lavado

Figura 11. Incubación en mexclador orbital

Figura 12. Adición de solución para detener

Figura 13. Ubicación de las placas sobre el lector de placas

Figura 14. Resultados obtenidos en el lector de microplaca

Figura 15. Curva estándar y fórmula.

Figura 16. Distribución de los 28 caninos clínicamente sanos de la muestra por Edad y raza

Figura 17. Pocentaje por edades de los caninos usados en la investigación

Figura 18. Valores de isoprostanos según No. de paciente usado en el est.

Figura 19. Valor min y máximo de isoprostanos en pacientes clin. Sanos

Figura 20. Comparación de resultados de pacientes clínicamente sanos menores de 7 años.

Figura 21: Comparación entre pacientes caninos clin. Sanos menores de 7 años respecto pacientes geriátricos

Figura 22: Comparación entre pacientes caninos clínicamente sanos menores de 7 años respecto a los pacientes con alguna patología 49

Figura 24: Valores máximo y mínimo, posición de la mediana y dispersión de los datos en tres grupos de caninos de la clínica Zoomedica

Figura 25: Comparación según género en pacientes caninos clínicamente sanos menores de 7 años

Figura 26. Nivel de Isoprostanos en hembras y machos

Figura 27. Valor determinado por edades

Figura 28 Concentración de Isoprostanos F2 en pacientes clínicamente sanos con edades entre 1 y 7 años.

Figura 29: Variación de la concentración de Isoprostanos F2 entre caninos clínicamente sanos de 1 a 7 años de edad.

1. INTRODUCCIÓN

El estrés oxidativo se origina por un desequilibrio entre la formación de radicales libres y la producción de antioxidantes que genera el organismo animal. Los radicales libres son átomos o moléculas químicas que tienen en su orbital externo uno o varios electrones desapareados. Se han descrito radicales libres de varios tipos: radicales libres de oxígeno, conocidos como especies reactivas de oxígeno (EROs), radicales libres de nitrógeno o especies reactivas de nitrógeno (ERNs), radicales tioles que contienen en su molécula azufre, y otros radicales que contienen carbono o fósforo en su estructura química. Los radicales libres más estudiados han sido EROs y ERNs. (Halliwell & Gutteridge, 1984)

En el presente estudio se evaluará el comportamiento de las concentraciones de isoprostanos F2 en orina de pacientes caninos clínicamente sanos que ingresen a la clínica veterinaria Zoomedica de Tunja sin tener en cuenta raza, se tomarán muestras de orina por medio de sonda urinaria, se realizarán usando el test de ELISA (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2), como marcador de estrés oxidativo.

Los antioxidantes son vitaminas y minerales en los alimentos que contrarrestan los radicales libres y detener su daño a las células. Las mayores fuentes de antioxidantes son vitamina A, vitamina C, vitamina E, el selenio mineral y ácido alfa lipóico. Es necesario medir los niveles de estrés oxidativo ya que dependiendo el resultado se puede suplementar la dieta con antioxidantes favoreciendo la respuesta inmune y disminuye el estrés oxidativo, generando una mayor resistencia a enfermedades infecciosas y degenerativas (Chew, 1995; Roedor, 1995).

Actualmente son pocos los estudios realizados en esta área de trabajo, los cuales son en pacientes geriátricos y enfermos por lo cual se ha planteado la siguiente investigación con el fin de facilitar el diagnóstico clínico en pacientes sanos para 15

medir la cantidad de estrés oxidativo mediante los isoprostanos F2 para determinar valores y poder estandarizarlos para que sirvan como base para próximos estudios.

Además, el propósito de esta investigación es contribuir con la ciencia y el mejoramiento de ayudas diagnósticas para determinar alguna enfermedad mediante los isoprostanos F2 como indicadores del estrés oxidativo. Asimismo, se facilitarán el diagnóstico de enfermedades que presenten alto estrés oxidativo y se podrán usar terapias que disminuyan el daño celular y por tanto, el daño histológico. Los barredores de radicales libres más usados son vitamina E, Selenio, vitamina A, vitamina C, entre otros. Esto podría ser un paso importante en el desarrollo y la innovación de la medicina veterinaria a nivel nacional y regional.

2. MARCO DE REFERENCIA

2.1 ESTADO DEL ARTE

Los radicales libres de oxígeno (ROS)causan daño oxidativo y este se ha visto implicado en la etiología o patología de más de cien enfermedades diferentes, entre las que se encuentran distintos tipos de cáncer, enfermedades cardíacas y vasculares, diabetes y desórdenes neurológicos ( Aldershvile,1998). Un radical libre es cualquier molécula que contiene uno o más electrones no pareados. En las células aeróbicas existen diversas vías que conducen a la producción de radicales libres derivados del oxígeno (Rybczynska, 1994).

Las fuentes principales de ROS son las enzimas asociadas al metabolismo del ácido araquidónico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo P-450. La presencia y ubicuidad de enzimas (superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasas) que eliminan productos secundarios de la vía univalente en las células aeróbicas sugieren que los aniones superóxidos y el peróxido de hidrógeno son productos secundarios importantes del metabolismo oxidativo (Rybczynska, 1994). Las especies de oxígeno reactivo pueden lesionar macromoléculas como el ADN, los hidratos de carbono y las proteínas. Estas especies de oxígeno citotóxico pueden clasificarse en 2 tipos: a) Los radicales libres, como el radical superóxido (O2) y el radical hidroxilo (OH) y b) las especies de oxígeno no radicales, como el peróxido de hidrógeno (H 2O2), el oxígeno singlete (O1), que resulta una especie muy tóxica, el peroxinitrito y el ácido hipocloroso (HClO) (Martínez,1995).

Los radicales inestables atacan componentes celulares causando daño sobre los lípidos, proteínas y ADN, los cuales pueden iniciar una cadena de eventos que dan como resultado lesión celular (Aldershvile, 1998). Estos procesos reductivos son acelerados por la presencia de metales de transición como el Fe y el Cu y enzimas específicas, como las monoxigenasas y ciertas oxidasas (Sahnoun, 17

1997). Los radicales libres se producen continuamente en el organismo por medio de reacciones bioquímicas de óxido reducción con oxígeno (REDOX), que tienen lugar por el metabolismo normal de las células, por los fagocitos, en una reacción inflamatoria controlada y también en ocasiones, como respuesta a la exposición de radiaciones ionizantes, rayos ultravioletas, contaminación ambiental, humo de cigarrillos, hiperóxia y exceso de ejercicio e isquemia (Halliwell, 1995). “Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que provocan reacciones en cadena; estas reacciones solo son eliminadas por la acción de otras moléculas que se oponen a este proceso tóxico en el organismo, los llamados sistemas antioxidantes defensivos. Un primer grupo trabaja sobre la cadena del radical inhibiendo los mecanismos de activación, un segundo grupo neutraliza la acción de los radicales libres ya formados, por tanto detiene la cadena de propagación” (Oldfield, 2003).

En este grupo pueden encontrarse enzimas detoxificadoras notables como la superóxido dismutasa y la catalasa, que producen peroxidasas particularmente importantes como la glutatión peroxidasa (Jamoussie, 1997)

Las enzimas utilizan en su mayoría elementos trazas como cofactores para sus reacciones. Muchas de estas moléculas se pueden encontrar en la fase lipídica, otras por el contrario son lipofóbicas. El sistema antioxidante protege a los tejidos de los efectos de los radicales libres. Los antioxidantes se clasifican en primarios, secundarios y terciarios, en dependencia de su función. En el primer grupo, los enzimáticos, se encuentran fermentos que protegen al organismo contra la formación de nuevos radicales libres, entre los que se encuentran (Sahnoun, 1997): 

Superóxido dismutasa (SOD) que transforma el oxígeno en peróxido de hidrógeno.



Glutatión peroxidasa (GPX) que convierte el peróxido de hidrógeno y los peróxidos lipídicos en moléculas inofensivas antes de que puedan formar radicales libres.



Proteínas de unión a metales (GR) que frenan la disponibilidad del Fe, Necesario para la formación del radical OH.

En el segundo grupo de antioxidantes, los secundarios no enzimáticos hay 2 subgrupos: 

Antioxidantes hidrofílicos: entre los que se encuentran la vitamina C, (ascorbato), ácido úrico, bilirrubina y albúmina.



Antioxidantes lipofílicos: entre los que se encuentran la vitamina E (alfatocoferol), carotenoides y las ubiquinonas.

Dentro de los antioxidantes terciarios, encargados de reparar biomoléculas dañadas por los radicales libres se incluyen las proteasas reparadoras de ADN y la metionina sulfóxido reductasa (Stampher, 1993). La defensa antioxidante, enzimática y no enzimática protege al organismo contra el daño oxidativo, pero no con el 100 % de eficiencia. Los antioxidantes no enzimáticos son frecuentemente añadidos a los alimentos para prevenir la peroxidación lipídica que se asocia a numerosas patologías y a estados de estrés oxidativo (Free 1997)

En estudios realizados sobre el efecto de la peroxidación lipídica y el estado antioxidante en la arterosclerosis se encontró que bajos niveles de antioxidantes y la peroxidación lipídica están involucrados en las fases tempranas del proceso aterosclerótico (Bonithon, 1997)

Los ácidos grasos poliinsaturados distintos del ácido araquidónico también son vulnerables a las especies reactivas de oxígeno y producen isoprostanos. Por ejemplo, además de las cuatro clases de F2-isoprostanos que pueden surgir a partir de ácido araquidónico , la peroxidación de ácido eicosapentaenoico (EPA) se prevé para dirigir a la generación de seis clases de isoprostanos F3, ácidos αlinolénico y γ-linolénico a dos clases de E1 y F1-isoprostanos, y ácido docosahexaenoico a ocho clases de D4-isoprostanos y ocho clases de E4isoprostanos. Cada uno de los clases comprenden hasta ocho isómeros racémicas, que conduce a un asombroso número de moléculas de isoprostano (Janssen, 2001).

Las prostaglandinas son compuestos que pueden ser formados por la peroxidación catalizada por radicales libres no enzimáticos del ácido araquidónico libre. En los estudios realizados por Morrow y colaboradores se demostró que una novedosa familia de isómeros tipo prostaglandinas se formaron como resultado de la oxidación por radicales libres sobre el ácido araquidónico esterificado a fosfolípidos en las membranas celulares, llamado isoprostanos (Morrow,1990). Diferentes

isoprostanos

pudieran

ser

producidos

preferentemente

bajo

condiciones de estrés oxidativo (Morrow, 1997).

En un estudio realizado por Patrono en 1997 en ratas deficientes en vitamina E y selenio se reportan elevados niveles de isoprostanos, así como en humanos que se produce después de terapia trombolítica. Niveles elevados de estos compuestos en plasma y orina han sido asociados con otros factores de riesgo cardiovascular como son diabetes tipos 1 y 2 y la hipercolesterolemia, y fueron encontrados también en las lesiones ateroscleróticas (Gniwotta, 1997).

En 1997 cuantificaron con el uso de una técnica de inmunoensayo, iPF2 alfa-III (F2-isoprostanos) y se encontró niveles significativamente altos en un grupo de pacientes hipercolesterolémicos no así en el grupo control (Davi, 1997). Por otra parte Really y colaboradores en 1998 encontraron una fuerte relación entre la 20

hipercolesterolemia y el incremento en la peroxidación lipídica en pacientes con hipercolesterolemia familiar homocigota y con hipercolesterolemia moderada. Hoy en día el impacto de la terapia antioxidante sobre los niveles de isoprostanos caninos, muestra datos relativamente pobres, pero en estudios realizados con suplementación de vitamina E (100-600 mg/ día / 2 semanas) se encontró que la excreción urinaria de isoprostanos disminuyó en sujetos hipercolesterolémicos (Really, 1998). En otro estudio realizado con la suplementación de vitamina C y vitamina E lo redujo en fumadores (Really, 1996). Pratico y otros en 1998 demostró en un estudio un aumento en los niveles de iPF2 alfa- III en plasma, orina y tejido arterial en ratones hipercolesterolémicos

En deficientes

paralelamente a la progresión de las lesiones ateroscleróticas. El uso de la vitamina E en esa población produjo una reducción en la excreción de isoprostanos e inhibió la formación de lesiones sin afectar los niveles de colesterol. (Bonithon, K, 1997)

Los antioxidantes pueden formar parte de enzimas que directa o indirectamente protegen a las células contra los efectos adversos de numerosas drogas y sustancias carcinogénicas. Tienen una gran capacidad para disminuir la carga de radicales libres en el organismo, que rompen a las moléculas en tres diferentes fases: iniciación, propagación y terminación, teniendo acción en cualquiera de las fases (Bendich, 1990).

Los niveles plasmáticos de vitamina E se correlacionan inversamente con los niveles plasmáticos de isoprostanos presentes en lesiones y excretados por la orina, datos que demuestran definitivamente la relación directa entre la aterogénesis y la peroxidación lipídica in vivo así como que la administración de vitamina E reduce la excreción de isoprostanos (Tangirala, 1998)

2.2 MARCO TEÓRICO

Los radicales libres o especies reactivas al oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), hacen parte del metabolismo normal de la célula, en las reacciones de óxido-reducción, o a partir de procesos como la hipoxia, que puede causar lipoperoxidación en las membranas celulares, todos estos procesos hacen que los radicales causen daños asociados a lípidos de las membranas celulares, proteínas, carbohidratos y ADN (Halliwell, 1999).

Los radicales libres son moléculas o átomos que presentan, al menos, un electrón no apareado. La mayoría de los radicales libres son en extremo reactivos y tienden a asociarse a un electrón libre, son altamente tóxicos y capaces de reaccionar con diverses moléculas orgánicas, mecanismos a través de los cuales provocan daños a nivel celular y tisular, causando alteraciones funcionales (Miller, 1994) ; hay muchas formas bioquímicas de cómo producen los radicales libres y a su vez el estrés oxidativo algunos de ellos son:

La respiración celular, que es la principal fuente de energía de las células aeróbicas para producir ATP; las mitocondrias y los sistemas de transporte de electrones es el sitio de mayor oxidación celular (figura 1) (Tiskow, 1996)

El consumo de O2 incrementado por la acción bactericida en las células fagocíticas es una fuente importante de radicales superóxido extracelulares (Clifford, 1999); los neutrófilos poseen la enzima mieloperoxidasa que genera radicales de óxido hipocloroso (HClO) al reaccionar con H2O2; así, un gran número de neutrófilos activados producen radicales libres (Tiskow, 1996)

Figura 1. Sistema de trasporte de electrones. Fuente: http://www.biologia.edu.ar

La autoxidación de catecolaminas, que son degradadas por la enzima monoamino oxidasa (MAO) involucrando un proceso oxidativo con producción excesiva de electrones; en el proceso de reperfusión tisular posterior a la isquemia, el O 2 puede actuar como agente receptor de electrones y producir radicales OH y moléculas de H2O2 (Tiskow, 1996).

Figura 2. Formula química del ácido úrico. Fuente: www.iqb.es

En la síntesis de prostaglandinas la fase de transformación del ácido araquidónico a prostaglandinas por la acción de la ciclo-oxigenasa produce radicales OH que a su vez pueden inhibir a la ciclo-oxigenasa y favorecer la formación de tromboxano A2 que posee propiedades agregantes de las plaquetas (Tiskow, 1996)

La oxidación de hipoxantina y xantina hasta ácido úrico (Figura 2), reacción que es catalizada por la xantina-oxidasa, y durante la cual se acopla una reducción del O2 (Halliwell et al., 1995)

Procesos al interior de las células, como producto de sus actividades fisiológicas normales o a partir de procesos como la hipoxia, en la que se observa un aumento en la formación de radicales libres que pueden inducir a lipoperoxidación en las membranas de las células (González, 2000)

A partir de fuentes exógenas, como las radiaciones ultravioleta, productos de la detoxificación celular de drogas y toxinas, algunos productos químicos carcinogénicos, oxidación de alimentos, fotosensibilizadores, contaminantes atmosféricos, humo de cigarro, productos de la combustión de la materia orgánica y pesticidas (Halliwell et al., 1992; Clifford, 1999).

Por otro lado, los isoprostanos son prostaglandinas compuestas formados in vivo a partir del radical libre catalizada por la peroxidación de los ácidos grasos esenciales (principalmente ácido araquidónico) y sin la acción directa de la ciclooxigenasa (COX). Los compuestos fueron descubiertos en 1990 por L. Jackson Roberts (Morrow, 1990). Estos eicosanoides, no clásicos poseen actividad biológica potente como inflamatorios mediadores que aumentan la percepción del dolor (Evans, 2000). Estos compuestos son marcadores precisos de la peroxidación de lípidos tanto en modelos humanos y animales de estrés oxidativo.

Figura 3: cascada del ácido araquidónico Fuente: www.elsevier.es Los niveles elevados de isoprostanos son sospechosos de contribuir a un mayor riesgo de ataque al corazón en pacientes que están expuestos al humo de cigarrillo (Seet, 2011), Los ácidos grasos poliinsaturados distintos del ácido araquidónico también son vulnerables a las especies reactivas de oxígeno y producen isoprostanos. Por ejemplo, además de las cuatro clases de F2isoprostanos que pueden surgir a partir de ácido araquidónico (Figura 3), la peroxidación de ácido eicosapentaenoico (EPA) se prevé para dirigir a la generación de seis clases de isoprostanos F3, ácidos α-linolénico y γ-linolénico a dos clases de E1 y F1-isoprostanos, y ácido docosahexaenoico a ocho clases de 25

D4-isoprostanos y ocho clases de E4-isoprostanos. Cada uno de los clases comprenden hasta ocho isómeros racémicas, que conduce a un asombroso número de moléculas de isoprostanos (Janssen, 2001).

numerosas

patologías

como

problemas

cardiovasculares,

tumorales,

enfermedades degenerativas e incluso el proceso de envejecimiento. Durante los procesos de oxidación, los sistemas biológicos previenen los daños mediante una gran cantidad de mecanismos, dentro de los cuales los antioxidantes tienen una importante función en forma de enzimas (superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa) y como compuestos biológicos no-enzimáticos (Bendich, 1990; Biewenga et al., 1997).

2.3 MARCO LEGAL

En Colombia la ley 576 de 2000, que rige la manipulación de animales con fin de investigación, en la cual se da a conocer todos los procesos que se debe realizar. Con esta ley se expide el Código de Ética para el ejercicio profesional de la Medicina Veterinaria, y Zootecnia. Artículo 1º. La medicina veterinaria y la zootecnia, son profesiones basadas en una formación científica, técnica y humanística que tienen como fin promover una mejor calidad de vida para el hombre mediante la conservación de la salud animal, el incremento de las fuentes de alimento de origen animal, la protección de la salud pública, la protección del medio ambiente, la biodiversidad y el desarrollo de la industria pecuaria del país. 26

Parágrafo. En el campo de las ciencias animales, existen en Colombia tres profesiones afines, a saber: La medicina veterinaria, la medicina veterinaria y zootecnia y la zootecnia.

Artículo 5º. Los médicos veterinarios y los zootecnistas, en su labor diaria, deben hacer uso de todos sus conocimientos y capacidades para cumplir cabalmente la misión profesional.

Es responsabilidad de los citados profesionales mantener un alto nivel de competencia, mostrarse receptivos a los cambios científicos y tecnológicos a través del tiempo. Deben poner todos sus logros a disposición de sus colegas y aprovechar los de éstos en beneficio de un mejor desempeño.

Artículo 7º. Los profesionales sujetos a la presente ley, se vincularán con el desarrollo de estudios relacionados con la conservación de los ecosistemas animales, su entorno de vida y bienestar, sistemas de cofinanciamiento y prácticas de producción animal, frente a los sistemas apropiados de producción y desarrollo tecnológico. Teniendo como objetivo primordial el bienestar del ser humano, dentro de los más altos y sanos principios éticos.

CAPÍTULO 5 De la investigación científica, publicación de trabajos y propiedad intelectual

Artículo 76. Los profesionales sujetos a esta norma dedicados a la investigación, son responsables de los temas de estudio del método y los materiales empleados en la misma; del análisis de sus conclusiones y resultados, así como de su divulgación y prevención para su correcta utilización.

Artículo 77. Los profesionales que adelanten investigaciones de carácter científico deberán abstenerse de aceptar presiones o condiciones que limiten la objetividad 27

de su criterio y obedezcan a intereses que ocasionen distorsiones o pretendan dar uso indebido a los hallazgos

Artículo 78. Los trabajos de investigación podrán ser divulgados o publicados con la debida autorización de sus autores, de conformidad con las normas sobre Derechos de Autor.

Artículo 79. Los profesionales no auspiciarán publicación de artículos que no se ajusten estrictamente a los hechos científicos debidamente comprobados, o los presentados en forma que induzcan a error bien sea por su contenido o por el título de los mismos.

Artículo 80. En la publicación de trabajos científicos, el profesional no cebe valerse de su posición jerárquica para hacer suyos los trabajos de sus subalternos.

Artículo 81. Cuando los trabajos de tesis sean dirigidos y orientados por un profesional de las ciencias animales, éste respetará las normas sobre Derechos de Autor para su creador.

Artículo 82. Todo profesional de las ciencias animales tiene derechos de propiedad intelectual sobre los trabajos que elabore en forma individual o en equipo, en un todo de acuerdo con lo prescrito por las disposiciones sobre Derechos de Autor. La ley por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los animales es la ley 84 del 27 de Diciembre de 1.989.

ARTICULO 87. En toda investigación en la que los animales sean sujeto de estudio deberán tenerse en cuenta, además de las disposiciones determinadas en la Ley 84 de 1989, las siguientes:

“Los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad apropiada, y utilizar el mínimo número requerido para obtener resultados científicamente válidos”. “Solamente se emplearán animales adquiridos legalmente y se mantendrán en condiciones adecuadas y que cumplan con las reglamentaciones sanitarias vigentes”. Además “los investigadores y demás personal nunca deben dejar de tratar a los animales como seres sensibles y deben considerar como un imperativo ético el cuidado y uso apropiado y evitar o minimizar el disconfort, la angustia y el dolor”. Por todo lo anterior, el número de animales utilizados para el estudio, será el mínimo necesario para obtener resultados confiables y la toma de muestras se hará teniendo en cuenta todas las consideraciones de buen manejo para disminuir los factores de estrés. Es de aclarar que los procedimientos realizados para llevar a cabo este proyecto, como la toma de muestra sanguínea en la vena coccígea no atenta de ninguna manera contra la integridad del animal, así como no ocasiona ningún tipo de dolor por ser un procedimiento de rutina en grandes y pequeños animales, poco invasivo.

2.4. MARCO GEOGRÁFICO Este estudio se realizará en la ciudad de Tunja (Figura 4) departamento de Boyacá en la clínica veterinaria Zoomedica. Tunja se encuentra a una altura promedio de 2775 m.s.n.m con una temperatura promedio de 13° Con una población 234,581 habitantes.

Figura 4. Mapa de Boyacá y su capital. Fuente: http://www.tunja.gov.co/

La Clínica Veterinaria Zoomedica la cual se encuentra ubicada en la transversal 11 # 23-54 en el parque Santander en la zona centro de la ciudad, Allí, se prestan con ayuda del médico veterinario y el pasante, los servicios de urgencias 24 horas los 7 días de la semana, al igual que consulta, rayos x, ecografía, vacunación, cirugía, hospitalización, asistencia reproductiva en caninos y felinos, pet shop, guardería, peluquería, y consulta especializa en neurología, dermatología, fauna silvestre, laboratorio clínico y patología (Figura 5).

Figura 5: Clínica veterinaria Zoomedica. Fuente: López, 2015

Además cuenta con 2 consultorios los cuales fueron útiles para el desarrollo de esta investigación y cuenta con laboratorio propio el cual favoreció para correr las muestras y almacenarlas para así lograr un resultado verídico y exacto.

La Clínica Veterinaria Zoomedica maneja una casuística a nivel de pequeños animales (perros y gatos) la cual es importante para este proyecto de investigación porque se presentan menos limitantes para toma, recolección y procesamiento de muestras.

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar los niveles de isoprostanos F2 en orina de pacientes caninos clínicamente sanos de 1 a 7 años de edad en la Clínica Veterinaria Zoomedica

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Determinar la variación de los niveles de isoprostanos F2 en orina con respecto al género de los pacientes  Determinar la variación de los niveles de isoprostanos F2 en orina con respecto a la edad de los pacientes  Comparar los resultados obtenidos, con los estudios realizados en pacientes gerontes y enfermos.

4. DISEÑO METODOLÓGICO

4.1 TIPO DE ESTUDIO

Este estudio es de tipo transversal exploratorio por cuanto la información reportada en medicina veterinaria acerca de los IsoPs es escasa. Este proyecto se realizó en la Clínica Veterinaria Zoomédica de la ciudad de Tunja, se utilizaron caninos domésticos con edades menores de 7 años, con el fin de determinar y medir los valores de isoprostanos F2 en orina como marcador de EO

4.2. HIPÓTESIS

Ho: No hay variación en los niveles de isoprostanos F2 en orina en pacientes clínicamente sanos.

Ha: Hay variación en los niveles de isoprostanos F2 en orina en pacientes clínicamente sanos.

4.3 METODOLOGÍA

4.3.1 Universo, población, muestra y unidades experimentales.

El presente estudio se realizó en la ciudad de Tunja, en la Clínica Zoomedica, mediante el test ELISA, (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α), como marcador de estrés oxidativo, en la que se evaluó el comportamiento de las concentraciones de isoprostanos F2 en orina de pacientes caninos clínicamente sanos, teniendo en cuenta la edad (menores de 7 años) y género sin importar la raza, se tomó muestras de orina por medio de sonda urinaria.

A la Clínica ingresan un promedio de 32 pacientes clínicamente sanos al mes, de los cuales se seleccionó 28 individuos al azar en el transcurso del estudio, a estos se les realizó un examen físico completo y realización del ECOP.

Con previo consentimiento informado de los propietarios se procedió a realizar la toma de la muestra de orina, se inició con la desinfección de la zona perineal con alcohol y yodo; la muestra se obtuvo por cateterización vesical con sonda urinaria estéril lubricada con lidocaína en gel para neutralizar el dolor al momento en el que la sonda se introduzca por la uretra.

Se descartó la primera orina proveniente de la sonda, tomando así una muestra mayor a un mililitro siendo recolectadas en recipientes aptos para orina debidamente identificados y sellados y posteriormente conservados a una temperatura menor a 4 ºC hasta el momento de ser procesadas

El almacenamiento de muestras se realizó en el Laboratorio de la Clínica Veterinaria Zoomédica y la implementación, capacitación, utilización, montaje y lectura de resultados se realizó en el laboratorio de microbiología de la Secretaria de Salud de Boyacá.

4.3.2 Materiales y métodos de investigación. proceso y procedimientos aplicados. El OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α de Cell Biolabs, Inc provee cierta cantidad de reagentes permitiendo la realización de 28 pruebas.

Para la ejecución del kit se inició con la preparación de los reagentes; empezando con la preparación del 1X buffer para lavado diluyendo el concentrado buffer para lavado 10X hasta 1X con agua desionizada, esto se agita hasta lograr la homogenización.

Figura 6 El anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α El anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α se diluye antes de su utilización en una proporción de 1:1000 más el diluyente muestra

Figura 7 A, B conjugado conjugado 8-iso-PGF2α-HRP y el conjugado 1:80 con el diluyente muestra.

Figura 8: A, solución del sustrato.

B, muestra con reactivos

El conjugado 8-iso-PGF2α-HRP se preparó antes de usarlo, diluyendo el conjugado 1:80 con el diluyente muestra preparando suficiente conjugado para las pocetas establecidas por el kit.

La solución substrato se debe dejó a temperatura ambiente antes de su preparación, al igual que a las muestras recolectadas antes de procesarlas

A continuación, se efectuó el proceso de hidrólisis ácida de las muestras rompiendo así las uniones que mantienen unidos los lípidos y los no lípidos, acidificando la orina a un pH 3, adicionando 100μl de HCl 1N a 1ml de muestra de orina y diluyéndola, posteriormente, en pbs o en diluyente muestra a razón de 1:4 a 1:8.

Figura 9: proceso de hidrólisis a la muestra

Duración

El estudio tuvo una duración de 4 meses, en los cuales se seleccionó la población la cual cumplió con los siguientes criterios de inclusión: caninos menores de 7 años, se tuvo en cuenta el género sin importar la raza, a los cuales se les realizó un examen físico completo, se tomaron las muestras (teniendo en cuenta el previo consentimiento informado de los propietarios) y se realizó su posterior procesamiento, lectura, interpretación y análisis de resultados. Los datos se organizarón y se consignarón en una tabla donde se ingresó los datos referentes al número de resultados los cuales fueron nombre del paciente, edad, raza, y género.

Tabla 1. Tabulación de datos de los pacientes 1 2 3 4 5 6 7 8 9

RESULTADO 0.584 0.535 0.452 0.557 0.534 0.545 0,604 0,527 0,552

EDAD 3 4 2 7 3 5 6 3 4

RAZA CRIOLLO F. POODLE F. POODLE BEAGLE LABRADOR SCHANUZER CRIOLLO GOLDEN R BEAGLE

GENERO HEMBRA HEMBRA MACHO HEMBRA MACHO MACHO MACHO HEMBRA MACHO

NOMBRE LUNA CUKY TONY MILU ROCO NICO RINGO ISA HORACIO

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

0,538 0,412 0,415 0,355 0,553 0,459 0,559 0,541 0,511 0,473 0,508 0,511 0,495 0,553 0,479 0,491 0,491 0,377 0,499

2 1 6 2 4 1 5 3 7 1 7 6 5 1 1 2 4 5 2

BEAGLE CRIOLLO SCHANUZER COCKER SHITZU P. COLLIE CRIOLLO F. POODLE GOLDEN R COCKER SHITZU SCHANUZER F. POODLE LABRADOR P. ALEMAN P. ALEMAN F. POODLE CRIOLLO COCKER

MACHO HEMBRA HEMBRA MACHO HEMBRA MACHO MACHO HEMBRA MACHO HEMBRA HEMBRA MACHO HEMBRA MACHO MACHO HEMBRA MACHO HEMBRA HEMBRA

LUKY SUSY JUANA BENJAMIN CONY GANDALF LOLA CANELA JACOBO PATY LISA AXEL NIÑA THOR DRACO HELGA MOTAS MARA RAMONA

2.5 TRATAMIENTO - PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN.

La preparación del estándar fresco se realiza diluyendo el estándar 8-iso-PGF2α desde 200μg/mL hasta 0.2 μg/mL en el diluyente muestra, para una dilución final 1:1000; se preparan series del 8-iso-PGF2α Standard restante de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 2). Tabla 2. Preparación de la curva 8-iso-PGF2α Standard.

Tubos estándar

8-iso-PGF2α Standard (μL)

Diluyente muestra (μL)

5 μL of Standard Stock 250 μL of Tube #1 250 μL of Tube #2 250 μL of Tube #3 250 μL of Tube #4 250 μL of Tube #5 250 μL of Tube #6 0 Μl

4995 μL

8-iso-PGF2α Standard (pg/mL) 200,000

750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 200 μL

50,000 12,500 3,125 781 195 49 0

2 3 4 5 6 7 8

Posterior a la realización de la curva se procede a la adición de 100 μL del anticuerpo Anti-8-iso- PGF2α diluido a la placa cubierta de anticuerpo cabra anticonejo y se deja incubar 1 hora a 25 °C en un mezclador orbital. De ahí se procede a remover la solución anticuerpo de las pocetas y se lavan 5 veces 41 con 300 μL de solución buffer para lavado 1X por poceta (Figura 10); en el último lavado se vacían las pocetas y se golpea suavemente la placa de micropipeta sobre trozos de papel absorbente removiendo así el exceso de solución para lavado.

Figura 10. Lavado con solución buffer para lavado A continuación se procede a combinar 55 μL del 8-iso-PGF2α de la muestra y 55 μL del 8-iso-PGF2α-HRP conjugado en un microtubo y se mezcla muy bien, de allí se transfieren 100 μL de la solución combinada para cada poceta; seguidamente se incuba a 25ºC sobre un mezclador orbital (Figura 7).

Figura 11. Incubación en mezclador orbital 39

La solución combinada se remueve de las pocetas y son lavadas 5 veces con 300 μL de buffer para lavado 1X por poceta , en el último lavado se vacían las pocetas y se golpea la placa de micropipeta sobre papel absorbente eliminando así el exceso de solución de lavado. De ahí se continúa a la adición de 100 μL de solución substrato a cada placa y es incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos en un mezclador orbital (Figura 7).

La reacción enzimática que se produce es detenida adicionando a cada poceta 100 μL de solución; la lectura se hace de inmediato ya que el color se desvanece con el tiempo (Figura 8)

Figura 12. Adición de solución para detener

La absorbancia de cada placa es analizada sobre un lector de microplaca utilizando 450nm como longitud de onda primaria (Figura 9).

Figura 13. Ubicaci贸n de las placas sobre el lector de placas

El lector de microplaca, arroj贸 los siguientes resultados (Figura 14):

Figura 14. Resultados obtenidos en el lector de microplaca

5. RESULTADOS

Las 86 muestras numeradas (anexo 1), se dividieron en 4 grupos siendo los primeros 28 pacientes sanos, del 29 al 56 pacientes geriátricos los cuales fueron utilizados para el presente estudio, del 57 al 84 pacientes con diferentes patologías y los dos finales 85-86 se descartaron.

Los resultados arrojados por el lector de microplaca no se pueden graficar ya que son inversos, paro lo cual el fabricante del kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α provee dos curvas estándar y una fórmula para la interpretación exacta de los resultados (Figura 14 y Figura 15)

Standard Curve 0,7

OD 450nm

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1

100

1.000

10.000

100.000 1.000.000

pg/ml

Figura 14. Curva estándar, dada por el del kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α

Standard Curve 0,6 y = -0,111ln(x) + 1,1123 R² = 0,9743

OD 450nm

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1

100

1.000

10.000

100.000

pg/ml

Figura 15. Curva estándar y fórmula. La figura muestra la regresión lineal, donde se observa que es negativa y se explica en un 97% la relación entre las dos variables

5.1. CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA La muestra de caninos clínicamente sanos estuvo compuesta por 28 individuos distribuidos en forma equitativa entre géneros (14 machos y 14 hembras), y con diferente representación de 10 razas de las cuales French Poodle y Criollo son las mejor representadas en la muestra con 17,86 % cada una. Los individuos de la muestra tenían edades comprendidas entre 1 y 7 años, la mayoría con 1 y 2 años (35,71%) (Figura 6).

Número de individuos

Raza del Canino Edad en años

Figura16. Distribución de los 28 caninos clínicamente sanos de la muestra por edad y raza El nivel de Isoprostanos F2 en la muestra presentó valores entre 97,44 pg/ml y 1352,77 pg/ml para un valor de Rango del conjunto de datos de R=1255,32. Las medidas de tendencia central indican que la distribución de esta variable es asimétrica, ya que la media es de 320,68 pg/ml, la moda de 154,27 pg/ml y la mediana 225,22 pg/ml; que el valor de la moda y la mediana sean inferiores al de la media indica que la distribución es asimétrica positiva (coeficiente de asimetría = 2,47) y significa que la mayoría de los individuos de la muestra tienen concentración de Isoprostanos F2 por debajo del promedio general (21 individuos). La parte izquierda (sin color) de la tabla 4 corresponden a los datos medidos por absorbancia en el lector de microplaca y los graficados en la parte derecha (color VERDE) son los arrojados por Microsoft Excel 2010 al implementar la fórmula

Tabla 3. Resultados obtenidos sin la fórmula (BLANCO) y resultados obtenidos tras la aplicación del a fórmula (VERDE).

sin con formula formula 0,584 116,68 0,535 181,44 0,452 383,24 0,557 148,81 0,534 183,08 0,545 165,80 0,604 97,44 0,527 194,99 0,552 155,67 0,538 176,60 0,412 549,50 0,415 534,85 0,355 918,30 0,553 154,28 0,459 359,81 0,559 146,16 0,541 171,89 0,511 225,23 0,473 317,18 0,508 231,40 0,511 225,23 0,495 260,15 0,553 154,28 0,479 300,49 0,491 269,70 0,312 1352,77 0,377 753,20 0,499 250,94 En la figura 17 se observa que el 22% de los pacientes tienen 1 año de edad y un 13% presenta los pacientes de 5 y 6 años, y se observa que los rangos entre los 2 y 5 años presentan una proporción de 18% y13%, respectivamente.

Porcentaje de pacientes sanos en los intervalos de EO pg/ml dados por edad 13%

22%

13% 18% 17% 17%

1 año

2 años

3 años

4 años

5 años

6 años

Figura 17. Porcentaje por edades de los caninos usados en la investigación

En la figura 18 se observa que se presentaron dos picos muy elevados, correspondientes a los pacientes 13 y 26, siendo éste último el que presentó el mayor pico en los valores de Isoprostranos dentro de los caninos sanos. Los dos datos pueden tratarse como “outlayers”, al ser datos atípicos en relación con los demás.

Valores de IsPs en caninos sanos 1600,00 1400,00 1200,00 1000,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00

250,94 116,68 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 EO pg/ml

Exponencial (EO pg/ml)

Figura 18. Valores de isoprostanos según número de paciente usado en el estudio (estrés oxidativo: EO) 46

Los valores de isprostanos en caninos clínicamente sanos menores de 7 años tienen un valor mínimo de 97.44 IsoPs pg/ml y un valor máximo de 135.77 IsoPs pg/ml. (figura 19), se puede observar la distribución encuanto a la media, moda, medianay promedio.

Intervalo de IsoPs pg/ml en los pacientes sanos 1600,00 1352,77

1400,00 1200,00 1000,00 800,00 600,00 400,00 200,00

97,44

154,2753108

217,3097477

225,23

Media

Mediana

320,68

0,00 Valor minimo de intervalo

Moda

Promedio

Valor mayor de intervalo

Intervalo de IsoPs pg/ml en los pacientes gerontes de la clinica veterinaria zoomedìca.

Figura 19. Valor mínimo y valor máximo de isoprostanos en pacientes clínicamente sanos.

Se observa, en la figura 20, que los niveles de pacientes con alguna patología y los pacientes gerontes muestran niveles más altos de isoprostanos con respecto a los pacientes clínicamente sanos. Se puede apreciar la variación en la concentración de isoprostanos que tuvo cada paciente.

Lineas de tendencia sobre comparación de dosis de EO pg/ml de caninos con diferentes patologías CANTIDAD DE ISOPS PG/MI

9000,00 8000,00 7000,00 6000,00 5000,00 4000,00 3000,00 2000,00 1000,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 CANINOS SANOS, GÈRIATRICOS Y DIFERENTES PATOLOGÌAS Geriátricos

Sanos < de 7 años

Patológicos

Figura 20. Comparación de resultados de pacientes clínicamente sanos menores a 7 años, caninos mayores a 7 años (gerontes) y con diferentes patologías.

Lineas de tendencia sobre comparaciòn de dosis de EO pg/ml de geriatricos contra sanos CANTIDAD DE EO PG/ML

3500,00 3000,00 2500,00 2000,00 1500,00 1000,00 500,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 CANINOS SANOS Y GÈRIATRICOS Geriátricos

Sanos < de 7 años

Figura 21: comparación entre pacientes caninos clínicamente sanos menores de 7 años respecto pacientes geriátricos

Cantidad de IsoPs pg/ml

Lineas de tendencia sobre comparaciòn de dosis de EO pg/ml de caninos sanos contra caninos con diferentes patologias 9000,00 8000,00 7000,00 6000,00 5000,00 4000,00 3000,00 2000,00 1000,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Caninos sanos, Gèriatricos y diferentes patologìas Sanos < de 7 años

Patológicos

Figura 22. Comparación entre pacientes caninos clínicamente sanos menores de 7 años respecto a los pacientes con alguna patología

5.2. NIVEL DE ISOPROSTANOS EN CANINOS CLÍNICAMENTE SANOS, GERIÁTRICOS Y CON DIFERENTES PATOLOGÍAS Al comparar los resultados obtenidos en estudios realizados en pacientes geriátricos y enfermos (Ávila, 2013; Velandia, 2012), se observó que los valores de Isoprostanos más altos, se presentaron en pacientes que tenían alguna patología seguidos por los pacientes gerontes y los valores más bajos fueron los de pacientes clínicamente sanos. Además, se construyó un gráfico (Figura 23) para visualizar la forma de la distribución de frecuencias del nivel de isoprostanos F2 en cada grupo de pacientes: clínicamente sanos, geriátricos y patológicos. Si bien los rangos y promedios son distintos entre los grupos, existe un patrón similar en la distribución y es la asimetría positiva, de tal forma que el valor del promedio no es representativo de ninguno de los tres conjuntos de datos ya que la mayoría de los pacientes presentan concentraciones por debajo de ese valor (Figura 23). 49

Figura 23. Histogramas con la distribución de frecuencia para la concentración de Isoprostanos en A. pacientes geriátricos, B .patológicos y C. clínicamente sanos de la Clínica Zoomédica (Tunja)

Esta condición asimétrica, mostrada por la distribución de frecuencia en la concentración de Isoprostanos (Figura 23), indica que la comparación de los valores promedio no puede hacerse con una prueba paramétrica como el ANOVA (Análisis de Varianza) y por esto se utilizó la alternativa no paramétrica de KruskalWallis para la comparación. El resultado indica un valor de H=34,75 y p=2,84x10 -8, que al ser menor a 0,05 soporta que existes diferencias significativas en la concentración de Isoprostanos entre pacientes clínicamente sanos, geriátricos y patológicos. Además de la comparación general se realizaron pruebas pareadas de Mann-Withney que indican la misma tendencia general por pares particulares: Geriátricos Vs. Sanos p=0,005612, Geriátricos Vs. Patológicos p=0,005613 y Sanos Vs. Patológicos p= 8,76x10-8, todos los valores inferiores a 0,05 representan diferencias significativas entre pares de grupos. Los rangos más amplios de concentración de Isoprostanos se encuentran en el grupo de pacientes patológicos seguido por los geriátricos. La dispersión de los datos, medida con la desviación estándar, también es mayor en estos grupos, aunque similar a la observada en el grupo de sanos (Tabla 4). Tabla 4. Resumen descriptivo de la concentración de Isoprostanos en los grupos de caninos sanos, geriátricos y patológicos Media Mediana Moda Desviación estándar Coeficiente de asimetría Rango Mínimo Máximo

Sanos Geriátricos Patológicos 320,7 696,8 1942,7 225,2 429,0 1191,5 154,3 239,9 539,7 279,3 709,8 1931,3 2,5 2,4 1,7 1255,3 97,4 1352,8

3016,2 110,5 3126,7

7418,9 209,6 7628,4

Aunque el grupo de caninos con patologías presenta valores muy altos de Isoprostanos, presenta también algunos pacientes con valores que coinciden con los de pacientes sanos y geriátricos dificultando la interpretación de esos valores como característicos de alguna de las tres condiciones (Figura 24). 51

Figura 24. Valores máximo y mínimo, posición de la mediana y dispersión de los datos en tres grupos de caninos de la clínica Zoomedica.

Valor determinado según género EO pg/ml

1600,00 1400,00 1200,00 1000,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00

1352,77 753,20

116,68 Hembras

97,44

Género

Machos

Figura 25. Comparación según género en pacientes caninos clínicamente sanos menores de 7 años Se puede apreciar que los niveles de estrés oxidativo, es mayor en los machos con respecto a las hembras, ya que se tomo 50% de la población hembras y 50% de machos.

5.3. INFLUENCIA DEL GÉNERO SOBRE EL NIVEL DE ISOPROSTANOS 52

Los datos de la muestra fueron agrupados por género para observar si existen diferencias en el nivel de isoprostanos F2 entre machos y hembras. Los niveles más elevados se encontraron en los machos, así como la mayor variación entre individuos; sin embargo la distribución de los dos grupos es asimétrica negativa, coincidiendo con el resultado general e indicando que en machos y hembras el promedio no es un valor representativo de la muestra ya que la mayoría de individuos tienen niveles por debajo de ese valor (Tabla 5) Tabla 5. Resumen del análisis descriptivo del nivel de Isoprostanos F2 en hembras y machos clínicamente sanos Media Mediana Moda Desviación estándar Coeficiente de asimetría Rango Mínimo Máximo

HEMBRA 295,4 241,2 No Aplica 186,4 1,5 636,5 116,7 753,2

MACHOS 346,0 204,2 225,2 354,8 2,3 1255,3 97,4 1352,8

La forma de la distribución indica que aunque los promedios son distintos entre géneros, los valores superiores a la media no son los más frecuentes en la muestra de machos; la mediana es un parámetro similar entre los dos grupos, pero inferior en los machos, que en general se muestran como un grupo con elevada variabilidad (desviación estándar y rango en Tabla 5 y tamaño de la caja en Figura 26). La dispersión en los niveles de Isoprostanos en las hembras es menor que en los machos (Figura 25 y Figura 26).

Figura 26. Nivel de Isoprostanos en hembras y machos, las barras muestran los valores máximo y mínimo, el tamaño de la caja la variación o dispersión de los datos (desviación estándar) y la barra dentro de la caja la posición de la Mediana de los datos. Considerando que, según los estadísticos descriptivos anteriores para el factor género, los datos no siguen una distribución normal; por lo tanto, la diferencia en los niveles de Isoprostanos entre machos y hembras se contrastó utilizando una prueba no paramétrica de Krukal Wallis usando el programa Past 2.12. El valor del estadístico H es de 0,1188 y el valor de p es de 0,7304, que al ser mayor a 0,05 indica que no existen diferencias significativas entre género.

Valor determinado por edades EO pg/ml

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

918,30 1352,77

753,20

549,5

154,28

176,6

194,99 116,68

1 Año

2 Años

3 Años

534,85 154,28 4 Años

146,16 5 Años

231,40 97,44

6 Años

148,81 7 Años

Edad

Figura 27. Valor determinado por edades

5.4.

INFLUENCIA

EDAD

CONCENTRACIÓN

ISOPROSTANOS

El análisis de los datos considerando a la edad como un factor determinante de la concentración de Isoprostanos F2 indica que los valores mínimos, medios o máximos se presentan en forma independiente de la edad y que la mayoría de los datos se encuentran por debajo del promedio general del grupo (Figura 28).

Concentración de Isoprostanos F2

1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0

Edad en años del canino clínicamente sano

Figura 28. Concentración de Isoprostanos F2 en pacientes clínicamente sanos con edades entre 1 y 7 años

La concentración de Isoprostanos presenta un comportamiento variable entre grupos de edad, el promedio y la desviación estándar se muestran heterogéneos y no hay una concentración que pueda considerarse característica o representativa de cada grupo etario, ya que la variabilidad es grande sobre todo en los grupos de 4, 5 y 6 años (Tabla 6, Figura 28). Tabla 6. Resumen del análisis descriptivo del nivel de Isoprostanos F2 en caninos clínicamente sanos de 1 a 7 años de edad

Media Mediana Desviación estándar Rango Mínimo Máximo

1 336,3 317,2 142,1 395,2 154,3 549,5

Edad en años 3 4 166,7 461,0 177,5 168,6 34,6 594,6 78,3 1198,5 116,7 154,3 195,0 1352,8

2 399,8 269,7 299,2 741,7 176,6 918,3

5 331,3 213,0 285,6 607,0 146,2 753,2

6 285,8 225,2 224,9 437,4 97,4 534,8

7 201,8 225,2 46,0 82,6 148,8 231,4

La presentación de valores extremos en el nivel de Isoprostanos se refleja en la dispersión de los datos de los grupos de 4 y 5 años, mientras que en el grupo de 6 años, la dispersión es producto del rango pues el valor mínimo es el más bajo de todo el grupo. Las medidas de tendencia central, media y mediana, sólo pueden considerarse representativas en los grupos de 1 y 3 años (Figura 29).

Figura 29. Variación de la concentración de Isoprostanos F2 entre caninos clínicamente sanos de 1 a 7 años de edad. El tamaño de las cajas muestra la variabilidad dentro de cada grupo etario.

Se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal Wallis para evaluar si las diferencias entre grupos etarios son estadísticamente significativas. El análisis señaló un valor de H=5,391 y p=0,4997, indicando que las diferencias no son significativas; posteriormente se realizó un test pareado de Mann-Withney para evaluar diferencias entre grupos de edad, indicando que tampoco hay diferencias significativas ya que en todos los casos el valor de p fue superior a 0,05 (Tabla 7). 57

Tabla 7. Resultados de la prueba pareada de Mann Withney mostrando que no hay diferencias significativas entre grupos etarios, todos los valores de p son mayores a 0,05 1 1 2 3 4 5 6 7

2 1

EDAD EN Aﾃ前S 3 4 5 6 0,1113 0,6228 0,5403 0,551 0,06619 0,3913 0,3913 0,551 0,8852 0,665 0,5959 0,8852 0,8597

7 0,136 0,136 0,3768 0,8597 0,8597 0,8248

6. DISCUSIÓN

Halliwell (1995), demostró que los radicales libres son productos continuos de las reacciones bioquímicas de los organismo animales, lo que se evidenció en el presente estudio porque en animales sanos, gerontes y patológicos, existieron niveles de isoprostanos, los cuales se producen preferentemente bajo condiciones de estrés oxidativo (Morrow, 1997), explicando los resultados en patológicos, principalmente, y gerontes.

Además, Chew (2000) reporta que no todos los individuos de la misma especie en presentan iguales niveles de isoprostanos porque existen condicionamientos de carácter genético y ambiental, llevando a que los proceso de estrés oxidativo no sea homogéneo en todos los seres vivos; lo expuesto, puede explicar que los pacientes 13 y 26 presentaran niveles más altos que el promedio normal.

En la investigación realizada por Ávila (2013) en pacientes caninos mayores de siete años, reporta que “los niveles de estrés oxidativo se ve reflejado en la edad del paciente, puesto que la edad es directamente proporcional al nivel de estrés oxidativo, es decir que entre más edad del paciente mayor será la concentración de isoprostanos”. Esto puede deberse a que el estrés oxidativo es un estado de desequilibrio entre los compuestos con poder oxidantes y los sistemas que defienden por procesos antioxidantes (Haliwell, 1995). En caninos menores de siete años sanos, no se pudo revisar la posible relación de edad y estrés oxidativo porque la proporción entre edades fue variada.

Por otro lado, Davi (1997), reporta que en un estudio realizado en pacientes hipercolesterolemicos en ratas usando los isoprostanos F2 como biomarcador de estrés oxidativo, los niveles resultaron significativamente altos, similar al estudio realizado por Velandia (2012), donde se encontraron niveles elevados de la concentración de F2 isoprostanos; en contraste, los individuos sanos, presentan niveles comparativamente más bajos (entre patológicos y sanos) mostrando que el 59

estrés oxidativo es un biomarcador sensible para la revisión clínica de la condición del estado de los individuos. Según Montuschi, et al, (2007) el estrés oxidativo se caracteriza por un desequilibrio entre el aumento de la exposición a los radicales libres y las defensas antioxidantes,

En cuanto a los resultados obtenidos por género, se obtuvo mayor concentración de F2-isoprostanos en machos con respecto a las hembras. Sobre esto, Vitale y Savioli (2010), descubrieron que las hormonas sexuales pueden influir en el estrés oxidativo, porque el estrés oxidativo mitocondrial es mayor en machos que en hembras debido a la diferencia en los valores de estrógenos el cual es mayor en hembras que en machos.

Por lo tanto, la mayoría de los individuos de la muestra tienen concentración de Isoprostanos F2 por debajo del promedio general, se observó que los valores de Isoprostanos más altos, se presentaron en pacientes que tenían alguna patología seguidos por los pacientes gerontes y los valores más bajos fueron los de pacientes clínicamente sanos. Se puede apreciar que los niveles de estrés oxidativo, es mayor en los machos con respecto a las hembras, ya que se tomó 50% de la población hembras y 50% de machos. Los rangos más amplios de concentración de Isoprostanos se encuentran en el grupo de pacientes patológicos seguido por los geriátricos.

Hay una concordancia entre diferentes autores en donde se reporta que los pacientes clínicamente sanos también van a presentar un nivel de estrés oxidativo en una menor cantidad, demostrando que los pacientes gerontes y patológicos van a presentar niveles altos ya que la reacción bioquímica de las células se altera dado que el metabolismo presenta un cambio aumentando el nivel de estrés oxidativo

7. IMPACTO

El Estrés oxidativo (EO) es una condición ampliamente descrita en la literatura médica; con un impacto significativo en el origen, desarrollo y perpetuación de estados patológicos; sin embargo hasta el momento en medicina veterinaria el conocimiento de dicha condición y sus consecuencias han sido escasamente valoradas y su evidente existencia e impacto se presumen y asumen por la extrapolación de reportes en medicina humana; la presente investigación abre las puertas a la evaluación objetiva y cuantitativa del EO en medicina veterinaria mediante la cuantificación de los niveles de F2 isoprostanos; los cuales podrán determinar los valores normales en pacientes caninos clínicamente sanos.

En la Clínica con el presente estudio se evidencio y se tomó como uno de los estudios más importantes en la cuantificación de este parámetro mediante la medición de IsoPs F en orina; y su importancia se refleja en la comparación realizada en las muestras poblacionales diferentes: sanos, gerontes y pacientes con diferentes patologías, en donde se evidencio diferencias significativas relacionadas con la edad y el estado de salud del paciente.

Tomando el presente estudio se dara continuidad del EO, sus causas, consecuencias, valoración y monitoreo; y de esta forma se contempla la posibilidad de desarrollar pruebas fácilmente repetibles, que permitan evaluar la tendencia de esta condición, en estados fisiológicos y patológicos. Generar un nuevo plan diagnóstico en donde se pueda identificar

la concentración de

isoprostanos F2 para que sea una práctica de rutina en la parte clínica de los médicos veterinarios donde se pueda usar de manera rápida, fácil y confiable; además abre puertas para nuevas investigaciones basándose en los resultados que arroje el estudio. Las pruebas mínimamente invasivas son de gran utilidad en la práctica clínica diaria, porque permiten una valoración eficaz y segura de

diferentes alteraciones; lo que a su vez repercute en un mejor proceso de abordaje al paciente en diferentes situaciones patol贸gicas.

8. CONCLUSIONES

Se logró determinar la variación de los niveles de isoprostanos F2 en orina de acuerdo al género ya que se encontró en el estudio que los niveles son mayores en machos respecto a las hembras.

Se logró determinar que si hay variación en los niveles de isoprostanos

F 2

respecto a la edad de los pacientes ya que se encontró como resultado que entre más edad tenga el paciente mayor será la concentración de estrés oxidativo, observando que los niveles de estrés oxidativo son directamente proporcionales a la edad del paciente. Además se pudo determinar la variación de los niveles de isoprostanos f2 en orina en pacientes clínicamente sanos menores de 7 años en donde se logró observar que si hay variación.

En la comparación de los estudios anteriores con relación a los caninos clínicamente sanos menores de 7 años se pudo observar que los niveles de estrés oxidativo son mayores en pacientes con alguna patología seguido de los pacientes gerontes y por último se encuentra la población estudio de esta investigación, dichos datos se usaron para establecer los niveles de isoprostanos F2 en orina en pacientes clínicamente sanos y menores de 7 años.

El EO es complemento esencial y necesario como lo es la etapa senil en cualquier especie animal, lo cual se pudo evidenciar en este estudio, dando así la eventualidad de realizar una nueva herramienta que permita la valoración del grado de estrés oxidativo en el cual se halla el paciente, dando al clínico de pequeños animales un mayor entendimiento de la situación.

9. RECOMENDACIONES

Realizar próximos estudios en donde se evalué nuevas variables como por ejemplo la concentración de isoprostanos de acuerdo a la raza, hábitos alimenticios, realización de ejercicio etc. Para asi poder lograr nuevos resultados en la investigación sobre el tema de estrés oxidativo.

Además se recomienda que se desarrolle un kit que pueda medir estos niveles que sea desarrollado en Colombia o simplemente que sea de un mayor acceso, ya que el utilizado en esta investigación es muy difícil de conseguir y así mismo complica un poco más la utilización como prueba paraclínica.

También recomiendo a la universidad que apoye los proyectos de investigación de los estudiantes ya que surgen buenas ideas de investigación que muchas veces no se pueden desarrollar por falta de presupuestos y patrocinios que al final pueden ser proyectos investigativos que pueden cambiar la visión de la medicina veterinaria usada y desarrollada en Colombia.

10.LITERATURA CITADA

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ANEXO

ANEXO 1. Numeración de muestras de todo el estudio (Sano[], geriátrico[] y enfermos[])

Está ndar 1 0.08 7 Está ndar 2 0.06 3 Está ndar 3 0.09 6 Está ndar 4 0.17 7 Está ndar 5 0.36 6 Está ndar 6 0.54 6 Está ndar 7 0.58 Está ndar 8 0.60 5

Diluyente De muestras 0.643

7 0,60 4

15 0,45 9

23 0,55 3

31 0,59 0

39 0,52 5

47 0,50 4

55 0,51 6

63 0,35 3

71 0,41 4

79 0,47 6

Diluyente De muestras 0.605

8 0,52 7

16 0,55 9

24 0,47 9

32 0,48 6

40 0,48 8

48 0,40 7

56 0,46 5

64 0,51 9

72 0,41 4

80 0,46 1

1 0.584

9 0,55 2

17 0,54 1

25 0,49 1

33 0,50 4

41 0,52 5

49 0,46 7

57 0,44 7

65 0,46 5

73 0,29 9

81 0,19 2

2 0.535

10 0,53 8

18 0,51 1

26 0,49 1

34 0,42 3

42 0,34 6

50 0,39 8

58 0,28 7

66 0,12

74 0,33 6

82 0,23 5

3 0.452

11 0,41 2

19 0,47 3

27 0,37 7

35 0,30 8

43 0,34 5

51 0,30 3

59 0,24 5

67 0,15 5

75 0,13 9

83 0,39

4 0.557

12 0,41 5

20 0,50 8

28 0,49 9

36 0,44 1

44 0,21 9

52 0,34 6

60 0,29 1

68 0,31 7

76 0,23 7

84 0,26 9

5 0.534

13 0,35 5

21 0,51 1

29 0,43 8

37 0,39 4

45 0,45 4

53 0,44 9

61 0,36 5

69 0,36 3

77 0,35 9

85 0,13

6 0.545

14 0,55 3

22 0,49 5

30 0,43 3

38 0,46

46 0,38 7

54 0,23 9

62 0,20 5

70 0,42 1

78 0,23 6

86 0,62 2