Evaluación del efecto antibacteriano in vitro de extractos etanolicos y cloroformicos de este by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE EXTRACTOS ETANOLICOS Y CLOROFORMICOS DE ESTEVIA (Stevia rebaudiana Bertoni), SOBRE SALMONELLA SPP.

EDUARD PIRACOCA LINARES

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011

EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE EXTRACTOS ETANOLICOS Y CLOROFORMICOS DE ESTEVIA (Stevia rebaudiana Bertoni), SOBRE SALMONELLA SPP.

EDUARD PIRACOCA LINARES

Trabajo de grado para optar el título de Médico Veterinario

DIRECTOR DE TRABAJO Dr. SANDRA PAOLA RODRIGUEZ COODIRECTORA DE TRABAJO Dr. CONSUELO GONZALEZ

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011

CONTENIDO

LISTAS ESPECIALES ...............................................................................................................................5 GLOSARIO.............................................................................................................................................8 RESUMEN ...........................................................................................................................................12 INTRODUCCIÒN..................................................................................................................................14 PLANTAMIENTO DE PROBLEMA.........................................................................................................14 OBJETIVOS ..........................................................................................................................................18 CAPITULO I .........................................................................................................................................19 MARCO REFERNECIAL ........................................................................................................................19 1.1.

ESTADO DEL ARTE ....................................................................................................................19

1.2.

MARCO TEORICO .....................................................................................................................23

1.2. 1. EL GÉNERO SALMONELLA .....................................................................................................23 1.2. 2. LA ESTEVIA (Stevia rebaudiana Bertoni) ...............................................................................39 1.2. 3. MARCO GEOGRAFICO Y CLIMATICO .....................................................................................43 1.2. 4. MARCO LEGAL .......................................................................................................................44 CAPITULO II ........................................................................................................................................45 METODOLOGIA ..................................................................................................................................45 2.1.

TIPO DE ESTUDIO ..................................................................................................................45

2.2.

DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................................................45

2.3.

UNIVERSO, POBLACION, MUESTRA Y UNIDADES EXPERIMENTALES ....................................46

2.4.

METODOS Y PROCEDIMEINTOS. ...........................................................................................47

2.4.1. Transporte y Preparación de extracto de Estevia(Stevia rebaudiana Bertoni) ....................47 2.4.2. Toma muestra y Aislamiento de Salmonella spp. ................................................................47 2.4.3. Determinación actividad antimicrobiana .............................................................................48 2.5.

DISEÑO O ANLISIS ESTADISTICO............................................................................................50

CAPITULO III .......................................................................................................................................51 ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS............................................................................................51 3. 1.

RESULTADOS .........................................................................................................................51

3. 2.

ANALISIS Y DISCUSION ..........................................................................................................55

CAPITULO IV ......................................................................................................................................58 CONCLUSIONES ..................................................................................................................................58 CAPITULO V........................................................................................................................................59 IMPACTO ............................................................................................................................................59 CAPITULO VI ......................................................................................................................................60 RECOMENDACIONES ..........................................................................................................................60 CAPITULO VII .....................................................................................................................................61 BIBLIOGRAFIA.....................................................................................................................................61 CAPITULO VIII ....................................................................................................................................69 ANEXOS ..............................................................................................................................................69

LISTAS ESPECIALES

INDICE DE TABLAS

pรกg.

Tabla 1: Actividad antimicrobiana de los extractos de Estevia.

Tabla 2: Actividad de antimicrobianos en el tratamiento control.

Tabla 3: Anรกlisis de varianza de etanol, cloroformo, grupo control

Tabla 4: Comparaciรณn de la actividad antimicrobiana de los extractos de Estevia (Stevia Rebaudiana Bertoni) y tratamiento control con las tablas de NCCLS

INDICE DE ANEXOS

Anexo I Diagrama Aislamiento De Salmonella Según ISO 6579: 2000

Anexo II Preparación Agua peptonada

Anexo III Preparación Salmonella Shigella Agar.

Anexo IV Preparación estándar 0,5 de Mc Farland

Anexo V Preparación Agar Müeller Hinton

Anexo VI Interpretación estándar del tamaño del diámetro de la zona de inhibición para Enterobacteriaceae (para ciertos discos de antimicrobianos apropiados para la prueba de Salmonella spp.

INDICE DE FIGURAS

Figura 1: Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni)

Figura 2: Localizaci贸n de Tunja

Figura 3: Actividad antimicrobiana de los extractos de Estevia

Figura 4: Actividad de antimicrobianos en el tratamiento control.

Figura 5: An谩lisis de varianza de etanol, cloroformo, grupo control

Figura 6: Actividad antimicrobiana de los 3 tratamientos sobre salmonella spp

GLOSARIO

Agente antimicrobiano: designa una sustancia natural, semisintética o sintética, que, en concentración in vivo, da muestras de actividad antimicrobiana (mata o inhibe el desarrollo de microorganismos). Se excluyen de esta definición los antihelmínticos y las sustancias clasificadas en la categoría de los desinfectantes o los antisépticos. Antibiograma: Perfil de sensibilidad de una bacteria a un conjunto de agentes antimicrobianos Antibiótico: Cualquier agente antimicrobiano producido por un microorganismo. Este inhibe el metabolismo y/o el crecimiento de un microorganismo y puede matarlo. Por ejemplo la penicilina del Penicillium notatum. En la naturaleza existe un gran número de antibióticos, pero solamente unos pocos son seguros para uso humano. Antimicrobiano: Cualquier sustancia natural, semi-sintética o de origen sintético que inhibe el metabolismo y/o el crecimiento de un microorganismo y puede matarlo. Autoridad Veterinaria: designa la Autoridad de un Miembro de la OIE que incluye a los veterinarios y demás profesionales y paraprofesionales y que tiene la responsabilidad y la capacidad de aplicar o de supervisar la aplicación de las medidas de protección de la salud y el bienestar de los animales, los procedimientos internacionales de certificación veterinaria y las demás normas y recomendaciones del Código terrestres todo el territorio del país. Aves de corral: designa todas las aves domesticadas, incluidas las de traspatio, que se utilizan para la producción de carne y huevos destinados al consumo, la producción de otros productos comerciales, la repoblación de aves de caza o la reproducción de todas estas categorías de aves, así como los gallos de pelea, independientemente de los fines para los que se utilicen. Brote: designa la presencia de uno o más casos en una unidad epidemiológica. Colonizadores: Microorganismos presentes en un huésped que no están causando un proceso infeccioso.

Concentración inhibitoria mínima: Es la concentración más baja de un agente antimicrobiano requerida para inhibir el crecimiento de un microorganismo. Control veterinario oficial: designa las operaciones por las que los Servicios Veterinarios, sabiendo dónde residen los animales y tras tomar las medidas pertinentes para identificar a su propietario o a la persona encargada de cuidarlos, pueden aplicar las medidas apropiadas de sanidad animal cuando es necesario. Esto no excluye otras responsabilidades de los Servicios Veterinarios, como, por ejemplo, la inocuidad de los alimentos. Desinfestación: designa la aplicación de procedimientos destinados a eliminar los artrópodos que pueden provocar enfermedades o ser vectores potenciales de agentes infecciosos responsables de enfermedades animales, incluidas las zoonosis. Enfermedad: designa la manifestación clínica y/o patológica de una infección. Enfermedad de declaración obligatoria: designa una enfermedad inscrita en una lista por la Autoridad Veterinaria y cuya presencia debe ser señalada a esta última en cuanto se detecta o se sospecha, de conformidad con la reglamentación nacional. Enfermedad emergente: designa una infección nueva consecutiva a la evolución o la modificación de un agente patógeno existente, una infección conocida que se extiende a una zona geográfica o a una población de la que antes estaba ausente, un agente patógeno no identificado anteriormente o una enfermedad diagnosticada por primera vez y que tiene repercusiones importantes en la sanidad de los animales o la salud de las personas. Estándar de McFarland: El Estándar 0,5 de McFarland corresponde a aproximadamente 1,5 × 108 CFU/mL. Es usado cuando se ajustan suspensiones del inóculo para pruebas de susceptibilidad. Microorganismos Fastidiosos: Se refiere a los microorganismos que requieren de nutrientes o condiciones ambientales especiales para su crecimiento. In vitro: En el laboratorio.

MicroScan: Es un equipo comercial automatizado utilizado rutinariamente en muchos laboratorios de microbiología para la identificación y pruebas de sensibilidad para bacterias de crecimiento rápido NCCLS: El Instituto para la normatización de Laboratorios Clínicos anteriormente conocido como El Comité Nacional para la Normatización de Laboratorios Clínicos (NCCLS) es una organización sin fines de lucro, con miembros representando a varias disciplinas. Es una organización educativa que enseña a través de foros el desarrollo, promoción y uso de normas nacionales e internacionales relacionadas con las pruebas de susceptibilidad, su uso apropiado y la interpretación de los resultados. Plan de bioseguridad: designa un plan en el que se identifican las vías posibles de introducción y propagación de una enfermedad en una zona o un comportamiento y se describen las medidas que se aplican o se aplicarán, siempre que proceda, para reducir los riesgos asociados a dicha enfermedad. Prueba de difusión (Kirby-Bauer): Es un tipo de prueba de sensibilidad en la cual se utilizan discos de papel filtro impregnado con varios agentes antimicrobianos y colocados sobre la superficie de una caja o placa Petri con agar, previamente inoculada con la bacteria del paciente. Después de una noche de incubación, las zonas de inhibición alrededor del disco son medidas e interpretadas como sensible, intermedio o resistente (basada en criterios preestablecidos). PSA: Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Punto de corte (limite): Asociado con el “criterio interpretativo” de las tablas del NCCLS de los valores en la CIM y pruebas de difusión para distinguir entre sensible, intermedio y resistente. Recuento de colonias: Número de colonias que crecen en un medio de cultivo luego de colocar el espécimen en el agar. Cada colonia se forma a partir de una única bacteria a menos que ellas se desarrollen en grupos o cadenas. Reporte selectivo: Es reportar la prueba de susceptibilidad basada en la identificación del organismo, su perfil completo de susceptibilidad y el sitio que presenta infección en el paciente. Agentes antimicrobianos secundarios (amplio

espectro, drogas más costosas o más tóxicas) son reportados únicamente si ellos ofrecen ventajas clínicas o si el organismo es resistente a los agentes primarios. Resistente: Es un término terapéutico, resistencia significa que un microorganismo no es inhibido por una concentración del agente antimicrobiano que puede alcanzar en un fluido del cuerpo luego de una dosis estándar terapéutica. RCP: Reacción en cadena de la polimerasa. Esta reacción permite la detección e identificación de los microorganismos mediante la amplificación de secuencias de ADN, únicas en cada microorganismo. Susceptible (sensible): En términos terapéuticos sensible significa que un microorganismo es inhibido por una concentración del agente antimicrobiano que puede alcanzar en un fluido corporal luego de una dosis terapéutica. Tamizaje de sinergia: Esta prueba detecta la resistencia de alto nivel de los aminoglucósidos (a gentamicina y/o estreptomicina) en enterococos y determina si los aminoglucósidos actuarán sinérgicamente en combinación con un agente activo contra la pared celular. UFC (unidad formadora de colonias): Una unidad formadora de colonia se asume que se forma a partir de una bacteria. Vitek: Vitek Equipo automatizado, ampliamente utilizado en muchos laboratorios de microbiología para la identificación y pruebas de sensibilidad de bacterias de crecimiento rápido. Zoonosis: designa cualquier enfermedad o infección que puede ser transmitida naturalmente por los animales a las personas.

RESUMEN

Varios serotipos de Salmonella entérica se encuentran entre los patógenos zoonóticos más importantes causantes de enfermedades transmitidas por los alimentos alrededor del mundo, siendo especialmente las aves y sus subproductos uno de los mayores vehículos de contagio de Salmonelosis a los humanos.

Por lo tanto el objeto de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro de extractos etanòlicos y clorofórmico

de la Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni)

sobre

salmonella spp. aislada de 15 muestras tomadas con hisopos cloacales en ponedoras comerciales clínicamente sanas. En cada una de las muestras se obtuvo un aislamiento de salmonella spp. El método

que se utilizo para el

aislamiento de la salmonella spp. es fue el descrito en la norma ISO 6579:2002, para comprobar la sensibilidad se evaluó según el método descrito por BauerKirby, mostrando halos de inhibición en promedio de 7.3mm en el extracto de cloroformo y 5.6mm en el extracto de Etanol, los antimicrobianos usados tratamiento control la ampicilina (22.75mm), la tetraciclina (6.75mm) y el Trimetoprim / sulfa (16mm). Con los resultados arrojados en el presente trabajo de investigación se concluye que para estos dos tipos de solventes usados en los extractos de Estevia (Stevia Rebaudiana Bertoni), no presenta

efecto sobre la

Salmonella sp.

Palabras Claves: salmonella, Estevia, Extracto vegetal, actividad antimicrobiana

ABSTRACT

Several Salmonella enterica serotypes are among the pathogens most important causes of zoonotic diseases transmitted by food around the world, being especially birds and their products a major vehicle of transmission of Salmonella to humans. Therefore the aim of this study was to evaluate the effect in vitro ethanol and chloroform extracts of

Stevia (Stevia rebaudiana

Bertoni)

on Salmonella spp. Isolated from 15 samples taken cloacal swabs in clinically healthy commercial Salmonella spp. the

layers. in

each

method

that

one

sample was

was

obtained isolation of

used for

the

isolation

of Salmonella spp. it was described in ISO 6579:2002 to check the sensitivity evaluated according to the method described by Bauer-Kirby, showing halos inhibition averaged 7.3mm in ethanol extract, antimicrobial

the chloroform

extract and 5.6

use the control treatment

ampicillin

mm in (22.75mm),

tetracycline (6.75mm) and trimethoprim / sulfa (16mm). With the results obtained in this work

was

concluded

that for

these

two

types of

solvents

used

in extracts of Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni), no effect on Salmonella sp. Key words: salmonella, stevia, vegetable extract, antimicrobial activity

INTRODUCCIÒN

Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza,

encentrándose como comensales y patógenos en el tracto

gastrointestinal de mamíferos domésticos y silvestres, reptiles, aves e insectos, causando

amplio

espectro

enfermedades

sus

hospederos,

considerándose como la principal enterobacteria de importancia en salud pública. (Saravia, 2008)

Para el caso de Latinoamérica y especialmente para Colombia la investigación acerca de Salmonella spp. se ha centrado en relación con las enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha investigado con respecto a la problemática que presenta la resistencia bacteriana y los tratamientos no efectivos tanto en las explotaciones avícolas como en los humanos, sin embargo

a pesar que las autoridades reguladoras del medio

ambiente reconocen el problema zoonótico que representan esta patología, las investigaciones en el área biológica y veterinaria son insuficientes. (Hurtado, 2001).

Es tanto así que en las granjas avícolas usualmente no producen enfermedad clínica en las aves sino un estado de portador asintomático; y a veces ocasionalmente pueden observarse signos clínicos (paratifosis aviar) que incluyen depresión, anorexia y diarrea; en pollos jóvenes se han reportado lesiones como pericarditis fibrinosa, aerosaculitis, perihepatitis, peritonitis e impactaciones cecales; en hembras con infección ovárica, los huevos se encuentran frecuentemente dañados, descoloridos y congestionados. Las hembras infectadas producen ocasionalmente huevos infectados, pero bajo condiciones de estrés los animales pueden excretar más Salmonellas y la frecuencia de infección de los huevos aumentan

y usualmente

llega esta enfermedad a los

consumidores

humanos; de igual forma los huevos pueden contaminarse por transmisión vertical (transovárica), en el momento de la postura o durante la manipulación o el almacenamiento. (Breuil, 2000)

Por otro lado los antibióticos

que se utilizan en la cría de pollos con fines

terapéuticos, profilácticos y como promotores de crecimiento, han inducido una selección de bacterias resistentes a los antibióticos en la flora intestinal, incluyendo a Salmonella spp. (Oliveira y col, 2006). En los últimos años, se han detectado cepas de Salmonella spp. multirresistentes a los antibióticos, especialmente la clona de Salmonella serotipo Typhimurium (DT104), que presenta resistencia a ampicilina, Cloranfenicol, estreptomicina, sulfametoxazol y tetraciclina

en algunos países latinoamericanos productores de huevo y pollo

como México, Venezuela y Colombia (Gebreyes y Thakur, 2005) .

Por lo anterior, y debido a la continua presencia de estos microorganismos en los las producciones avícolas se conduce a buscar alternativas de inhibición y eliminación con una mayor posibilidad de aplicación como pueden ser las sustancias de origen natural tales como extractos y aceites vegetales, los cuales pueden llegar a poder efectos como antimicrobianos, fungicidas, insecticidas y plaguicidas.

Es el caso de la Stevia rebaudiana Bertoni, que se le ha reportado como poseedora de características antimicrobianas, antifúngicas y fitoterapéutica, las cuales la hacen una especie promisoria para su uso en actividades farmacéuticas, uso en el sector agrícola y la preservación de los alimentos para evitar la proliferación de microorganismos causantes de enfermedades. Esto con lleva a la realización de una investigación con el propósito de evaluar la actividad bactericida del extracto Estevia sobre la salmonella spp.

Para tan fin, se llevara a cabo el aislamiento de enterobacterias del género salmonella, mediante el hisopado cloacal en gallinas comerciales, utilizando la norma 6579:2002 para su cultivo y finalmente probando la sensibilidad ante los extractos según el método de difusión en disco descrito por Kirby y Bauer, para posteriormente reconocer su valor zoonótico y lograr con la investigación hacer un aporte sustancial en cuanto a los riesgos biológicos y epidemiológicos de importancia en salud publica en la región.

PLANTAMIENTO DE PROBLEMA

DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA En muchos países se ha encontrado una alta proporción de cepas de Salmonella spp, con resistencia múltiple en producciones animales (Acha P, 2001 y Breuil J, 2000), y cuya

principal causa es el excesivo uso de antimicrobianos

en las

raciones de animales, como promotores de crecimiento, también el tratamiento indiscriminado en animales por prescripción médica y veterinaria (Phillips, 2004 y Shea et al, 2004), por el cual se siguen presentando un incremento mundial en los casos, convirtiéndose así en gran impacto económico e importancia en salud pública y salud animal, tanto que en el 2006, se notificaron más de 192.000 casos en humanos y, probablemente, muchos más sin informar. (Saravia, 2008). Este caso se ve especialmente en las producciones avícolas ya que es el principal reservorio de salmonella, y debido a la alta presencia de resistencia bacteriana, se producen en las explotaciones una morbilidad y mortalidad hasta del 50%, generando grandes pérdidas económicas, debido al alto costo de los tratamientos y poco eficientes. Teniendo en cuenta lo anterior

es indispensable

realizar

investigaciones encaminadas a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas a partir de fuentes naturales para evitar que se sigan presentando resistencia en las bacterias normalmente en las producciones.

que se encuentran presentes

Para tal fin, es necesario

conocer las

propiedades antimicrobianas que posee la Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni) sobre la salmonella spp. ya que anteriormente se le han realizado estudios en donde se le descubrieron

efectos sobre algunas bacterias patógenas como la

Escherichia coli, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (Sumit et al 2008) causantes de las toxiinfecciones por Enfermedades Transmitidas por Alimentos( ETA), siendo de vital importancia ya que se requiere brindarle a los productores nuevas alternativas de bajo costo, de fácil acceso.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extractos etanòlicos

y clorofórmicos

de Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni), sobre salmonella spp.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Analizar la efectividad del aislamiento de salmonella spp. por

hisopos

cloacales en ponedoras comerciales.  Determinar

si la muestra de ponedoras comerciales que se estudiaran

son portadoras asintomáticas o no de salmonella spp.  Analizar de forma comparada la actividad del extracto de Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni), y de los antimicrobianos (ampicilina, tetraciclina y Trimetoprim/sulfa) usados como control en este trabajo sobre la salmonella spp.

CAPITULO I

MARCO REFERNECIAL

1.1.

ESTADO DEL ARTE

Para la realización del estado del arte del este trabajo de investigación se realizo teniendo en cuanta dos parámetros como lo son la susceptibilidad de la salmonella spp. a antimicrobianos y la Estevia como antimicrobiano.

En estudios realizados por mantilla et al 2010 en el cual estudio 20 cepas de salmonella

del grupo D aisladas en ponedoras comerciales, se determino la

resistencia total frente a estreptomicina con 20 cepas resistentes (100%), tetraciclina con 18 (90%), florfenicol con 13 (65%), y una menor resistencia a productos como fosfomicina más tilosina en donde no se presentaron cepas resistentes, mientras la combinación fosfomicina más fructuosa obtuvo 2 cepas resistentes (10%) y fosfomicina sola mostró una cepa resistente (5%).

De igual forma Ruiz et al 2006, midieron la susceptibilidad in vitro de 30 cepas de salmonellas provenientes de

aves clínicamente sanas, instalaciones, equipos,

aguay alimentos, en granjas

de ponedoras comerciales del departamento de

Antioquia, en donde encontraron resultados del 100% en todas las cepas que fueron evaluados con antimicrobianos pertenecientes a los grupos de los betalactámicos,

los

carbapenémicos,

ureidopenicilinas,

quinolonas,

aminoglucósidos y fenicoles.

El estudio que realizo Camacho et al 2010 en donde se estudio la resistencia en 152 aislamientos en vísceras de pollo en Sonora Mexico a 18 antibióticos por el método de difusión en disco, donde se observó mayor resistencia en la cefalotina

(41%), amoxicilina/ acido clavulánico (38%), cefoxitín (36%), y ampicilina (26%). El 71% de las cepas estudiadas fueron resistentes a un antimicrobiano y el 17.1 % fueron resistentes al menos a 4 antimicrobianos.

Sin embargo en

la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos, la

implementación de modelos farmacodinámicos es una herramienta útil para el análisis de los compuestos naturales potencialmente activos, estos se deben construir cuidadosamente para poder generar datos en estudios in vivo e in vitro y así pueden generar ideas en la dinámica de las poblaciones bacterianas que son la base del surgimiento de la resistencia bacteriana (Campion et al. 2005).

Una de esas plantas es la Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni), la cual se han practicado diferentes estudios para descubrir sus propiedades químicas, bioquímicas y farmacéuticas.

Esmat y ferial, 2009 estudiaron extractos en seis diferentes solventes (acetona, cloroformo, hexano, metanol, acetato etílico y agua) de Estevia (S. rebaudiana Bertoni) sobre cepas de Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli,

mostrando que el extracto de

metanol tiene el mayor potencial antibacteriano para las cepas de L. monocytogenes, S. aureus, P. aeruginosa y B. cereus seguido de extracto de acetona con las mismas cepas. Por otra parte, las hojas extraída por el cloroformo y el hexano afectados sólo en P. aeruginosa. A diferencia de las otras hojas extraídas (por el acetato de etilo y agua) no afectó a las cepas estudiadas.

Sumit et al 2008 evalúo extractos utilizando seis solventes (el agua, etanol, éter de petróleo, ciclo hexano, la acetona y el cloroformo) todos al grado de HPLC. de Estevia (S. rebaudiana B). cultivos microbianos

frente a 10 bacterias obtenidas de la colección de

(CMCM)

en Chandigarh India,(Escherichia coli, Bacillus

subtilis, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Streptococcus Mutans) usando el método de difusión en disco. Obteniendo que

el extracto de éter de petróleo mostro en el halo de

inhibición (16,3 mm) contra todos los patógenos que significa su alta potencialidad antimicrobiana, pero el etanol y ciclo-hexano con (5,0 mm) demostrando ser menos efectiva.

Debnath en el 2008, evaluó el cultivo in vitro de Estevia (S. rebaudiana Bertoni) por segmentos nodales con yemas axilares y la actividad antimicrobiana in vitro y in vivo de utilizando para el extracto tres solventes (agua destilada, cloroformo, alcohol metílico),

sobre algunas bacterias provenientes de un banco de

microorganismos en Imtech (E. coli, B. subtilis, S. Mutans, S. aureus) utilizando el método de difusión en agar. Los resultados que encontró fue que el extracto metanólico fue el más eficaz contra todas las bacterias S. aureus (9mm), S. Mutans (12mm), B. subtilis (3mm) y E. coli(4mm), se guido del extracto en cloroformo. Tadhani et al 2006, evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de las hojas Estevia (Stevia Rebaudiana Bertoni), los solventes que uso para realizar los extractos fueron el

agua, metanol, acetato de etilo y hexano y se examinaron sobre

microorganismos

como Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus

luteus, Serratia marcenscens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Proteus vulgaris, y levaduras como: Aspergillus niger y Rhizopus. Oligoporus.

Los resultados que obtuvo fue que el extracto de metanol dio la

mayor zona de inhibición frente a P. aeruginosa, mientras que la zona de mínimo de la inhibición se encontró frente a S. aureus y levaduras. B. megaterium. Las levaduras resultaron ser altamente susceptibles a los extractos de acetato de etilo y hexano, respectivamente, extracto hexánico mostró la mayor actividad frente a levaduras entre los microorganismos ensayados. Yuvaraj et al 2010,

examino cuatro solventes (acetato de etilo, acetona,

cloroformo, agua), sobre

alguno agentes patógenos como Staphylococcus

aureus, Salmonella typhii, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aeromonas. Hydrophila y Vibrio cholerae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes y Epidermophyton,

con el fin de evaluar la

efectividad de la Estevia (S. rebaudiana Bertoni) sobre estas bacterias, levaduras y la actividad antifúngica. Para la elaboración del extracto utilizo 25grs de polvo seco de las hojas y lo sumergió en 100ml del solvente, dejándolo por 48 horas a 150 rpm en un agitador, La suspensión se filtra y se concentra a sequedad a 40 º C en horno de aire caliente. El extracto se disolvió en 0.25% dimetil sulfóxido (DMSO, Merck) a una concentración de 100 mg / ml. Para el ensayo antimicrobiano utilizo el método de difusión en disco. Los resultados que obtuvo fue que entre los cuatro extractos probados, extracto de acetona tenía un potencial antibacteriano eficaz sobre Gram positivos que negativos, seguida del extracto acetato de etilo. Los extractos de cloroformo y el agua fueron poco eficaces o ineficaces contra los organismos de prueba, respectivamente Todos los extractos fueron activos contra las especies Epidermophyton y Candida albicans. Por último Jayaraman et al 2008, evaluó la actividad antimicrobiana y antitumoral de extractos con cuatros solventes (acetato de etilo, acetona, cloroformo y el agua) de hojas de Estevia (S. rebaudiana Bertoni), sobre bacterias (S. aureus, S. typhi, E. coli, B. subtilis, A. hydrophila y Vibrio cholerae) utilizando el método de difusión en agar, las levaduras y hongos fueron Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes y Epidermophyton para esta utilizo el agar papa dextrosa y para el ensayo antitumoral lo realizo con células humanas epithiloma laringe (HEp2). Los resultados fueron los mismos que obtuvo Yuvaraj et al 2010.

1.2.

MARCO TEORICO

1.2. 1. EL GÉNERO SALMONELLA

El género Salmonella recibe su nombre en honor al microbiólogo americano Daniel Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes descubrieron los gérmenes designados como salmonellas, en 1885, aislándolos de cerdos con cólera (Stanchi, 2007)

Salmonella spp. es la Enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pública por producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino en todas las especies animales (Lujan y Blas, 2007; Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979,)

Los microorganismos del género Salmonella sp. están extensamente diseminados en la naturaleza como comensales y como patógenos del aparato digestivo de los mamíferos domésticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonellas son potencialmente patógenas (Stanchi 2007; Smith et al. 1952; Mahajan et al. 2003) al ser parásitos intracelulares y por medio de los macrófagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo afectado aprovechando la vía linfática y sanguínea (Stanchi, 2007; Suter, 1956; Smith et al. 1952).

En medicina humana están descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre entérica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda, subaguda y crónica, y abortos en diferentes especies animales (Stanchi, 2007). Las diversas especies de salmonellas se transmiten por

contacto tanto con enfermos como con portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida por este agente microbiano tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados con el patógeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminación ambiental es invariablemente la materia fecal (Stanchi 2007; Smith et al. 1952). Caracterización morfológica y bioquímica Los miembros del género Salmonella son bacilos Gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5μm,no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados (Terragno et al, 2003);generalmente móviles por flagelos perítricos con la excepción de Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente (Stanchi2007, Terragno et al, 2003).

Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo; fermentan glucosa con producción de ácido y gas (excepto S. typhi), también fermentan L-arabinosa, maltosa, Dmanitol, D manosa, L-ramnosa, Dsorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcitol (Terragno et al, 2003).

Son oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges- Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo, producen H2S, son urea negativo, lisina ornitina y descarboxilasa positivo (Terragno et al, 2003). Entre otras características bioquímicas se encuentran la reducción de nitratos a nitritos, no desaminan la fenilalanina y son tetrationato reductasa (Jawetz, et al, 2005).

Las salmonellas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubación por 18 a 24 horas a 32oC son de 2 a 3 mm de diámetro salvo algunos serotipos que producen colonias pequeñas; con algunas excepciones no presentan cápsula (Suter 1956; Smith et al.1952). Los miembros del género Salmonella crecen en un amplio rango de temperaturas (7 - 28oC), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son incapaces de tolerar altas

concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada durante periodos prolongados (Jawetz et al. 2005). Clasificación taxonómica

La más reciente clasificación del género Salmonella está basada en estudios realizados sobre la base de técnicas de hibridación del DNA de la bacteria y se ha concluido que éste está conformado por dos especies:

1) Salmonella entérica, dividida en seis subespecies aisladas de:

a. Subespecie I. S. enterica subsp. enterica: Humanos y Animales de sangre caliente b. Subespecie II. S. enterica subsp. salamae: Animales de sangre fría y del ambiente. c. Subespecie III a. S. enterica subsp. arizonae: Animales de sangre fría y del ambiente. d. Subespecie III b: S. enterica subsp. diarizonae. Animales de sangre fría y del ambiente. e. Subespecie IV. S. enterica subsp. houtenae. Animales de sangre fría y del ambiente. f. Subespecie VI. S. enterica subsp. indica. Animales de sangre fría y del ambiente.

2) Salmonella bongori. Subespecie V: No constituye un patógeno para los humanos, pero si ha sido implicada en ciertas patologías en animales (Grimont y Weill; 2007; Stanchi 2007; Farmer 2003 y Terragno et al 2003Popoff y Le Minor, 1992). Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonellas según su hibridación de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se encuentran constituidas por más de 2400

variedades serológicas, determinadas según las distintas asociaciones de los antígenos somáticos O y flagelares H (Stanchi, 2007). También puede hacerse una clasificación de las salmonellas desde el punto de vista epidemiológico en tres grupos:

1) Sin ninguna afinidad por hospedador 2) Afectan únicamente al ser humano 3) Adaptadas a un hospedador animal únicamente (Stanchi 2007; Terragno et al 2003). Estructura antigénica

La estructura antigénica de Salmonella sp.

Es similar a la de otras

Enterobacterias, contando con la presencia de dos clases de antígenos principales: Antígenos O (somáticos) y Antígenos H (flagelares). En algunas cepas se encuentra un tercer tipo de Antígeno de superficie, análogo funcionalmente a los Antígenos K (capsulares) de otros géneros. Al estar este antígeno relacionado con la virulencia de las cepas se le denomina Antígeno Vi (Koneman y Allen. 1999), que puede interferir con la aglutinación por antisueros O y que se relacionan con invasividad (Jawetz et al, 2005).

a. Ag Somático (O de pared celular): Es un polisacárido, termostable, tipo específico, que se halla en todas las especies (Stanchi 2007). Se distinguen dos clases: mayores (determinantes del serogrupo) y menores (se hallan en algunas Salmonellas y serogrupos de éstas), son compartidos por diferentes serovares y no determinan los serogrupos (Stanchi 2007), aunque existen numerosos antígenos O, son los factores O principales los que sirven para caracterizar los diferentes tipos antigénicos. (Por ejemplo O4: se refiere al grupo B, O9: Grupo D, entre otros) (Muñoz et al. 2002). El complejo de antígenos O determina el subgrupo somático al que pertenecen los géneros de

Salmonella, sp., Arizona sp., Citrobacter sp., Escherichia sp., Providencia spp. Serratia sp. entre otros (Bayley y Schott, 1982).

b. Ag Flagelar (H): Es proteico y termolábil, constituido por flagelina, cuya composición en aminoácidos es constante para un tipo antigénico determinado (Bayley y Schott, 1982). Por lo general, los microorganismos que tienen este antígeno, poseen dos fases diferenciables por medio de aglutinación en tubo de ensayo (Stanchi 2007; y Terragno et al, 2003); esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase 1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria.

c. Ag capsular (K): Es un antígeno termolábil aunque existen pocas excepciones (Bayley y Schott, 1982); es llamado en Salmonella el Ag (Vi), que protege a la bacteria dándole resistencia antifagocìtica. La presencia de este antígeno hace imposible la aglutinación de sueros anti O, debido a que recubre toda la bacteria; en este caso, la cepa en estudio debe ser sometida a un calentamiento a 100oC durante 30 minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de aglutinación con el Ag somático correspondiente (Stanchi 2007; Terragno et al, 2003). De allí que la expresión de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresión tenga lugar. (Parra et al. 2002)

Transmisión

La enfermedad entra en la granja a través de la compra de nuevos animales, pudiendo permanecer dichas explotaciones infectadas durante años. El contagio se produce principalmente de forma directa a través de animales infectados por

vía oral (por contacto feco-oral), aunque también por vía aerógena (por aire) y conjuntival.(Stanchi, 2007)

En determinadas especies y tipos de animales se producen también transmisiones intrauterinas y transplacentarias. En aves, Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum son capaces de transmitirse transováricamente (a través de los huevos).(Parra et al. 2002).

Las infecciones por algunos tipos de Salmonella pueden ser indirectas y proceder del agua, del pienso y de las más variadas especies de animales (roedores, moscas y pájaros actúan como huéspedes reservorios).Los factores estresantes actúan de desencadenantes de la enfermedad. En general, muchos animales se convierten en portadores y pocos enferman. La contaminación de alimentos para el consumo humano se debe a deficiencias higiénico-sanitarias y de conservación, y puede darse durante la fase de la producción animal o durante la realización de los procesos culinarios.(Stanchi, 2007) Síntomas y Lesiones El periodo de incubación es variable. Suele durar varias semanas, aunque puede reducirse a pocas horas • Curso agudo: Normalmente se produce una evolución a forma crónica. Según los órganos afectados, el tipo de Salmonella y la especie animal, se pueden dar diarreas persistentes, afección de la parte superior del aparato respiratorio; inflamación de articulaciones, tendones, meninges, testículos, útero, y abortos. (Parra et al. 2002). • Curso crónico: Animales con grado severo de emaciación. Se observan focos necróticos (muerte de las células) e inflamación crónica (granulomas) en el hígado, riñón, bazo y pulmones.(Parra et al. 2002).

Patogénesis y patogenicidad

Todos los serotipos de Salmonella sp. conocidos son patogénicos para el hombre y los animales (Parker y Collier, 1990). La virulencia de la bacteria se relaciona con su capacidad de invadir las células hospedadoras, replicarse en su interior y resistir tanto la digestión por los fagocitos como la destrucción por la acción del complemento, lo cual facilita la difusión de las salmonellas en el organismo del hospedador (Quinn et al. 2002; Henrici 1999; Smith et al.1952).

El complejo proceso de invasión es mediado por los productos de la expresión de varios genes cromosómicos, mientras que la capacidad de crecer en el interior de las células hospedadoras depende de la presencia de plásmidos de virulencia (Vadillo et al 2002; Quinn et al, 2002; Smith et al1952.). Algunos factores que determinan el carácter patógeno de ciertas especies del género Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en las que se denominan genéricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patógenos pero que están ausentes o solo presentes de forma esporádica en las especies saprófitas (Vadillo et al2002; Terragno et al 2003).

Las células blancas revisten el último tramo del intestino delgado y el primer tramo del intestino grueso; si la célula blanca está “libre” con respecto al número de salmonellas, es posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del género Salmonellas segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan quela enfermedad generada sea diarreica o septicémica. Las cepas que producen diarrea se multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolábil) que altera la síntesis de los nucleótidos cíclicos, haciendo que el microorganismo invada la célula, ya en el interior, las Salmonellas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y líquido hacia la luz intestinal, lo que

a su vez ocasiona diarrea. (Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990). La gravedad de la enfermedad depende del número de células blancos afectados (Blaser y Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990). Diagnóstico Existe un gran número de métodos diagnósticos diferentes que pueden realizarse para la determinación de Salmonella sp., sin embargo, según la mayor parte de estudios realizados, el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente empleada para el aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico.

Ningún método cumple con todos los criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y algunas pruebas bioquímicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse también en los nuevos métodos de diagnóstico que están innovando para el aislamiento de Salmonella spp. mediante el uso de pruebas serológicas y moleculares como ELISA y PCR respectivamente; esta última tiene la capacidad de detectar un pequeño número de organismos del género Salmonella (102 a 104). Estos métodos arrojan resultados favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos (Ward et al 2005 y Terragno et al 2003).

Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio es variado: se enviará en caso de infección intestinal, muestra de heces; en enfermedad sistémica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estándar (Stanchi 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990). Además, es posible determinar la contaminación de alimentos y agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisión de una muestra al laboratorio para ser analizada convenientemente (Stanchi 2007); el diagnóstico incluye aislamiento, identificación bioquímica y Serotipificación de las cepas aisladas (Stanchi 2007, Luna 1991).

Métodos para el aislamiento de Salmonella sp.

Los métodos para el aislamiento de la bacteria están divididos en tres etapas sucesivas las cuales son: (1) Enriquecimiento No Selectivo, (2) Enriquecimiento Selectivo, (3) Siembra en Placa con medios sólidos selectivos y diferenciales.

Posteriormente se lleva a cabo el estudio de las características Bioquímicas de las colonias sospechosas en los medios adecuados para su identificación, y finalmente el Análisis Antigénico (Luna, 1991).  Preenriquecimiento en medio no selectivo: Se utiliza cuando la muestra en estudio ha sufrido un proceso de desecación o irradiación, cuando ha estado congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento puede determinar que las bacterias presentes en la muestra se encuentren en un estado semilatente y tiene como finalidad la revitalización de los microorganismos afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento, permitiendo que las células bacterianas comiencen el proceso de multiplicación normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que puedan llegar a ser tóxicas para estas bacterias “debilitadas”, sustancias que si están presentes en los medios selectivos de enriquecimiento.

Se realiza en caldo peptonado bufferado o lactosado al 0,2%, para incrementar la recuperación de especies de salmonellas deterioradas por técnicas de elaboración, preservación, preservantes, presión osmótica alta, cambios bruscos de pH, entre otros. (Luna 1991; Hurtado 2001).  Medios

enriquecimiento

selectivo:

realiza

caldos

enriquecimiento, los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella sp., e inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre

los caldos mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp. se encuentran:  Caldo selenito: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y el mecanismo de acción del selenito, es inhibir el crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y Enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de incubación. Salmonella sp., Proteus sp., y Pseudomona sp., no son inhibidos (Merck, 1994).  Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de salmonellas con excepción de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros materiales. Mediante la utilización de este caldo, es posible obtener algunas ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obteniéndose un rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43oC y previo enriquecimiento (Van Schothorst et al, 2004). El medio cuenta con una baja concentración de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para así obtener un mayor porcentaje de recuperación de Salmonella sp. Además la reducción del pH a 5,2 mejora la selectividad (Trichopoulos 1972; Iveson 1964).

 Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual

forma coliformes y otras bacterias acompañantes, sin alterar las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia obligatoria en el intestino (Palumbo y Alford, 1970)

 Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) según Hajna: Favorece la recuperación de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y

Salmonella sp., pues en su composición tiene triptona que actúa como nutriente en el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con acción bactericida para organismos Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer, evitando la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de productos metabólicos ácidos. Adicionalmente, la elevada concentración de manitol sobre la dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y Salmonella sp. (Hurtado, 2001)

Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectarla recuperación de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inoculó es pequeño (S. paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S. treforest, entre otras)(Van Schothorst, et al, 1977).  Medios de cultivos selectivos y diferenciales

Medios de cultivo selectivos: Son aquellos que permiten seleccionar ciertos microorganismos deteniendo el desarrollo de otros; esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como antibióticos, ciertos colorantes, sales biliares, etc.

a. Agar eosina azul de metileno (EMB): permite demostrar la presencia de enterobacterias patógenas y propiciar su aislamiento, sin embargo, no es confirmativo, solo permite una orientación al diagnóstico. El modo de acción del medio se basa en que sus componentes lactosa y sacarosa permiten diferenciar las enterobacterias de acuerdo con su capacidad de fermentarlos y por el aspecto y el color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben notablemente el desarrollo de gérmenes Gram Positivos. Las colonias de Salmonella sp. se observan en el medio incoloras o con tonalidad ámbar (Bonnie, 2001).

b. Agar MacConkey (McK), las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibición significativa sobre las bacterias Gram Positivas. La lactosa y el indicador rojo neutro permiten comprobar la degradación de ese disacárido; las colonias lactosa positivas (Escherichia coli) aparecen rojas con halo turbio; las lactosa negativas (Salmonella spp.) son incoloras (Stanchi, 2007).

c. Agar desoxicolato: es un medio altamente selectivo por ser el desoxicolato

sódico supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivos. Las colonias típicas de la Salmonella sp. son pequeñas, incoloras, elevadas y opacas; algunas cepas producen precipitado negro en el centro (Stanchi, 2007).

d. BD BBLTM CHROMagarTM Orientacion®: Medio de cultivo para el aislamiento e identificación de patógenos del tracto urinario. Permite la identificación de Escherichia coli, Enterococcus, grupos KES (Klebsiella Enterobacter. Serratia) y PMP (Proteus – Morganella - Providencia), Staphylococcus saprophyticus y Streptococcus agalactiae aunque requiere de pruebas confirmatorias.

Algunos de estos microorganismos producen enzimas para el metabolismo de lactosa, glucósidos o ambos. Otros organismos no producen ningún tipo de enzima, por ejemplo E. coli contiene enzimas para el metabolismo de lactosa pero

glucosidasa

negativo;

algunos

miembros

familia

Enterobacteriacea, como Salmonella sp. y algunos cocos Gram positivos son ! glucosidasa positivo pero no poseen las enzimas para la fermentación de la lactosa. Adicionalmente, la enzima triptófano deaminasa es típicamente encontrada en el grupo PMP. El medio contiene sustratos cromógenos que pemiten la diferenciación de los microorganismos mediante la degradación de enzimas específicas de cada uno(Bonnie, 2001; ISO, 2002). (Ver anexo 1).

Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioquímicamente las bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no la bacteria, y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna actividad enzimática que modifica su aspecto. En el proceso de recuperación de Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la observación de colonias características y propias de la bacteria (Stanchi, 2007).

Los medios más reconocidos para el aislamiento de Salmonella spp. son:

a. Agar Hektoen entérico: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, a partir de los más diversos materiales tales como heces y alimentos entre otros (Merck, 1994). Las colonias del género Salmonella se desarrollan con producción de ácido sulfhídrico (H2S) y un halo trasparente alrededor dando características de un “ojo de pescado” (Merck, 1994, Murray y Shea 2004). Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para enterobacterias Hektoen aun cuando posee suficiente efecto supresor de la flora acompañante, ejerce escasa inhibición de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo tanto, permite la obtención de altos rendimientos en estos gérmenes (King y Meztger 1968, Taylor y Schelhart 1971).

Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias

H2Spositivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompañante (Merck, 1994, Murray y Shea 2004).

b. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): Medio para el aislamiento y diferenciación de enterobacteriáceas patógenas, especialmente especies de Shigella sp. y Salmonella sp. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil; el desoxicolato genera la inhibición de bacterias coliformes y permite la dispersión de cepas de Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonella; adicionalmente, la diferenciación entre Salmonella sp. y Shigella sp. se da porque la primera produce fermentación de Xilosa, decarboxilación de Lisina y genera ácido sulfhídrico(Hurtado, 2001). La forma de acción del medio se basa en que la degradación a ácido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje del medio a amarillo, por el indicador rojo de fenol.

El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formación de ácido sulfhídrico por la precipitación de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo– purpúreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias (Merck, 1994, Murray y Shea 2004). Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o

sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH, ó a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más prolongada.

Las colonias de Salmonella sp. se observan con pigmentación rosa o roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras (Murray y Shea 2004). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes y del mismo

color que el medio de cultivo. Este género bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol; como tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina (Murray y Shea 2004).

a. Agar Salmonella – Shigella (SS):Es un medio selectivo y diferencial. La selectividad está dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de coliformes y el desarrollo invasor del Proteus sp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa y la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella spp, desarrolla colonias traslúcidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a causa de la producción de ácido sulfhídrico (Meljem, 1995, Murray y Shea 2004). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas (Murray y Shea 2004).

b. Agar verde brillante: Medió de enriquecimiento altamente selectivo y diferencial para el aislamiento de enterobacterias patógenas como Salmonella sp. a excepción de S. enterica serovar typhi y paratyphi A. En el medio la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el indicador de pH, que vira a amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares; el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el verde brillante actúa como agente selectivo. Las colonias de Salmonella sp. se observan con coloración rosa, blanca o transparente sobre un fondo rojo (Murray y Shea, 2004)

c. Agar bismuto sulfito: Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e identificación de Salmonella enterica serovar typhi y otras bacterias entéricas. El medio contiene peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato férrico y sulfito bismuto que actúa como inhibidor de la mayoría de organismos comensales. Las colonias típicas de Salmonella sp. pueden ser café, gris o negras con o sin brillo metálico, generalmente el medio circundante (halo) es café que posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro (Murray y Shea 2004).

d. AGAR XLT4® (DIFCO

): Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado

para el aislamiento e identificación de microorganismos del género Salmonella excepto S. enterica serovar typhi (Dush y Altwegg, 1955).El medio contiene peptona como fuente de nitrógeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la diferenciación de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la fermentación de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilación de la lisina y la producción de sulfuro de hidrógeno, la cual es detectada por la adición de iones férricos.

Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente desulfuro inorgánico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio y el rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las reacciones de fermentación y decarboxilación. Al medio base, es adicionado suplementó de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos diferentes a la Salmonella sp.

Las colonias típicas de la bacteria (H2S positivas), aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro después de 18 – 24horas de incubación. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de pigmentó negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, concentro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H2S negativas, aparecen de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayoría de las colonias de Citrobacter sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento.

g. BD BBLTM CHROMagarTM Salmonella®: Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificación presuntiva de especies de Salmonella spp, permitiendo la diferenciación de la enterobacteria de la flora acompañante dada la presencia de sustratos cromógenos en el medio. Los organismos Gram positivos son inhibidos como resultado de un medio base selectivo; adicionalmente cuenta con un agente antifúngico que previene el crecimiento de especies de Candida;

otros agentes antimicrobianos presentes en el medio de cultivo inhiben el crecimiento de Gramnegativos, microorganismos no fermentadores de lactosa y especies de Proteus.

Debido a diferencias metabólicas en la presencia de cromógenos seleccionados, las colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa – púrpura, mientras que los microorganismos pertenecientes a otros géneros se observan con pigmento verde– azulado, ó son completamente inhibidos (Gaillot, et al; 1999) 1.2. 2. LA ESTEVIA (Stevia rebaudiana Bertoni) Historia

Durante

siglos,

los guaraníes de Paraguay y Brasil usaron

el ka'ahe'ẽ como

edulcorante natural. El naturalista suizo Moisés Bertoni fue el primero en describir la especie científicamente en el Alto Paraná. Posteriormente, el químico paraguayo Ovidio Rebaudi publicó en 1900el primer análisis químico que se había hecho de ella. En ese análisis, Rebaudi descubrió un glucósido edulcorante capaz de endulzar 200 veces más que el azúcar refinado, pero sin los efectos tan contraproducentes que ésta produce en el organismo humano. La especie fue bautizada oficialmente por Bertoni en su honor como Eupatorium rebaudiana, o Stevia rebaudiana. (Cardoso, 1986).

A partir de ese momento, Moisés Bertoni comenzó una profunda investigación científica de la planta. Ya en el año 1900 solicita la colaboración de su amigo de nacionalidad paraguaya, el químico Ovidio Rebaudi. Tras los primeros estudios sobre sus principios y características químicas, el científico consiguió aislar los dos principios

activos,

conocidos

como

el "esteviósido"

y el

"rebaudiosido"

actualmente. Sin embargo, las dificultades para la germinación de las semillas hicieron que un intento de exportarlas a Gran Bretaña para cultivarlas

comercialmente

durante

la Segunda

Guerra

Mundial resultara

infructuoso.

(Cardoso, 1986)

Fueron la hija y el yerno de Bertoni, Vera y su esposo Juan B. Aranda, quienes comenzaron con éxito la domesticación del cultivo alrededor de 1964; el botánico japonés Tetsuya Sumida la introdujo cuatro años más tarde en Japón, que es hoy uno de los mercados principales del producto. En Paraguay el cultivo a gran escala comenzó en los años 1970, y desde entonces se ha introducido enArgentina, Francia , España, Colombia, Bolivia, Perú, Corea, Brasil, México, Esta dos Unidos, Canadá, y sobre todo en China, hoy el principal productor.(Cardoso, 1986)

Figura 1: la Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni)

Descripción Botánica: La Stevia rebaudiana pertenece a la familia Asteraceae es una planta herbácea perenne, tallo erecto, subleñoso, pubescente; durante su desarrollo inicial no posee ramificaciones, tornándose multicaule después del primer ciclo vegetativo, llegando a producir hasta 20 tallos en tres a cuatro años; puede alcanzar hasta 90 cm de altura en su hábitat natural y en los trópicos puede llegar a tener alturas superiores a 100 cm. 40

La raíz es, pivotante, filiforme, y no profundiza, distribuyéndose cerca de la superficie. La S. rebaudiana tiene hojas elípticas, ovales o lanceoladas, algo pubescentes; presentan disposición opuesta en sus estados juveniles, y alternas cuando las plantas llegan a su madurez fisiológica, previa a la floración. La flor es hermafrodita, pequeña y blanquecina; su corola es tubular, pentalobulada, en capítulos pequeños terminales o axilares, agrupados en panículas corimbosas (Shock, 1982). La planta es autoincompatible (protandria), por lo que la polinización es entomófila; se dice que es de tipo esporofítico y clasificada como apomíctica obligatoria (Monteiro, 1982).

El fruto es un aquenio que puede ser claro (estéril) u oscuro (fértil) y es diseminado por el viento (Gattoni, 1945). Se clasifica como una planta de día corto, situando el fotoperíodo crítico de 12 a 13 horas según el ecotipo. Existen otras especies como: Stevia eupotoria, S. obata, S. plummerae, S. salicifolia, S. serrata. En Ecuador se han determinado S. anisostemma, y S. bertholdii en Chimborazo e Imbabura: S. crenata; en Loja S. bertholdii; en Pichincha, S. anisostemma, S. crenata, S. dianthoidea., en Tungurahua S. tunguraguensis (Pérez, 2004)

Requerimientos Climáticos

La Estevia en su estado natural, crece en la región subtropical, semihúmeda de América, con precipitaciones que oscilan entre 1.400 a 1.800 mm., distribuidos durante todo el año, temperaturas que van desde los 24 a 28 oC y humedad relativa de 75% a 85%. Esta planta requiere días largos y alta intensidad solar (heliofanía). Los suelos óptimos para el cultivo de la Estevia, son aquellos con pH 6,5 - 7, de baja o nula salinidad, con mediano contenido de materia orgánica, de textura franco arenosa a franco, y con buena permeabilidad y drenaje. Esta planta no tolera suelos con exceso de humedad ni los de alto contenido de materia

orgánica, principalmente por problemas fúngicos que pueden causar grandes pérdidas económicas. (Pérez, 2004). Con respecto a los macro-nutrientes, los análisis realizados muestran principalmente exceso en fósforo, seguido por el nitrógeno y el potasio. En los micronutrientes los excesos más comunes son en el cobre y el hierro y en la localidad Cerecita el boro se encuentra en niveles de toxicidad (1,40 ppm). (Shock, 1982).

Propiedades

Algunos estudios indican su actividad antibiótica, en especial con las bacterias que atacan las mucosas bucales y los hongos que dan origen a la vaginitis en las mujeres. Por sus propiedades curativas, se utiliza también para contrarrestar la fatiga, y para combatir dolencias en el hígado, el páncreas y el bazo.

Así mismo, podría ayudar a individuos que padecen obesidad, a equilibrar o disminuir su ingesta calórica facilitando su lucha en la pérdida de peso. También podemos encontrar la Estevia en productos antienvejecimiento, como geles de baño, spray para cara e incluso en dentífricos. (Pérez, 2004). Se puede tomar en forma de fermentado natural, con un efecto antioxidante destacadísimo seis veces mayor que en el reputado te verde. (Haffner, 1993) En el Área Pecuaria

La Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni), dentro del campo animal y aplicando sus propiedades, tiene las siguientes utilidades: 

Saborizante de piensos (para animales de granja y domésticos)



Dentro de algunos estudios se la ha aplicado como alimento para animales en los que se ha visto el aumento de la producción, como en vacunos, cerdos y aves.



Estimula el apetito



Previene enfermedades reduciendo el uso de antibióticos



Mejora el sabor de la carne y su calidad (menor exudación y mejor conservación)



Disminuye la cantidad de huevos rotos en ponedoras



Previene la erosión y ulceración de la molleja en pollos (por el stress y exceso de producción de la histamina)

1.2. 3. MARCO GEOGRAFICO Y CLIMATICO

Tunja, capital del departamento de Boyacá, fue fundada en 6 de agosto de 1539 por el Capitán Gonzalo Suárez Rondón; guarda en sus construcciones coloniales la huella de la cultura española que conjuga con las raíces aborígenes. Limita al norte

con

los

municipios

Oicatá, Chivatá y Soracá,

de Motavita, Cómbita y Oicatá, al

sur

los

oriente

municipios

con de

Boyacá, Ventaquemada y Samacá, y al occidente con Samacá, Sora y Cucaita. La extensión territorial del distrito de Tunja, es de 118 km², de los cuales el 85% corresponde al área rural y el 15% al área urbana. La altura sobre el nivel del mar de la cabecera municipal abarca desde 2.650 msnm hasta 2.775 msnm, aunque en la jurisdicción rural del municipio la altura máxima es de 3.200 msnm en límites con el municipio de Cucaita. El Clima de Tunja es seco y frío de montaña. Cómo está en los trópicos tiene el mismo clima durante casi todo el año, sufriendo pocas variaciones de temperatura, la más significativa entre el día y la noche, dónde puede bajar hasta 8ºC o 9ºC y subir hasta 19ºC o 21ºC. El trabajo de investigación se desarrollara en las instalaciones de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, en el laboratorio de microbiología en el cual se llevara a cabo la extracción del extracto de la Estevia y se realizaran las pruebas

pertenecientes al aislamiento

de la salmonella spp. y posteriormente el

antibiograma. Figura 2: Localización de Tunja

Tunja

1.2. 4. MARCO LEGAL Dentro del marco legal se utilizaran las normas Técnicas Colombianas vigentes para la determinación de microorganismos en alimentos para el consumo humano como lo son: 

ISO 6579:2002 Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Método horizontal para la detección de Salmonella.



La Procesos Operativos Estandarizados ( POEs) del laboratorio, guía de seguridad y Buenas prácticas del laboratorio.

CAPITULO II METODOLOGIA

2.1.

TIPO DE ESTUDIO

Estudio Exploratorio

Este tiene el propósito de examinar un tema o problema de investigación poco estudiado, del cual se tienen muchas dudas o no se ha abordado con anterioridad. Sirve para familiarizarnos con este tipo de temas, obtener más información o de manera más completa, sobre un contexto particular, así como también nos permite investigar problemas del comportamiento humano que consideren cruciales los profesionales de determinada área, identificar conceptos o variables promisorias, establecer prioridades para investigaciones futuras, o sugerir afirmaciones o postulados verificables.

2.2.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Se utilizo para este trabajo el diseño de parcelas divididas, el cual es un diseño experimental combinado que resulta útil cuando al estudiar simultáneamente varios factores, alguno o algunos de ellos deben ser aplicados sobre unidades experimentales relativamente grandes, pudiéndose aplicar el otro o los otros en unidades experimentales menores, dentro de las unidades mayores. Para este caso se toma una población de 1500 aves, alojadas en un solo galpón, de las cuales se muestrean 15 aves de la producción, y se cultivaron el mismo número de muestras en el laboratorio de microbiología de la JDC con el objetivo

de aislar salmonella spp, una vez cultivadas se manejaron tres grupos los cuales se distribuyeron en el mismo número de tratamientos. En el primer grupo fue tratamiento con extracto de Estevia en Etanol a los 95%, el segundo con Cloroformo y el tercero con antimicrobianos utilizados comúnmente en el tratamiento de salmonellosis los cuales fueron Tetraciclina, ampicilina y Trimetoprim/Sulfa.

2.3.

UNIVERSO, POBLACION, MUESTRA Y UNIDADES EXPERIMENTALES

La población tomada para este estudio fue de 1500 aves, las cuales se ubicaban en la explotación ubicada en la vereda

el Salitre a 5 Km del municipio de

Arcabuco, esta consta de un solo galpón en piso, de la estirpe Lohmnan Brown. La superficie

por animal, comederos, bebederos,

están de acuerdo a la

reglamentación que existe actualmente en Colombia sobre bienestar animal. De donde se tomo una muestra de 15 animales con los siguientes parámetros de inclusion: 

Las aves deben estar clínicamente sanas



Tener una edad de 15 – 16 semanas



Presentar las plumas cerca de la cloaca con rastros de materia fecal.

2.4.

METODOS Y PROCEDIMEINTOS.

2.4.1. Transporte y Preparación de extracto de Estevia (Stevia rebaudiana Bertoni).

El material vegetal se obtuvo en una tienda naturista de la ciudad Tunja, las cuales se presentan en bolsas de 100 grs. La Estevia se trasporto al laboratorio de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos para elaborar el extracto así:

Procedimiento:

1) Se colocaron 100ml de los alcoholes etanol y cloroformo en un frasco con tapa

2) Se maceraron las hojas secas de Estevia (S. rebaudiana Bertoni) en un mortero hasta lograr que queden en partículas más pequeñas.

3) Se cogieron 5grs de Stevia previamente trituradas y se ponen en contacto duradero con el solvente.

4) Se dejaron a temperatura ambiente durante 2-14 días hasta el agotamiento de la droga vegetal.

5) Posterior a este tiempo la mezcla se filtra, el material insoluble fue lavado con el mismo solvente y los filtrados se mezclaron. (Gillessen,1998)

2.4.2. Toma muestra y Aislamiento de Salmonella spp.

Para la toma de la muestra se uso un hisopo estéril, el cual se introdujo en la cloaca del ave, luego se giro lentamente para tomar la muestra de fluidos. Luego 47

para el transporte de la muestra el hisopo se conservo hasta su recepción en el laboratorio en un tubo estéril que contiene 10 ml de agua peptonada. (Ver anexo 2) Todas las muestras se trasportaron al laboratorio de Microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos para su procesamiento el mismo día de la toma. Para realizar el cultivo de la salmonella spp. se utilizo la norma ISO 6579:2002 en el cual se utiliza como medio de enriquecimiento el Agar Salmonella-Shigella y agar XLT4 de la siguiente manera. (Ver anexo 3). En primer lugar se realizo el preenrequecimeinto no selectivo de las muestras en una dilución de 1:10 en agua peptonada incubando a 37 + 1 ºC durante 18 + 2 horas. Una vez que se incuban las muestras se transfirieren 100 uL de la muestra enriquecida, en tres gotas, en cada uno de los agares luego se incuba durante 24-48 horas a 35-37ºC. Se considerara muestras sospechosas aquellas que presentan halo en los puntos de incubación de la muestra

2.4.3. Determinación actividad antimicrobiana

Para evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos etanòlicos y clorofórmicos de Estevia se utilizo el método

disco difusión y antibiograma basados en el

trabajo de Kirby y Bauer, en 1966 de la siguiente manera: Para la elaboración de los discos estos se fabricaron con papel filtro y con la ayuda de una perforadora manual, los cuales se hicieron de 5mm de diámetro. Una vez que se obtiene los discos se coge el extracto y se lleva hasta ebullición dejando enfriar, con el fin de eliminar el exceso de alcohol en la solución. Luego se toma 5 ml del extracto y se vacío en una caja de petri para suspender en ella los discos de papel. En seguida se dejan secar a temperatura ambiente y se guardan hasta su uso.

La Preparación del inoculo se coloco entre 4 y 5 ml de suero fisiológico estéril en un tubo de ensayo. Se tomo un asa bacteriológica tres o cuatro colonias morfológicamente similares y se suspendieron en el tubo hasta alcanzar una turbidez comparable a la solución de Mc Farland 0.5. (Ver anexo 4). Luego de preparado el inoculo bacteriano con la cepa en estudio se procedió a Introducir un hisopo estéril en el inoculó bacteriano preparado, de manera que se humedezca completamente. Antes de retirarlo se escurrió sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de líquido del mismo.

Inmediatamente se siembra en el agar de Müeller- Hinton (MH) de manera que se obtuviera un crecimiento confluente, para lo cual se estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repitió el procedimiento rotando la placa 60° en dos oportunidades más. (Ver anexo 5). Se Dejo secar el agar entre 3 a 5 minutos, antes de colocar los discos con una pinza estéril tanto los hechos con el papel filtro que contienen los extractos (etanol y cloroformo)

como los Sensidiscos de los antimicrobianos

utilizados para el control (ampicilina, tetraciclina y Trimetoprim/ sulfa. Luego de estar sobre el agar estos presionaron levemente para que quedaran adheridos al mismo.

Una vez colocados los discos las placas se incubaron a 35ºC a 37°C en grupos no

mayores

cinco

placas

durante

horas.

Para

detectar

meticilinorresistencia las placas deben incubarse 24 horas completas. Las placas se colocaron en forma invertida para que el agua condensada no caiga sobre el agar, ya que cambiaría las condiciones del medio y por lo tanto no serviría para la lectura de los halos.

Los cultivos para antibiograma se relazaron por triplicado con un control que consiste en realizar un antibiograma con ampicilina, tetraciclina y Trimetoprim/

sulfa antibióticos utilizados comúnmente para el tratamiento de Enterobacterias spp.

Para la interpretación de resultados se hará de acuerdo a las tablas del Instituto para la normalización de Laboratorios Clínicos (NCCLS) (ver anexo 6), el cual definen tres categorías: resistente, intermedio, sensible y estas dependerá básicamente de los “breakpoints” o halos de inhibición que se mide en mm, estos permiten una categorización como sensible, resistente o intermedio.

2.5.

DISEÑO O ANLISIS ESTADISTICO

El método estadístico que se uso para el análisis de los resultados fue el análisis de varianza de un factor (ANOVA) esta es una potente herramienta estadística, de gran utilidad tanto en la industria, para el control de procesos, como en el laboratorio de análisis, para el control de métodos analíticos. Los ejemplos de aplicación son múltiples, pudiéndose agrupar, según el objetivo que persiguen, en dos principalmente: la comparación de múltiples columnas de datos y la estimación de los componentes de variación de un proceso. Las siguientes son las tablas en las que se reunieron todos los resultados de este estudio de investigación.

CAPITULO III ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS

3. 1.

RESULTADOS

De acuerdo con las tablas y gráficos siguientes podemos dar los resultados para este trabajo de investigación así: Tabla 1 :Actividad antimicrobiana de los extractos de Estevia ( zona de Inhibición en mm)

Extractos Etanol al 95% Cloroformo

Disco 01 6 mm 9mm

Halos de inhibición (mm) Disco 02 Disco 03 Disco 04 Disco 05 7mm 7mm 7mm 7mm 8mm 6mm 6mm 9mm

Disco 06 6mm

Figura 3: Actividad antimicrobiana de los extractos etanólico y clorofórmico (zona de Inhibición en mm)

de Estevia

10 8 6

Etanol al 95%

Cloroformo

2 0 Disco 01 Disco 02 Disco 03 Disco 04 Disco 05 Disco 06

En la grafica 3 y la tabla 1 se observan los efectos a los tratamientos con los extractos de etanol y el cloroformo medido como halo de inhibición sobre la salmonella spp, La grafica nos muestra que el extracto de cloroformo fue más efectivo que el del etanol al 95 % ya que halo de inhibición fue mayor. Cuando se le realizo

el análisis de varianza

de factor

observo que entre

estos dos

tratamientos el que obtuvo menor variabilidad fue también el cloroformo con un 2.26, en cambio el del etanol fue 7.86.

Tabla 2: Actividad de antimicrobianos en el tratamiento control. Antimicrobiano Ampicilina Tetraciclina Trimetoprim/ Sulfa

Disco 01 23mm 7mm 16mm

Halos de inhibición (mm) Disco 02 Disco 03 Disco 04 22mm 23mm 23mm 7mm 6mm 7mm 16mm 16mm 16mm

Figura 4: Actividad de antimicrobianos en el tratamiento control. (Z. de Inhibición en mm)

25 20 Ampicilina

Tetraciclina

Trimetropin/ Sulfa

5 0 Disco 01

Disco 02

Disco 03

Disco 04

En la tabla 2 y figura 4 se pueden evidenciar los 3 antimicrobianos utilizados para el tratamiento control, los cuales nos muestran como se comportaron frente a la salmonella spp, obteniendo en los tres casos datos diferentes al medir el halo de inhibición, dejar ver que la ampicilina

con un promedio de 22.7 mm y

Trimetoprim/ sulfa con 16 mm siguen teniendo una alta efectividad ante esta clase de bacteria, en cambio la tetraciclina con unos 7.6 mm mostro resultados por debajo de lo mostrado por los dos antibióticos anteriores.

Estos resultados se

pueden ver reflejados para este caso porque en la región el antimicrobiano de elección para toda clase de infecciones es la tetraciclina por su fácil acceso y su bajo costo en el mercado.

Tabla 3: Análisis de varianza de etanol, cloroformo, grupo control Tratamientos

Cuenta

Suma

Promedio

Varianza

Etanol al 95%

5,67

7,867

Cloroformo

7,3

2,267

Ampicilina

22,75

0,25

Tetraciclina

6,75

0,25

Trimetoprim/ Sulfa

Figura 5: Análisis de varianza de etanol, cloroformo, grupo control

Varianza 8 6 4 2 0

Etanol al 95% Cloroformo Ampicilina Tetraciclina Trimetoprim/ Sulfa

En la tabla 3 y el figura 5, están los datos a los cuales se les aplico el método de análisis de varianza, estos muestran que los tres tratamientos obtuvieron un factor p< 00.5, y aunque estadísticamente no son iguales, los que menos tuvieron varianza a la hora del desarrollo de la investigación fueron los antimicrobianos utilizados como tratamiento control, en cambio de los dos extractos utilizados el que menos tubo variabilidad fue el extracto hecho con cloroformo. Figura 6: actividad antimicrobiana de los tres tratamientos sobre la salmonella spp. 10% 12%

27%

Etanol al 95% Cloroformo

12% 39%

Ampicilina

En esta figura se encuentran los tratamientos utilizados para este trabajo en donde se observan que el más efectivo de todos fue la ampicilina con un 22.75 mm (39%) de promedio en el halo de inhibición, le sigue el Trimetoprim/ sulfa con 16 mm (27%), el cloroformo con 7.3 mm (12%), la tetraciclina con 6.75 mm (12%) y etanol con 5.6 mm (10%).

Tabla 4: Comparación de la actividad antimicrobiana de los extractos de Estevia (Stevia Rebaudiana Bertoni) y tratamiento control con las tablas de NCCLS

Extracto

contenido de disco

diámetro de zona de inhibición (mm) según tablas de NCCLS

diámetro de zona de inhibición (mm)

resistente intermedio sensible Cloroformo

10-12 ug

9-10

11>

7,3 mm

etanol 95 %

10-12 ug

9-10

11>

5.6 mm

Ampicilina

10 ug

<13

14-16

17>

22,75 mm

Tetraciclina Trimetoprim / sulfa

30 ug

<14

15-18

19>

6,75mm

23,75 ug

<10

13-15

16>

16mm

En esta tabla están comparados los resultados con las tablas establecidas por la NCCLS para evaluación de antibióticos según el método de Kirby y Bauer, los resultados que dieron los tratamientos evaluados fue que la salmonella spp, es resistente a los extractos con alcohol etílico y cloroformo

de Estevia (Stevia

Rebaudiana Bertoni), mientras que los antimicrobianos que se encuentran en el tratamiento control el único que dio el mismo resultado anterior fue la tetraciclina. Cosa que no sucedió con la ampicilina y Trimetoprim/ sulfa en cual la salmonella spp. aun sigue siendo sensible.

3. 2.

ANALISIS Y DISCUSION

Las actividades antimicrobianas de las plantas han sido ampliamente reportadas en diferentes trabajos, ya sea que esta cualidad se encuentre en las flores, hojas, tallo o frutos. Pero hasta ahora nace una necesidad de estudiarlas para descubrir nuevas propiedades, Esto según Bauer et al 2003 es “porque existe la necesidad

permanente

urgente

para

descubrir

nuevos

compuestos

antimicrobianos con estructuras químicas diversas y nuevos mecanismos de acción debido a un aumento alarmante en la incidencia de nuevas y reemergentes enfermedades infecciosas y la aparición de resistencia a los antibióticos de uso clínico actual” Para este caso la actividad antimicrobiana de los solventes (cloroformo y Etanol) de Stevia mostraron variaciones significativas (p<0.05) como se muestra en la tablas 1,3 y graficas 1, 3. Entre los extractos el que mostro mayor potencial antibacteriano fue el Cloroformo con un halo de inhibición de 7.3mm (12%) con respecto al etanol que fue de 5.8 mm (10%) esto se debe probablemente a que el cloroformo es un alcohol apolar

y tiene la capacidad de extraer mas los

compuestos de las plantas, en cambio el etanol es polar y su efectividad no es la misma. No obstante los resultados de este trabajo son similares a los Yuvaraj, 2010 y Jayaraman et al 2008, donde muestra unos resultados en el halo de inhibición en los extractos de cloroformo de 6mm, 8mm, 6mm, 7 mm, sobre E. coli, B. subtilis, S. aureus, V. cholerae, respectivamente, demostrando que este extracto es ineficaz frente a los organismos de la prueba. También hay que tener en cuenta que la concentración de los extractos no jugó un papel importante ya que estos nunca dependieron de la concentración inicial del alcohol, ni su posterior concentración, como lo muestran cada uno de los estudios en donde se evaluaron extractos de Estevia, y aunque para este caso no se hizo de la misma manera, los resultados arrojados no variaron significadamente.

Por otra parte, cabe resaltar que en la literatura no se encuentran datos actuales en los cuales indiquen estas propiedades de la Estevia (Stevia Rebaudiana Bertoni) sobre la salmonella spp. para poder tener un punto de comparación. No obstante si existen reportes en donde han utilizado extractos que posee un cierto grado de eficacia sobre algunas bacterias. Como es el caso de Esmat y ferial, 2009, emplearon realizar

los

varios

extractos

solventes orgánicos entre ellos el cloroformo, de

Stevia

rebaudiana

sobre

para

monocytogenes,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus y Escherichia coli, dando como resultado variaciones significativas en todos los extractos, pero para el caso del cloroformo solo afecto a la

P. aeruginosa con un halo de

inhibición de 11 mm, estos resultados son similares a los Sumit, 2008 que emplea también en las fabricación de los extractos cloroformo (11 mm) para evaluar el efecto esta vez sobre E. coli, B. subtilis, E. faecalis, P. aeruginosa, S. aureus, siendo esta ultima en la que mostro mayor efecto. De todas maneras los resultados del presente estudio indican que los extractos de hoja de stevia tienen actividades inhibitorias contra los microorganismos, aunque su actividad antibacteriana es más bajo que los tratamientos convencionales Sin embargo, los extractos de hoja de stevia puede ser un candidato ideal para nuevas investigaciones sobre sus usos para la conservación de los alimentos, así como los productos basados en plantas farmacéuticas y naturales.

Otro de los puntos importantes para tener en cuenta es la susceptibilidad que aun presenta

la salmonella spp ante la Ampicilina (39%) estos resultados

contrastan con los obtenidos por Seyfarth et al 1997, el cual evaluó 98 cepas de salmonella spp. aisladas en aves de corral, en las cuales el 9.2 % presentaron resistencia a las Aminopenicilinas (penicilinas) siendo esta resistencia mediada por B-lactamasas. Los resultados de este trabajo son similares a los de Ruiz et al 2006, en los cuales el 100% de las 30 cepas de Salmonella spp estudiadas fueron susceptibles. Esto se atribuye a que en la avicultura colombiana por su alto costo, baja disponibilidad y

venta

restringida en las diferentes droguerías

veterinarias es poco su uso, a lo que conlleva buscar otras alternativas en los antimicrobianos disponibles en el mercado.

En este estudio también encontró que la salmonella spp. aislada y cultivada para el antibiograma fueron resistencia ante la Tetraciclina (12%) según lo muestra en la tabla 4, estos resultados son similares a los que obtuvo Cruchaga et al2001, en el cual el

61% de las cepas aisladas presentaron resistencia a las

Tetraciclinas. En cambio contrastan con los resultados obtenidos por Ruiz et al 2006, en donde las 30 cepas estudiadas mostraron un 90% sensibles, 6.7 % fueron medidamente sensibles y 3.3% de la cepas resistentes. La resistencia a tetraciclina ha sido atribuida a su uso extendido y prolongado en la industria avícola, como agente profiláctico, terapéutico y como promotor de crecimiento (Schmidt, 2002; Miles y col., 2006).

En lo que se refiere a la susceptibilidad de la salmonella spp. ante el combinado de Trimetoprim/ sulfa (27%),estos datos coinciden con otras investigaciones como la Ruiz et al 2006 y difieren con los datos de Cruchaga et al 2010, el cual obtuvo un 49% de los aislamientos eran resistentes a esta combinación. No obstante las diferencias observadas entre los resultados del presente trabajo con los reportados por otros investigadores se debe a que la resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno variable en espacio y tiempo, y depende, de manera importante, del uso de los antibióticos (Yoko-Furuya y Lowy, 2006).

Por lo anterior y por los resultados del trabajo de investigación

se acepta la

hipótesis nula y se rechaza hipótesis de investigación. Ya que si bien la Estevia para este caso no arrojo los resultados esperados, pero queda abierto el tema para futuras investigaciones, siempre y cuando se siga con el mismo objetivo de buscar nuevas propiedades y usos a la Estevia, en el campo de la Medicina Veterinaria.

CAPITULO IV CONCLUSIONES 

Las aves del galpón muestreadas son portadoras asintomáticas de salmonella spp, sin embargo se deben tomar medidas de prevención para minimizar en un futuro la presencia de cuadros clínicos por esta clase de patógeno oportunista en la producción.



Este estudio da a conocer

algunos extractos de hojas de Stevia

rebaudiana como un virtual antimicrobiano. Sin embargo sigue habiendo una necesidad de mayor investigación de esta planta con el fin de identificar y aislar su principio activo. 

El método de aislamiento por hisopado cloacal fue efectivo para este trabajo, pero no es suficientemente seguro cuando se quiere realizar una identificación del género salmonella spp. en una población, ya se debe emplear más de un tipo de muestra para obtener mayor porcentaje de resultados positivos.



La ampicilina y el Trimetoprim/ sulfa son unos fármacos ideal para tratar las aves que presenten sintomatología asociada a salmonellosis en esta producción avícola, ya sigue teniendo una alta efectividad, pero se deben tener en cuenta realizar un esquema de rotación de antimicrobiano para evitar la resistencia bacteriana.



Se evidencia que la cepa aislada para este trabajo presenta una resistencia frente a la tetraciclina por los halos de inhibición tan bajos. Sin embargo se pueden realizar en el lugar un perfil de sensibilidad y resistencia para tener una mayor confianza.

CAPITULO V IMPACTO

A largo plazo se podría llegar a hablar de un impacto social, ya que si continua investigando utilizarse

esta planta y se le descubren

en las granjas de aves

nuevos usos, se podría llegar a

como prevención o un tratamiento más

económico de la salmonella spp. o en otras enfermedades en donde se hayan implicadas microorganismos que por investigaciones anteriores se saben que tienen algún efecto positivo como por ejemplo la E. coli o S. aureus. También se presenta un

impacto científico ya que los resultados

pretenden

aportar un nuevo conocimiento con respecto a las propiedades antimicrobianas que tiene la Estevia y dan un punto de partida para las futuras investigaciones. De igual forma se habla de un impacto epidemiológico ya que se da a conocer la posible presencia del microorganismo en las producciones de la región, y por ende en los productos derivados de estos.

CAPITULO VI RECOMENDACIONES 

Realizar nuevos estudios en donde se aíslen salmonella spp. en las plantas de sacrificio de pollos de la región, con el fin de evaluar si existe riesgo de infección de salmonella en estos sitios.



Realizar un estudio epidemiológico y de resistencia antimicrobiana de las cepas de salmonella spp. presentes en las diferentes explotaciones de aves que existen en la región, con el fin poder establecer hasta que grado la resistencia bacteriana es culpa del uso inadecuado por parte de los Médicos Veterinarios



Se recomienda realizar estudios fitoquímicos y cromatografico a la Estevia cultivada en la región, para determinar todos los compuestos que esta planta contiene.

CAPITULO VII BIBLIOGRAFIA

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CAPITULO VIII ANEXOS

Diagrama Aislamiento De Salmonella SegĂşn ISO 6579: 2000

ANEXO II AGUA PEPTONADA

Ingredientes: Peptona 1.0 grs. Cloruro de Sodio 8.5 grs. Agua 1 Litro Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua ajustar el pH a 7 con cloruro de sodio 1N  Distribuir en una proporción de 99.9 y 9 ml según lo requiera  Esterilizar a 121 ºC por 15 min  Después de las esterilizaciones los volúmenes y el pH debe ser iguales a los iniciales

Siembra Por inoculación directa del material en estudio. Como diluyente: realizar las diluciones 1:10 y 1:100, dependiendo del uso que se le quiera dar. Incubación Aeróbica, a 35-37 ºC durante 18-24 horas. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

ANEXO III Salmonella Shigella Agar. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05). Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona Extracto de carne Lactosa Mezcla de sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato férrico Agar Verde brillante Rojo neutro pH final: 7.0 ± 0.2

5.0 5.0 10.0 8.5 8.5 8.5 1.0 13.5 0.00033 0.025

Instrucciones Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

Siembra: Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05).

Incubación: Durante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento

Características del medio preparado: rojo naranja. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

ANEXO IV Preparación del estándar0, 5 de Mc Farland: Los estándares de turbidez de Mc Farland se utilizan para estandarizar el número de bacterias aproximado en una suspensión comparando la turbidez de la misma con la turbidez del estándar. Los estándares de McFarland se preparan agregándole cloruro de bario a una solución de ácido sulfúrico para obtener un precipitado de sulfato de bario. Se pueden preparar estándares con varios grados de turbidez, ajustando los volúmenes de ambos reactivos, lo que representa distintas concentraciones de bacterias. El estándar usado más comúnmente en el laboratorio de microbiología para los métodos de sensibilidad de rutina es el 0,5, el cual representa 1.5 x 108 bacterias por ml.

A. REACTIVOS

1. ACIDO SULFURICO 1% (H2SO4)

a. Agregar aproximadamente 90 ml de agua destilada a un frasco graduado de 100 ml.

b. Con una pipeta de 1 ml agregar 1ml de H2SO4 concentrado al frasco.

c. Llevar a 100ml de volumen con agua destilada y mezclar.

d. Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa a rosca por más de un año.

2. CLORURO DE BARIO 1,175% (p/v) (BaCl2)

a. Pesar 1,175 g de BaCl2. 2H2O y pasarlo a un frasco graduado de 100 ml.

b. Agregar aproximadamente 50 ml de agua destilada y mezclar bien hasta disolver.

c. Llevar a 100ml de volumen con agua destilada y mezclar.

d. Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa a rosca por más de un año.

B. PROCEDIMIENTO

a. Agregar aproximadamente 85 ml de H2SO4 a un frasco graduado de 100 ml.

b. Con una pipeta de 0,5 ml agregar 0,5ml de 1,175% BaCl2 gota a gota al H2SO4 manteniendo una agitación constante.

c. Llevar a 100ml de volumen con H2SO4 1%.

d. Agitar con agitador magnético por 3 a 5 minutos.

e. Examinar la solución visualmente para asegurarse de que sea homogénea sin precipitados visibles.

f. Medir la densidad óptica en un espectrofotómetro a 625 nm. La absorbencia a esta longitud de onda debería ser 0,08 – 0,10.

g. Fraccionar en tubos similares a los que se van a utilizar para preparar los inóculos bacterianos (3– 5 ml).

h. Cerrar los tubos y sellarlos con Parafilm o parafina.

Conservar en oscuridad a temperatura ambiente por 3 meses o más.

C. CONTROL DE CALIDAD

a. Cada vez que se va a utilizar el estándar controlar si hay precipitados visibles y compararlo con un estándar que no esté en uso. Si se observan precipitados, descartar el estándar.

b. Controlar cualquier evidencia de evaporación. Esto puede hacerse dibujando una línea en el tubo señalando el menisco en el momento de llenar los tubos. Si al usarlo el nivel de líquido está por debajo de esa marca, descartar el estándar.

c. Luego de tres meses de uso leer la densidad óptica de un estándar que no se haya usado nunca. Si la densidad óptica se encuentra dentro de los límites se puede seguir usando ese lote por un mes más.

d. Seguir controlando la densidad óptica todos los meses y si sigue en rango se puede extender el uso del lote hasta un año.

D. NOTAS

a. Los inóculos bacterianos a medir y el 0,5 de Mc. Farland deben estar en tubos del mismo diámetro.

b. Cuando se utilizan tubos de vidrio, lavarlos con agua acidulada ayuda a disminuir los precipitados.

ANEXO V AGAR MUELLER HINTON Usos

El Agar Müeller Hinton es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Bauer-Kirby. Este medio también es conocido como Agar M-H

Explicación

Bauer, Kirby, Sherris y Tuck recomendaron el Agar de Müeller Hinton para llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a antibióticos, utilizando un solo disco impregnado con una alta concentración de un antimicrobiano. El Agar Müeller Hinton cumple con los requerimientos de la Organización Mundial de la Salud y está especificado en la FDA.

Este medio es el seleccionado por la NCCLS

(National Commitee for Clinical Laboratory Standards) para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la mayoría de los patógenos no fastidiosos. Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusión de carne y la peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas, carbón y aminoácidos. El almidón es agregado para absorber cualquier metabolito tóxico y el agar es adicionado como agente solidificante.

Formula 

Infusión de Carne 300.0



Almidón. 1.5



Peptona de Caseína H 17.5



Agar Bacteriológico 17.0



pH 7.4 ± 0.2

Método: 

Suspender 38 g del medio en un litro de agua purificada.



Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.



Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos.



Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles.



Para obtener desarrollo de Neisseria enfriar el medio a 45-50 °C y agregar sangre de borrego desfibrinada estéril al 5% calentada a 80 °C.



Para realizar pruebas de oxacilina y meticilina con estafilococcos, el medio deberá ser suplementado con 2% de cloruro de sodio.

Procedimiento:

Consultar las referencias apropiadas para la técnica de susceptibilidad en placa por el método de difusión. Consultar las referencias apropiadas para la interpretación de resultados.

Almacenamiento: 2-30° C. Caducidad: 5 años en frasco cerrado. Presentación: Frasco con 450 g

ANEXO VI Interpretación estándar del tamaño del diámetro de la zona de inhibición para Enterobacteriaceae (para ciertos discos de antimicrobianos apropiados para la prueba de Salmonella spp