Evaluación in vitro de dos extractos de poleo clinopodium brownei by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN IN VITRO DE DOS EXTRACTOS DE POLEO Clinopodium brownei (Sw.) SOBRE LA GARRAPATA Ripicephalus (Boophilus) microplus

JULIO HUMBERTO PERALTA PEÑA

Trabajo de Grado en Modalidad Investigación Presentado como Requisito para Optar el Título de Médico Veterinario

FUNDACION UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA TUNJA (BOYACA) 2013

EVALUACIÓN IN VITRO DE DOS EXTRACTOS DE POLEO Clinopodium brownei (Sw.) SOBRE LA GARRAPATA Ripicephalus (Boophilus) microplus

JULIO HUMBERTO PERALTA PEÑA

DIRECTORA ANASTASIA CRUZ CARRILLO MV Esp. MsC Farmacología y Toxicología

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA TUNJA (BOYACÁ) 2013

TABLA DE CONTENIDO 1.

INTRODUCCIÓN………………………………………………………...

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN………………………………...…..

JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………

OBJETIVOS………………………………………………………………

5.1

GENERAL…………………………………………………………….......

5.2

EPECÍFICO……………………………………………………………….

MARCO REFERENCIAL………………………………………………..

6.1

ESTADO DEL ARTE…………………………………………………….

6.2

MARCO TEÓRICO………………………………………………………

6.2.1

Garrapata Riphicephalus (Boophilus) microplus……………………..

6.2.1.1 Ciclo Biológico de la Garrapata………………….……………………..

6.2.1.2 Efectos de Riphicephalus (Boophilus) microplus…………….……....

6.2.1.2 Tratamiento y Control de la Garrapata……………….………………..

6.2.2

Plantas con Efecto Insecticida……………………………………….…

6.2.2.1 Clinopodium brownei (Sw.) (Poleo)………………………….…………

6.2.2.2 Composición Química…………………………………………………...

6.2.2.3 Usos Medicinales………………………………………………………...

6.2.2.4 Metodos de Extraccion…………………………………………………..

6.3

MARCO LEGAL………………………………………………………….

6.4

MARCO GEOGRÁFICO………………………………………………...

METODOLOGÍA………………………………………………………….

7.1

LUGAR DE ESTUDIO……………………………………….…………..

7.2

ANIMALES DE ESTUDIO ………………………………………………

7.2.1

Mantenimiento de las Garrapatas en el Laboratorio…………………

7.3

DISEÑO METODOLÓGICO………….…………………………………

7.4

PROCEDIMIENTO……………………………………………………….

7.4.1

Recolección de Material Vegetal………………………………...…….

7.4.2

Elaboración del Extracto………………………………………………...

7.4.3

Extracción por Soxhlet………………………………………………......

7.4.4

Extraccion Etanolica en Frio (Casero)……………………………………

7.4.5

Prueba de Eficacia in vitro…………………………………………………

7.5

ANÁLISIS DE DATOS………………………………………………………

HIPÓTESIS…………………………………………………...……………..

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………

9.1

Resultados…………………………………………………………………..

9.1.1

Identificación de la Planta………………………………………...............

9.1.2

Extractos Obtenidos………………………………………………….........

9.1.3

Evaluación de la Eficacia Ixodicida……………………………………….

9.1.3.1

Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto Sohxlet Puro…………

9.1.3.2

Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto Sohxlet en Dilución

1:1 (Extracto:Agua)………………………………………………………… 9.1.3.3

Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto Sohxlet en Dilución

1:5 (Extracto:Agua)………………………………………………………… 9.1.3.4

Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto en Frio (Casero) Puro.

9.1.3.5

Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto en Frio (Casero) en

Dilución 1:1 (Extracto:Agua)…………………………………….………… 9.1.3.6

Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto en Frio en Dilución 1:5

(Extracto:Agua)…………………………..…………………………………. 9.1.3.7

Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto Sohxlet Puro………..

9.1.3.8

Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto Sohxlet en Dilución

1:1 (Extracto:Agua)…………………………………………………………. 9.1.3.9

Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto Sohxlet en Dilución

1:5 (Extracto:Agua)…………………………………………….................. 9.1.3.10 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto en Frio (Casero)

Puro………………………………………………………………………….. 9.1.3.11 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto en Frio en Dilución

1:1 (Extracto:Agua)………………………………………………………… 9.1.3.12 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto en Frio en

Dilución 1:5 (Extracto:Agua)………………………………………………. 9.1.3.13 Exposición de Garrapatas Grandes a Agua Destilada……………........

9.1.3.14 Exposición de Garrapatas Medianas Agua Destilada…………………

49 50

9.1.3.15

Exposición de Garrapatas Grandes a Etanol…………………………...

9.1.3.16

Exposición de Garrapatas Medianas a Etanol………………………….

9.1.3.17.

Exposición de Garrapatas Grandes a Condiciones de Laboratorio….

9.1.3.18

Exposición de Garrapatas Medianas a Condiciones de Laboratorio…

9.1.3.19

Exposición de Garrapatas Grandes a Cipermetrina……………………

9.1.3.20

Exposición de Garrapatas Medianas a Cipermetrina………………….

9.1.3.21

Exposición de Garrapatas Grandes Amitraz…………………………...

9.1.3.22

Exposición de Garrapatas Medianas Amitraz ………………………...

9.1.3.23

Exposición de Garrapatas Grandes Bendiocarb……………………….

9.1.3.24

Exposición de Garrapatas Medianas a Bendiocarb……………………

9.1.4

Consolidación de Resultados……………………………………………..

9.1.4.1

Resultados Grupos Tratados y Controles positivos……………………

9.1.4.2

Resultados Grupo Control Negativo……………………………………..

9.1.4.3

Comparación entre Grupos……………………………………………….

9.2

DISCUSIÓN………………………………………………………………...

9.2.1

Comparación del Efecto Ixodicida entre Grupos……………………….

10.

IMPACTO…………………………………………………………………...

11.

CONCLUSIONES………………………………………………………….

12.

RECOMENDACIONES……………………………………………………

13.

BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………..

14.

ANEXOS…………………………………………………………………….

INDICE DE TABLAS Tabla 1.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas expuestas a extracto etanólico (Soxhlet), puro de Clinopodium brownei (Sw.)……..

Tabla 2.

Cantidad de garrapatas R. (B.) microplus,muertas,expuestas a extracto etanólico (Soxhlet), en dilución 1:1 de Clinopodium brownei (Sw.)…………………………………………………………………………..

Tabla 3.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas a extracto etanólico (Soxhlet), en dilución 1:5 de Clinopodium brownei (Sw.)…….…...........................................................................................

Tabla 4.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus,muertas, expuestas a extracto en frio (casero) puro de Clinopodium browne (Sw.)………......

Tabla 5.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus,muertas,expuestas a extracto en frio (casero) puro en dilución 1:1 de Clinopodium brownei (Sw.)…………………………………………………………………………..

Tabla 6.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas expuestas a extracto en frio (casero) puro en dilución 1:5 de Clinopodium brownei (Sw.)…………………………………………………………………………..

Tabla 7.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas a extracto (Sohxlet) puro de Clinopodium brownei (Sw.) ………………...

Tabla 8.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas expuestas a extracto Sohxlet) en dilución 1:1 de Clinopodium brownei (Sw.) ……...

Tabla 9.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas a extracto (Sohxlet) en dilución 1:5 de Clinopodium brownei (Sw.) …….

Tabla 10. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas a extracto en frio (casero) puro Clinopodium brownei (Sw.)……………..

Tabla 11. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas expuestas a extracto en frio (casero) en dilución 1:1 Clinopodium brownei (Sw.) … Tabla12.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, expuestas a extracto en frio (casero) en dilución 1:5 Clinopodium brownei (Sw.) ……………………

Tabla 13. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas agua destilada…………………..…………………………………………………. 6

Tabla 14.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas agua destilada…………………..……………………………………………….....

Tabla 15.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas,expuestas a Etanol……………………………..…………………………………………..

Tabla 16.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas a Etanol…………………………………...…………………………………..... 51

Tabla 17.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, en condiciones de laboratorio……………………………………………………………………. 52

Tabla 18.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus,muertas, en condiciones de laboratorio……………………………………………………………………. 53

Tabla 19.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus,muertas, expuesta a cipermetrina………………………………………………………………….

Tabla 20.

Cantidades de garrapatas R. (B) microplus,muertas, expuesta a cipermetrina………………………………………………………………….

Tabla 21.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuesta amitraz..

Tabla 22.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuesta amitraz..

Tabla 23.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas bendiocarb……………………………………………………………………

Tabla 24.

Cantidad de garrapatas R. (B) microplus, muertas, expuestas bendiocarb……………………………………………………………………

Tabla 25.

Porcentajes de mortalidad promedio en los grupos tratados y productos comerciales en los dos tamaños de garrapatas……………..

Tabla 26.

Riesgo relativo, calculado para cada tratamiento en garrapatas grandes y medianas………………………………………………………… 66

INDICE DE FIGURAS

Figura 1.

Equipo de extracción Sohxlet………………………………………………

Figura 2.

Departamento de Boyacá con la ubicación de San Miguel de Sema….

Figura 3.

Mapa del departamento de Boyacá con la ubicación de la ciudad de Tunja……………………………………………………………………….….

Figura 4.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet puro en los tiempos de observación……

Figura 5.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:1 en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 6.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:5 en los tiempos de observación............................................................................................

Figura 7.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto frio puro en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 8.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto frio en dilución 1:1 en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 9.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto en frio en dilución 1:5 en los tiempos de observación............................................................................................

Figura 10. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet puro en los tiempos de observación………..…………………………………………………………

Figura 11. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:1 en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 12.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:5 en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 13.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto en frio puro en los tiempos de observación…….

Figura 14.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R .(B) microplus expuestas al extracto en frio en dilución 1:1 en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 15.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto en frio en dilución 1:5 en los tiempos de observación…………………………………………………………………..

Figura 16.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas agua destilada en los tiempos de observación………..........

Figura 17.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas a Bendiocard en los tiempos de observación………….……

Figura 25.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas Amitraz en los tiempos de observación……………..………

Figura 24.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas Amitraz en los tiempos de observación………………………

Figura 23.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas a Cipermetrina en los tiempos de observación………...……

Figura 22.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas a Cipermetrina en los tiempos de observación………..…….

Figura 21.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus a condiciones de laboratorio en los tiempos de observación……..………

Figura 20.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas a Etanol en los tiempos de observación……..………………

Figura 19.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas agua destilada en los tiempos de observación…..…………

Figura 18.

Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas a Bendiocard en los tiempos de observación………………. 9

Figura 26.

Diferencias entre grupos de tratamiento en garrapatas grandes y medianas………………………………………………………………………

INDICE DE IMÁGENES

Imagen 1.

Ciclo biológico de la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus…………………………………………………………………….

Imagen 2.

Poleo Clinopodium brownie (Sw.)…………………………..….…………

Imagen 3.

Pesaje de garrapata R. (B) microplus…………………………………….

Imagen 4.

Selección de garrapata R. (B) microplus……………………..………….

Imagen 5.

Separación de cada una de las réplicas de garrapata R. (B) microplus…………..……………………………………………….………..

Imagen 6.

Recepción de garrapatas R. (B) microplus, en Laboratorio……………

Imagen 7.

Trituración de las hojas de poleo Clinopodium brownie (Sw.)…………

Imagen 8.

Material Vegetal Clinopodium brownei (Sw.) en cámara de Soxhlet…

Imagen 9.

Obtención del extracto……………………………………..………………

Imagen10.

Equipo Soxhlet………………………………………...……………………

Imagen11.

Extractor de grasas…………………………………………………………

Imagen12.

Prueba de inmersión de garrapata R. (B) microplus……………………

INDICE DE ANEXOS

Anexo 1.

Clasificación Taxonomica de Poleo Clinopodium brownei (Sw.) en Herbario UPTC……………………………………………………………….

DEDICATORIA

A Dios, a mis padres que siempre me han apoyado con su amor incondicional en mi formaci贸n como persona 铆ntegra; quienes en mis errores me aconsejan y en mis triunfos me fortalecen, a mis hermanos que siempre me alientan con su ternura y sinceridad. En general a todas las personas que hicieron parte de mi formaci贸n intelectual y al desarrollo de mi trabajo.

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por acompañarme siempre en las buenas y en las malas, y en mis logros como persona.

A mis padres, Martha lucia Peña y José Humberto Peralta por su apoyo y amor en todo este tiempo.

A mi directora, la Doctora Anastasia Cruz Carrillo por su apoyo, dedicación y paciencia en el desarrollo del trabajo.

A los jurados, la Doctora Consuelo Gonzales y a la Profesora Sonia Jiménez por su tiempo y sus aportes en el desarrollo del trabajo.

A la laboratorista, por su apoyo y sus consejos en la ejecución del trabajo.

A la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, en especial al Laboratorio de Nutrición Animal, por permitirme desarrollar el trabajo.

A mi Amigo Nelson Enrique Numpaque y a todos aquellos que se me escapan pero que saben que los llevo en mi corazón

GLOSARIO

ANTESIS: Es el periodo de florescencia o floración de las plantas con flores. Es el periodo de expansión de una flor hasta que está completamente desarrollada y en estado funcional, durante el cual ocurre el proceso de polinización.

BIOCIDA: Es una sustancia química, natural o sintética destinada a destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer el control sobre cualquier microorganismo considerado nocivo para el hombre.

ECLOSIÓN: Aparición o salida, especialmente de un animal o un capullo de flor.

ECTOPARÁSITO: Parásito que vive en la superficie de otros organismos o entra en contacto con ello solo en el momento de alimentarse.

EXTRACTO: Es una sustancia obtenida por extracción de una parte de una materia prima, a menudo usando un solvente como etanol o agua. Los extractos pueden comercializarse como tinturas o en forma de polvo.

EMULSIONANTE: Es una sustancia que tiene dos componentes, uno que atrae el aceite (hidrofóbico) y otro que atrae el agua (hidrofílico).

FITOTERAPIA: Disciplina que estudia la utilización de productos de origen vegetal con finalidad terapéutica, ya sea para prevenir, para atenuar o curar un estado patológico.

FITOFARMACOLOGÍA: Es la ciencia que estudia los fármacos derivados de vegetales, sus mecanismos de acción, su aplicación terapéutica, interacciones, contraindicaciones y efectos adversos.

GARRAPATA: Ectoparásito artrópodo hematófago, perteneciente al sub-orden ixodida, dentro del cual existen tres familias Ixodidae, Argasidae, Nuttalliellidae; todas son vectores de numerosas enfermedades infecciosas y parasitarias.

HERBARIO: (del latín herbarium) Es una colección de plantas o partes de plantas, desecadas, preservadas, identificadas y acompañadas de información crítica sobre el sitio de colección, nombre común y usos. Tal colección en general representa a la flora, o patrimonio vegetal, de una localidad, región o país. También se conoce como herbario al espacio donde se encuentra esta colección.

HERBOLOGÍA: Es el estudio de las propiedades y las aplicaciones medicinales de las plantas con fines terapéuticos medicinales u otros usos que dan beneficio a la comunidad, a los animales y / o al medio ambiente.

HIALURONIDASA: Es una enzima, cuya función es, como su propio nombre indica, degradar el ácido hialurónico (AH). Se encuentra en el acrosoma, y su función principal es degradar la corona radiada durante el proceso de fecundación. Además se encuentra en algunas bacterias patógenas, siendo un factor de virulencia, ya que esta enzima hidroliza también el ácido hialurónico de la matriz extracelular. También está presente en el veneno de la mayoría de las serpientes.

HISTAMINA: Es una amina idazólica involucrada en las respuestas locales del sistema inmune.

También

regula

funciones

normales

estómago y

actúa

como neurotransmisor en el sistema nervioso central. Una nueva evidencia también indica que la histamina desempeña una función en la quimiotaxis de glóbulos blancos como los eosinófilos.

HOSPEDADOR O HUESPED: Se aplica al organismo, animal o vegetal, que alberga o soporta a un parásito o a un comensal.

IXODICIDA: Son sustancias químicas de cualquier origen que pertenecen al grupo de los plaguicidas y se utilizan para prevenir, controlar o combatir parásitos del suborden ixodida.

INOCUIDAD: La inocuidad de un alimento es la garantía de que no causará daño al consumidor, cuando sea preparado o ingerido y de acuerdo con el uso a que se destine. La inocuidad es uno de los cuatro grupos básicos de características que junto con las nutricionales, organolépticas y comerciales componen la calidad de los alimentos.

LARVA: Es un animal en estado de desarrollo, que ya ha abandonado su huevo y puede alimentarse por sí mismo, pero que aún no ha desarrollado la forma y la organización

que

caracteriza

adultos

especie.

METABOLITO PRIMARIO: Sustancia química sintetizada por las plantas, necesarias para los procesos vitales de estas, que además son producidos por todas las plantas.

METABOLITO SECUNDARIO: Son sustancias químicas sintetizadas por solo algunas plantas, que no son vitales para éstas, sino que les sirven para contrarrestar el efecto de agentes externos, ya sea daño mecánico o por plagas

NINFA: Estadios juveniles tanto de insectos con metamorfosis incompleta como de ácaros y garrapatas.

OVIPOSICIÓN: Es el tiempo considerado desde que se inicia la puesta de los primeros huevos hasta los últimos.

POLEO: El poleo es una planta aromática perenne de la familia de las labiadas, parecida a la menta pero con hojas más grandes. Crece hasta 40 centímetros en zonas de fuerte precipitación su aceite y hojas se usan con fines medicinales. A lo largo de la

historia, tanto el poleo Americano como el poleo Europeo se han utilizado indistintamente como una fuente de aceite de poleo.

RESISTENCIA ADQUIRIDA: Es un proceso adaptativo, de mutación genética, en el que un agente infeccioso o parasitario, pierde la sensibilidad a un fármaco que anteriormente lo podría afectar

SOXHLET: Es un extractor denominado así en honor a su inventor Franz von Soxhlet, que corresponde a un tipo de material de vidrio utilizado para la extracción de compuestos, generalmente de naturaleza lipídica, contenidos en un sólido, a través de un disolvente afín.

SOLVENTE: Es una sustancia que permite la dispersión de otra sustancia en esta a nivel molecular o iónico. Es el medio dispersante de la disolución. Normalmente, el solvente establece el estado físico de la disolución, por lo que se dice que el solvente es el componente de una disolución que está en el mismo estado físico que la misma. Además, también se podría decir que es la sustancia que disuelve al soluto y que se encuentra en mayor proporción.

TOXICIDAD: Es la cantidad de una sustancia capaz de producir efectos indeseados en un organismo vivo, dicho efecto puede ser de carácter funcional o estructural.

RESUMEN

En el presente trabajo se describe la evaluación in vitro del efecto ixodicida de los extractos etanólico de la planta Clinopodium brownei (Sw.) sobre garrapatas de la especie Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El extracto de la planta fue obtenido mediante dos métodos de extraccion sohxlet y frio (casero). Para las pruebas, se utilizaron garrapatas adultas de dos tamaños (grandes y medianas), que fueron expuestas a cada uno de los los extractos de la planta, por medio la técnica de inmersión en adultas. La estimación de mortalidad se hizo a los 30 min y cada 24 h pos exposición, teniendo en cuenta como mínimo de eficacia 60% de mortalidad. Las pruebas iniciales se realizaron con extractos puros y luego se procedió a realizar dos diluciones 1:1 y 1:5, Los resultados obtenidos en los tratamientos de garrapatas expuestas a cada uno de los extractos, Sohxlet y en frio (casero), de Clinopodium brownei (Sw.) en las garrapatas medianas indica que fue más eficaz el extracto puro elaborado en frío, seguido por el extracto Sohxlet puro, mientras que el tratamiento que produjo menor mortalidad fue el extracto en frio en dilución 1:5. En conclusión podemos decir que el extracto de Clinopodium brownei (Sw.) tiene un efecto ixodicida bajo, respecto al % mínimo de eficacia.

PALABRAS CLAVE

Ixodicida, plantas medicinales, fitofarmacología, Boyacá, metabolitos secundarios

ABSTRACT

In this paper we described the in vitro evaluation of the acaricide effect of ethanolic extracts of the plant Clinopodium brownei ( Sw ) on ticks of the species Rhipicephalus ( Boophilus ) microplus . The plant extract was obtained by two extraction methods Sohxlet and cold (homemade) . For testing, we used adult ticks two sizes ( large and medium ), which were exposed to each of the plant extracts , through immersion technique in adults. Mortality estimates are made after 30 minutes and every 24 hours post-exposure , taking into account at least 60 % mortality efficacy . Initial tests were conducted with pure extracts and then proceeded with two 1:1 and 1:5 dilutions , The results obtained in the treatment of ticks exposed to each of the extracts, and cold Sohxlet ( home ) of Clinopodium brownei (Sw.) in ticks medium indicates that it was more effective to extract pure cold drawn , followed by Sohxlet pure extract , while treatment resulted in lower mortality than the extract was diluted 1:5 in cold . In conclusion we can say that brownei Clinopodium extract ( Sw ) has a low acaricide effect , as a % minimum efficiency.

KEYWORDS

Acaricide, medicinal plants, phytopharmacology, Boyacรก, secondary metabolites

1. INTRODUCCIÓN

La sanidad de los animales es primordial porque de ahí depende en gran parte, el bienestar animal y las expectativas en la producción. La garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus, figura como uno de los ectoparásitos hematófagos de mayor importancia económica a escala mundial, el cual afecta con frecuencia producciones pecuarias en las regiones de la zona tropical. Dentro de los efectos que ocasiona dicho parásito se destacan la disminución en la ganancia de peso, en la producción de leche y en la fertilidad, además de actuar como vector de microorganismos como Babesia spp.y Anaplasma spp., causantes de enfermedades que, en algunos casos pueden llegar a ocasionar la muerte (Rodríguez, 2005).

Con base en el impacto negativo que producen las garrapatas en los bovinos, el uso de productos ixodicidas sigue en aumento, llegando en muchos casos a ser indiscriminado. En consecuencia, se favorece el desarrollo de resistencia en la garrapata o bien de efectos tóxicos en el animal, lo que disminuye aún más la productividad del ganado (Kemp et al., 1998).

En razón a que el desarrollo de resistencia conduce a ineficacia de los productos, en algunas zonas existen grupos farmacológicos que ya no muestran ningún tipo de beneficio, por ende se ha despertado el interés por buscar nuevas sustancias con acción ixodicida en diferentes plantas. El poleo es una planta reconocida como medicinal de fácil hallazgo en el departamento de Boyacá, cuyo efecto insecticida ha sido reportado (García, 1992) pero se desconoce si incluye una acción ixodicida.

Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue evaluar

el efecto ixodicida del

extracto de poleo,Clinopodium brownei (Sw.) empleando el método de extracción en caliente (Soxhlet) y etanolico en frio (casero) contra la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus mediante una prueba de evaluación in vitro.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Diferentes estudios realizados en el país sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus, han reportado que es la especie que se encuentra más ampliamente distribuida a nivel local, convirtiéndose así en uno de los ectoparásitos hematófagos de mayor prevalencia en el departamento de Boyacá. Genera efectos adversos, dentro de los que se destaca la inducción de anemias y la transmisión de Anaplasma spp. y Babesia spp. (Rodríguez, 2006), además de producir estrés y disminución en la producción.

Buscando controlar la población de garrapatas, se vienen empleando productos químicos de diferentes características, dentro de los que se destacan organofosforados, carbamatos, piretroides, amidinas, fenilpirazolonas y lactonas macrocíclicas (Guerra et al., 2005). Estos insecticidas muestran eficacia contra las garrapatas, sin embargo su uso frecuente ha conducido al desarrollo de resistencia, por lo que la efectividad disminuye o se pierda totalmente impidiendo el control de los ectoparásitos. Adicionalmente, el uso de estos productos favorece la presencia de residuos tóxicos que pueden afectar a los animales, humanos y al ecosistema, además de poder contaminar la leche y la carne y con ello poner en riesgo la salud humana (Peter et al., 2005).

Debido al desarrollo de resistencia de la garrapata a los productos químicos, los productores han optado por aumentar las dosis de éstos y reducir los intervalos de aplicación, lo cual arriesga la inocuidad alimentaria por la presencia de residuos en alimentos de origen animal y aumenta la probabilidad de casos de intoxicación por plaguicidas en los bovinos. En respuesta a tal situación, en la biodiversidad botánica mundial, se han buscado e identificado plantas con metabolitos insecticidas o específicamente ixodicidas que constituyen una posibilidad futura para el control de ectoparásitos con eficacia y mayor seguridad para el ecosistema. Dentro de las plantas con efecto insecticida se destacan Nicotiana tabacum (L.), Ruta graveolens, (L.) Urtica urens (L.), Capsicum frutescens (L) y Clinopodium brownei (Sw.) entre otras. A esta última, se le ha comprobado efecto insecticida contra moscas, pulgas y piojos (Silva, 2002), así

como acción repelente de los mismos, sin embargo no se encuentran reportes de haber sido probada contra garrapatas, y partiendo de que muchos de las moléculas que actúan contra dípteros también tienen efecto ixodicida, es necesario demostrarlo inicialmente en forma in vitro antes de proponer su uso en los animales.

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Los extractos etanólicos de Clinopodium brownei, (Sw.) obtenidos por métodos “en frío” y “en caliente”, presentan efecto ixodicida sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus y, en tal caso, hasta qué grado de dilución lo conservan?

4. JUSTIFICACIÓN

La búsqueda de nuevas moléculas con acción ixodicida capaces de controlar de manera eficaz la población de garrapatas que afecta a los bovinos, se hace necesaria, toda vez que los insecticidas comerciales, que usualmente han sido utilizados a nivel mundial, van perdiendo eficacia con el paso de los años. (Guerrero y Pruett, 2003). Las comunidades académicas y los investigadores independientes, deben aportar su conocimiento para contribuir a resolver esta problemática, la cual está afectando la salud y la producción bovina.

Si se logra demostrar que Clinopodium brownei (Sw.) posee acción ixodicida, se podría proponer como alternativa para el control integral de las garrapatas in vitro y posteriormente, daría la posibilidad de evaluarla sobre los animales, para no solo evidenciar su eficacia in vitro sino también in vivo. A pesar de que la tradición popular, la reconozca como planta insecticida y repelente de insectos, es necesario realizar estudios controlados para determinar si la mencionada acción insecticida

involucra

además un efecto contra las garrapatas.

Todos los aportes que se hagan al conocimiento del uso de plantas medicinales en animales, serán útiles para favorecer la producción limpia y la inocuidad alimentaria, así como también para disminuir el riesgo de presentación de efectos adversos y de contaminación ambiental.

5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto ixodicida in vitro de dos extractos de poleo Clinopodium brownei (Sw.) para el control de la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Evaluar el efecto ixodicida del extracto etanólico de Clinopodium brownei (Sw.) obtenido a temperatura ambiente sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus.  Evaluar el efecto ixodicida del extracto etanólico de Clinopodium brownei (Sw.) obtenido a 37,2oC (método Sohxlet), sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus.  Determinar el grado mínimo de dilución en el cual cada uno de los extractos, evidencia efecto ixodicida sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus.

6. MARCO DE REFERENCIA

Las plantas medicinales son aquellas plantas usadas para el tratamiento de una afección, que han sido usadas por las personas desde hace miles de años mostrando gran efectividad, sin embargo, con el paso del tiempo y el avance de la tecnología se han dejado de lado, ya que han empezado a llegar nuevos medicamentos químicos al mercado (Álvarez et al., 2008).

6.1 ESTADO DEL ARTE

Pérez et al. (2012), realizaron una investigación en la Universidad Agraria de la Habana, donde se evaluó in vitro, el efecto acaricida del extracto de Neem (Azharidacta indica) sobre la garrapata Boophylus microplus, presentes en animales de San José de las Lajas (Cuba). Los autores evidencian eficacia acaricida del extracto acuoso de las hojas de Neem, aunque la mortalidad estuvo alrededor de 63%.

Beatriz et al. (2010) evaluaron la composición química volátil del aceite esencial, extractos y fracciones volátiles de hojas y tallos frescos Clinopodium brownei (Sw.) mediante diferentes técnicas de extracción y evaluaron la actividad antioxidante de su aceite esencial. Reportando que el principal compuesto encontrado en todos los extractos de Clinopodium brownei (Sw.) fue la pulegona con un (54-71%). De igual forma este aceite esencial presentó actividad antioxidante

Martínez et al. (2011) evaluaron la actividad acaricida de extractos crudosy aceites esenciales de semillas de comino (Cuminum cyminum), bayas de pimienta de Jamaica (Pimienta dioca) y hojas de albahaca (Ocimun basilicum) sobre garrapata R. (B) microplus de 10 días de edad, encontrando un efecto tóxico con algunos extractos, ya que produjeron 100% de mortalidad de las larvas con las concentraciones evaluadas. El aceite esencial de pimienta de Jamaica produjo una mortalidad del 100% en todas las concentraciones evaluadas. Por el contrario, el aceite esencial de albahaca no ha

demostrado ser tóxica para las larvas de la garrapata R. (B) microplus. Los compuestos más comunes detectados por espectrometría de masas-cromatografía de gases fueron las siguientes: comino: cuminaldehido (22,03%), γ-terpineno (15,69%) y 2-Caren-10-al (12,89%); pimienta de Jamaica: metil eugenol (62,7%) y eugenol (8,3%); albahaca: linalol (30,61%) y estragol (20,04%).

En India, Magadum et al. (2009), evaluaron la acción garrapaticida y el efecto sobre la ovoposición con Annona squomosa, Tamarindus indicus, Nicotiniana tabacum, Eucalypto globulus, Citrus leminum y bulbos de Allium sativum, sobre garrapata R. (B) microplus. Estos investigadores encontraron que el extracto de la semilla de Annona squamosa, mostró el mayor porcentaje de mortalidad (70.8 %), así como disminución de la tasa de oviposición después de 24 horas.

Álvarez y Bonilla (2007), realizaron una investigación in vitro en la Universidad Nacional de Costa Rica sobre el efecto ixodicida de la garrapata Ripicephalus Boophilus Acari, de igual forma

determinaron los efectos sobre la ovoposición y la eclosión de los

huevos por medio de extractos hidro-alcohólicos de diez plantas tropicales. Los resultados indican que de todas las plantas evaluadas, el extracto puro de la canela (Cinnamomun zeylanicum) produjo 100 % de mortalidad pero la actividad disminuyó casi totalmente (2,18 %) cuando se evaluó en una dilución 1:1 en agua. Otro extracto que manifestó un buen porcentaje de mortalidad (68 %) fue el de morera (Morus alba).

Se realizó un estudio in vitro, en Pereira, Colombia, para evaluar el efecto de los extractos crudos de Sapindus saponaria sobre la oviposición, viabilidad de los huevos y fertilidad de garrapatas R (B) microplus, obtenidas de animales naturalmente parasitados de la ciudad de Medellín. Se demostró que el extracto crudo de S. saponaria, fue eficaz en una concentración de 50 ppm. Se apreció una reducción cercana al 50% especialmente sobre la oviposición, viabilidad de los huevos y fertilidad. En los grupos tratados se afectaron todas las variables (Cardona et al., 2007). Ramírez, et al. (2009) realizaron una investigación en la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, para evaluar el efecto de los extractos de Altamisa (Ambrosia

cumanenses), Chipaca (Bidens pilosa), Borrachero (Brugmasia arbórea), Sauco (Sambucus nigra) y Tabaco (Nicotiana tabacum), sobre la mosca Haemaobia irritans. Los investigadores reportan que las plantas que presentaron

mayor actividad

insecticida fueron Nicotiana tabacum, con un porcentaje de mortalidad de 100, 96,6, 80 y 60 %, con diluciones de 5:10; 2,5:10; 1,25:10 y 0,62:10, respectivamente; seguida por Brugmasia arborea y Sambucus nigra. Los extractos que mostraron menor efectividad fueron Bidens pilosa y Ambrosia cumanensis.

Partiendo de los resultados del trabajo anterior, Ortiz et al. (2009), evaluaron las mismas plantas pero obteniendo los extractos mediante el método Soxhlet. Los resultados obtenidos para las cinco plantas, fueron similares, sin embargo, reportan los autores, que hubo mayor eficacia de los extractos mediante este método de extracción, que cuando los mismos se obtienen con técnica en frio.

(Rodríguez, 2002), evaluaron el efecto ixodicida del extracto etanólico de las plantas, Brugmasia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, Bidens pilosa y Ambrosia cumanenses, mediante la técnica de inmersión de garrapatas adultas de la especie R (B) microplus, colectadas en Gachantivá, departamento de

Boyacá.

Encontraron que el extracto de N. tabacum, mostró efectividad en garrapatas pequeñas, hasta las diluciones 0,5:10 y 1:10 en clima frio y cálido, respectivamente y con dilución 2,5:10 y 5:10 sobre garrapata mediana en clima frio y cálido, respectivamente; B. arbórea, mostró eficacia sobre garrapata pequeña hasta la dilución 7,5:10 en ambos climas; S. nigra y B. pilosa solo fueron eficaces en clima cálido sobre garrapatas pequeñas empleando extracto puro. A. cumanenses no fue eficaz en ninguna de las pruebas.

6.2 MARCO TEÓRICO

6.2.1 Garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Las garrapatas son ectoparásitos de hábitos hematófagos de tamaño pequeño o mediano con aplanamiento dorso ventral y cuerpo con aspecto coriáceo. La cabeza de la garrapata presenta dos órganos lacerantes o de corte, denominados quelíceros, un órgano de succión penetrante semejante a un ancla y el hipostoma. También posee dos apéndices accesorios semejantes a las patas, que actúan como elementos sensitivos o de soporte cuando la garrapata se engancha al cuerpo del hospedador (Bock et al., 2008). El cuerpo de la garrapata puede estar parcial o totalmente cubierto por una placa dura y quitinosa, el escudo. El aparato bucal puede estar escondido bajo el cuerpo del insecto o puede extenderse desde su extremo anterior. La mayoría de las garrapatas son mono coloreadas y presentan una tonalidad que va desde el rojizo hasta el caoba (Guglielmone et al., 2006).

6.2.1.1

Ciclo Biológico de la Garrapata

Las garrapatas tienen cuatro estados evolutivos en su ciclo vital, que son, el huevo, la larva o pinolillo, la ninfa y el adulto. De acuerdo con el tipo de garrapata, su ciclo puede desarrollarse en uno o varios hospedadores por lo que se denominan garrapatas de uno, dos o tres hospedadores. En cualquier caso, para que las garrapatas logren su desarrollo es necesario que pasen por tres fases, no parasítica, de encuentro y parasítica (Lima et al., 2000) (Imagen 1). Las dos especies del género Boophilus spp., reportadas en México (B. annulatus y B. microplus), así como Anocentor (Dermacentor spp.) nitens, la garrapata tropical de los caballos, son ejemplos clásicos de garrapatas de un hospedador, es decir, pasan las tres fases de su ciclo evolutivo parasitario (larva, ninfa y adulta) en la piel de un mismo animal (López, 2006).

Imagen 1. Ciclo biológico de la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus (Campos y Labruna 2008). La vida parasitaria de la garrapata Boophilus spp., sobre los bovinos dura generalmente tres semanas, incluyendo sus dos mudas (de larva a ninfa, de ninfa a adulta). Las hembras fecundadas y repletas de sangre se caen del animal hospedador (bovino) y depositan entre 2.000 y 3.000 huevecillos, de los que, dependiendo el clima, nace una nueva generación de larvas en un lapso de 6 a 8 semanas. La hembra muere después de la ovoposición (Campos y Labruna, 2008).

Por otra parte, son pocas las especies de garrapatas cuyo ciclo evolutivo se caracteriza por la parasitación de dos animales hospedadores, son ellas Rhipicephalus evertis, R. bursa, y algunas especies de Hyalomma spp.. Estas mudan de larva a ninfa sobre el mismo animal; luego, repletas de sangre se desprenden para mudar a adulta en el suelo, y después buscan un nuevo animal qué parasitar. Por el cambio de animal, el ciclo dura dos o tres veces más que el de las garrapatas que completan su ciclo sobre un solo animal (Estrada et al., 2006).

Finalmente, otro tipo de garrapatas, requiere de tres animales durante su desarrollo, éstas pueden ser no sólo ganado bovino, sino animales silvestres, de diferentes especies, dentro de éstas se incluye Amblyomma spp., Dermacentor spp., Haemaphysalis spp e Ixodes spp. Estas garrapatas realizan todas las mudas en el suelo; la larva repleta de sangre se deja caer, muda a ninfa, busca a otro animal, para

alimentarse, vuelve al suelo y muda a adulta, después busca otro hospedador para cumplir con la última fase de su vida parasitaria (Rodríguez, 2005).

6.2.1.2

Efectos de Ripicephalus (Boophilus) microplus

La presencia de garrapatas sobre el ganado, genera efectos indeseados de diferentes características, todos ellos, capaces de afectar negativamente la salud y la producción animal (Osorno, 2006).

Debido a su carácter de parásito hematófago, cuando la carga parasitaria sobre un animal, es alta, se puede llegar a producir anemia por la pérdida constante de sangre, ya que estas, durante la fase parasitaria se alimentan permanentemente. De manera complementaria, actúan como

vectores de hemoparásitos como Babesia spp.y

Anaplasma spp, causando enfermedades en algunos casos mortales para los bovinos. La picadura constante, también genera dolor y estrés en los animales lo que afecta su bienestar y puede llegar a lesionar la piel de los mismos, lo que repercute

en la

comercialización del cuero por disminución de su valor económico (Díaz et al, 2006).Todo lo anterior afecta la rentabilidad para el productor, porque no solo disminuye la producción de carne y leche, sino por el costo de los tratamientos para su control (Bock et al., 2008).

Es así como, buscando combatir de manera eficaz este parásito, se utilizan productos químicos, en algunos casos de manera indiscriminada que pueden conducir al desarrollo de resistencia por parte de los parásitos, conduciendo a estados de ineficacia de los productos existentes (Soberanes et al., 2002).

6.2.1.3 Tratamiento y Control de la Garrapata

Los métodos de control de garrapatas se clasifican en químicos (ixodicidas o garrapaticidas) y no químicos (vacunas y control biológico). El método más utilizado para el control de R. (B) microplus es el uso de productos químicos tales como, carbamatos, organofosforados, pieretroides, amidinas, fenilpirazolonas y lactonas macrociclicas (Rodríguez et al., 2005). Dentro del grupo de los Carbamatos, se encuentran como principios activos Carbaril y Bendiocarb, entre los más comunes. Estos compuestos son esteres de los acidos nmetil o n–dimetil carbámico, que actúan inhibiendo de manera reversible la enzima colinesterasa, por lo que producen efecto colinérgico y parálisis excitatoria en los parásitos (Sumano y Ocampo, 2006).

Otro grupo de frecuente utilización en Colombia, son los organofosforados que de manera similar al grupo anterior, inhiben la colinesterasa, pero de manera irreversible con lo que la transmisión de impulsos en el parásito se hace sostenida y éste muere por parálisis. Dentro de este grupo se encuentra principios activos como Etión, Cumafós, Clorpirifós (Junquera, 2013).

Los piretroides, son derivados sintéticos de las piretrinas, moléculas de origen natural. Estos insecticidas actúan prolongando la fase de despolarización en los parásitos, por lo que producen parálisis excitatoria como los dos grupos anteriores, pero mediante un mecanismo de acción diferente. La mayoría de piretroides producen efecto KO (Knockout), que significa una acción inmediata, lo que disminuye los riesgos de desarrollo de resistencia. Dentro del grupo se encuentran Cipermetrina, Deltametrina y Permetrina, entre otros (Junquera, 2013).

Otro grupo de frecuente uso, son las lactonas macrociclicas, dentro de las que se encuentran ivermectina, doramectina, moxidectina y eprinomectina. Estas moléculas estimulan en los parásitos el neurotransmisor GABA, con lo que se incrementa la permeabilidad de la membrana neuronal a los iones de cloro con la consecuencia

hiperpolarizacion y parálisis inhibitoria de la musculatura faríngea y somática de los mismos (Lifschitz et al., 2002).

Otro producto utilizado para controlar este parásito es el fipronil, una molécula extremadamente activa que altera el sistema nervioso central de los insectos, bloqueando los receptores GABA lo que produce hiperexcitación. Esta inhibición es mucho mayor en invertebrados que en vertebrados (Coure et al.,2008).

Finalmente, dentro de los método de control de la garrapata tradicionalmente se ha usado el Amitraz el cual Inhibe la acción de la enzima monoamino oxidasa, afectando la transmisión de fibras nerviosas adrenérgicas e interfiriendo en el metabolismo de las catecolaminas. En los insectos inhiben la acción de los receptores de la octopamina en el cerebro de los parásitos: provocan hiperexcitabilidad y seguidamente parálisis y muerte. La excitación hace también que las garrapatas no logren fijarse al hospedador para chupar sangre (Betancur et al., 2004).

Como se ha mencionado, el control tradicional de garrapatas, en Colombia y muchos países se ha realizado con el uso de ixodicidas de origen sintético, elaborados y comercializados por los laboratorios fabricantes. Sin embargo desde hace algunos años se ha despertado el interés por buscar nuevas moléculas en las plantas, que ofrezcan buena eficacia contra estos parásitos pero que también sean seguras para los animales, el hombre y en general para el ecosistema.

6.2.2 Plantas con Efecto Insecticida

Dentro del conocimiento existente, de carácter científico y popular, sobre las plantas medicinales, se identifican muchas especies vegetales con acción insecticida, algunas de las cuales son utilizadas exitosamente en algunas partes del mundo. Así mismo, se diferencia la acción insecticida propiamente dicha, que hace referencia a las plantas cuyos metabolitos secundarios, son capaces de destruir algunos parásitos, por diversos

mecanismos de acción y la acción repelente, la cual, sin matar los parásitos, los aleja, evitando su contacto con los animales.

Dentro de los procesos metabólicos que poseen las plantas se

encuentra el

metabolismo primario, en el que se sintetizan compuestos esenciales y de presencia en todas las especies vegetales. Por el contrario, los productos finales del metabolismo secundario no son ni esenciales ni de presencia general en las plantas. Entre estos metabolitos son comunes aquellos con funciones defensivas contra insectos, tales como alcaloides, aminoácidos no proteicos, esteroides, fenoles, flavonoides, glicósidos, glucosinolatos, quinonas, taninos y terpenoides las mayores concentraciones de estos tipos de compuestos se encuentren en flores y semillas (Silva et al., 2002).

La biodiversidad botánica ofrece una gran cantidad de plantas con acciones insecticidas, dentro de las que se destacan algunas de hallazgo común en Colombia como Bidens pilosa (L.) ("chipaca" o "amor seco"), a la que se le atribuyen diversas acciones farmacológicas (Lastra y Ponce, 2001), Brugmansia arborea (L.) Lagerh. ("borrachero") de la familia de las solanáceas que posee como principal componente la escopolamina y variados alcaloides del grupo tropano (Pino et al., 2008). Así mismo, se encuentra Nicotiana tabacum (L.) (tabaco), reconocida por su acción fungicida, insecticida, repelente y acaricida; propiedades atribuidas a su principal componente, la nicotina (Silva, 2002). Otra de las plantas reportadas es Ambrosia cumanensis (Kunth), empleada sobre todo para el control de pulgas, chinches y mosquitos. Dentro de sus principales componentes se encuentran los taninos, inulina, cumarinas, y aceites esenciales producidos en sus partes aéreas (Makabir, 1999). Sambucus nigra (L.) se ha reportado por poseer propiedades como laxante, diurético, estimulante de las defensas del organismo y se dice popularmente, que actúa como agente insecticida. De esta planta, estudios fitoquímicos señalan la presencia de flavonoides, esteroles y alcaloides, al igual que aceites esenciales como ácido cafeico y clorogénico (Chagas, 2010). Otra planta es el Neem (Azadirachta indica),originario de India, es un árbol que se caracteriza por poseer alrededor de 18 compuestos entre los que destacan

salanina, meliantrol y azadiractina que es el que se encuentra en mayor concentración en las semillas, además muestra una acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la oviposición y esterilizante (Silva, 2002). El ajo contiene hasta 5% de su peso seco de metabolitos secundarios de aminoácidos sulfatados no proteicos tales como (+)-S-alil-l-cisteína S-óxido (aliina), se indica que posee actividad antioxidante, antihipertensiva, hipocolesterolemiante, preventiva del cáncer, de la diabetes, del síndrome metabólico, entre otros (Chung, 2006). Otra de las plantas que tiene un efecto insecticida es la altamisa (Ambrosia cumanensis), que posee aceites esenciales ricos en compuestos terpénicos y lactonas sesquiterpénicas. Se utiliza para curar las hemorroides y evitar la formación de abscesos, de igual forma se ha encontrado su acción contra insectos (Adams, 2001). Finalmente se encuentra la planta poleo (Clinopodium brownei), la cual se utiliza como antigripal, carminativo, efecto aperitivo, digestivo, colagogo, espasmolítico, expectorante, diurético, antiséptico, cicatrizante y repelente de insectos. Se destaca la presencia de la pulegona, p-menta-1(7), 8-dieno ,3-octanona, p-menten-9-ol, piperitona, isomentol (García, 1992). Lo anterior, es solo un ejemplo de las plantas que pueden tener acción insecticida o repelente y que por ello, pueden eventualmente ser usadas para el control biológico de parásitos en las ganaderías, dejando claro que la riqueza botánica es extensa y por ello son amplios los reportes encontrados en la literatura.

6.2.2.1 Clinopodium brownei (Sw.) (Poleo)

Clinopodium brownei (Sw) es una planta perenne de 10-20 cm, con tallos cuadrados y extensas hojas opuestas. Es pubescente en el vástago y el interior y exterior del cáliz. La corola es bilabiada, los labios son finos y delicados y puede contener pelos. Y es de color blanco-rosado a lila ó blanco (Pino et al., 1997) (Imagen 2)

Imagen 2. Poleo Clinopodium brownei (Sw.) (Toloza, 2012)

Taxonómicamente la planta se clasifica como sigue:

Reino: Plantae Orden: Lamiales Familia: Lamiaceae Género: Clinopodium Especie: Clinopodium brownei (Sw.) (Correa y Bernal, 1898)

6.2.2.2 Composición Química.

La esencia de poleo contiene fundamentalmente la pulegonas, seguido de otros compuestos como, a-tuyeno, a-pineno, sabineno, trans-p-mentano, b-pineno, 3octanona, b-mirceno, 3-octanol, p-menta-1(7), 8-dieno, limoneno, b-felandreno, 1,8cineol, mentona, isomentona, a-terpineol, piperitol, monoterpenos, monoterpenonas. De manera similar a como ocurre con las demás plantas medicinales, la proporción de cada metabolito secundario, depende de varios factores, dentro de los que se destaca, el estado de desarrollo de la planta, factores climáticos y ecológicos así como las características del suelo (Gioti et al., 2007).

6.2.2.3 Usos Medicinales

Con base en la composición química del poleo, esta planta se ha usado popularmente por sus aceites esenciales en medicina tradicional, aromaterapia, industrias farmacéutica y cosmética no solo por sus fragancias, sino también por la actividad biológica (bactericida, fungicida, antiparasitaria, etc.) que pueden presentar; así como por su actividad antioxidante, expectorante, diurética, antiséptica, cicatrizante y repelente de insectos (Bakkali et al., 2008).

Por otra parte, estudios científicos reportan el efecto del extracto acuoso de Clinopodium vulgare (L.) en las respuestas inflamatorias inducidas por LPS (lipopolisacáridos) de murinos RAW 264.7 macrófagos. Evidenciando que el extracto tiene fuertes propiedades de barrido de radicales libres y ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad de la xantina oxidasa, lo que disminuye los niveles de ROS intracelular. Y así se evidencia su propiedad antiinflamatoria (Burket al., 2009)

Estudios científicos reportan la acción antioxidante de Clinopodium brownei (Sw.) (Correa y Bernal 1989). De igual forma se demuestra un efecto acaricida de los aceites esenciales de algunas plantas (poleo, ylang, citronela, hierba de limón, árbol de té, y romero) a diferentes dosis (0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 y 0,00625 microlitro/cm2), utilizando tiempos de exposición de 5, 10, 20, 30 y 60 minutos, sobre ácaros del polvo (Dermatophgoides farinae y D. pteronyssinus), demostrando que algunas plantas, y dentro de ellas el poleo, poseen un efecto acaricida del 100% a 0,025 microlitros / cm2, durante 60 minutos (Korean,2006).

6.2.2.4 Métodos de Extracción

La extracción es una técnica de separación y purificación de sustancias biológicamente activas de los materiales inertes o inactivos de una planta, a partir de la utilización de un disolvente seleccionado y de un proceso de extracción adecuado, donde siempre se

obtiene por lo menos dos componentes; la solución extraída en su disolvente (extracto) y el residuo (Domínguez y Domínguez 1990).

Dentro de la farmacognosia existen gran número de métodos de extracción dentro de los cuales se encuentran.

*Soxhelt *Lixiviación *Maceración *Percolación *Infusión *Licuado

La extracción por el método Soxhlet, se realiza usando un aparato de extracción semicontinua, pues una de las fases el sustrato se agrega solo al principio, mientras que el solvente de extracción cumple un ciclo de extracción y purificación continua.

La purificación se realiza en forma paralela por destilación del solvente, de manera que el sustrato siempre está en contacto con el solvente puro. Se utiliza cuando es necesaria una extracción exhaustiva del compuesto activo.

El aparato se compone de varias partes en vidrio que se acoplan una a otras para permitir la extracción (Figura 1). Antes de colocar el material vegetal en el cuerpo del extractor, se debe colocar papel de filtro en el orificio inferior de éste, para evitar que se obstruya, cuando inicie la salida del extracto (sifonaje). Este compartimiento se acopla con la matriz que es un balón de vidrio el cual recibe el extracto con el solvente y va colocado sobre la estufa. Simultáneamente se han conectado las mangueras en las salida del tubo refrigerante, por las cuales se va a mantener un flujo constante de agua, que enfriará el extracto evaporado permitiendo su condensación (¸Zarnowski y Luque, 2004).

Tubo Refrigerante

Refrigerante Cuerpo Extractor

Tubo Conductor del Disolvente

Matriz Figura 1. Equipo de extracción Sohxlet (Mamidipally, 2004).

Es así como se coloca el material vegetal sin alcanzar el orificio superior del tubo conductor de disolvente, el cual debe quedar libre. Luego se adiciona el solvente escogido hasta que se logre humedecer el material vegetal, en su totalidad y se inicia el calentamiento, evitando que llegue a ebullición. Una vez inicia el proceso, el solvente circula por el tubo conductor de forma continua, pasando por el material vegetal, y llegando evaporado al tubo condensador, en el cual por la baja temperatura se hace líquido y nuevamente cae sobre cuerpo extractor al balón. El proceso culmina cuando el extracto sale traslúcido (Zarnowski et al, 2004).

Otros de los métodos de extracción es la lixiviación, proceso en el cual se extrae uno o varios solutos de un sólido mediante la utilización de un disolvente líquido. Ambas fases entran en contacto íntimo y el soluto o los solutos pueden difundirse desde el sólido a la fase liquida, lo que produce una separación de los componentes originales del solido (Weast, 1981).

Por otra parte, la maceración es un proceso de extracción solido-líquido, donde la materia prima posee una serie de compuestos solubles en el líquido de extracción que son los que se pretende extraer. El proceso de maceración genera dos productos que

pueden ser empleados dependiendo de las necesidades del uso, el sólido ausente de esencias o el propio extracto. La naturaleza de los compuestos extraídos depende de la materia prima empleada así como del líquido de extracción (Hernandez, 2002).

6.3 MARCO LEGAL

La ley 84 del 27 de diciembre de 1989 mediante la cual se normatiza el Estatuto Nacional de Protección de los Animales, en su artículo 2, tiene por objeto “prevenir y tratar el dolor y el sufrimiento de los animales”, en tal sentido, en el desarrollo de este trabajo, se dará cumplimiento a la norma debido a que la obtención de la garrapata no genera dolor o sufrimiento lo que no justifica el uso de analgesia o anestesia. De igual forma el artículo 24 del capítulo V, de la misma ley dispone que “el animal usado en cualquier experimento deberán ser puesto bajo los efectos de la anestesia lo suficiente fuerte para evitar que sufre dolor”, sin embargo, el retiro de las garrapatas del cuerpo de los bovinos, para el estudio no genera dolor que justifique someterlos a un estado de anestesia general riesgoso, ni tampoco a ningún tratamiento analgésico.

En el artículo 17 del capítulo V, de la misma ley, se afirma que puede haber sacrificio de animales en cuanto a “constituir una amenaza cierta o inminente para la salud pública o de los animales”, de acuerdo a este articulo lo que se busca con el desarrollo de este trabajo es encontrar una nueva alternativa para el control de la garrapata, en beneficio de la salud animal y humana.

6.4 MARCO GEOGRÁFICO

Este trabajo se desarrolló en San Miguel de Sema, donde se recogió el material vegetal y las garrapatas; y en la ciudad de Tunja, donde se elaboraron los extractos y las pruebas de eficacia in vitro

San Miguel de Sema es un municipio ubicado en la provincia del occidente del departamento de Boyacá (Figura 2) localizado a 5º 31´ 15” latitud norte y 73º 43´ 39” al oeste del meridiano de Greenwich; posee una extensión de 90 Km 2 (9.044 Ha), distribuida en área rural 99,77% y 0,23% en zona urbana. Se encuentra ubicado a 2.615 msnm, con altura máxima de 2.850 msnm y

mínima de 2500 msnm; su

temperatura media, anual es de 13ºC. El municipio limita por el norte con Chiquinquirá, por el sur con Guachetá, por el occidente con Ráquira y Tinjacá y por el oriente con Simijaca y Capellanía (Senado de la república. Municipios Colombianos, 1989).

Dentro de la actividad económica del municipio, se destaca la ganadería de leche; seguida por actividades agrícolas de consumo que llevan a que el municipio tenga una independencia relativa en cuanto a los centros de desarrollo regionales.

Figura 2. Ubicación de San Miguel de Sema en Boyacá (http://sanmigueldesema-boyaca.gov.co/)

Por su parte, Tunja es la capital del Departamento de Boyacá, ubicada en la zona del centro del Departamento (Figura 3).

Figura 3 .Ubicación de Tunja en Boyacá (http://www.tunja-boyaca.gov.co/)

Tunja se encuentra localizada en el Valle del Alto Chicamocha, sobre la Cordillera Oriental de los Andes en el centro del país. Se encuentra entre 2.800 y 3000 msnm, aproximadamente. La temperatura oscila entre 8oC y 13oC. La ciudad limita por el norte con la provincia de Tundama y el departamento de Santander; por el sur con la provincia de Márquez y el departamento de Cundinamarca; por el oeste con la provincia de Ricaurte y por el este, con las provincias, de Márquez y Sugamuxi (Alcaldía Mayor de Tunja 2005).

7. METODOLOGÍA

El estudio fue de tipo experimental debido a que se manipularon variables (variables independientes) y se evaluó el efecto de las mismas sobre las variables dependientes (mortalidad observada), con el fin de determinar mediante una prueba in vitro, la eficacia de los extractos

7.1 LUGAR DE ESTUDIO

Como ya se mencionó la colecta de garrapatas se hizo en el municipio de San Miguel de Sema, en la finca Santa Isabel, ubicada en la vereda Quintoque Centro. El secado del material vegetal, la elaboración de los dos tipos de extractos y las pruebas de eficacia in vitro, se realizaron en el Laboratorio de Nutrición Animal de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Sede Central Tunja – Boyacá

7.2 ANIMALES DE ESTUDIO

En el desarrollo del estudio, se utilizaron aproximadamente 500 garrapatas R.(B) microplus, obtenidas de bovinos naturalmente parasitados de la raza Holstein los cuales se mantienen en pastoreo. Las garrapatas se obtuvieron pasando la mano sobre la piel del animal, sujetándolas suavemente y desprendiéndolas con cuidado para no lesionarla, tal como lo describen Gallardo y Morales (1999). En tal proceso se tuvo precaución de colectar garrapatas de un peso aproximado de 120 mg (grandes) y de 80 mg (medianas) (Imagen 3). Las cuales se ubicaron en un recipiente de vidrio con tapa perforada y se transportaron hasta el laboratorio donde se llevó a cabo el estudio.

Imagen 3. Pesaje de garrapata R. (B) microplus,

7.2.1 Mantenimiento de las Garrapatas en el Laboratorio

Una vez llevadas las garrapatas al laboratorio, se limpiaron con solución salina estéril para retirar cualquier suciedad debida a colecta o el envió. Se secaron con papel secante y, con la ayuda de un pincel, se observaron una a una, buscando desechar aquellas que hubiesen tenido extremidades mutiladas o estuviesen muertas (Imagen 4).

Imagen 4. Selección de garrapata R. (B) microplus

Posteriormente, fueron valoradas por un parasitólogo, quien confirmo las características morfológicas propias del género a estudiar. Una vez seleccionadas, se pesaron en balanza analítica para conformar los grupos de grandes y medianas, estas fueron

repartidas en frascos de vidrio en grupos de 11, de acuerdo con los grupos de tratamiento, que se mencionarán más adelante (Imagen 5).

Imagen 5. Separación de las réplicas de garrapata R. (B) microplus,

Durante todo el estudio las garrapatas, distribuidas en los recipientes rotulados, se mantuvieron en la estufa a una temperatura constante de 20 oC y 80 90% humeded (Imagen 6)

Imagen 6. Recepción de garrapatas R. (B) microplus en laboratorio

7.3 DISEÑO METODOLÓGICO

Las garrapatas de estudio se dividieron en grandes y medianas de esta forma se conformaron ocho grupos de tratamiento por cada tamaño, con 11 garrapatas cada uno y haciendo cada ensayo por triplicado, por lo que cada tratamiento tuvo 33 garrapatas. Todos los procedimientos que se realizaron, fueron idénticos para las garrapatas grandes y para las medianas, para cada uno de los extractos, Sohxlet, etanólico en frio (casero) y para los grupos control, así:

Tratamiento 1-G. (Grupo Control Negativo) (N=33). Las garrapatas de este grupo se mantuvieron en las condiciones de laboratorio sin ser expuestas a ningún solvente.

Tratamiento 2-G (Grupo Control Negativo) (N=33). Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a agua destilada, de igual calidad que la empleada en las diluciones y para la elaboración de los extractos.

Tratamiento 3-G (Grupo Control Negativo) (N =33).Las garrapatas de este grupo fueron expuestas al solvente etanol a una concentración de 74%, el cual

se usó en las

diluciones y elaboración de los extractos.

Tratamiento 4-G (Grupo Control Positivo) (N= 33). Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a un producto comercial (Amitraz) preparado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta.

Tratamiento 5-G (Grupo Control Positivo) (N= 33). Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a un producto comercial (Cipermetrina) preparado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta.

Tratamiento 6-G (Grupo Control Positivo) (N= 33). Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a un producto comercial (Bendiocard) preparado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta.

Tratamiento 7-G (Extracto puro # 1) Las garrapatas de este grupo fueron expuestas al extracto etanólico puro, realizado a temperatura ambiente (extracto en frio). Tratamiento 8-G (Extracto puro # 2) Las garrapatas de este grupo fueron expuestas al extracto puro obtenido por el método Sohxlet (extracto en caliente).

La misma distribución de tratamientos presentada anteriormente, se realizó para las garrapatas medianas, generando en total dieciséis grupos cada uno con tres repeticiones Con base en los resultados obtenidos, con esta distribución de grupos de tratamiento, se procedió a realizar las diluciones respectivas a partir del extracto puro y usando agua destilada en relación 1:1, 1:5 (extracto: agua)

7.4. PROCEDIMIENTOS

7.4.1 Recolección de Material Vegetal

Se cortaron 10 kg de hojas de Clinopodium brownei (Sw.) (poleo), y se seleccionando únicamente aquellas que se encontraban completamente sanas, posteriormente se colocaron dentro de papel periódico para su transporte al laboratorio de Nutrición de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia en la ciudad de Tunja, para su respectivo secado, el cual se llevó a cabo en la estufa a una temperatura de 1000C en un tiempo de 24 horas, una vez transcurrido este tiempo las hojas quedaron totalmente secas y crujientes. Se procedió a separar las hojas del tallo, para luego ser llevadas al molino.

7.4.2 Elaboración del Extracto

Las hojas secas y separadas del tallo, fueron trituradas con las manos y divididas en dos partes. (Imagen 7).

Imagen 7. Trituración de las hojas secas de Clinopodium brownei (Sw.) (poleo)

Una parte se colocó dentro de un recipiente de vidrio para la posterior elaboración del extracto Sohxlet y la otra se pasó a un molino de martillo para la posterior elaboración del extracto etanólico en frio (casero)

7.4.3 Extracción por Soxhlet

Aproximadamente 50 gr de las hojas trituradas se colocaron en la cámara de extracción del equipo Soxhlet y simultáneamente se colocó el etanol 74%, en el contenedor del mismo equipo (Imagen 8).

Imagen 8. Material vegetal Clinopodium brownei (Sw.) en cámara de Soxhlet 48

Posteriormente, se le agregó 200 ml de etanol el cual fue cayendo al balón del equipo soxhlet una vez realizado este procedimiento se prosigue a montar todo el equipo, se inicia calentando el etanol evitando que haya ebullición (Imagen 9).

Extracto obtenido

Imagen 9. Obtención de extracto

Por las mangueras de enfriamiento se pasó de manera constante agua fría, lo que permitió la condensación del solvente y el posterior goteo de este, sobre el material vegetal, proceso que conduce a la extracción de los compuestos solubles en etanol. Este proceso se repitió cuantas veces fue necesario, hasta que se completó la extracción y el solvente salió traslúcido. (Imagen 10).

En razón a que el extracto así obtenido, contiene los metabolitos recuperados a partir de las hojas de la planta, pero también contiene el etanol usado como solvente, se tuvo que evaporar este último, con el fin de evitar la presencia de residuos alcohólicos en el extracto. Fue así como el extracto se colocó en un extractor de grasas, y finalmente en baño maría durante 30 minutos (Imagen 11).

Mangueras de Enfriamiento

Material Vegetal con el etanol

Extracto recuperado

Imagen 10. Equipo Soxhlet empleado en la extraccion

La utilizaci贸n del extractor de grasas se basa en que en la obtenci贸n de las mismas se usan solventes, los cuales pueden ser evaporados para concentrar la muestra recuperada, principio que se adapta a la extracci贸n de solventes usados por el m茅todo Sohxlet.

Imagen 11. Extractor de grasas

7.4.4 Extracción Etanólica en Frio (Casero)

Se tomó la parte restante de las hojas secas y se molió en un molino de martillo, obteniendo así 50gr una vez se obtuvo el polvo, se colocaron los 50 gr de éste en un balde plástico con tapa, con 312,5 ml de alcohol al 74% y 225 ml de agua. Esta mezcla se agitó y se dejó en reposo por 10 días revolviéndolo cada 12 horas. Cumplido este tiempo se obtuvo el extracto (Fonseca et al., 2009).

7.4.5 Prueba de Eficacia In Vitro

La evaluación de la eficacia de los extractos, se

realizó mediante la prueba de

inmersión de adultas, que consistió en utilizar vasos de precipitado de 100 ml, en los cuales se adicionó la solución correspondiente a cada grupo de tratamiento y se depositaron las garrapatas correspondientes, dejándolas por 30 minutos Drummond et al., (1967) (Imagen 12). Cumplido el tiempo se extrajo el líquido, usando un colador y finalmente se colocaron sobre papel periodico para que se secaran.

Imagen 12. Prueba de inmersión de garrapata R. (B) microplus

Posteriormente se observaron

cada 24 horas, durante 4 días, con ayuda de una

lámpara, con el fin de determinar el porcentaje de mortalidad, empleando para ello la siguiente fórmula:

Total de Garrapatas Muertas % de Mortalidad = -------------------------------------------Total de garrapatas expuestas

X 100

El movimiento de las patas es la manifestación de que la garrapata está viva y por el contrario, la ausencia de dicho movimiento o de algún tipo desplazamiento, indica que la misma, está muerta.

7.5 ANALISIS DE DATOS

Los resultados de mortalidad y supervivencia, se analizaron inicialmente en términos porcentuales para cada grupo de tratamiento, incluyendo los controles, positivos y negativos y se presentan de manera descriptiva.

Posteriormente, se elaboraron tablas de 2 x 2, en las que se enfrentó la exposición a cada tratamiento (expuestos) y al grupo control (agua destilada) (no expuestos), contra el número de garrapatas muertas y vivas, así:

Evento

MUERTOS

VIVOS

EXPUESTOS

NO EXPUESTOS

Exposición

A partir de esta organización de los resultados, se calculó el RR (riesgo relativo), el cual permite determinar la relación de causalidad entre un evento y la exposición a un tratamiento. Fue así, como se estableció

la relación entre la exposición a cada

tratamiento con la presentación de muerte en las garrapatas. El RR se obtuvo con la siguiente fórmula:

A -------A+B RR = ------------------------C ------C+D (Sackettd et al., 1998) Como se mencionó, el RR se utilizó para determinar si había relación entre la exposición a un tratamiento y la muerte de las garrapatas, interpretándose el resultado así: RR < 1: Es un factor de protección, la exposición al tratamiento mortalidad de las garrapatas. . RR = 1: Se considera un valor nulo, no existe relación.

no produce la

RR > 1 Es un factor de riesgo, hay relación entre la exposición al tratamiento y la mortalidad de las garrapatas. Adicionalmente, con el fin de establecer si existieron diferencias en las mortalidades producidas por cada tratamiento, es decir diferencias entre grupos, así como entre garrapatas grandes y medianas, se realizó un análisis de varianza (ANOVA), mediante este análisis se compararon los promedios obtenidos en cada grupo y cuando el P valor, fue < 0,05 se estableció que había diferencia y en tal caso se aplicó la prueba de comparación múltiple de diferencia mínima significativa, para establecer la significancia de la misma.

8. HIPÓTESIS

Hipótesis

Alternativa (Ha): El

extracto de poleo Clinopodium brownei (Sw) posee

efecto ixodicida sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus.

Hipótesis Nula (Ho): El extracto de poleo Clinopodium brownei (Sw) no posee efecto ixodicida sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus

9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

9.1 RESULTADOS

9.1.1 Identificación de la Planta

La identificación taxonómica se llevó a cabo en el Herbario de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, donde indicaron: Familia: Laminaceae Género: Clinopodium Especie: Clinopodium brownei (Sw) Kuntze (Anexo 1)

9.1.2 Extractos Obtenidos

El extracto obtenido por el método Soxhlet, fue acuoso, de color verde esmeralda y no fue traslúcido. El extracto “casero” se diferenció del anterior en el color, ya que éste fue verde-café, dando una tonalidad notoriamente más oscura.

9.1.3 Evaluación de la Eficacia Ixodicida

Los resultados obtenidos en los tratamientos de garrapatas expuestas a cada uno de los extractos, Sohxlet y en frio (casero), así como a los tratamientos control, se presentarán de forma descriptiva. La observación de la mortalidad se hizo inmediatamente después de la exposición luego a las 24, 48, 72 y 96 horas.

9.1.3.1 Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto Sohxlet Puro.

De las 33 garrapatas del presente grupo (tres réplicas), dos murieron inmediatamente después de la exposición; a las 24 horas murió una más, a las 48 horas murieron tres más y en la última lectura habían muerto 8 de las 33 garrapatas. Tabla 1. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto etanólico (Soxhlet), puro de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 0,6± 0,5

24 0 (0/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,0 ± 1,0

48 2 (2/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 2,0± 2,0

72 2 (2/11) 4 (4/11) 1 (1/11) 2,3± 1,5

96 2 (2/11) 4 (4/11) 2 (2/11) 2,6± 1,1

TOTAL DE GARRAPATA S MUERTAS

Estos mismos resultados expresados en términos de porcentaje de mortalidad, muestran que la mayor mortalidad encontrada fue a las 72 y 96 horas, alcanzando 35%, cuando se tuvieron en cuenta las réplicas de manera individual (Figura 4). Sin embargo, cuando se analiza el porcentaje de mortalidad con los promedios de garrapatas muertas, obtenidos de las tres réplicas, estos estuvieron entre 5,45 y 36,3%. Por su parte, la mortalidad total alcanzada en el tiempo de estudio con las 8 garrapatas muertas fue de 24,2%

Figura 4. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet puro en los tiempos de observación.

9.1.3.2 Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto Sohxlet en Dilución 1:1 (Extracto: Agua)

Al momento de la exposición al extracto solo una garrapata de las tres réplicas murió; a las 24 horas murieron dos más; el total de garrapatas muertas a las 48 horas después de la exposición fue 5; una más murió a las 72 horas y finalizada la observación habían muerto en total 7 garrapatas de las 33 (Tabla 2)

Tabla 2. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto etanólico (Soxhlet), en dilución 1:1 de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

24 0 (0/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,0 ± 1,0

48 1 (1/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 1,6± 1,1

72 1 (1/11) 4 (4/11) 1 (1/11) 2,0± 1,7

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 1 (1/11) 4 (4/11) 2 (2/11) 2,3± 1,5

Fue así como teniendo en cuenta todos los tiempo de observación,

la mortalidad

individual de cada réplica, estuvo entre 0% y 33% (Figura 5); y al observar dicha mortalidad teniendo en cuenta el promedio de las tres réplicas , la mortalidad en el tiempo 0, es decir inmediatamente después de

la exposición fue de 2,7% y fue

aumentando a 9%, 14,5%, 18,1% y 20,9% a las 24, 48, 72 y 96 horas respectivamente; a partir de las 48 horas hubo por lo menos una garrapata muerta en todas las réplicas. La mortalidad total para el grupo fue de 7 garrapatas, que equivale a 21,2%

4,5 4

% Mortalidad

3,5 3 2,5

Replica 1

Replica 2

1,5

Replica 3

1 0,5 0 0

Tiempo/Horas

Figura 5. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:1 en los tiempos de observación 9.1.3.3 Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto Sohxlet en Dilución 1:5 (Extracto: Agua)

Inmediatamente después de la exposición, murieron tres garrapatas de las tres réplicas, que equivale a una en promedio. A las 24 horas murieron dos más, sumando un total de 5 muertas para ese tiempo de muestreo (1,6 en promedio); a las 48 horas no hubo nuevas mortalidades y a las 72 habían muerto dos nuevas garrapatas y así se mantuvo hasta las 96 horas (Tabla 3). De esa manera el total de garrapatas muertas fue de 7

Tabla 3. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto etanólico (Soxhlet), en dilución 1:5 de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,0± 1,0

24 1 (1/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 1,6 ± 1,5

48 1 (1/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 1,6± 1,5

72 2 (2/11) 4 (4/11) 1 (1/11) 2,3± 1,5

96 2 (2/11) 4 (0/11) 1 (1/11) 2,3± 1,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Los porcentajes de mortalidad al tener en cuenta las réplicas por separado, estuvieron entre 0% y 36% (Figura 6) y al tener en cuenta los promedios de las tres réplicas, se encontraron mortalidades entre 9,1% y 21%. Teniendo en cuenta el total de garrapatas muertas en este tratamiento, la mortalidad total fue de 21,2%.

4,5 4

% Mortalidad

3,5 3 2,5

Replica 1

Replica 2

1,5

Replica 3

1 0,5 0 0

Tiempos/ Horas

Figura 6. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus, expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:5 en los tiempos de observación.

9.1.3.4 Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto en Frio (Casero) Puro

En este grupo hubo una mortalidad total de 7 garrapatas inmediatamente después de la exposición al extracto, que para la hora 24, post-exposición, había aumentado a 10, es decir que dos garrapatas murieron para ese tiempo de observación. En las 48 horas no hubo mortalidad y a las 72 horas solo una garrapata murió. En la última lectura se observó que de las 33 garrapatas, 12 habían muerto (Tabla 4)

Al evaluar el porcentaje de mortalidad de cada réplica en todo el tratamiento, para este grupo, se encuentra que estuvo entre 9% y 45%. Sin embargo, al considerar los

promedios de las tres réplicas en las cinco observaciones, la mortalidad estuvo entre 20,9% y 36,3% (Figura 7).

Tabla 4. Cantidad de garrapatas R. (B.) microplus muertas, expuestas a extracto en frio (casero) puro de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 2 (2/11) 1 (1/11) 4 (4/11) 2,3± 1,5

24 4 (4/11) 2 (2/11) 4 (4/11) 3,3 ± 1,5

48 4 (4/11) 2 (2/11) 4 (4/11) 3,3± 1,5

72 4 (4/11) 3 (3/11) 4 (4/11) 3,6± 0,5

96 4 (4/11) 3 (0/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Se considera que la mortalidad total para este grupo fue de 36,36%, que corresponde a 12 garrapatas muertas.

Figura 7. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto frio puro en los tiempos de observación.

9.1.3.5 Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto en Frio (casero) en Dilución 1:1 (Extracto: Agua).

Del total de garrapatas (N= 33), dos murieron al momento de la exposición al extracto; hacia las 24 horas dos más habían muerto y una más hacia las 48 horas; en las 72 horas una más murió y a las 96 horas otra murió. Finalmente fueron 7 garrapatas las que murieron en este tratamiento (Tabla 5).

Tabla 5. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto en frio (casero) puro en dilución 1:1 de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 1 (1/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,6± 0,5

24 2 (2/11) 2 (2/11) 0 (2/11) 1,3 ± 1,1

48 2 (2/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,6± 0,5

72 2 (4/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 2,0± 1,0

96 2 (2/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 2,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Los porcentajes de mortalidad individual, en los cinco tiempos de observación, estuvieron entre 0% y 27,2% (Figura 8) y cuando se analizaron con base en los promedios de garrapatas muertas, dicho porcentaje estuvo entre 5,45% y 20,9%. La mortalidad equivalente a las 7 garrapatas muertas en todo el tratamiento fue de 21,2%

Figura 8. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto frio en dilución 1:1 en los tiempos de observación.

9.1.3.6 Exposición de Garrapatas Grandes al Extracto en Frio en Dilución 1:5 (Extracto: Agua)

Inmediatamente después de la exposición al extracto, no hubo ninguna garrapata muerta. Hacia las 24 horas dos habían muerto y una más en las 48 horas; en las 72 horas dos más murieron y no hubo muertes en la última observación (Tabla 6).

Tabla 6. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto en frio (casero) puro en dilución 1:5 de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

24 0 (0/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 0,6 ± 0,5

48 1 (1/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 1,0± 0,0

72 2 (2/11) 1 (1/11) 2 (2/11) 1,6± 0,5

96 2 (2/11) 1 (1/11) 2 (2/11) 1,6± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

El porcentaje de mortalidad de las réplicas por separado, se encontraron entre 0% y 18,1%, siendo mayor hacia las 72 y 96 horas post-exposición (Figura 9). El porcentaje

de mortalidad con base en los promedios de las tres réplicas, estuvo entre 0 y 14,5%. El total de garrapatas muertas fue de cinco, que equivale a 15,1%

9.1.3.7 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto Sohxlet Puro

De las 33 garrapatas del presente grupo (tres réplicas), cuatro murieron inmediatamente después de la exposición; a las 24 horas murió una más, a las 48 horas murieron tres más y en la última lectura habían muerto 11 en total. 2,5

%Mortalidad

2 1,5 Replica 1

Replica 2

0,5

Replica 3

0 0

Tiempos/ Horas

Figura 9. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas al extracto en frio en dilución 1:5 en los tiempos de observación.

Tabla 7. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto (Sohxlet) puro de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 1 01/11) 1 (1/11) 3 (3/11) 1,6± 1,1

24 1 (1/11) 2 (2/11) 3 (3/11) 2,0 ± 1,0

48 2 (2/11) 3 (3/11) 4 (4/11) 3,0± 1,0

72 3 (3/11) 3 (1/11) 5 (5/11) 3,6± 1,1

96 3 (3/11) 3 (3/11) 5 (5/11) 3,6± 1,1

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Estos mismos resultados expresados en términos de porcentaje de mortalidad, muestran que la mayor mortalidad encontrada fue a las 72 y 96 horas, alcanzando 45.5%, cuando se tuvieron en cuenta las réplicas de manera individual (Figura 10). Sin embargo, cuando se analiza el porcentaje de mortalidad con los promedios de garrapatas muertas, de las tres réplicas, estuvieron entre 5-45%. La mortalidad total alcanzada en el tiempo de estudio con las 11 garrapatas muertas fue de 33,3%

% Mortalidad

5 4 3

Replica 1 Replica 2

Replica 3

1 0 0

Tiempos / Horas

Figura 10. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet puro en los tiempos de observación.

9.1.3.8 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto Sohxlet en Dilución 1:1 (Extracto: Agua)

Al momento de la exposición al extracto ninguna de las garrapata de las tres réplicas murió; a las 24 horas murieron dos; el total de garrapatas muertas a las 48 horas después de la exposición fue 4; se mantuvo así hasta 72 horas y finalizada la observación habían muerto en total 5 garrapatas de las 33 (Tabla 8 ).

Tabla 8. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto Sohxlet) en dilución 1:1 de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

24 1 (1/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,6 ± 0,5

48 1 (1/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,3± 0,5

72 1 (3/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 2 (2/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,6± 0,5

Fue así como teniendo en cuenta todos los tiempo de observación,

la mortalidad

individual de cada réplica, estuvo entre 0% y 18% (Figura11); y al observar dicha mortalidad teniendo en cuenta el promedio de las tres réplicas, la mortalidad en el tiempo 0, es decir inmediatamente después de la exposición fue 0% y fue aumentando a 9%, y 18,2% a las 24, manteniéndose así hasta las 96 horas respectivamente; en todas las réplicas. La mortalidad total para el grupo fue de 5 garrapatas, que equivale a 15,1%

Figura 11. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:1 en los tiempos de observación

9.1.3.9 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto Sohxlet en Dilución 1:5 (Extracto: Agua)

Inmediatamente después de la exposición, murió una garrapata de las tres réplicas, que equivale a 0,3 en promedio.

A las 24 horas murieron tres más, sumando un total de 4 muertas para ese tiempo de muestreo (1,3 en promedio); a las 48 horas hubo una muerta más y a las 72 se mantuvo las mismas mortalidades de garrapatas, a las 96 horas murió una garrapata más (Tabla 9). De esa manera el total de muertas fue de 6.

Tabla 9. Cantidad de garrapatas R. (B.) microplus muertas, expuestas a extracto (Sohxlet) en dilución 1:5 de Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 0/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

24 1 (1/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,3 ± 0,5

48 1 (1/11) 2 (2/11) 2 (2/11) 1,6± 0,5

72 1 (3/11) 2 (2/11) 2 (2/11) 1,6± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 1 (1/11) 2 (2/11) 3 (3/11) 2,0± 1,0

Los porcentajes de mortalidad calculados teniendo en cuenta las réplicas por separado, estuvieron entre 0% y 27% (Figura 12) y al hacerlo con base en los promedios de las tres réplicas, se encontraron mortalidades entre 9,1% y 18,2%. Teniendo en cuenta el total de garrapatas muertas en este ensayo, la mortalidad total fue de 18,1%.

Figura 12. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto Sohxlet en dilución 1:5 en los tiempos de observación.

9.1.3.10 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto en Frio (Casero) Puro

En este grupo hubo una mortalidad total de 9 garrapatas inmediatamente después de la exposición al extracto, que para la hora 24, post-exposición, había aumentado a 10, es decir que una garrapata murió para ese tiempo de observación. En las 48 horas no hubo mortalidad y a las 72 horas dos garrapatas murieron. En la última lectura se observó que de las 33 garrapatas, 12 habían muerto (Tabla 10).

Tabla 10. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto en frio (casero) puro Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 1 1/11) 4 (4/11) 4 (4/11) 3,0± 1,7

24 2 (2/11) 4 (4/11) 4 (4/11) 3,3 ± 1,1

48 2 (2/11) 4 (4/11) 4 (4/11) 3,3± 1,1

72 3 (3/11) 4 (4/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

96 3 (3/11) 4 (4/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Al evaluar el porcentaje de mortalidad de cada réplica en todo el estudio, para este grupo se encuentra que estuvo entre 9% y 45%. Sin embargo, al considerar los promedios de las tres réplicas en las cinco observaciones, la mortalidad estuvo entre 20,9% y 36,3% (Figura 13). La mortalidad total para este grupo fue de 36,3%, que corresponde a las 12 garrapatas muertas.

Figura 13. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto en frio puro en los tiempos de observación.

9.1.3.11 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto en Frio en Dilución 1:1 (Extracto: Agua)

Del total de garrapatas (N= 33), una murió al momento de la exposición al extracto; hacia las 24 horas una garrapata más había muerto y una más hacia las 48 horas; en las 72 horas dos más murieron y a las 96 horas dos más murieron. Finalmente fueron 7 garrapatas las que murieron en este ensayo (Tabla 11).

Tabla 11. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas expuestas a extracto en frio (casero) en dilución 1:1 Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA 1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 24 48 72 96 0 0 1 1 2 0/11) (0/11) (1/11) (1/11) (2/11) 1 1 1 2 2 (1/11) (1/11) (1/11) (2/11) (2/11) 0 1 1 2 3 (0/11) (1/11) (1/11) (2/11) (3/11) 0,3± 0,5 0,6 ± 0,5 1,0± 0,0 1,6± 0,5 2,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Los porcentajes de mortalidad individual en cada replica por separado en los cinco tiempos de observación

estuvieron entre

0% y 27,2% (Figura 14) y cuando se

analizaron con base en los promedios, dicho porcentaje estuvo entre 9,1% y 18,2%. La mortalidad de las 7 garrapatas en todo el tratamiento equivale a 21,2%

Figura 14. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto en frio en dilución 1:1 en los tiempos de observación.

9.1.3.12 Exposición de Garrapatas Medianas al Extracto en Frio en Dilución 1:5 (Extracto: Agua)

Inmediatamente después de la exposición, una garrapata murió; hacia las 24 horas dos; en las 72 horas una más, y a las 96 horas, otra garrapata murió (Tabla 12). Tabla 12. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a extracto en frio (casero) en dilución 1:5 Clinopodium brownei (Sw.) REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0.3 + 0,5

24 0 (0/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,1± 1,1

48 0 (0/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,1 ±1,1

72 1 (1/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 1,3 ± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 1 (1/11) 2 (2/11) 2 (2/11) 1,6 ±0,5

El porcentaje de mortalidad de las réplicas por separado, estuvo entre 0% y 9,1%, siendo mayor hacia las 72 y 96 horas post-exposición (Figura15). El porcentaje de mortalidad calculado con base en los promedios de las tres réplicas, estuvo entre 0 y 18,1%. El total de garrapatas muertas fue cinco, que equivale a 15,1%

Figura 15. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas al extracto en frio en dilución 1:1 en los tiempos de observación.

9.1.3.13 Exposición de Garrapatas Grandes a Agua Destilada

En este grupo, no se observó mortalidad inmediata, frente a la exposición a agua destilada, sin embargo a las 24 horas una garrapata de las tres réplicas (1/33), murió, siendo la única en todo el tratamiento (Tabla 13). Tabla 13. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas agua destilada REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0.0+ 0,0

24 0 (0/11) 0 (0/11) 1 (1/11) 0,3± 0,5

48 0 (0/11) 0 (0/11) 1 (1/11) 0,3± 0,5

72 0 (0/11) 0 (0/11) 1 (1/11) 0,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 0 (0/11) 0 (0/11) 1 (1/11) 0,3± 0,5

Ninguna garrapata murió inmediatamente después de la exposición y a las 24 horas, solo una murió, lo que equivale a mortalidad de 9,09%, para las 24, 48, 72 y 96 horas (Figura16). Habiendo muerto solo una garrapata en todo el ensayo, la mortalidad total fue 3%

Figura16. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus

expuestas agua destilada en los tiempos de observación. 9.1.3.14 Exposición de Garrapatas Medianas Agua Destilada

Inmediatamente después de la exposición no hubo ninguna garrapata muerta; hacia las 24 horas una había muerto y otra lo hizo a las 72 horas (Tabla 14)

Tabla 14. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas agua destilada CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total)

REPLICA

1 2 3 + DS

0 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0.0+ 0,0

24 0 (0/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

48 0 (0/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

72 0 (0/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 0,6± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 0 (0/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 0,6± 0,5

Para este grupo la mortalidad de cada réplica estuvo entre 0% y 9,09% (Figura 17) y considerando los promedios de mortalidad de las tres réplicas, estuvo entre 0% y 5,4%. En total murieron 2 garrapatas, que corresponde a 6,06%

1,2

% Mortalidad

1 0,8 Replica 1

0,6

Replica 2

0,4

Replica 3 0,2 0 0

48 Tiempos/Horas

Figura17. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas agua destilada en los tiempos de observación. 9.1.3.15 Exposición de Garrapatas Grandes a Etanol

En ninguna de las réplicas y para ningún tiempo de lectura se encontró mortalidad en este grupo (Tabla 15). Tabla 15. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a etanol REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0.0+ 0,0

24 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

48 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

72 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

96 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

9.1.3.16 Exposición de Garrapatas Medianas a Etanol

Al momento de la exposición a etanol, una garrapata de una de las réplicas murió y dos lo hicieron hacia las 96 horas post-exposición Tabla 16. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a etanol REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 1 (1/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0.3+ 0,5

24 1 (1/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

48 1 (1/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

72 1 (1/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

96 1 (1/11) 0 (0/11) 2 (2/11) 1,0±1,0

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

El porcentaje de mortalidad individual para cada réplica estuvo entre 0 y 18,1% (Figura 18). Teniendo en cuenta que murieron tres garrapatas en todo el tratamiento, la mortalidad total fue 9,09%

Figura18. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas a etanol en los tiempos de observación.

9.1.3.17 Exposición de Garrapatas Grandes a Condiciones de Laboratorio

Hubo una muerte a las 24 horas y la segunda a las 72 horas (Tabla 17). Tabla 17. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas en condiciones de laboratorio REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0.0+ 0,0

24 0 (1/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

48 0 (0/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

72 0 (0/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 0,6± 0,5

96 0 (0/11) 1 (1/11) 1 (1/11) 0,6± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

El porcentaje de mortalidad, considerando las réplicas por separado, estuvo entre 0% y 9,09% (Figura 19). Murieron dos garrapatas en todo el tratamiento, lo que corresponde a 6,06% de mortalidad total.

Figura19. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus a condiciones de laboratorio en los tiempos de observación

9.1.3.18 Exposición de Garrapatas Medianas a Condiciones de Laboratorio

De las 33 garrapatas utilizadas una murió, a las 48 horas de exposición (Tabla 18). La mortalidad total encontrada para el ensayo fue una, por lo que la mortalidad total para el tratamiento fue 3.03%. Tabla 18. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas en condiciones de laboratorio CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total)

REPLICA

1 2 3 + DS

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0.0+ 0,0

0 (0/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,0± 0,0

1 (1/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 0,3± 0,5

1 (1/11) 0 (0/11) 0 (0/11) 1,0± 1,0

9.1.3.19 Exposición de Garrapatas Grandes a Cipermetrina

En este grupo hubo una mortalidad total de 10 garrapatas (10/33), inmediatamente después de la exposición al producto. A las 48 horas, otra garrapata murió y otra lo hizo a las 72 horas. De las 33 garrapatas, 12 habían muerto (Tabla 19)

Tabla 19. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuesta a cipermetrina REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 4 (4/11) 2 (2/11) 4 (4/11) 3.3+ 1,1

24 4 (4/11) 2 (2/11) 4 (4/11) 3,3± 1,5

48 4 (4/11) 3 (3/11) 4 (4/11) 3,6± 0,5

72 4 (4/11) 3 (3/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

96 4 4/11) 3 (3/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

El porcentaje de mortalidad de cada réplica, para este grupo estuvo entre 18,2% y 45%. Sin embargo, al considerar los promedios de las tres réplicas, la mortalidad estuvo entre 20,9% y 36,3% (Figura 20). La mortalidad total para este grupo fue de 36,36%, que corresponde a las 12 garrapatas muertas

Figura 20. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas a cipermetrina en los tiempos de observación. 10.1.3.20 Exposición de Garrapatas Medianas a Cipermetrina

Del total de garrapatas (N= 33), tres murieron al momento de la exposición al producto; hacia las 24 horas dos garrapatas más habían muerto y una más hacia las 48 horas; en las 72 horas, se mantuvo esta cifra y a las 96 horas otra murió. Finalmente fueron 7 garrapatas las que murieron en este tratamiento (Tabla 20). Tabla 20. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas cipermetrina REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 2 (2/11) 1 (1/11) 0 (0/11) 1.0+ 1,0

24 2 (1/11) 1 (1/11) 2 (2/11) 1,6± 0,5

48 2 (2/11) 2 (2/11) 2 (2/11) 2,0± 0,0

72 2 (2/11) 2 (2/11) 2 (2/11) 2,0± 0,0

96 2 (2/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 2,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Los porcentajes de mortalidad individual (cada réplica por separado), en los cinco tiempos de observación, estuvieron entre 0% y 27,2% (Figura 21) y cuando se analizaron con base en los promedios de garrapatas muertas, el porcentaje estuvo entre 5,45% y 20,9%. Las 7 garrapatas muertas en todo el tratamiento equivalen a 21,2%

Figura 21. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas a cipermetrina en los tiempos de observación. 9.1.3.21 Exposición de Garrapatas Grandes Amitraz.

Inmediatamente después de la exposición, murieron 11 garrapatas de las tres réplicas (3,6 en promedio). A las 24 horas murieron dos más, sumando un total de 13 muertas para ese tiempo de muestreo, la mortalidad fue 4,3 % (Tabla 21).

Tabla 21. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuesta a amitraz REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 3 (3/11) 4 (4/11) 4 (4/11) 3.+ 0,5

24 3 (3/11) 4 (4/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

48 3 (3/11) 4 (4/11) 5 (5/11) 4,0± 1,0

72 4 (4/11) 4 (4/11) 5 (5/11) 4,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 4 (4/11) 4 (4/11) 5 (5/11) 4,3± 0,5

Los porcentajes de mortalidad de las réplicas por separado, estuvieron entre 9,09% y 15,1% (Figura 22) y al tener en cuenta los promedios de las tres réplicas, se encontraron mortalidades entre 27,3% y 45,5%. Teniendo en cuenta el total de garrapatas muertas en este tratamiento, la mortalidad total fue de 39,3%.

Figura 22. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas amitraz en los tiempos de observación. 9.1.3.22 Exposición de Garrapatas Medianas Amitraz

Al momento de la exposición al producto murieron seis garrapata de las tres réplicas; a las 24 horas murió una más, otra a las 72 horas y a las 96 murió una más, finalizando en un total de 9 garrapatas de las 33 (Tabla 22).

Tabla 22. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a amitraz REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 3 (3/11) 2 (2/11) 1 (1/11) 2.0+ 1,0

24 3 (3/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 2,3± 1,1

48 3 (3/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 2,6± 0,5

72 3 (3/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 2,6± 0,5

96 4 (4/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 3,0± 1,0

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

Los porcentajes de mortalidad al tener en cuenta las réplicas por separado, estuvieron entre 3,0% y 12,1% (Figura 23) y al tener en cuenta los promedios de las tres réplicas, se encontraron mortalidades entre 9,1% y 36,4%. Teniendo en cuenta el total de garrapatas muertas en este ensayo, la mortalidad total fue de 27,2%

Figura 23. Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas amitraz en los tiempos de observación. 9.1.3.23 Exposición de Garrapatas Grandes a Bendiocarb.

Del total de garrapatas, doce murieron al momento de la exposición al producto; hacia las 24 horas dos garrapatas más habían muerto y tres más hacia las 48 horas;. Finalmente fueron 17 garrapatas las que murieron con este tratamiento (Tabla 23) Tabla 23. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuestas a bendiocarb REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 3 (3/11) 5 (5/11) 4 (4/11) 4.0+ 1,0

24 5 (5/11) 5 (5/11) 4 (4/11) 4,6± 0,5

48 5 (5/11) 6 (6/11) 6 (6/11) 5,6± 0,5

72 5 (5/11) 6 (6/11) 6 (6/11) 5,6± 0,5

96 5 (5/11) 6 (6/11) 6 (2/11) 5,6± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

El porcentaje de mortalidad de cada réplica en todo el tratamiento, estuvo entre 18% y 54%. Sin embargo, al considerar los promedios de las tres réplicas en las cinco observaciones, la mortalidad estuvo entre 30,9% y 51,5% (Figura 24). La mortalidad total para este grupo fue de 51,5%, que corresponde a las 17 garrapatas muertas

Figura 24. Porcentaje de mortalidad de garrapatas grandes R. (B) microplus expuestas a bendiocard en los tiempos de observación. 9.1.3.24 Exposición de Garrapatas Medianas a Bendiocarb.

De las 33 garrapatas del presente grupo (tres réplicas), 4 murieron inmediatamente después

de la exposición; a las 24 horas murieron 2 más y en la última lectura murió

una más para un total de muertas de 8 de las 33 garrapatas (Tabla 24)

Tabla 24. Cantidad de garrapatas R. (B) microplus muertas, expuesta a bendiocarb REPLICA

1 2 3 + DS

CANTIDAD DE GARRAPATAS MUERTAS EN DIFERENTES TIEMPOS ( # Muertas/Total) 0 1 (1/11) 2 (0/11) 1 (1/11) 1.3+ 0,5

24 2 (2/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 2,0± 1,0

48 2 (2/11) 3 (3/11) 1 (1/11) 2,0± 1,0

72 2 (2/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 2,3± 0,5

TOTAL DE GARRAPATAS MUERTAS

96 3 (3/11) 3 (3/11) 2 (2/11) 2,6± 0,5

Los porcentajes de mortalidad individual (cada réplica por separado), en los cinco tiempos de observación, estuvieron entre 9,1% y 27,3% (Figura 25), y la mortalidad equivalente a las 8 garrapatas muertas en todo el tratamiento fue de 24,2%.

Figura 25.Porcentaje de mortalidad de garrapatas medianas R. (B) microplus expuestas a Bendicard en los tiempos de observación. 9.1.4. Consolidación de Resultados

Una vez presentados los resultados de cada uno de los tratamientos evaluados en el trabajo, se presentarán en forma consolidada, para facilitar la comparación de los mismos, entre grupos.

9.1.4.1 Resultados Grupos Tratados y Controles Positivos

Considerando los promedios de mortalidad encontrados en cada grupo de tratamiento, se encuentra que hubo mayor porcentaje de mortalidad en las garrapatas grandes que estuvieron expuestas

a bendiocarb, amitraz, extracto frio puro y cipermetrina con

porcentajes de 51,5%, 39,3%, 36,6% y 36,3%, respectivamente. Por su parte, en las garrapatas medianas

fue más eficaz el extracto puro elaborado en frío, seguidos

extracto Sohxlet puro y el tratamiento que produjo menor mortalidad fue extracto en frio en dilución 1:5 (Tabla 25). Tabla 25. Porcentajes de mortalidad promedio en los grupos tratados y productos comerciales en los dos tamaños de garrapatas

TRATAMIENTO SOXHELT PURO SOXHELT 1:1 SOXHELT 1:5 FRIOPURO FRIO 1:1 FRIO 1:5 CIPERMETRINA AMITRAZ BENDIOCARD

GARRAPATAS GRANDES # Muertas % Mortalidad 8 24.2 7 21.1 7 21.1 12 36.6 7 21.1 5 15.1 12 36.3 13 39.3 17 51.5

GARRAPATAS MEDIANAS # Muertas % Mortalidad 11 33.3 5 15.1 6 18.1 12 36.3 7 21.1 5 15.1 7 21.2 9 27.2 8 24.2

9.1.4.2 Resultados Grupos Control Negativo

De acuerdo con lo indicado, los grupos control, ambiente, agua y alcohol, se incluyeron en el estudio con el fin de demostrar que las condiciones de laboratorio no afectaron a las garrapatas y por ello no causaron la mortalidad observada; igualmente que el agua usada para las diluciones y el alcohol usado en la elaboraciรณn de los dos tipos de extracto, no tiene efecto ixodicida. Esto se pudo demostrar ya que la mortalidad total observada fue 6%, 3% y 0% para los grupos ambiente, agua y etanol, respetivamente.

9.1.4.3 Comparaciรณn entre Grupos

Buscando establecer si existe diferencia significativa entre las mortalidades producidas por los tratamientos evaluados, en los dos tipos de garrapatas, se plantearon las siguientes hipรณtesis:

* Hipรณtesis Nula (Ho): Los promedios de mortalidad obtenidas entre grupos de tratamiento en las garrapatas grandes y medianas no muestra diferencias significativas (P<0,05)

* Hipรณtesis Alterna (Ha): Por lo menos uno de los promedios de mortalidad obtenidas entre grupos de tratamiento en las garrapatas grandes y medianas muestra diferencias significativas (P<0,05) 83

Con base en los resultados de valor P de anova (P=0; P<0,05), se establece que por lo menos uno de los promedios de mortalidad encontrados, fue diferente a los otros (tratamientos), aceptando así, la hipótesis alternativa. Sin embargo no hubo diferencias significativas con respecto a los grupos control negativo, tanto en garrapatas grandes como en medianas; dicho comportamiento fue similar para los grupos control positivo. En términos generales, en las garrapatas grandes no se encontró diferencia significativa entre los tratamientos de extracto Sohxlet puro y en sus diluciones. Sin embargo, la mortalidad producida con el extracto frío puro y en sus diluciones, mostró diferencias significativas, con base en esto no hubo diferencias significativas entre la mortalidad encontrada en los grupos tratados con cipermetrina y extracto frío puro, como tampoco entre los grupos tratados con extracto Sohxlet en las dos diluciones y extracto frio en las dos diluciones (Figura 26).

En cuanto a las garrapatas medianas hubo diferencia significativa entre los grupos tratados con el extracto Sohxlet puro y sus diluciones así como en las mortalidades encontradas con el extracto frío puro y sus diluciones. Ningún grupo de tratamiento, incluyendo los controles positivos, tuvieron el mismo comportamiento por lo que el extracto frio puro, fue el cual produjo la mayor mortalidad (Figura 26).

Figura 26. Diferencias entre grupos de tratamiento en garrapatas grandes y medianas. Letras iguales indican que no hay diferencia significativa. Letras diferentes indican que existe diferencia significativa

9.2 DISCUSIÓN El análisis de los resultados se realizó comparando los grupos de tratamiento desde tres puntos de vista, el riesgo relativo, el porcentaje de mortalidad y mediante el análisis de varianza.

9.2.1. Comparación del Efecto Ixodicida entre Grupos

En los grupos expuestos a los extractos evaluados tanto puros como en sus diluciones, así como a los productos comerciales, hubo algún grado de mortalidad, la cual estuvo entre 15,1% – 51,5% y 15,1% – 36,3%, para garrapatas grandes y medianas, respectivamente, encontrando así, diferencias significativas entre estos grupos excepto para las dos diluciones de Sohxlet y la dilución 1:1 del extracto frio 85

cuyos resultados estadísticos fueron iguales (a pesar de que entre éstos hubo mortalidades diferentes). Los productos comerciales a base de cipermetrina, amitraz y bendiocarb, son ixodicidas, al producir parálisis excitatoria de las garrapatas mediante diferentes mecanismos de acción (Sumano y Ocampo, 2006), sin embargo en este estudio la mortalidad producida fue inferior a la esperada. Si bien la metodología desarrollada con base en los objetivos planteados en este estudio, no permite afirmar que la baja eficacia se haya debido al desarrollo de resistencia por parte de las garrapatas, es probable que esta sea la explicación, teniendo en cuenta que los productos fueron preparados siguiendo las indicaciones de los fabricantes. Desde la década de los 60s, se encuentran reportes de resistencia de garrapatas

a los

organofosforados y carbamatos y posteriormente a los piretroides y al amitraz. Es así como actualmente existen zonas del mundo en las que estos parásitos, son resistentes a todos los ixodicidas existentes, conduciendo a ineficacia de los mismos (Rodríguez, 2012; Armendaris, 2003). En Colombia, Benavides (1989), citado por Díaz et al., (2006), encontró cepas de garrapatas resistentes a cipermetrina y posteriormente Betancourt (1993) citado por el mismo autor, encontró cepas resistentes a piretroides, demostrando que hace más de tres décadas, la resistencia de las garrapatas se viene desarrollando.

De manera complementaria, para corroborar si la mortalidad encontrada en los grupos de garrapatas tratadas se debía al efecto de los tratamientos, se calculó el riesgo relativo con lo que se compara la mortalidad producida en cada tratamiento a evaluar (expuestos), contra la mortalidad del control negativo (no expuestos) que para este caso se utilizó el agua destilada. Considerando que un RR superior a uno, indica que hay relación de causalidad entre la mortalidad y la exposición a los tratamientos evaluados, con los resultados aquí encontrados, se puede afirmar que las mortalidades observadas en los grupos de garrapatas grandes y medianas, expuestos a los extractos puros y sus diluciones, así como a los productos comerciales, exposición de las garrapatas a los mismos (Tabla 26 ).

se debieron a la

Tabla 26. Riesgo relativo, calculado para cada tratamiento en Garrapatas grandes y medianas RIESGO RELATIVO (RR) TRATAMIENTO

SOXHLET PURO SOXHLET 1:1 SOXHLET 1:5 FRIO PURO FRIO 1:1 FRIO 1:5 BENDIOCAR

PARA GARRAPATAS GRANDES

MEDIANAS

5.5

3,5

2.5

3,5

3.5

2,5

2.5

8,5

Es de tener en cuenta que entre más alto sea el valor del RR, es mayor el efecto del tratamiento sobre la mortalidad de las garrapatas, lo que permitiría establecer que para las garrapatas grandes el mejor efecto ixodicida lo produjo el bendiocarb y en el caso de las medianas, si bien dicho el bendiocard no obtuvo el mayor RR, fue el tercero en orden decreciente (Tabla 26). Dicho efecto se esperaba ya que el bendiocarb es un insecticida con acción ixodicida debido a su capacidad de inhibir la enzima acetilcolinesterasa en las garrapatas, produciendo una parálisis excitatoria por la acción sostenida de la acetil colina sobre los receptores nicotínicos, que termina produciendo la muerte del parásito (Sumano y Ocampo, 2006). Comparando el RR obtenido en los grupos Sohxlet puro y frio puro, se encuentra que hubo mayor efecto ixodicida con el segundo sobre las garrapatas grandes y medianas, lo que se puede explicar porque algunos metabolitos se ven afectados cuando se someten a ciertas temperaturas, disminuyendo así su actividad (Pedrozo, 2000), por el contrario, en otros casos, la temperatura favorece la extracción de los metabolitos de material vegetal permitiendo una mayor concentración de los mismos y por ello mayor eficacia (Castelblanco et al., 2013)

Respecto a la mortalidad encontrada en los grupos tratados con los extractos puros (Sohxlet y frío), en el caso de las garrapatas grandes fue similar a la de los productos comerciales y en el caso de las medianas, fue superior. Lo anterior sugiere que los extractos obtenidos en este estudio, a partir de las hojas de Clinopodium brownei (Sw), contienen metabolitos con acción ixodicida, tal como se demuestra en estudios de fitoquímica, a través de los cuales se destaca el hallazgo de pulegona (64,3%), mentona (20,2%), isomentona (3,4%) e isopulegona (2,4%), que poseen efecto insecticida (Senatore et al., 1998)

Respecto a las mortalidades producidas en los grupos tratados con los extractos puros, comparadas con aquellos expuestos a las diluciones, se encontró que para los dos tamaños de garrapatas hubo mayor eficacia de los extractos puros respecto a sus diluciones, encontrando diferencias estadísticamente significativas. Estos resultados concuerdan con trabajos similares al que aquí se presenta, en donde los extractos puros de Brugmasia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, Bidens pilosa y Ambrosia cumanenses, produjeron mayor mortalidad que sus diluciones (Castelblanco et al 2013; Rodríguez et al., 2010). Igualmente Pulido (2012), también reporta mayor eficacia ixodicida de los extractos puros de Ruta graveolans y verbena officinalis (L.) respecto a las diluciones de los mismos.

Por otra parte, en este trabajo, al enfrentar las garrapatas a las diluciones de los extractos en agua destilada, la mortalidad disminuyó de manera similar a lo reportado por Rodríguez et al (2010), aunque en dicho trabajo, la mortalidad se mantuvo por encima de 60% en dos de las diluciones evaluadas, lo cual se interpretó como eficaz. La disminución de la eficacia del extracto de Clinopodium brownei (Sw) al realizar las diluciones en agua destilada, difiere de otros trabajos en donde se hicieron diluciones de los extractos puros de la planta (Diospyrus anisandra) en solvente tween-80 (Rosado et al, 2008), y de Nicotiana tabacum de Brugmasia arborea, Sambucus nigra, , Bidens pilosa y Ambrosia cumanenses, en el mismo solvente (Martínez y Martelo, 2010), donde

el solvente tween 80 potenció la acción ixodicida al mejora las perfusión de los extractos en las garrapatas.

Como se ha indicado, todos los extractos puros elaborados con la metodología indicada en este estudio, así como las diluciones realizadas a partir de éstos, produjeron mortalidad en algún grado, sin embargo ésta no fue alta y en términos de eficacia, se considera baja, ya que la literatura reporta que para que un extracto sea eficaz, la mortalidad producida debe ser mínimo de 60%-80% (Tomizawa y Casida, 2009). En consecuencia, se demuestra que Clinopodium brownei (Sw) posee metabolitos con efecto ixodicida aunque la eficacia fue inferior a lo que reportan trabajos similares realizados con plantas de otros géneros y familias, como el trabajo de Prates et al., (1998) en el que evaluó in vitro, el aceite esencial del pasto gordura (Melinis minutiflora), logrando mortalidades de 100% en larvas de la garrapata

R (B.)

microplus; así mismo, Borges et al., (2003), demostró la eficacia ixodicida del extracto de fruta madura de Melia azedarach L. contra la misma garrapata. Finalmente Rodríguez et al., 2010, reportan eficacia de los extractos de Nicotiana tabacum, Brugmasia arborea, Sambucus nigra y Bidens pilosa sobre dichas garrapatas.

Si bien, los reportes encontrados sobre el efecto antiparasitario de Clinopodium brownei se limitan a describirla como una planta con acción repelente de insectos, (Garcia, 1992; Bernal y Correa 1989), en este estudio se pudo demostrar que también posee acción ixodicida aunque esta haya sido baja. A pesar de lo anterior, el hecho de que la eficacia de los extractos de la planta, haya resultado inferior a lo requerido, se puede deber a que los metabolitos posean un efecto débil, pero también, dicho comportamiento se puede explicar por la presencia de diversos factores que pueden intervenir negativamente en la misma, como el método de extracción, la parte de la planta utilizada, la etapa biológica en la que se haya colectado la planta (prefloración, floración o postfloración), la época del año y el tipo de suelo, entre las más importantes

Como ya se mencionó, en las garrapatas de los grupos control negativo expuestos a agua destilada, etanol y a las condiciones del laboratorio, no se evidenciaron

porcentajes de mortalidad relevantes (<10%), siendo inferiores a los demás tratamientos, con diferencias estadísticamente significativas. Con tales resultados se confirma, que en este trabajo las mortalidades observadas en los grupos tratados no se debieron a las condiciones en las que se mantuvieron las garrapatas en el laboratorio, como tampoco al agua utilizada en las diluciones, ni al solvente usado en la elaboración de los extractos. Las garrapatas puede sobrevivir, sin consumir alimento hasta 5 años y en el medio ambiente pueden durar hasta 4 meses (Hernández, 1985). Dicho periodo, supera el tiempo que se tuvieron en el laboratorio en el presente trabajo, por lo que se puede

asegurar

que

las

condiciones de

laboratorio

fueron

las

adecuadas.

Adicionalmente, se sabe que el agua, tal como se usó en el presente estudio no afecta las garrapatas, ya que estudios realizados con la misma metodología no muestran mortalidades altas como se describe en la evaluación in vitro el efecto ixodicida de los extractos

etanólicos

arborea (L.)

las

Larget, Bidens

hojas

de Ambrosia

cumanenses Kunth, Brugmasia

pilosa (L.) Sambucus

nigra (L.)

y Nicotiana

tabacum (L.) obtenidos por Soxhlet sobre garrapatas adultas Boophilus microplus (acari: ixodidae) (Rodriguez et al., 2010), y el etanol al 74% tampoco causó mortalidad, bajo las condiciones planteadas en este estudio, coincidiendo con los encontrado en otros trabajos en los que se utilizó como solvente para la elaboración de los extractos acuosos del neem (Azadirachta indica (L.) Juss.) (Meliaceae) sobre Boophilus microplus) (Huertas y Rodriguez, 1999) y

extracción de dos extratos de Sesbania

virgata, Tabebuia ochraceae y Tecomastans en larvas de Boophilus microplus (Méndes et al., 2002).

Finalmente, bajo las condiciones planteadas en este estudio no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre las mortalidades encontradas en las garrapatas grandes y medianas, expuestas a los tratamientos evaluados, por lo que se podría inferir que no se hace necesario discriminar entre un tamaño y otro. Sin embargo estos resultados difieren de lo reportado por Rodríguez et al., (2010), quienes encontraron mayor eficacia ixodicida de los extractos evaluados en las garrapatas pequeños respecto a las medianas.

10 IMPACTO

Con los resultados obtenidos

en el estudio se puede decir que el extracto de

Clinopodiun brownei (Sw.) genera un impacto para los ganaderos de la zona de San miguel de Sema puesto que se demostró que posee aparte de un efecto repelente, un efecto ixodicida bajo, generando con esto un beneficio para la población puesto que se mejoraran las condiciones de salud tanto para el animal como para el hombre y medio ambiente Es así como la planta se perfila para futuras investigaciones con un efecto ixodicida siempre y cuando se potencialice su eficacia con nuevos métodos de extracción, disolventes y se usen partes diferentes de la planta. De esta forma, se plantea una alternativa para los ganaderos ya que se reduce el uso de productos comerciales, lo cual disminuye los gastos de tratamientos con este fin, sino que también favorece el bienestar animal y una inocuidad alimentaria.

11 CONCLUSIONES

Los extractos etanolicos de poleo Clinopodium brownei (Sw.) obtenidos a partir de los métodos de extraccion Soxhlet (caliente) y etanólico en frio (casero) mostraron efecto ixodicida sobre la garrapata Ripicephalus (Boophilus) microplus sin embargo, considerando que los porcentajes de mortalidad estuvieron por debajo del mínimo eficaz, 60%, se debe afirmar que dicha eficacia fue baja. Sin embargo se podría buscar mejorar estos resultados, utilizando otros métodos de extracción, otras partes de la planta o utilizando diluyentes como Tween-80, el cual mejora la eficacia del extracto en la garrapata.

Se puede afirmar que fuera del efecto repelente que tiene la planta sobre las garrapatas, el cual si bien se reporta en la literatura, no se evaluó en este estudio, también es capaz de causarles la muerte, aunque en baja proporción, lo cual establecería una capacidad ixodicida, para las condiciones planteadas en este estudio.

Por otro lado, al analizar la mortalidad producida por los extractos, se observó que los mejores porcentajes de mortalidad se obtuvieron con el extracto etanólico en frio puro (casero), posiblemente porque la temperatura usada en el método de Sohxlet afectó los metabolitos o bien que al haber molido el material vegetal,

haya favorecido la

extracción de los compuestos activos.

Para las condiciones planteadas en este estudio no fue relevante la diferenciación entre garrapatas grandes y medianas, ya que en ambos grupos se encontraron resultados muy similares. Es posible que la inclusión de garrapatas más pequeñas o de larvas de garrapatas, muestren un comportamiento diferente.

De manera concordante con uno de los principios de la farmacología que hace referencia a que la intensidad de un efecto es directamente proporcional a la concentración de los principios activos en este estudio se observó mayor eficacia con

los extractos puros en los cuales los metabolitos activos se encuentran en mayor proporción que en las diluciones.

Con los resultados encontrados en los grupos control negativo se afirma que la metodología utilizada en cuanto a la manipulación y mantenimiento de las garrapatas en condiciones de laboratorio, es adecuada y que las mortalidades producidas durante el estudio, no se debieron a causas diferentes al efecto de los tratamientos evaluados. Por lo anterior se puede recomendar replicar esta metodología en estudios futuros.

Respecto a los productos comerciales incluidos en el estudio como controles positivos, se encontró una eficacia inferior a la esperada, posiblemente debido a que las garrapatas utilizadas, eran parcialmente resistentes a tales principios activos, sin embargo dicha afirmación no puede demostrarse porque la metodología desarrollada no permite comprobarlo

12 RECOMENDACIONES

Con base en la experiencia adquirida con el desarrollo de este trabajo se recomienda a futuros investigadores:  Identificar nuevos métodos de extracción que brinden mayor eficacia en la obtención de los metabolitos secundarios de la planta y realizar pruebas de cromatografía para identificar sus principios activos, corroborando la obtención de los mismos, lo cual no pudo realizarse en este trabajo por limitación en pruebas de laboratorio.  Evaluar otras partes de la planta, como flores y semillas o bien, continuar evaluando las hojas en diferentes estados de fenológicos de la planta.  Se recomienda en futuras investigaciones, evaluar extractos puros y en mezclas ya que puede existir enmascaramiento de las propiedades ixodicidas.  Evaluar el efecto de los extractos de la planta sobre la ovoposición de garrapatas adultas.  Se podría evaluar los extractos aquí probados, en un estudio in vivo, aplicando sobre los animales, ya que si bien la eficacia in vivo fue baja, es posible que puede ejercer un efecto de control de parasitismo en animales que se encuentren en pastoreo o en confinamiento, sin que llegue a una erradicación total.  Buscando definir si el mejor efecto encontrado con el extracto frío se debió a la temperatura o al haber molido el material vegetal, se sugiere el desarrollo de futuras investigaciones con esta planta en las que los extractos se obtengan mediante el método de lixiviación y mediante licuado en frio y en caliente.

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ANEXOS

Anexo 1. Clasificaci贸n Taxon贸mica de Poleo Clinopodium brownei (Sw) en Herbario

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