Evaluación in vitro del efecto ixodicida by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN IN VITRO DEL EFECTO IXODICIDA DE DOS TIPOS DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE Polygonum segetum (BARBASCO) SOBRE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

NELSON ENRIQUE NUMPAQUE FAGUA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA (BOYACÁ) 2015 1

EVALUACIÓN IN VITRO DEL EFECTO IXODICIDA DE DOS TIPOS DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE Polygonum segetum (BARBASCO) SOBRE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Trabajo de Grado (Modalidad Investigación)

NELSON ENRIQUE NUMPAQUE FAGUA

DIRECTORA ANASTASIA CRUZ CARRILLO MV Esp. MsC

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA (BOYACÁ) 2015 2

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………....

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ……………………………………….

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN…………………………………………..

4. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………….

……………………………………………………………….

5.1 OBJETIVO GENERAL ……………………………………………………….

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ……………………………………………….

6. MARCO DE REFERENCIA……………………………………………………

6.1 ESTADO DEL ARTE………………………………………………………….

6.2 MARCO TEÓRICO……………………………………………………………

6.2.1. Garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus……………………….

6.2.1.1. Ciclo Biológico……………………………………………………………

6.2.1.2. Efectos en la Salud del Animal…………………………………………

6.2.1.3. Tratamiento y Control de la Garrapata………………………………....

6.2.2 Plantas con Efecto Insecticida…………………………………………….

6.2.2.1 Barbasco (Polygonum segetum) Kunth………………………………..

6.2.2.2 Clasificación Taxonómica………………………………………………..

6.2.2.3 Caraterísticas Botánicas………………………………………………….

6.2.2.4 Composición Quimica………………………………………………………

6.2.2.5 Usos Medicinales…………………………………………………………

6.3 MARCO LEGAL………………………………………………………………..

6.4 MARCO GEOGRÁFICO……………………………………………………….

6.4.1 Descripcion fisica…………………………………………………………..

5. OBJETIVOS

7 METODOLOGÍA…………………………………………………………………

7.1 LUGAR DE ESTUDIO…………………………………………………………

7.2 ANIMALES DE ESTUDIO…………………………………………………….

7.2.1 Mantenimiento de garrapatas en el laboratorio……………………….....

7.4 DISEÑO METODOLÓGICO…………………………………………………..

7.5 PROCEDIMIENTOS……………………………………………………………

7.5.1 Recolección de la Planta para Identificación…………………………….

7.5.2. Proceso Colecta de Hojas, Secado y Elaboración de los Extractos…

7.5.2.1 Extracción Etanólica por el Método Soxhlet………………………………. 49 7.5.2.2 Extracción Etanólica por el Método de Lixiviación……………………..

7.5.3 Pruebas Cualitativas…………………………………………………………

7.5.4 Obtención de las Garrapatas…………………………………………………

7.6 Pruebas de Inmersión de Garrapatas Adultas………………………………

54.

7.7 Definición y Operacionalización de las Variables y los Indicadores…….

7.8 Tratamiento y Procesamiento de la Información…………………………..

8. ANÁLISIS DE DATOS…………………………………………………………..

9. HIPÓTESIS………………………………………………………………………..

10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………….

10.1 RESULTADOS……………………………………………………………….

10.1.1 Identificación de la Planta…………………………………………………

10.1.2 Resultados de Pruebas Cualitativas de Metabolitos Secundarios……

10.1.3 Mortalidad Con Extracto Etanólico Soxhlet……………………………..

10.1.4 Mortalidad Con Extracto Etanólico Obtenido por Lixiviación…………

10.1.5 Mortalidad Obtenida en los Grupos Control…………………………….

10.1.6 Mortalidad Obtenida en los Grupos Control Positivo…………………..

10.1.7 Mortalidad Obtenidad de Garrapatas Expuestas al Extracto Etanólico de Soxhlet en Dilución 1:1 (Extracto: Agua)……………………………………….

10.1.8 Mortalidad Obtenidad de Garrapatas Expuestas al Extracto Etanolico Obtenido por el Método de Lixiviación en Dilución 1:1 (Extracto: Agua)…….

10.1.9 Resultado Riesgo Relativo………………………………………………...

10.2 DISCUSIÓN……………………………………………………………………

11. IMPACTO……………………………………………………………………….

12. CONCLUSIONES……………………………………………………………...

13. RECOMENDACIONES……………………………………………………….

14. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………...

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.

Algunos ixodicidas comerciales………………………………………...32

Tabla 2.

Resultado metabolitos secundarios………………………………...53

Tabla 3

Análisis de datos………………………………………………………….57

Tabla 4.

Resultado pruebas cualitativas………………………………………….60

Tabla 5.

Porcentaje y número de R. (B.) microplus muertas tras la exposición al extracto etanólico puro de Polygonum segetum utilizando el método Soxhlet…………………………………………………………...60

Tabla 6.

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus muertas expuestas al extracto etanólico puro en frio de Polygonum segetum utilizando el (método de lixiviación)………………………………………………..61

Tabla 7.

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control negativo muertas expuestas al ambiente………………………………………...62

Tabla 8. .

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control negativo muertas expuestas al agua destilada………………………………….63

Tabla 9

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control negativo muertas expuestas al etanol…………………………………………….64

Tabla 10

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control positivo muertas expuestas al produto comercial Amitraz…………………….65

Tabla 11

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control positivo muertas expuestas al producto comercial coumaphos………………65

Tabla 12

Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control positivo muertas expuestas al producto comercial cipermetrina……………..66

Tabla 13

Porcentaje de mortalidad y número de R. (B.) microplus muertas en dilución 1:1 de extracto etanólico puro de P segetum obtenido por el método Soxhlet…………………………………………………...67

Tabla 14

Porcentaje de mortalidad y número de R. (B.) microplus muertas 6

en dilución 1:1 del extracto etanólico puro de P segetum obtenido por el método de lixiviación……………………………………………..68 Tabla 15.

Consolidado del riesgo relativo (RR), para todos los tratamientos evaluados en el estudio………………………………………………….69

NOTA DE ACEPTACIĂ&#x201C;N __________________________________ __________________________________ __________________________________

______________________________________ Firma de jurado

DEDICATORIA

A DIOS, por haberme permitido llegar a este momento tan especial en mi vida y quien me ha dado fortaleza para continuar en los momentos difíciles.

A mis tías, que con su fortaleza ejemplar me han enseñado a no desfallecer ni rendirme ante las adversidades y siempre perseverar a través de sus sabios consejos.

A mi Familia, por estar siempre a mi lado, por apoyarme moral y económicamente a lo largo de toda mi vida, por estar en mis triunfos y en mis derrotas.

A la Doctora Anastasia Cruz, directora de tesis, por su valiosa guía y asesoramiento a la realización de la misma

A mis Amigos, ya que siempre que los necesite estaban dispuestos a apoyarme y ofrecerme buenos concejos.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a DIOS por darme la fortaleza y sabiduría necesaria para llevar a cabo las metas que me he propuesto.

A mis tías, que con su fortaleza ejemplar me han enseñado a no desfallecer ni rendirme ante las adversidades y siempre perseverar a través de sus sabios consejos.

A mi familia en general, porque me han brindado su apoyo incondicional y por compartir conmigo buenos y malos momentos.

A la Doctora Anastasia Cruz, directora de tesis, por su valiosa guía y asesoramiento a la realización de la misma.

A la Doctora Viviana Gómez por su comprensión y apoyo durante el proceso de estudio y desarrollo de la tesis.

A mis compañeros de estudio por haber logrado nuestro gran objetivo con mucha perseverancia. Por demostrarme que podemos ser grandes amigos y compañeros de trabajo a la vez.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Ciclo biológico de R.B.microplus………………………………………………..

Figura 2.

Polygonum segetum………………………………………………………………

Figura 3.

Ubicación San Miguel de Sema en el departamento de Boyacá……..

Figura 4.

Ubicación ciudad de Tunja………………………………………………..

Figura 5.

Frascos de vidrio utilizados para la distribución de garrapatas………………

Figura 6.

Incubadora para el mantenimiento de las garrapatas en el laboratorio……..

Figura 7.

Esquema del diseño metodológico………………………………………

Figura 8.

Estufa de aire recirculado para el secado del material vegetal………………

Figura 9.

Pesado material vegetal….............................................................................

Figura 10.

Equipo de extracción Soxhlet…………………………………………………….

Figura 11.

Proceso de evaporación del solvente etanólico en el rotaevaporador……...

Figura 12.

Extracción etanólica por el método de lixiviación en frio……………………...

Figura 13.

Prueba de inmersión de adultas por triplicado…………………………………

GLOSARIO

BIOCIDA: sustancia química, natural o sintética destinada a destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o ejercer el control sobre cualquier microorganismo considerado nocivo para el hombre.

ANTIPARASITARIOS: Medicamento de uso humano y animal para el control de parásitos externos e internos.

CICLO BIOLÓGICO: Período que incluye todas las diferentes generaciones de una especie que se suceden mediante la reproducción, ya sea a través de la reproducción asexual o sexual.

CONTAMINACIÓN: acción o momento por el cual una persona, animal o elemento (ambiente, agua, aire, tierra, alimento) se convierte en vehículo mecánico de diseminación de un agente patogénico.

CONTROL INTEGRADO: el uso de varias medidas para controlar diferentes parásitos o diferentes estadios parasitarios presentes en el animal y estadios presentes en el medio ambiente.

ECLOSIÓN: aparición o salida, especialmente de un animal o un capullo de flor.

PARÁSITO: Ser vivo que de manera temporal o permanente vive a expensas de otro organismo de distinta especie, que es el hospedador, obteniendo de éste nutrición y morada, al que puede producir daño y con el que tiene una dependencia obligada y unilateral.

EFICACIA FARMACOLOGICA: capacidad de un fármaco para producir el efecto de manera adecuada. 12

EXPOSICIÓN: contacto directo o indirecto de un individuo con un agente físico, químico o biológico, capaz de producir daño a la salud.

EXTRACTO: preparación de consistencia líquida (extractos fluidos y tinturas); semisólida (extractos blandos o densos), o sólida (extractos secos), obtenido a partir de drogas vegetales o tejidos animales en estado generalmente seco.

FUENTE DE INFECCIÓN: Persona, animal, objeto o sustancia desde la cual el agente infeccioso pasa a un individuo susceptible.

GARRAPATA: ectoparásito artrópodo hematófago, perteneciente al sub-orden ixodida, dentro del cual existen tres familias Ixodidae, Argasidae, Nuttalliellidae; todas son vectores de numerosas enfermedades infecciosas y parasitarias.

HEMATÒFAGO: son parásitos que se alimentan de sangre.

HERBARIO: (del latín herbarium) Es una colección de plantas o partes de plantas, desecadas, preservadas, identificadas y acompañadas de información crítica sobre el sitio de colección, nombre común y usos. Tal colección en general representa a la flora, o patrimonio vegetal, de una localidad, región o país. También se conoce como herbario al espacio donde se encuentra esta colección.

HIPEREMIA: es el aumento del contenido sanguíneo intravascular de un órgano, segmento de órgano o tejido vascularizado.

HOSPEDADOR: organismo simple o complejo, incluido el hombre, que en circunstancias naturales permite la subsistencia o el alojamiento de un agente infeccioso.

INANICIÓN: es una condición o un estado biológico que se produce ante la carencia de los nutrientes que los humanos y animales reciben a través de la alimentación.

INOCUIDAD: condición de los alimentos que garantiza que no le causarán daño a los consumidores cuando se preparen y o consuman de acuerdo con el uso al que se destinan. Es uno de los cuatro factores que con los nutricionales, organolépticas y comerciales, componen la calidad de los alimentos.

IXODICIDA: sustancia química de cualquier origen que pertenece al grupo de los plaguicidas y se utiliza para prevenir, controlar o combatir parásitos del suborden ixodida.

LARVA: es un animal en estado de desarrollo, que ya ha abandonado su huevo y puede alimentarse por sí mismo, pero que aún no ha desarrollado la forma y la organización que caracteriza a un adulto de su especie.

METAMORFOSIS: conjunto de cambios biológicos que experimentan ciertos animales durante su desarrollo para manifestar su forma, funciones y género de vida definitivos.

NECROSIS: es la muerte de tejido corporal y ocurre cuando no está llegando suficiente sangre al tejido, ya sea por lesión, radiación o sustancias químicas. La necrosis es irreversible.

NINFA: estadios juveniles tanto de insectos con metamorfosis incompleta como de ácaros y garrapatas.

OVIPOSICIÓN: es el tiempo considerado desde que se inicia la puesta de los primeros huevos hasta los últimos. 14

PATÓGENO: organismo que tiene la capacidad de causar enfermedad por diversos factores que incluyen, la dosis infectante del germen, la puerta de entrada al organismo y especialmente la susceptibilidad del huésped.

RESISTENCIA: la resistencia se produce naturalmente por selección natural a través de mutaciones producidas por azar, pero también puede inducirse artificialmente mediante la aplicación de una presión selectiva a una población.

RESISTENCIA ADQUIRIDA: es aquel tipo de resistencia que aparece por mutaciones puntuales en el DNA o por la adquisición de fragmentos de éste (plásmidos, trasposones, integrones). Dicho DNA posee información que conduce a la pérdida de la sensibilidad frente a los antibacterianos.

SALUD PÚBLICA: Es una disciplina encargada de la protección de la salud a nivel poblacional. Tiene como finalidad el mejoramiento de la salud de la población.

SOXHLET: el extractor Soxhlet o simplemente Soxhlet (en honor a su inventor Franz von Soxhlet) es un equipo hecho en vidrio utilizado para la extracción de compuestos, generalmente de naturaleza lipídica contenidos en un sólido, a través de un disolvente.

TEGUMENTO: Cubierta externa o envoltura a manera de piel en los parásitos.

RESUMEN

Los estudios sobre el efecto ixodicida de diferentes especies de plantas constituyen una alternativa eficiente y económica para el control de vectores. Por ende en el presente trabajo se describe la evaluación in vitro del efecto ixodicida de dos tipos de extractos etanólicos de Polygonum segetum (barbasco) sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Los extractos de esta planta se obtuvieron utilizando como solvente etanol al 70% y dos métodos de extracción Soxhlet (caliente) y lixiviación (frio). Para la evaluación del efecto ixodicida se usaron teleoginas adultas las cuales fueron sometidas a la prueba de inmersión de adultas para evaluar

la mortalidad. Las pruebas iniciales se realizaron con

extractos puros y posteriormente con diluciones, de manera que los resultados encontrados durante esta investigación demostraron que el extracto puro de Polygonum segetum obtenido con el método Soxhlet produjo una mortalidad de 54,5% y con el método de lixiviación fue de 30,3%. Por esta razón se puede concluir que el extracto obtenido por el método Soxhlet en caliente posee mayor efecto ixodicida.

1. INTRODUCCIÓN

Durante los últimos años el sector ganadero ha tenido un crecimiento significativo y ha permitido tanto el desarrollo económico como el agropecuario del país, por lo que empresarios y productores buscan diferentes alternativas para ser más competitivos, dentro de las cuales se encuentran, la implementación de sistemas de aseguramiento de la calidad y de buenas prácticas de manejo, garantizando de esta manera la trazabilidad.

En los sistemas de producción bovina, de cualquier tipo, se hace necesaria la implementación de un plan sanitario que incluya el control integral de los parásitos internos y externos y con ello de las enfermedades trasmitidas por aquellos hematófagos, que se comportan como vectores (Rodríguez et al.,2006). La garrapata

Rhipicephalus

(Boophilus)

microplus

impacta

negativamente

ganadería en países tropicales y subtropicales, no solo por producir daños directos a la piel (cuero) sino también disminución de la producción, alteraciones reproductivas y daños indirectos mediante la transmisión de agentes patógenos (Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale) (Lima et al., 2000).

Considerado los perjuicios que causa este parásito, los productores utilizan en su gran mayoría ixodicidas comerciales, los cuales, a pesar de ser eficaces, con el paso de los años han ido perdiendo efectividad debido al desarrollo de resistencia por parte de las garrapatas, lo cual dificulta notoriamente el control de éstas (Díaz et al., 2006).

En tal proceso,

se desarrollan garrapatas multirresistentes que difícilmente

pueden ser controladas con los productos existentes y eliminando individuos susceptibles ya que es un proceso que aparece por selección genética 17

(Domínguez et al., 2010); artrópodos como la garrapata R. B. microplus, han logrado sobrevivir de esta manera natural a condiciones adversas, mediante un proceso de adaptación gradual (Rosario y Hernández, 2001).

En razón a los procesos de resistencia por parte de las garrapatas, se disminuye la actividad ixodicida de los diferentes productos garrapaticidas comerciales y aumenta la contaminación de los diferentes ecosistemas rurales, por el uso creciente de estos productos y de asociaciones entre ellos que pueden resultar tóxicas. La preocupación actual por la conservación de los recursos naturales, así como los daños causados al hospedador han puesto en evidencia la importancia de buscar nuevas sustancias que muestren actividad ixodicida, en la biodiversidad botánica de las diferentes regiones. De esa manera, algunos reconocen al “barbasco”, Polygonum segetum, como insecticida, aunque para otros solo es una maleza que crece a

orillas de los yacimientos de agua. (Morales y Guzmán,

2010).

Con los resultados obtenidos se podrá establecer como una nueva alterativa para el control integral de este parasito y de esta manera generar producciones limpias es decir libres de residuos de productos ixodicidas comerciales. Sin embargo es necesario realizar otros estudios científicos y de campo en donde se avalúe más a fondo los metabolitos que presentan la actividad ixodicida y los efectos secundarios que pueden provocar en animales y humanos.

Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto ixodicida del extracto de barbasco Polygonum segetum para el control in vitro de la garrapata R. B.microplus empleando técnicas como la extracción en caliente Soxhlet y lixiviación a temperatura ambiente.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La garrapata Rhipicephalus (B.) microplus, es un ectoparásito de hábitos hematófagos considerado como uno de los mayores y más importantes agentes transmisores de enfermedades que afectan tanto la producción de leche como de carne, generando grandes pérdidas económicas por la disminución en la producción, el costo de los tratamientos, tiempo que se requiere para la recuperación de los animales afectados, acción traumática, tóxica e infecciosa, deterioro de pieles, debilitamiento, retardo en el crecimiento en los jóvenes y baja ganancia de peso, entre otros. Por ende la garrapata R. B. microplus es considerada como la más importante del ganado bovino a nivel mundial (Márquez et al., 2003).

Debido

sus

características

morfológicas

fisiológicas,

factores

medioambientales, relacionados con aspectos como las bajas condiciones de saneamiento, nivel de resistencia, adaptabilidad a diferentes climas y a la extensa gama de reservorios representados no solo en animales domésticos, sino también silvestres, R. B. microplus, constituye una de las especies de mayor importancia en bovinos por su impacto en la salud, debido a su papel como vector de hemoparásitos como Babesia spp y Anaplasma spp (Cortes et al.,2010), llegando a consolidarse como un problema de origen zoosanitario (Guglielmone et al., 2003).

El control de garrapatas básicamente se basa en la selección de fármacos que aplicados por aspersión o inmersión sean eficaces contra las distintas etapas parasitarias de las mismas (Broglio et al., 2009). A pesar de que la mayoría de estos productos son efectivos en el control y prevención de las infestaciones, estos parásitos han creado alta resistencia a estos fármacos por el uso 19

indiscriminado que se les ha dado, causando resistencia y promoviendo la mutación genética de R.B microplus disminuyendo así la efectividad de los tratamientos disponibles (FAO, 2003).

Así mismo estas sustancias ixodicidas pueden penetrar en el cuerpo causando residualidad, mediante ingestión, inhalación o absorción dérmica provocando intoxicación de los animales con manifestaciones locales o sistémicas cuyos efectos pueden llegar a ser agudos o crónicas; asimismo estos pueden actuar a corto o largo plazo sobre el ambiente afectando sistemas abióticos, suelos, aguas superficiales y subterráneas y aire, como también provocar la muerte de diversos organismos sensibles que a largo plazo pueden desencadenar desequilibrios ecológicos que alteran los diversos sistemas naturales y favorecen el surgimiento de especies resistentes.

En razón a esto surgió la necesidad de buscar y desarrollar nuevas herramientas que permitieran aumentar la producción a menores costos y con menor impacto negativo sobre la inocuidad alimentaria por la presencia de residuos en alimentos de origen animal y que disminuyan la probabilidad de casos de intoxicación por el uso desmesurado de insecticidas en los bovinos.

En respuesta a esta realidad. Se han encontrado plantas medicinales productoras de metabolitos ixodicidas constituyendo una alternativa en el control de estos parásitos. Muchas de ellas, han sido usadas popularmente y por tradición cultural y otras han sido estudiadas científicamente, demostrando su eficacia. En este último grupo se

destaca Urtica urens (L.) Capsicum frutescens,Clinopodium

brownei (Sw.) Nicotina tabacum (L.) Ruta graveolens (L.), Lippia javanica y Margaritaria discoidea, entre muchas otras, a las cuales se les atribuye efecto insecticida. Por otra parte, se encuentran los barbascos los cuales poseen gran variedad de especies entre los que se destaca Lonchocarpus utilis (Smith, 1930), cuyo metabolito secundario natural es la rotenona que tiene efecto biocida como 20

regulador de larvas de mosquito (Mariño et al., 2004). También se ha reportado efecto biocida en Tephrosia cinérea (“sacha”, “barbasco”) y de Lonchocarpus nicou (“barbasco del monte”); a su vez Morales et al., (2010), reporta el efecto insecticida de Polygonum segetum empleando hojas trituradas para el control de pulgas y de ácaros en perros; tal efecto depende de la composición química conformada por flavonoides, alcaloides, saponinas y terpenos (Fuertes et al., 2010). La familia Polygonaceae, comprende diversas especies como Hydropi peroides, Solanum nigrum y Calliandra pittieri entre otras, han demostrado un efecto insecticida sobre el gusano cogollero (Spodoptera frugiperda).

A pesar de la existencia de esta información publicada con base en estudios científicos, del efecto insecticida de los diferentes tipos de barbasco, no se han encontrado reportes sobre la existencia de efecto ixodicida de la planta sobre ningún tipo de garrapata, como tampoco el desarrollo de trabajos en el municipio de San Miguel de Sema. La demostración de la acción insecticida por parte de una planta o de los extractos de ésta, no garantiza que la misma, tenga acción ixodicida, efecto que debe ser demostrado mediante estudios de investigación específicos. Adicionalmente, cuando se utilizan extractos de plantas buscando efectos medicinales, los resultados pueden variar de acuerdo con el tipo de extracto que se elabore, en razón a las diferencias químicas entre un metabolito secundario y otro. Es así como factores como el solvente utilizado, la temperatura de extracción, el manejo físico que se dé al material vegetal o las características del suelo donde se colecte la planta, pueden influir los resultados obtenidos.

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Los extractos de Polygonum segetum obtenidos por métodos de lixiviación y Soxhlet, tienen efecto ixodicida sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, y en tal caso, hasta qué grado de dilución lo conservan?

4. JUSTIFICACIÓN

Las principales herramientas para controlar la garrapata R. (B) microplus, han sido los insecticidas químicos, sin embargo presentan efectos nocivos para la salud y el medio ambiente, sumados al desarrollo de diversos mecanismos de resistencia y factores medio ambientales que favorecen la reproducción y crecimiento de este parásito, lo que representa mayores inversiones para los ganaderos en su control, y debido a la importancia que esta problemática zoosanitaria tiene para la salud pública, se deben

buscar e identificar factores de riesgo que predisponen la

seguridad sanitaria (FAO, 2003).

Frente a las pérdidas económicas por la disminución en la producción, el costo de los tratamientos empleados, acción traumática toxica e infecciosa, pérdida de pieles, debilitamiento, retardo en el crecimiento, y baja ganancia de peso; entre otros problemas relacionados con la mutación genética la cual repercute en el desarrollo de resistencia por parte de las garrapatas hacia los productos comerciales usados para su control, así como a la contaminación ambiental que estos generan hace que la búsqueda de nuevos metabolitos se conviertan en una prioridad (Quijada et al., 1997).

Por otra parte, dentro del avance de la fitoquímica, se ha podido determinar la importancia de evaluar diferentes métodos de extracción para la obtención de los metabolitos secundarios con actividad biológica, con el fin de identificar con cuál de ellos se logran extraer de manera más eficiente los principios activos, ya que la obtención de los metabolitos secundarios activos, depende directamente de la técnica utilizada (Ringuelet y Viña, 2013).

Con el desarrollo de este trabajo, así como de otros similares que se han ejecutado, se busca identificar plantas con acción ixodicida que no produzcan efectos adversos contra la salud humana, animal y del ecosistema. De manera que al evaluar la actividad ixodicida de Polygonum segetum y demostrar su efectividad para el control de la garrapata común del ganado se podría plantear como una alternativa biológica y económica para el control integral de esta garrapata proponiendo su uso en diferentes regiones del país. Adicionalmente, se espera determinar si la temperatura influye en la eficacia ixodicida de los extractos para poder generar las pautas de extracción alcohólica más adecuadas, para esta planta.

5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar in vitro el efecto ixodicida

de dos tipos de extractos etanólicos

Polygonum segetum (barbasco) sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Determinar si el extracto etanólico obtenido por lixiviación, muestra acción ixodicida y hasta que grados de dilución la mantiene.  Determinar si el extracto etanólico obtenido por Soxhlet, muestra acción ixodicida y hasta que grados de dilución la mantiene.  Evaluar cuál de los dos métodos empleados para la elaboración de los extractos proporciona mejores resultados para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

6. MARCO DE REFERENCIA

6.1 ESTADO DEL ARTE

Se hizo un estudio in vitro para evaluar el efecto ixodicida de los extractos etanólicos de las hojas de Ambrosia cumanenses Kunth, Brugmasia arborea (L.) Larget, Bidens pilosa L., Sambucus nigra L. y Nicotiana tabacum L, sobre garrapatas adultas Boophilus microplus (acari: ixodidae); obteniendo como resultado que el extracto de N tabacum puro y en diluciones hasta 2,5:10 ocasiona mortalidad de un 85% (Castelblanco et al., 2013).

Pérez et al., (2012), realizaron una investigación en la Universidad Agraria de la Habana, donde se evaluó el efecto acaricida in vitro del extracto de Neem (Azharidacta indica) sobre garrapatas R.B. microplus, presentes en animales de San José de las Lajas (Cuba). Los autores evidencian eficacia acaricida del extracto acuoso de las hojas de Neem, aunque la mortalidad estuvo alrededor de 63%.

Madzimure et al., (2011), evaluaron el efecto biocida en garrapatas del ganado y la toxicidad oral aguda de Lippia javanica, obteniendo que a mayor exposición (7 semanas) al extracto en concentraciones de 10 %, se logra su máxima actividad acaricida; el efecto toxico vía oral evaluado reporta que después de administrado el extracto los animales manifestaban un estado de aletargamiento.

Morales y Guzmán (2010), estudiaron los compuestos fenólicos presentes en las hojas de

Polygonum segetum del humedal Juan Amarillo (Bogotá-Colombia).

Como resultado se aislaron e identificaron; 5-hidróxi-7,8,4´-trimétoxi isoflavona, el 26

galato de etilo (derivado de taninos) y la 5,3´,4´-trihidróxi-7-metóxi flavanona. Además, por análisis GC-MS (cromatografía de gases-espectrofotometría de masas), se identificó el lignano 5-(3,4-dimetóxifenil)-7-metóxibenzofuranpropanol homoegonol; los cuales presentan actividad antifúngica y antibacteriana.

Rodríguez et al., (2010), realizaron una investigación in vitro sobre el efecto ixodicida de los extractos etanólicos de plantas como Brugmasia arborea, Sambucus nigra, Nicotiana tabacum, Bidens pilosa y Ambrosia cumanenses, obteniendo como resultado que el extracto de N. tabacum muestra el mayor efecto cuando se usa el extracto puro y aun en varios niveles de dilución.

En un estudio realizado por Broglio et al., (2009), sobre R.B. microplus (Acari: Ixodidae) con diferentes extractos vegetales elaborados en agua destilada estéril y con dimetilsulfóxido (DMSO) al 1%, se encontró que el extracto de semillas de Annona. muricata mostró tener mayor poder acaricida, con 100% de mortalidad, seguido de los extractos de flores de Syzygium malaccensis (75% y 57,25%) y semillas de Azadirachta indica (65% y 38,50%). Hubo 100% en la reducción de la eclosión de las larvas nacidas a partir de hembras tratadas con extracto de semillas de. A. muricata.

Se evaluó el efecto biocida de los extractos hidroalcohólicos y particiones polares y no polares de algunas plantas sobre los diferentes estadios de las garrapatas R. (B.) microplus, mediante ensayos obteniendo como resultado que el extracto de canela (Cinnamomun zeylanicum) y morera (Morus alba); produce una mortalidad mayor al 50% en telóginas, donde las particiones no polares y a diferentes diluciones mostraron mayor actividad biocida (Álvarez et al., 2008).

Pérez et al., (2008), realizaron una investigación para evaluar el efecto insecticida de las plantas Paullinia clavigera y Chondrodendronto mentosum por medio de extractos hidroalcohólicos a diferentes concentraciones sobre ninfas del III estadio 27

de Tuthillia cognata. Demostrando biocida cuando se aumenta

que las plantas evaluadas poseen efecto

el tiempo de exposición

y la concentración del

extracto.

Rosado et al., (2008), evaluaron

extractos crudos de Diospyros anisandra,

disueltos en Tween, etanol y DMSO para el control de larvas de R. (B.) microplus encontrando que los extractos crudos de la planta completa, disueltos en Tween20 (2%), etanol (95%) y DMSO (2.5%), produjeron mortalidades de larvas, 79,68 ± 22,79%, 69,42 ± 30,58 y 52,12 ± 34,80 %, respectivamente.

Kheirabadi y Abyaneh (2007), realizaron un estudio sobre la actividad biológica de las flores de manzanilla (Matricaria camomila) para evaluar el efecto sobre la supervivencia y ovoposición de garrapatas Acari ixodidae obteniendo como resultado que en concentraciones

4,0 a 8,0 % la mortalidad es de un 25%

también causando inhibición de la ovoposición.

Mariños et al., (2004) realizaron un estudio para evaluar la capacidad biocida del barbasco sobre larvas

de tercer y cuarto estadio de

Anopheles benarrochi,

obteniendo como resultado mayor eficacia con la dosis 3,1 g/L del polvo de raíz de barbasco, produciendo mortalidades mayores al 80% a las 12 horas y del 90% a las 24 horas de aplicación. Adicionalmente se evidenció que existe mayor eficacia con el tratamiento utilizando agua destilada.

En Colombia se realizó un estudio de alelopatía de Polygonum segetum y Rumex crispusen donde se demostró que algunas sustancias inhiben el crecimiento hasta un 75% en la germinación y un 90% en el crecimiento de algunas plantas, en donde

las

sustancias

más

influyentes

son

flavonoides,

terpenos,

sesquiterpenolactonas, quinonas, glicosidos y cumarinas (Gómez et al., 2003).

En un estudio realizado por Godwin et al. (1995), evaluaron la actividad acaricida de Margaritaria discoidea sobre la garrapatas Rhipicephalus appendiculatos y Amblyoma variegatum (ixodidae)

obteniendo como resultado que, a una

concentración de 6,25% expuesta por 10 minutos la mortalidad en adultas como en ninfas era del 100%.

6.2 MARCO TEÓRICO

6.2.1. Garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Rhipicephalus (Boophilus) microplus, conocida vulgarmente como la garrapata común del bovino, es un ectoparásito hematófago que se caracteriza por poseer un cuerpo parcial o totalmente cubierto por una placa dura y quitinosa, el escudo. El aparato bucal puede estar escondido bajo el cuerpo del insecto o puede extenderse desde su extremo anterior. La mayoría de las garrapatas son mono coloreadas y presentan una tonalidad que va desde el rojizo hasta el caoba (Rodríguez, 2006), de tamaño pequeño o mediano con aplanamiento dorso ventral y cuerpo con aspecto cariáceo. La cabeza de la garrapata presenta dos órganos lacerantes o de corte, denominados quelíceros, un órgano de succión penetrante semejante a un ancla y el hipostoma. También posee dos apéndices accesorios semejantes a las patas, que actúan como elementos sensitivos o de soporte cuando la garrapata se engancha al cuerpo del hospedador (Bock et al, 2008).

La clasificación de Las garrapatas es, como sigue: Phylum: Artrópoda, Subphylum: Chelicerata, Clase: Aracnoidea, Orden: Acari, Suborden: Ixodoidea; 29

Familias: Ixodidae, Argasidae y Nutalliellidae Dentro del Orden Acari son aproximadamente 870 especies de garrapatas descritas en las familias Ixodidae, Argasidae y Nutalliellidae en el mundo animal (Guglielmone et al., 2010), las cuales se caracterizan por tener el cefalotórax y el abdomen

fusionados;

son

ectoparásitos

obligados,

permanentes

vertebrados homotermos y poiquilotermos. Todas las especies son hematófagas exclusivas en todos los estadios de desarrollo (Núñez et al.,1987), presenta un dimorfismo sexual claramente definido, su aparato bucal es pequeño y presenta dos órganos lacerantes o de corte denominados quelíceros, un órgano de succión penetrante semejante a un ancla y su hipostoma. (Bock et al.,2008); También los machos presentan un proceso caudal característico y es la garrapata de mayor distribución en el mundo y está asociada con la transmisión de babesiosis y anaplasmosis a los bovinos (Álvarez et al., 2005).

6.2.1.1. Ciclo Biológico

El ciclo biológico de R.B. microplus, en promedio se cumple entre 2 a 2,5 meses produciendo de 4 a 5 generaciones. Se carecterizan por soportar largos periodos de inanición por tener un amplio rango de hospederos, alta tasa de oviposición, y carecen prácticamente de enemigos naturales. De acuerdo con el tipo de garrapata su ciclo puede desarrollarse en uno a varios hospedadores. Las garrapatas duras (ixodidae) como R.B. microplus se caracterizan por pertenecer a un sólo hospedador (monoxena), ya que su ciclo evolutivo lo desarrolla en un animal el cual corresponde a huevos, larvas, ninfas y adultos (Figura 1).

En la familia ixodidade, la cópula se efectúa durante la alimentación de la fase adulta, después de la cópula la hembra cae al suelo para poner los huevos, los cuales son expulsados al exterior por el oviducto, cubiertos por una sustancia pegajosa cuya función es hacer de los huevos formen una masa adherente para 30

protegerlos de la deshidratación (Suárez et al., 2007) despues de la ovoposición la hembra muere (Campos, 2008).

Figura 1. Ciclo biológico de R.B.microplus (Morales, 2004)

El tiempo de incubación de los huevos puede ser de 20 a 30 días, determinados por los factores de temperatura y humedad del medio. La transición de larvas a ninfas es de aproximadamente de 7-8 días, las cuales se ubican y desarrollan en la parte interior de la oreja y el periodo de transición de ninfas a adultos se desarrolla en la piel delgada y fina (8-9 días) estos procesos se llevan a cabo mediante metamorfosis con perdida de la cutícula (muda) la cual puede efectuarse sobre el huésped (Balladares, 1983).

6.2.1.2. Efectos en la Salud del Animal Las garrapatas como parásitos hematófagos llegan a succionar de 0,5 a 3 ml de sangre durante su ciclo parasitario, causando múltiples daños y enfermedades a los bovinos entre las que se destaca la anemia por la pérdida constante de sangre ya que estas durante su fase parasitaria se alimentan de manera permanente (Díaz et al.,2006). Por tal razòn afectan el crecimiento y ganancia de peso corporal, producción de leche, y el desempeño reproductivo, adicionalmente actúan como vectores de hemoparásitos como Babesia y Anaplasma. Cuando hay infestaciones severas estas debilitan el sistema inmunológico creando condiciones para la manisfestación de otras, enfermedades que en algunos casos pueden ser mortales (Guglielmone et al., 2003).

Las picaduras de garrapata provocan daños directos a sus hospedadores ya que se adhieren a la piel de los animales por acción de su órgano fijador el cual al ser introducido induce necrosis por lisis de los tejidos perivasculares del corión, hiperemia local, edema y hemorragia; quedando así una herida en la piel que causa dolor, comezón e intranquilidad en el animal (Tenorio y Oporta, 2006). Asi mismo pueden atraer a las moscas causantes de las miasis, pudiendo llegar a perjudicar el bienestar del animal. (Balladares 1983); Por lo anterior las pieles del ganado se ven afectados por las heridas provocadas por acción de las garrapatas ya que estas forman cicatrices de manera permanente (Vecino, 2006).

Por otro lado la saliva de la garrapata contiene una toxina anticoagulante que pueden provocar parálisis cuando es inyectada en lugares cercanos a la base del cerebro o a la médula espinal, la cual pude llegar a afectar diferentes especies de animales provocando: toxemia generalizada, temperaturas de hasta 40°C, parálisis flácida rápidamente ascendente, disfagia, disnea y muerte. La toxina más concentrada es la producida por una garrapata hembra adulta (Solórzano, 2008). 32

6.2.1.3. Tratamiento y Control de la Garrapata Los problemas relacionados con parasitosis por garrapatas y a las enfermedades que transmiten al ganado, se han considerado como una de las principales limitantes en esta actividad pecuaria, así mismo factores asociados a condiciones geográficas, ambientales e infraestructura (Rodríguez et al.,2006), se ven involucrados en el creciente desarrollo y adaptación de este parásito hematófago; de manera que las estrategias utilizadas se pueden enfocar en el control de la fase libre (campo) y de la fase parasítica (sobre el ganado); sin embargo el control de la garrapata R.B. microplus se ha orientado a la forma parasítica la cual se basa principalmente en evitar que la forma parasitaria llegue a teleógina, evitando que caiga al suelo a colocar los huevos y continúe con su ciclo (Marquez, 2003); por esta razòn los métodos de control se clasifican en químicos (ixodicidas o garrapaticidas) aplicados mediante baños de aspersión; baños por inmersión (FAO, 1993) sobre el dorso del animal (pour on) o inyectables. y no químicos (vacunas y control biológico)(Rodriguez et al., 2005) (Tabla1).

El uso inadecuado de estos productos generan resistencia y hace de este un proceso evolutivo que depende principalmente de la frecuencia inicial de los genes que confieren la resistencia, la intensidad de la selección, el grado de dominancia del gen y la relativa capacidad del genotipo (Stone J, 1962), que posteriormente se ve favorecida por múltiples factores como el uso indiscriminado de garrapaticidas, manejo

intensivo,

razas

alta

producción

con

menor

adaptación,

desconocimiento de nuevas alternativas de control; como también del clima, especies involucradas, agente transmisor, población de hospedadores, situación socioeconómica y la búsqueda de diferentes alternativas para el control de R. B. microplus (Solis, 1991).

Tabla 1. Algunos ixodicidas comerciales GRUPO

Carbamatos

Organofosforados

Lactonas macrociclicas

Piretroides

Amidinas

PRINCIPIO ACTIVO

FARMACO DINAMICA

FUENTE

Carbaril Bendiocarb

Inhiben de manera reversible la enzima colinesterasa, por lo que producen efecto colinérgico y parálisis excitatoria en los parásitos.

Sumanoet al., 2006

Etión Cumafós, Clorpirifós

Ivermectina, Doramectina, MoxidectinaEp rinomectina

Cipermetrina, Deltametrina Permetrina

Amitraz

Fenilpirazoles Fipronil

Inhiben de la colinesterasa, pero de manera irreversible con lo que la transmisión de impulsos en el parásito se hace sostenida y éste muere por parálisis. Estimulan en los parásitos el neurotransmisor GABA, con lo que se incrementa la permeabilidad de la membrana neuronal a los iones de cloro con la consecuencia hiperpolarización y parálisis inhibitoria de la musculatura faríngea y somática de los mismos. Prolongan la fase de despolarización en los parásitos, por lo que producen parálisis excitatoria. Inhibe la acción de la enzima monoamino oxidasa, afectando la transmisión de fibras nerviosas adrenérgicas e interfiriendo en el metabolismo de las catecolaminas. Y provocando hiperexcitabilidad y seguidamente parálisis y muerte. Altera el sistema nervioso central de los insectos, bloqueando los receptores GABA lo que produce hiperexcitación. Esta inhibición es mucho mayor en invertebrados que en vertebrados.

Junquera, 2013

Lifschitzet al., 2002

Junquera, 2013

Betancur et al.,2004

Coure et al., 2008

Dentro de las alternativas para el control de R.B. microplus se encuentra

el uso

de vacunas como método preventivo que produce reducción en el número de garrapatas repletas, en el peso de hembras ovigeras y una disminución de la oviposición y la eclosión, de manera que. La ùnica vacuna comercial, es aquella con base en el antígeno recombinante Bm86, proteína de la superficie del intestino de garrapatas (Alzugaray, 2012).

Como se ha mencionado los métodos de control en Colombia y en otros países se basan en productos ixodicidas de origen sintético; sin embargo se debe desarrollar nuevas alternativas y estrategias dentro de un modelo que favorezca el bienestar de los animales, y de las producciones libres de residuos para el consumo humano. Asi pues surge el interés por buscar nuevas sustancias o principios activos en plantas que ofrezcan acción insecticida dentro de las cuales se pueden evidenciar aquellas con funciones defensivas contra insectos, tales como alcaloides, aminoácidos no proteicos, esteroides.

Por otro lado se tiene el control genético, que implica reducir el potencial reproductivo de una población, alterando o reemplazando el material genético con la creación de cepas de artrópodos que, portando los genes responsables de la sensibilidad a insecticidas, o simplemente factores letales, mutaciones o genes defectuosos, los introduzcan en la población (Cuisanse et al., 1994).

6.2.2 Plantas con Efecto Insecticida Con el avance de la industria farmacéutica se ha dado origen a nuevos productos sintéticos cuyo rol ha sido importante en el desarrollo agrícola y pecuario. Sin embargo su uso desmesurado ha dado origen a distintos problemas como la contaminación ambiental, residuos en los alimentos y la resistencia por parte de los insectos; es por esta razon que se han identificado plantas como alternativa 35

para el control de insectos y parásitos, dentro de las cuales se encuentra Diospyros anisandra a la que se le atribuyen propiedades ixodicidas en el control de larvas de R.B microplus (Rosado et al.,2008). Nicotiana tabacum (tabaco), reconocida por su acción fungicida, insecticida, repelente y acaricida; propiedades atribuidas a su principal componente, la nicotina (Silva, 2002). Otra de las plantas reportadas es margarita discoideapara el control de Rhipicephalus appendiculatos y Amblyoma variegatum (Godwin et al.,1995).

Para el control de pulgas, chinches y mosquitos se ha utilizado Ambrosia cumanensis (Kunth), la cual dentro de sus principales componentes, se encuentran los taninos, inulina, cumarinas, y aceites esenciales (Makabir, 1999); Annona muricata se ha reportado por su efecto acaricida en el control de larvas de R.B microplus (Micheletti et al.,2009) Brugmansia arborea

(L.) Lagerh.

("borrachero") de la familia de las solanáceas que posee como principal componente la escopolamina y variados alcaloides del grupo tropano Pino et al., (2008). Otra planta es el Neem (Azadirachta indica), originario de la india es un árbol que se caracteriza por poseer alrededor de 18 compuestos entre los que destacan solanina, meliantrol y azadiractina que es el que se encuentra en mayor concentración en las semillas, además muestra una acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la oviposición y esterilizante (Silva, 2002).

6.2.2.1 Barbasco (Polygonum segetum) Kunth

Polygonum

segetum

viene

voz

griega

polygonum

que

significa

multirrodillonas y se refiere a los nudos abultados semejantes a rodillas que tienen en los tallos (Molina, 1999). Es considerada una planta invasora que crece en áreas subtropicales del mundo donde ocasiona grandes pérdidas en cosechas y 36

praderas debidas a sus propiedades alelopáticas que ejercen efecto sobre el crecimiento de especies cultivables inhibiendo la germinación en un 75% y 90% el crecimiento. En Colombia se encuentra en humedales o en ecosistemas de características similares y en zonas ubicadas por encima de los 2000 msnm, las cuales son muy difíciles de manejar por su alta competitividad y gran habilidad para propagarse, tanto sexual como vegetativamente (Gómez et al., 2003). Figura 2.

Figura 2. Polygonum segetum (Morales y Guzmàn, 2010).

6.2.2.2 Clasificación Taxonomica

Planta clasificada por Jara O.A en el 2008

Nombre cientifico: Polygonum segetum Reino: Plantae Phylum: Magnolliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Polygonales Familia: Polygonaceae Genero: Polygonum Epitelio especifico: Segetum Autor epitelio especifico: kuntk.(Instituto de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia).

Los nombres comunes de las plantas comprenden muchas denominaciones o cambios permanentes de nombres, lo cual obedece a las diferentes idiosincrasias, a la diversidad de lenguas y a las apreciaciones de cada grupo étnico, causando titubeos y dudas sobre los nombres de las plantas constituyéndose en un elemento limitativo e inmanejable en la ciencia de la clasificación botánica, de manera que en Boyacá es conocido como barbasco; en Cundinamarca barbasco rosado,barbasco, envidia, gloria, gualola, hierba de sapo y en los Andes;corazón herido, hierba de sapo (Instituto de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia).

6.2.2.3 Caraterísticas Botánicas

Polygenum segetum es una planta anual, herbácea que alcanza hasta 70 cm de altura. Presente en cultivos de clima frío, de raiz pivotante que se desarrolla en 38

suelos mal drenados y húmedos con tallos cortos erectos y algunas veces decumbentes; las ramas jóvenes así como los pedúnculos son glandulosos y pubescentes, y con brácteas no ciliadas (sin cerdas o pelos). Aunque sus hojas son alternas, lanceoladas atenuadas en ambos extremos, glandulosas y punteadas por el envés. En edad avanzada presentan una coloración rojiza en el haz que se sitúa en el centro de la hoja. En donde su fruto

es un aquenio

lenticular, de color marrón brillante y de 2 a 4 mm de diámetro. Y su semilla es redondeada, aplanada, acuminada y de coloración marrón posee algunas Inflorescencias dispuestas en espigas con flores de tamaño pequeño de color rosado a rojo (Saldarriaga , 2011).

6.2.2.4 Composiciòn Quimica.

Estudios fitoquimicos realizados con el barbasco han mostrado una gran variedad de metabolitos secundarios (Derita et al., 2008), que varian en su composición en las diferentes partes de las plantas y que se pueden modificar con la edad de la misma

y con las condiciones ambientales (Gómez et al.,2003). Contiene

principios activos flavonoides que poseen propiedad antioxidante (Morales et al, 2010); el galato de etilo que presenta actividad antimicrobiana, se ha utilizado como inhibidor de Mycobacterium tuberculosis (stone j, 1962) y el homoegonol que presenta actividad antifúngica y antibacteriana (Pauletti y Araújo, 2000); asi mismo se ha identificado la presencia de la flavona 5-hidróxi-7,8,4´-trimetóxi isoflavona, y la 5,3,4-trihidróxi-7-metóxi flavanona. cuyos metabolitos (flavonoides) se reportan por primera vez para el género Polygonum (Morales y Guzmán, 2010).

6.2.2.5 Usos Medicinales La identificación del valor curativo de las plantas ha surgido por la información proporcionada por el saber médico tradicional, que igualmente ha sido la fuente 39

para la investigación fitoquímica, la investigación de los principios activos, y en algunos casos, el desarrollo de nuevas fármacos. Es así como Morales et al (2010), reporta el uso tradicional de barbasco empleando hojas trituradas como insecticidas para el control de pulgas y la sarna en perros; como también se ha reportado el uso de sus flores para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II; como también es coadyuvante en el control de diarreas, catarros crónicos y hemorragias internas (García, 1990). Así mismo se reportan otros usos como narcótico, vermífugo, tratamiento de retención urinaria, cálculos renales, ranilla bovina (Parra et al., 1999). Por otra parte, estudios científicos reportan que el barbasco Lonchocarpus utilis cuyo principio activo es rotenona el cual tiene efecto biocida como regulador de larvas de mosquito Mariño et al (2004); como también se ha reportado efecto biocida de sacha barbasco y barbasco demonte; a su vez especies como Hydropiperoides,

Solanum

nigrum

Calliandra

pittieri

entre

otras,

han

demostradoefecto insecticida sobre el gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) (Morales et al., 2010).

6.3 MARCO LEGAL La ley 84 del 27 de diciembre de 1989 mediante la cual se normatiza el Estatuto Nacional de Protección de los Animales, en su artículo 2, tiene por objeto “prevenir y tratar el dolor y el sufrimiento de los animales”, en tal sentido, en el desarrollo de este trabajo, se dará cumplimiento a la norma debido a que la obtención de la garrapata no genera dolor o sufrimiento lo que no justifica el uso de analgesia o anestesia. De igual forma el artículo 24 del capítulo V, de la misma ley dispone que “el animal usado en cualquier experimento deberán ser puesto bajo los efectos de la anestesia lo suficiente fuerte para evitar que sufre dolor”, sin embargo, el retiro de 40

las garrapatas del cuerpo de los bovinos, para el estudio no genera dolor que justifique someterlos a un estado de anestesia general riesgoso, ni tampoco a ningún tratamiento analgésico.

En el artículo 17 del capítulo V, de la misma ley, se afirma que puede haber sacrificio de animales en cuanto a “constituir una amenaza cierta o inminente para la salud pública o de los animales”, de acuerdo a este articulo lo que se busca con el desarrollo de este trabajo es encontrar una nueva alternativa para el control de la garrapata, en beneficio de la salud animal y humana.

6.4 MARCO GEOGRÁFICO Este trabajo se desarrolló en el municipio de San Miguel de Sema (Figura 1), donde se recolectó el material vegetal y las garrapatas; que posteriormente se trasladaron a la ciudad de Tunja (Figura 2), en donde se elaboraron los extractos y las pruebas de eficacia in vitro dentro de los las instalaciones de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.

Figura 1. Ubicación San Miguel de Sema en el departamento de Boyacá (Disponible en: https://maps.google.es/) 41

Figura 2. ciudad de Tunja disponible en: https://maps.google.es/

6.4.1 Descripcion fisica

El municipio de San Miguel de Sema se encuentra ubicado en la provincia del occidente del departamento de Boyacá enmarcado dentro de las coordenadas topográficas: 5º 31´15” de latitud norte y a los 73´º 43´ 39” al oeste del meridiano de Greenwich; posee una extensión de 90 Km 2; representados en 9.044 hectáreas, de las cuales 9.023 corresponden a la parte rural y 21 al área urbana, es decir, El 99.77% es área rural y El 0. 23% es zona urbana.

El casco urbano del municipio de San Miguel de Sema se encuentra a una altitud de 2.615 metros sobre el nivel del mar donde su alturas máxima (2.850 m.s.n.m), corresponde a la cuchilla de Peña Blanca, ubicada en la vereda de Peña Blanca al norte del Municipio y la altura mínima (2500 m.s.n.m.), corresponde a: las veredas Quintoque, Hato Viejo, Sabaneca y Sirigay. 42

Su temperatura media, en todo el año es de 13ºC. El municipio limita por el norte con Chiquinquirá, por el sur con Guachetá, por el occidente con Ráquira y Tinjacá y por el oriente con Simijaca, Capellanía.

Dentro de la actividad económica del municipio, se destaca la ganadería de leche; como principal fuente de ingresos del municipio, especialmente ganado Holstein, su producción es tan importante que hoy día algunas de las empresas productoras de derivados lácteos, ha instalado centros de acopio. Existen aún zonas del municipio donde el principal renglón sigue siendo la agricultura principalmente papa y maíz. seguida por actividades agrícolas de consumo que llevan a que el municipio tenga una independencia relativa en cuanto a los centros de desarrollo regional.

Por su parte, Tunja es la capital del Departamento de Boyacá, ubicada en la zona del centro del Departamento (Figura 2).

Tunja se encuentra localizada en el Valle del Alto Chicamocha, sobre la Cordillera Oriental de los Andes en el centro del país. Se encuentra entre 2.800 y 3000 msnm, aproximadamente. La temperatura oscila entre 8oC y 13oC. La ciudad limita por el norte con la provincia de Tundama y el departamento de Santander; por el sur con la provincia de Márquez y el departamento de Cundinamarca; por el oeste con la provincia de Ricaurte y por el este, con las provincias, de Márquez y Sugamuxi (http://www.tunja-boyaca.gov.co).

7. METODOLOGÍA

El estudio fue de tipo experimental ya que se manipularon variables y se evaluó el efecto de los tratamientos sobre las variables dependientes, para establecer cuál fue el mejor.

7.1 LUGAR DE ESTUDIO Como ya se mencionó, la colecta de las garrapatas, se realizó en el municipio de San Miguel de Sema, específicamente en la vereda Quintoque, en una finca que tiene

una

extensión

aproximada

cuatro

hectáreas

conformadas

topográficamente por terrenos planos y pequeñas pendientes. Es una finca destinada a la producción lechera, en la cual también se colectó el material vegetal.

Las pruebas in vitro y la elaboración de los extractos se realizaron en el Laboratorio de Nutrición Animal del Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UPTC, que se encuentra ubicado en el Edificio de Laboratorios de la sede central, en la ciudad de Tunja. Allí se encuentran los equipos y materiales necesarios para la extracción como también cuenta con un espacio aislado para el mantenimiento de las garrapatas y almacenamiento de los materiales, hasta la culminación del estudio.

7.2 ANIMALES DE ESTUDIO. Los estudios reportados en la literatura coinciden en que el método de inmersión de adultas, ya validado, constituye la prueba más confiable para determinar la eficacia de diversos compuestos sobre garrapatas adultas. Es sabido que las 44

garrapatas tienen la capacidad de permanecer en estados de apnea por varias horas por lo que se sabe que la inmersión misma no genera la muerte de los parásitos, adicionalmente la inclusión dentro de los grupos control un grupo expuesto a agua, demuestra que el proceso de inmersión no genera la muerte de los animales. Dicha técnica se utilizan generalmete 10 garrapatas por ensayo y éstos se hacen por duplicado, sin embargo en este trabajo se decidio un número de garrapatas por ensayo de 11 buscando tener un número impar que facilite la interpretación de los resultados y hacerlo por triplicado para dar mayor confiabailidad; de tal forma que para el total de grupos tratamiento se requirieron 330 garrapatas R.B microplus que costituyeron las unidades experimentales las cuales se obtuvieron de bovinos naturalmente parásitados; de la raza Jersey, que se encuentran exclusivamente en pastoreo.

7.2.1 Mantenimiento de garrapatas en el laboratorio Una vez se tuvieron las garrapatas identificadas en el laboratorio se pocedió a eliminar cualquier cuerpo extraño lavándolas con agua en un colador posteriormente se colocarón en papel absorbente para secarlas y realizar su correcta distribución en los frascos de vidrio selecionados para este proceso (Figura3).

Imagen 3. Frascos de vidrio utilizados para la distribución de garrapatas. (Autor, 2014) 45

Durante este proceso, las garrapatas se colocaron en cada recipiente, tapándolas con mallas y rotuladolos debidamente y fueron llevadas a la incubadora donde se mantuvieron a un temperatura de 22 °C, para mantener la humedad se colocó papel de filtro en cada frasco humedeciéndolo diariamente con agua destilada y dentro de la estufa se colocaron recipientes con agua, evitando la desecación de los parásitos (Figura 4).

Imagen 4. Incubadora para el mantenimiento de las garrapatas en el laboratorio. (Autor, 2014)

7.4 DISEÑO METODOLÓGICO Buscando dar cumplimiento a los objetivos del trabajo las actividades a desarrollar se realizaron de manera consecutiva (Figura 3)

Figura 3. Esquema del diseño metodológico (Autor, 2013)

El trabajo se realizó bajo un diseño completamente al azar en el que se distribuyeron las garrapatas aleatoriamente en ocho grupos de tratamiento con 11 garrapatas cada uno, haciendo el ensayo por triplicado (réplicas), para luego, analizar los resultados, considerado el promedio de las tres réplicas. La distribución fue como sigue:

Grupo 1 (n=11). Las

garrapatas de este grupo fueron expuestas al extracto

etanólico puro obtenido mediante el método Soxhlet.

Grupo 2 (n=11). Las

garrapatas de este grupo fueron expuestas al extracto

etanólico puro obtenido por el método lixiviación.

Grupo 3 (n=11). Las garrapatas de este grupo fueron expuestas al solvente etanol a una concentración de 70%, que fue el mismo que se usó para la elaboración de los extractos.

Grupo 4 (n=11).Las garrapatas de este grupo fueron expuestas al agua destilada de igual calidad que la empleada en las diluciones.

Grupo 5 (n=11).Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a las condiciones ambientales del laboratorio, las mismas a las que estuvieron expuestas todas las garrapatas.

Grupo 6 (n=11). Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a un producto comercial a base de Coumaphos preparado según las indicaciones de la etiqueta, las cuales fueron diluir el producto en polvo en proporción 1:1300, de producto en agua.

Grupo 7 (n=11).Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a un producto comercial líquido a base de Cipermetrina, preparado según las indicaciones de la etiqueta, esto es en proporción 2:2000, de producto en agua.

Grupo 8 (n=11) Las garrapatas de este grupo fueron expuestas a un producto comercial líquido a base de Amitraz preparado según las indicaciones de la etiqueta, es decir en proporción 1:20000, de producto en agua.

Los grupos 6, 7, 8 fueron incluidos para que actúen como control positivo y los grupos 3, 4, 5 como control negativo para garantizar que los solventes y el agua

utilizada, así como las condiciones ambientales del laboratorio no interfieran en la muerte de las garrapatas.

Con base en los resultados de porcentaje de mortalidad obtenidos a partir de los grupos 1 y 2 se procedió a realizar las respectivas diluciones para cada grupo, en donde se utilizó agua destilada en relación 1:1 (Extracto: Agua), y un número aproximado de 66 garrapatas para un total de 330 garrapatas usadas en toda la investigación.

Una vez que cada grupo de garrapatas fue expuesto al respectivo tratamiento se evalúo la mortalidad determinada por el movimiento de las patas inmediatamente después de ser expuestas a las 24, 48, 72, y 96 horas.

7.5 Procedimientos

7.5.1 Recolección de la Planta para Identificación Buscando garantizar que las plantas que se usaron en el estudio pertenecen al género y especie, mencionadas, antes de iniciar el trabajo, se tomó al azar una muestra de una planta en estado de floración, arracada de raíz, garantizando que llevara todas sus partes intactas, la cual se envió al Herbario de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, para su identificación. Dicha planta se transportó, tal como lo indicaron en el herbario, extendiendo

cuidadosamente

todas sus partes y envolviéndola en papel periódico hasta su llegada al herbario.

7.5.2. Proceso Colecta de Hojas, Secado y Elaboración de los Extractos En el mismo sito donde se tomó la muestra de planta para enviar al herbario, se hizo la colecta del material vegetal para la elaboración de los extractos. Durante el 49

proceso de colecta se escogieron hojas sanas y limpias, las cuales fueron cortadas con tijeras teniendo precaución en no dañarlas durante esta proceso; posteriormente se llevaron al laboratorio de Nutrición de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia donde las hojas se dispusieron en una sobres de manila para su secado, el cual se realizó en una estufa de aire recirculado (MEMMERT, Suiza) a 66 ºC durante 12 horas. Una vez el material vegetal estuvo completamente seco, se procedió a triturar manualmente para la posterior elaboración del extracto, por los dos métodos seleccionados (Figura 5).

Imagen 5. Estufa de aire recirculado para el secado del material vegetal. (Autor, 2014)

7.5.2.1 Extracción Etanólica por el Método Soxhlet Para este método se pesaron 30 gr de las hojas trituradas de

Polygonum

segetum; Este proceso se realizó en el laboratorio de microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos utilizando una balanza (Figura 6).

Figura 6. Pesado material vegetal (Autor, 2014)

Con la cantidad indicada de material vegetal se procedió a colocarlo en la cámara de extracción del equipo Soxhlet y simultáneamente se colocó en un balón, etanol al 70%

del

mismo equipo y se procedió a colocar el solvente a punto de

ebullición. El solvente así evaporado asciende por la cámara de extracción hasta llegar a los tubos de flujo de agua, fría con lo que ocurre la condensación del mismo, cayendo sobre el material vegetal para realizar la extracción de compuestos afines al etanol. Este proceso es constante de manera que se obtiene el extracto etanólico gota a gota. El circuito se mantuvo funcionando hasta que el extracto fue traslucido, esto es 2 horas (Figura 7).

Figura 7. Equipo de extracci贸n soxhlet (Autor, 2014)

Figura 8. Proceso de evaporación del solvente etanólico en el rotaevaporador (Autor, 2014) Finalmente el extracto se llevó al rotaevaporador a una temperatura de 78ºC y 100 rpm, en donde se extrajo la mayor cantidad solvente obteniendo así un extracto puro (Figura 8).

7.5.2.2. Extracción Etanólica por el Método de Lixiviación

Para este método se pesaron 30 gr de hojas secas y trituradas, de Polygonum segetum, que fueron colocadas en una columna de extracción de PVC, empacando las dos terceras partes de su capacidad. Dicha columna de extracción, se conectó con mangueras, conformando así un circuito cerrado el cual 53

permitió reutilizar el solvente. Posteriormente a la columna se le agregó 200 ml de etanol al 70%, y se conectó a un motor para mantener constante el flujo del solvente, durante 24 horas (Figura 9).

Figura 9. Extracción etanólica por el método de lixiviación en frio (Autor, 2014) 7.5.3 Pruebas cualitativas

Estas pruebas se realizaron en el laboratorio de nutrición de la Universidad Pedagógica y Tecnología de Colombia para determinar los metabolitos presentes en las hojas de Polygonum segetum; en donde se utilizaron reactivos químicos para hacer la identificación de los metabolitos tabla 2. 54

Tabla 2. Metabolitos secundarios. PRUEBA

MÈTODO

METABOLITO

INTERPRETACIÒN

SHINODA

Se efectuó agregando lentamente magnesio en limaduras y posteriormente, gotas de ácido clorhídrico; después se esperó 2 minutos para saber si se producía un cambio de coloración.

Flavonoides

Rojizo

Lecoantocianidina Proantocianidina

Rojizo

ROSENHEIM

CLORURO FÉRRICO

SAPONINAS

TANINOS

A dos ml de extracto, colocado en un tubo de ensayo, se le agrego por las paredes del tubo gota a gota, HCl luego se calentó en baño maría hirviendo durante 15 minutos. A 1 ml de extracto colocado en un tubo de ensayo, se le agrego 1 gota de FeCl3 al 1% alcohólico y se mezcló constantemente.

Compuestos con grupos hidroxilos fenólicos

2 mL de extracto se diluyeron en 5 veces su volumen en agua destilada, se agitó durante 5 min y se esperó más de 2 minutos a que se presentara espuma en la superficie.

Saponinas

Se remojo 25 gr de gelatina, durante una hora, en una solución saturada de cloruro de sodio. Se calienta hasta que disuelva completamente y se afora a 1 Lt. Se agrega 1 ml de esta mezcla a 1 ml del extracto. Si se forma precipitado, centrifugar a 2000 rpm, durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante y re-disolver el precipitado en 2 ml de úrea. Añadir 2-3 gotas de cloruro férrico (FeCl3) al 10%.

Taninos

Verde oscuro

Presencia de abundante espuma

Colores o precipitados verdes, azules o verdes

7.5.4 Obtención de las Garrapatas Buscando garantizar que las garrapatas colectadas se encontraran en la misma fase del ciclo biológico, se tomaron solo aquellas que estaban en fase parasítica sobre el animal; durante este proceso se revisaban los animales, de cabeza a cola por el lado y lado; se recolectaron garrapatas con un tamaño entre 13 a 35 mm de longitud tomando el cuerpo de las garrapatas con el dedo indice y pulgar procurando llevar la uña del pulgar hasta el aparato de fijación, ejerciendo ligeras presiones y pequeños movimientos en todos los sentidos hasta que el animal se desprendia (Rodriguez y Cob, 1994). Posteriormente se colocaron en un frasco de vidrio de boca ancha con papel de filtro en el fondo, el cual se humedecía con unas gotas de agua y luego fueron llevadas al laboratorio para la identificación de género y especie, y selecion de individuos ya que algunas tenian mutaciones o estaban muertas y se mantuvieron en el laboratorio para el inicio de la prueba de eficacia in vitro.

7.6. Pruebas de Inmersión de Garrapatas Adultas Para la evaluación de la eficacia de los extractos, se realizó la prueba de inmersión de adultas utilizando vasos de precipitado con capacidad de 100 ml en los cuales se colocó 40 ml de la solución correspondiente al grupo de tratamiento, con el fin de que quedaran completamente cubiertas y como se mencionó cada grupo constó de 11 garrapatas y cada ensayo se hizo por triplicado, de manera que se tuvieron tres vasos con 11 garrapatas cada uno, con el mismo volumen de líquido en cada uno, diferenciándose únicamente por el tipo de sustancia según cada tratamiento. Las garrapatas fueron colocadas en los vasos dejándolas por 30 minutos, con el fin de dar un mayor tiempo de exposición. Cumplido el tiempo se extrajo el líquido, usando un colador y colocándolas en papel absorbente para que se secaran, y a partir de ese momento se observó la mortalidad durante las 0, 24, 48, 72 y 96 horas (Figura 10). 56

Figura 10. Prueba de inmersión de adultas por triplicado (Autor, 2014)

7.7 Definición y Operacionalización de las Variables y los Indicadores. Las condiciones de mantenimiento de las unidades experimentales en el laboratorio durante la fase de experimentación, fueron constates y se aplicaron para todos los grupos a evaluar. Variables independientes  Tratamientos (extractos puros, extractos diluidos, controles negativos y controles positivos).

Variables dependientes  % Mortalidad encontrado

7.8 Tratamiento y Procesamiento de la Información Para evaluar la mortalidad se observó la presencia de movimiento de las patas o algún movimiento como indicativo que la garrapata se encontraba viva; o por el 57

contrario se observaba ausencia de movimiento el cual era indicativo de mortalidad, y con el fin de determinar el porcentaje de mortalidad se tuvo en cuenta la siguiente fórmula:

Fuente (Casteblanco et al., 2012)

En este estudio se tuvo en cuenta el conteo de los animales vivos y muertos y no la biomasa ya que el cálculo de mortalidad o de supervivencia es más preciso de esta manera, en razón a que el peso de los animales puede variar con el transcurso de los días, dando datos erróneos.

8. ANÁLISIS DE DATOS Como información complementaria se calculó el riesgo relativo (RR) con el fin de determinar la relación entre la exposición a los tratamientos y la mortalidad; estos datos se organizaron en una tabla de 2X2 (Tabla 3).

Tabla 3. Analisis de datos.

Posteriormente se aplicó la siguiente formula:

Cómo se mencionó, el RR se utilizó para determinar si había relación entre la exposición a un tratamiento y la muerte de las garrapatas, interpretándose el resultado de esta manera: RR < 1: Es un factor de protección, la exposición al tratamiento no produce la mortalidad de las garrapatas. RR = 1: Se considera un valor nulo, no existe relación. RR > 1 Es un factor de riesgo, hay relación entre la exposición al tratamiento y la mortalidad de las garrapatas.

9. HIPÓTESIS.

Hipótesis de investigación (Hi): El extracto de barbasco Polygonum segetum posee efecto ixodicida sobre la garrapata Rhipicephalus Boophilus microplus.

Hipótesis nula (Ho): El extracto de barbasco Polygonum segetum no posee efecto ixodicida sobre la garrapata Rhipicephalus Boophilus microplus.

10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

10.1 RESULTADOS

10.1.1 Identificación de la Planta La identificación taxonómica fue realizada en el Herbario de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, donde indicaron: Familia: polygonaceae Género: plygonum Especie:Polygonum segetum (Anexo 1)

10.1.2 Resultados de Pruebas Cualitativas de Metabolitos Secundarios

Relizadas las pruebas cualitativas para la identificación de metabolitos secundarios, se pudo determinar la presencia de flavonoides, compuestos fenólicos y de proantocianidina y lecoantocianidina en ambos tipos de estractos.

10.1.3 Mortalidad Con Extracto Etanólico Obtenido por el Metodo Soxhlet (Grupo 1). De acuerdo con los resultados encontrados en el estudio se demuestra efecto ixodicida del extracto etanólico de P. segetum, obtenido mediante el método de Soxhlet, el cual fue aumentando a medida que pasaba el tiempo del estudio. Fue así como se obtuvo la mayor mortalidad hacia la hora 96 siendo ésta de 54,5% (Tabla 5).

Tabla 4. Resultado pruebas cualitativas PRUEBA

METABOLITO

MÉTODO SOXHLET

MÉTODO LIXIVIACIÓN

SHINODA

Flavonoides

(+)

ROSENHEIM

Lecoantocianidina Proantocianidina

(+)

CLORURO FÉRRICO

Compuestos con grupos hidroxilos fenólicos

(+)

TANINOS

Taninos

(-)

SAPONINAS

Saponinas

(-)

Tabla 5. Porcentaje y número de R. (B.) microplus muertas tras la exposición al extracto etanólico puro de Polygonum segetum utilizando el método Soxhlet. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS/# TOTAL DE GARRAPATAS)

Porcentaje (%) de

Tiempo de Observación (Horas) REPLICAS

Mortalidad acumulada por Tiempos

mortalidad 0

9,0%

54,5%

63,6%

(1/11)

(6/11)

(7/11)

27,2%

45,5%

72,7%

(3/11)

(5/11)

(8/11)

9,0%

18,1%

27,2%

(1/11)

(2/11)

(3/11)

15,15%

30.3%

39.4%

42.4%

54.5%

(5/33)

(10/33)

(13/33)

(14/33)

(18/33)

(# muertas/total)

54,5 (18/33)

Es de aclarar que para este los demás grupos, el tiempo cero (0), corresponde al recuento de garrapatas, inmediatamente después de haber terminado la inmersión.

10.1.4 Mortalidad Con Extracto Etanólico Obtenido por Lixiviación (Grupo 2). El extracto etanólico de

P. segetum, obtenido por lixiviación a temperatura

ambiente, mostró efecto ixodicida reducido, logrando una mortalidad total de 10 de las 33 garrapatas (30,3%). De la misma manera, se observó el mismo comportamiento del grupo anterior en el que la mortalidad inicial fue baja, pero aumentó con los días, siendo mayor en la última valoración. (Tabla 6)

Tabla 6. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus muertas expuestas al extracto etanólico puro en frio de Polygonum segetum utilizando el (método de lixiviación). PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS/# TOTAL DE GARRAPATAS)

Tiempo de Observación (Horas) Porcentaje (%) de

REPLICAS

mortalidad (# muertas/total)

9,0%

18,1%

27,2%

(1/11)

(2/11)

(3/11)

18,1%

27,2%

36,3%

(2/11)

(3/11)

(4/11)

30,3%

9,0%

18,1%

18,10%

18,1%

27,2%

(10/33)

(1/11)

(2/11)

(3/11)

acumulada

12,1%

15,1%

18,1%

24,2%

30,3%

por

(4/33)

(5/33)

(6/33)

(8/33)

(10/33)

Mortalidad

Tiempos

10.1.5 Mortalidad Obtenida en los Grupos Control (Grupos 3, 4 y 5) Las 33 garrapatas expuestas a las condiciones de laboratorio, sin haber sido expuestas a nigún tipo de sustancias, tuvieron una mortaldidad de 12,1%, inferior a los grupos de tratamientos, anteriormente mencionados. Con lo anterior se afirma que la temperatura y humedad a las cuales se mantuvieron durante todo el estudio no causaron una mortalidad considerable toda vez que ésta estuvo por debajo de 10% hasta las 72 horas postexposición (Tabla 7 ).

Tabla 7. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control negativo muertas expuestas al ambiente. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS / # TOTAL DE GARRAPATAS) Tiempo de Observación (Horas) Porcentaje (%) de mortalidad (# muertas/total) REPLICAS 0 24 48 72 96 1

Mortalidad acumulada por Tiempos

0,0%

18,1%

(0/11)

(2/11)

0,0%

9,0%

(0/11)

(1/11)

0,0%

9,0%

(0/11)

(1/11)

0,0%

3,0%

9,0%

12,1%

(0/33)

(1/33)

(3/33)

(4/33)

12,12% (4/33)

De manera similar al grupo anterior,con la exposición a agua destilada, se buscaba demostrar que ésta no tiene efecto garrapaticida por lo que la dilución de los extractos en la misma, no afecta la confiabilidad de los resultados. Fue asi como, en este grupo hubo una mortalidad de tan solo 9,09% (Tabla 8). 64

Tabla 8. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control negativo muertas expuestas al agua destilada. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS / # TOTAL DE GARRAPATAS) Tiempo de Observaci贸n (Horas) Porcentaje (%) de mortalidad (# muertas/total) REPLICAS 0 24 48 72 96 1

Mortalidad acumulada por Tiempos

0,0%

(0/11)

0,0%

9,0%

(0/11)

(1/11)

0,0%

9,0%

18,1%

(0/11)

(1/11)

(2/11)

0,0%

6,0%

9,0%

(0/33)

(2/33)

(3/33)

9,09% (3/33)

Finalmente, de las 33 garrapatas expuestas al etanol, ocho hab铆an muerto para la hora 96 del estudio (Tabla 9).

10.1.6 Mortalidad Obtenida en los Grupos Control Positivo (Grupos 6, 7 y 8)

De las 33 garrapatas, 5 murieron cuando fueron expuestas al producto comercial a base de amitraz durante los tiempos de observaci贸n 0, 24, 48, 72, y 96 horas no se evidenci贸 una mortalidad que permitiera ser interpretada como eficaz, ya que se obtuvo como resultado una mortalidad de 15,1% (Tablas 10).

Tabla 9. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control negativo muertas expuestas al etanol. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS / # TOTAL DE GARRAPATAS) Tiempo de Observación (Horas) Porcentaje (%) de mortalidad (# muertas / total) REPLICAS 0 24 48 72 96 1

Mortalidad acumulada por Tiempos

9,0%

18,1%

27,2%

(1/11)

(2/11)

(3/11)

0,0%

9,0%

18,1%

27,2%

(0/11)

(1/11)

(2/11)

(3/11)

0,0%

9,0%

18,1%

(0/11)

(1/11)

(2/11)

3,0%

6,0%

9,0%

18,1%

24,2%

(1/33)

(2/33)

(/33)

(6/33)

(8/33)

24,24% (8/33)

Por su parte, la exposicon de las garrapatas a coumaphos

produjo una

mortalidadad superior a la del producto anteriormente mencionado, siendo esta 63,6% (Tabla 11).

Por último y como se mencionó en la metodologìa, otro grupo de 33 garrapatas, se expuso a

cipermetrina, de las cuales murieron 27, entre las 48 y 72 horas

posteriores a la

exposición, obteniendo como resultado una mortalidad

significativa del 81,1% (Tabla 12).

Tabla 10. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control positivo muertas expuestas al produto comercial Amitraz. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS / # TOTAL DE GARRAPATAS) Tiempo de Observaci贸n (Horas) REPLICAS 1

Mortalidad acumulada por Tiempos

0,0%

9,0%

0/11

1/11

9,0%

1/11

0,0%

9,0%

27,2%

0/11

1/11

3/11

3,0%

6,0%

12,1%

15,1%

(1/33)

(2/33)

(4/33)

(5/33)

Porcentaje (%) de mortalidad (# muertas / total)

15,15% (5/33)

Tabla 11. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control positivo muertas expuestas al producto comercial coumaphos. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS / # TOTAL DE GARRAPATAS) Tiempo de Observaci贸n (Horas) REPLICAS

0,0%

27,2%

0/11

3/11

0,0%

18,1%

90,9%

100%

0/11

2/11

10/11

11/11

27,2%

36,3%

54,5%

63,6%

3/11

4/11

6/11

7/11

9,0%

12,1%

24,2%

60,6%

63,6%

(3/33)

(4/33)

(8/33)

(20/33)

(21/33)

Mortalidad acumulada por Tiempos

Porcentaje (%) de mortalidad (# muertas / total)

63,63% (21/33)

Tabla 12. Porcentaje de garrapatas R. (B.) microplus del grupo control positivo muertas expuestas al producto comercial cipermetrina. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS / # TOTAL DE GARRAPATAS) Tiempo de Observación (Horas) REPLICAS

0,0%

9,0%

18,1%

72,7%

100%

0/11

1/11

2/11

8/11

11/11

0,0%

63.6%

81,8%

90,9%

0/11

7/11

9/11

10/11

9,0%

18,1%

45,4%

54,5%

1/11

2/11

5/11

6/11

3,0%

6,0%

33,3%

66,6%

81,8%

(1/33)

(2/33)

(11/33)

(22/33)

(27/33)

Mortalidad acumulada por Tiempos

Porcentaje (%) de mortalidad (# muertas / total)

81,81% (27/33)

Considerando que la eficacia mínima de un producto ixodicida corresponde a una mortalidad de 80% y solo algunos autores la aceptan del 60%, en este trabajo solo hubo efecto ixodicida aceptado como eficaz con cipermetrina y con el cumafós apenas aceptable.

10.1.7 Mortalidad Obtenida de Garrapatas Expuestas al Extracto Etanólico de Soxhlet en Dilución 1:1 (Extracto: Agua) (Grupo 9)

Como se mencionó en la metodologìa, se realizaron diluciones 1:1 del estracto puro en agua destilada; encontrando la misma mortalidad en las tres réplicas, correspondiente a 27,2% para todo el ensayo (Tabla 13).

Tabla 13. Porcentaje de mortalidad y número de R. (B.) microplus muertas en dilución 1:1 de extracto etanólico puro obtenido por el método Soxhlet. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS/# TOTAL DE GARRAPATAS) Porcentaje (%) de

Tiempo de Observación (Horas) 0

REPLICAS 1 2 3 Mortalidad Acumulada Por tiempos

mortalidad (# muertas/total)

27,2% (3/11) 18,1% (2/11) 0,0% (0/11) 15,15%

27,2% (3/11) 27,2% (3/11) 18,1% (2/11) 24,24%

27,2% (3/11) 27,2% (3/11) 27,2% (3/11) 27,27%

5/33

8/33

9/33

27,27% (9/33)

10.1.8 Mortalidad Obtenidad de Garrapatas Expuestas al Extracto Etanolico Obtenido por el Método de Lixiviacion en Dilución 1:1 (Extracto: Agua).

Finalmente el grupo de garrapatas expuestas a la dilucion 1:1 (extracto etanólico por lixiviación : agua destilada), tuvieron una mortalidad de 18,1% (tabla 14).

10.1.9 Resultado Riesgo Relativo (RR) De acuerdo con la interpretación del RR, se encuentra que los extractos puros obtenidos por los dos métodos evaluados (Sohxlet y lixivición), produjeron mortalidad de las garrapatas, en porcentajes de 54,5% y 30,3%, respectivamente, siendo superior la acción con el extracto obtenido por Soxhlet. En ningún caso, los extractos superaron la acción ixodicida de coumaphos o de cipermetrina pero sí tuvieron mejor comportamiento que el amitraz, el cual para este estudio no mostró eficacia y no fue el causante de la muerte de las garrapatas, de una manera notoria. Tal como se esperaba, los resultados obtenidos en el RR de los grupos control, indican que ninguno de los factores involucrados (condiciones de laboratorio, agua destilada o

etanol), produjo la muerte de los animales de estudio, en razón a que dicho valor fue <1 (Tabla 15).

Tabla 14. Porcentaje de mortalidad y número de R. (B.) microplus muertas en dilución 1:1 del extracto etanólico puro de P segetum obtenido por el método de lixiviación. PORCENTAJE (%) DE MORTALIDAD (# GARRAPATAS MUERTAS/# TOTAL DE GARRAPATAS) Porcentaje (%) de

Tiempo de Observación (Horas) REPLICAS

mortalidad (# muertas/total)

Mortalidad Acumulada Por Tiempos

9,0%

18,1%

(1/11)

(2/11)

9,0%

18,18%

(1/11)

(6/33)

27,2%

(3/11)

15,15%

18,18%

5/33

6/33

Tabla 15. Consolidado del riesgo relativo (RR), para todos los tratamientos evaluados en el estudio. GRUPO Evento TRATAMIENTO MUERTAS VIVAS RR Exposición Expuesto No expuesto

18 8

15 25

2,3

SOXHLET PURO

Expuesto No expuesto

10 8

23 25

1,3

LIXIVIACIÓN PURO

Expuesto No expuesto

9 8

24 25

1.2

Expuesto No expuesto

6 8

27 25

0,7

Expuesto No expuesto

8 8

25 25

ALCOHOL

Expuesto No expuesto

3 8

30 25

0,4

H2O DESTILADA

4 8

29 25

0,5

AMBIENTE

Expuesto No expuesto

21 8

12 25

2,6

COUMAPHOS

Expuesto No expuesto Expuesto No expuesto

26 8

7 25

3,3

CIPERMETRINA

Expuesto No expuesto

4 8

29 25

0,5

AMITRAZ

SOXHLET 1:1

LIXIVIACIÓN 1:1

10.2 DISCUSIÓN Con base en los resultados obtenidos en este estudio y bajo las condiciones planteadas en el mismo, se puede afirmar que Polygonum segetum, tiene efecto ixodicida aunque, la mortalidad lograda no fue lo suficientemente alta, siendo 54,4% para el extracto puro elaborado por el métodos soxhlet, toda vez que la mortalidad mínima eficaz es de 60% para algunos autores (Castelblanco et al., 2013) y de 80% para otros (Rodríguez et al 2010). Si bien, esta planta no se ha reportado como ixodicida, se ha demostrado efecto insecticida contra pulgas y ácaros en caninos (García, 1990) y como vermífugo (Parra et al., 1999).

Con tales resultados se puede corroborar la existencia de metabolitos activos contra garrapatas en esta planta, sin embargo la moderada eficacia encontrada pudo deberse a los métodos de extracción utilizados, o bien al solvente con el que se trabajó; igualmente se puede deber a que dichos metabolitos se encuentran en baja concentración. Es sabido que uno de los factores que más influye en la eficacia de los extractos de plantas es el método mediante el cual éstos sean obtenidos, ya que en algunos casos no se logran obtener de manera completa. En tal sentido en la mayoría de los casos, el método Soxhlet resulta eficaz ya que la temperatura ayuda a extraer los metabolitos de mejor forma, en diferentes tipos de plantas (Ruso et al., 2003; Mohsen et al., 1990). Tales afirmaciones coinciden con lo entrado en este trabajo ya que el extracto con mayor acción ixodicida, fue el logrado mediante la extracción Sohxlet.

Adicionalmente, la

mortalidad

exhibida por los extractos evaluados no superan la

acción garrapaticida de cipermetrina y coumaphos, pero sí la lograda con amitraz, con lo que se reitera que la planta tiene acción ixodicida.

Otros factores que disminuyen la eficacia en la extracción son el tiempo y método de secado el material vegetal, el tiempo de extracción utilizado y los cambios de temperatura (Álvarez et al., 2008; Castellanos, 2006).

La eficacia obtenida en este trabajo, puede relacionarse por el hallazgo de metabolitos secundarios como

flavonoides, lecoantocianidina,proantocianidina, compuestos con

grupos hidroxilos fenólicos; la presencia de los mismos conincide parcialmente con lo reportado en la literatura, en la cual se indica que P. sagetum, contiene flavonoides, saponinas, taninos, (Morales y Guzaman, 2010). Los compuestos fenólicos y dentro de ellos los flavonoides se encuentra ampliamente ditribuidos en diferentes tipos de plantas, en las hojas, fruto o flores y dentro de sus propiedades medicinales, se incluye el efecto insecticida ya que en su mayoría son sintentizados por las plantas como mecanismo de defensa al ataque de los insectos. Se describe un efecto antialimentario sobre diferentes tipos de parásitos, el cual generaría la muerte de los mismos, con el paso de las horas después de la exposición. A diferencia de lo anterior, las moléculas que producen parálisis excitatoria o inhibitoria, pueden inducir la muerte de manera inmediata o a las pocas horas de la exposición (Vásquez et al., 2007; Morimoto et al., 2003, Morimoto et al., 2000). Con base en el reconocimiento de flavonoides y compuestos fenólicos en los extractos preparados para este estudio y en los tiempos en que se observaron las muertes, se puede inferir que éstos hayan sido los encargados de causar la muerte de las garrapatas, sin embargo asegurar tal afirmación no es conveniente, dada la metodología utilizada, en la que se probó el extracto completo y no se fraccionaron sus componentes, en cuyo caso sí se podría establecer qué compuesto fue el que mostró acción ixodicida.

Por otra parte, con base en los resultados obtenidos en los grupos control, se puede afirmar que las condiciones de laboratorio en las que se realizó el trabajo, fueron las adecuadas ya que la mortalidad causada por el agua, el etanol, y las condiciones ambientales en las que se mantuvieron las garrapatas, no causaron la muerte de éstas, tal como se reporta en diversos trabajos similares, al que aquí se presenta (Castelblanco et al., 2013; García, 2011; Dominguez et al 2010; Cardona et al., 2007).

Adicionalmente, los estudios indican que las garrapatas pueden sobrevivir durante un periodo de tiempo de hasta 3 a 4 meses sin alimentarse y a temperaturas bajas pueden vivir sin alimento hasta seis meses, de modo que este periodo de tiempo no, supera el tiempo que se mantuvieron las garrapatas en el laboratorio, por lo que se confirma que las condiciones de laboratorio fueron las adecuadas (García, 2011).

Por otra parte, los resultados encontrados en este trabajo con los grupos tratados con productos comerciales fueron los esperados. La mortalidad alcanzada con el producto a base de cipermetrina (81,8%), fue buena y rápida aunque también fue aumentando con el paso de los días. Es sabido que los piretroides prolongan el período de despolarización, produciendo parálisis excitatoria en la garrapata (Junquera, 2013).

El grupo de garrapatas tratado con el producto comercial a base de coumaphos también fue eficaz (63,6%), ya que siendo un organofosforado, Inhibe la enzima acetil colinesterasa, de manera irreversible, con lo que la transmisión de impulsos en el parásito se hace sostenida y éste muere por parálisis excitatoria (Junquera, 2013). A pesar de que el amitraz es un fármaco ixodicida que provoca hiperexcitación en las garrapatas en este estudio no mostró los resultados esperados, toda vez que la mortalidad total lograda no superó (15.5%). A pesar de que el diseño metodológico desarrollado en este trabajo no permite afirmar que sea un caso de resistencia de las garrapatas usadas en el mismo, contra el principio activo, se puede inferir que esta sea la causa de dicha ineficacia, ya que la preparación de la dilución se hizo siguiendo las indicaciones del laboratorio productor, tal como se hizo con los otros dos productos. En Colombia, desde hace muchos años, se ha presentado resistencia por parte de las garrapatas a productos pertenecientes a los grupos conocidos como organoclorados, carbamatos, organofosforados, piretroides sintéticos y amitraz (Benavides y col, 1997). Los resultados aquí obtenidos, también coinciden con lo encontrado por Rojas, (2010) en garrapatas Boophilus microplus, procedentes de bovinos de chota, Cajamarca, que mostraron frente al amitraz una eficacia que no superó 60.86%, de mortalidad.

Consolidando los resultados obtenidos en el trabajo se encuentran algunos aspectos que merecen atención.

En el presente estudio los dos extractos puros evaluados, mostraron mayor mortalidad de garrapatas en las primeras 24 horas post-exposición, posiblemente porque los metabolitos secundarios son capaces de absorberse de manera inmediata en las garrapatas y ejercer su efecto a las pocas horas de ésto, situación que resulta similar a otros estudios en donde se evalúan plantas insecticidas encontrando la máxima actividad insecticida hacia las 24 horas (Hernández et al., 2010). Adicionalmente, la mortalidad fue disminuyendo con los días sin desaparecer, indicando que hay efecto residual aunque la acción ixodicida descendió, posiblemente porque la molécula se va inactivando y perdiendo efectividad. En algunos casos la mortalidad de las garrapatas se observa con el paso de los días, tal como ocurrió en este estudio con las garrapatas expuestas a los productos comerciales y esto se puede deber principalmente a dos factores. Por un lado, algunas moléculas tardan en penetrar la cutícula de las garrapatas, pero gracias a su permanencia sobre la superficie, logran el efecto después de varias horas: o bien,

la propia farmacodinamia se desarrolla lentamente, hasta

lograr la mayor mortalidad hacia las 72 o 96 horas. Es así como muchos ixodicidas comerciales o naturales, incluso, pueden conducir a la caída de la garrapata del cuerpo del animal y morir horas después en el piso (Cuore et al., 2008). Es de recordar que los piretroides ejercen el efecto “knockout” contra los insectos pero rara vez con las garrapatas (Botana et al., 2003).

Respecto a la mortalidad de los grupos control negativo se considera que en los estudios realizados in vitro, la muerte de hasta 10% de las unidades experimentales es normal y se interpreta como una correcta manipulación de las muestras dando confiabilidad a los resultados (Araque et al., 2014). En este trabajo 8 de las 33 garrapatas en el grupo expuesto a etanol murieron, a pesar de que en trabajos previos la mortalidad no supera el 5%, se desconoce la razón de este comportamiento y con base en otras publicaciones no se podría afirmar que se haya debido al efecto del

alcohol ya que el que fue usado fue etanol 70% (alcohol antiséptico) y no alcohol industrial (90%), que en algunos casos puede producir mortalidad.

Finalmente, en este tipo de estudios, es común encontrar diferencias individuales entre las unidades experimentales, por ello para la determinación de la eficacia se tuvo en cuenta el promedio de las tres réplias y se reitera la importancia de contar con más de dos répicas para diminuir el sesgo por variabilidad individual.

11.IMPACTO

En en avance del conocimiento sobre las terapias alternativas en medicina veterinaria, se encuentra que aún existen muchos aspectos por estudiar y corroborar. Es por eso que a pesar de que en la Fundación Universitaria Juan de Castellanos a través del Grupo de Investigación, asi como en otras entidades educativas, se ha trabajado en la búsqueda de plantas medicinales y de sus metabolitos secundarios con actividad ixodicida, el conocimiento a este respecto no se ha completado por lo que con el desarrollo de este trabajo se aporta algo más en este proceso investigativo que se desarrolla a nivel regional, nacional y mundial, buscando opciones para el control de garrapatas, en vista de que los productos comerciales disponibles para los bovinos, día a día van perdiendo eficacia.

Adicionalmente, los resultados obtenidos con este trabajo indican que si bien la eficacia de Polygonum segetum no fue tan alta como se esperaba, se considera que la planta tiene metabolitos con acción ixodicida y por ello el trabajo que aquí se presenta, representa un punto de partido para continuar investigando con esta planta, evaluando otro tipo de solventes para la extracción, otros métodos de obtención e incluso, el uso de la planta en diferentes etapas de su ciclo biológico, con el fin de lograr una eficacia mayor a la que aquí se reporta.

Se considera que los esfuerzos logrados desde la actividad investigativa para buscar solucionar el problema de las garrapatas en el ganado bovino, generan un impacto socioeconómico porque puede contribuir a que los ganaderos logren controlar este ectoparásito que no solo representa pérdidas económicas para éste, sino que también es una fuente de stress para los animales. Adicionalmente, el hallazgo de alternativas naturales para el control de ectoparásitos puede minimizar la presencia de residuos de plaguicidas en los alimentos de origen animal y en general en el ecosistema.

12. CONCLUCIONES Los extractos de Polygonum segetum obtenidos por el método soxhlet y lixiviacion para determinar el efecto ixodicida sobre garrapatas B.microplus, bajo las condiciones propuestas en este estudio evidencian que los mejores resultados se obtuvieron con el extracto elaborado a partir del método soxhlet ya que produjo una mortalidad del 54, 5%, posiblemente porque la temperatura a la cual se hace la extracción favorece la liberación de los metabolitos activos; sin embargo dicha eficacia, aunque fue mayor a la lograda con el otro extracto, no supera la mortalidad mínima necesaria (60%), para considerar un producto como eficaz. Lo anterior determina la necesidad de continuar investigando con la misma planta, buscando mejorar la eficacia lograda con este trabajo.

La investigacion tambien permitió confirmar en los dos tipos de extractos, la presencia de metabolitos secundarios como

saponinas, fenoles, terpenos y flavonas,

responsables del efecto ixodicida observado.

Aidcionalmente, se concluye que la temperatura influyó en la eficacia de la extracion de los metablitos secundarios con acción ixodicida, ya que el extracto obtenido con el método soxhlet presentó mayor porcentaje de mortalidad que el extracto obtenido a temperatura ambiente. De esa manera se presume que estos metabolitos no son susceptibles a la temperatura manejada durante la obtención del extracto.

Finalmente Polygonum segetum, es una planta con acción ixodicida cuya eficacia podría potencializarse y con ello poderla considerar como alternativa en el control integral de las garrapatas.

13. RECOMENDACIONES

Con los resultados obtenidos en el transcurso y desarrollo de esta investigaion se recomienda a los futuros investigadores realizar:  Realizar pruebas cuantitativas de tipo cromatográfico, para determinar no solo la presencia de metabolitos sino la cantidad en la que éstos se encuentran y a partir de ello, poderlos separar y evaluar de manera independiente.  La evaluación de los extractos aquí probados, en un estudio in vivo, aplicandolos sobre los animales naturalmente parasitados, para establecer su eficacia in vitro así como la ausencia de efectos adversos producidos sobre el animal tratado.  Realizar investigaciones con otras partes de la planta y en diferentes estados fenológicos.  La evaluación del efecto ixodicida de Polygonum segetum, utilizando garrapatas de menor tamaño o bien evaluar el efecto que produce este extracto sobre la ovoposición y sobre larvas de garrapatas.  La Utilización de

solventes diferentes al etanol para la extracción de los

metabolitos presentes en las hojas de P segetum.

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