Evaluacion de la contaminación con criptosporidium by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN CON CRIPTOSPORIDIUM spp. EN SUELOS DE LOS PRINCIPALES PARQUES PÚBLICOS Y ZONAS VERDES DE LA CIUDAD DE TUNJA

ARLETH JOHANNA TELLEZ ACOSTA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2012 1

EVALUACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN CON CRIPTOSPORIDIUM spp. EN SUELOS DE LOS PRINCIPALES PARQUES PÚBLICOS Y ZONAS VERDES DE LA CIUDAD DE TUNJA

ARLETH JOHANNA TELLEZ ACOSTA

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Médico Veterinario

Directora Ana Consuelo González Patiño MVZ. Esp en Medicina Interna de Pequeños Animales

FUNDACION UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2012 2

LISTA DE TABLAS

Pág Tabla 1. Especies de Cryptosporidium, hospedadores, autores

Tabla 2. Clasificación de muestras según conteo de ooquistes.

Tabla 3. Porcentaje de muestras tomadas según el tipo de suelo

Tabla 4. Prueba de chi2 para variable suelo

Tabla 5. Prueba de chi2 para variable temperatura ambiental

Tabla 6. Prueba exacta de fisher para variable temperatura ambiental

LISTA DE FIGURAS

Pág Figura 1. Representación del ciclo biológico de C. parvum en el epitelio de la mucosa intestinal de un mamífero parasitado

Figura 2. Mapa de la ciudad de Tunja

Figura 3. Prevalencia de Cryptosporidium spp. en cada parque

Figura 4. Porcentaje de muestras según el número de ooquistes de Cryptosporidium spp. en cada parque

Fig. 5. Porcentaje de muestras según el número de ooquistes de Cryptosporidium spp. en cada suelo

Fig. 6. Relación ausencia - presencia de Cryptosporidium spp.

ANEXOS

Pág Anexo 1. Fotografías identificación de Cryptosporidium spp. Objetivo 40x.

Anexo 2. Tabulación De Datos

Anexo 3 Caracterización de suelos

Anexo 4 Informe meterològico IDEAM mes de septiembre

LISTA DE FOTOS

Foto 1. Identificación del protozoario tinción ZN modificada 40X. Foto 2. Parque San Antonio. Foto 3. Parque el Bosque. Foto 4. Parque Recreacional. Foto 5. Parque los Muiscas. Foto 7. Recolección de muestras Parque La florida. Foto 6. Recolección de muestras zona verde los Muiscas. Foto 8. Pozo de Hunzahúa Foto 9. Preparación de muestras para tamizaje. Foto10. Sedimentación espontanea. Foto 11. Retiro sobrenadante Foto 12. Tinción Zielh Neelsen modificada Foto 13. Medición pH muestras de suelo Foto 14. Laminas para lectura.

30 50 51 52 53 54 55 55 57 58 58 58 58 59

AGRADECIMIENTOS A Dios, a mi madre Mercedes, a mis tíos Ana Acosta, Clara Acosta, Anita Quiroga Arcelia Quiroga y Eduardo Mesa por sus voces de aliento y apoyo que fueron de gran apoyo en los momentos oportunos.

A la Clínica Veterinaria Zoomédica y laboratotio Medico Veterinario Microzoo, por su apoyo durante la realización de la parte práctica del proyecto. A la Dra. Ana consuelo Gonzalez, directora de este trabajo. Gracias por compartir sus conocimientos por ser amiga y ejemplo; sin su guía, apoyo constante y sabios consejos hubiese sido muy dificil dar este paso de mi formacion academica Al Dr. Guillermo Granados por sus enseñanzas, paciencia, confianza y valiosos aportes académicos y personales. . A la Dra. Viviana Gómez por su asesoría y valiosos aportes en la parte estadística del proyecto. Al Dr. Mauricio Boyacá Quintana por su asesoría, y aportes académicos. A los Doctores Ludy Paola Villamil, y William Sandoval del Programa de Medicina Veterinaria de la Fundación Universitaria Juan De Castellanos A la Dra. Sonia Torres y el equipo del Laboratorio Clínico Meditest por sus aportes al proyecto. Al Dr. Edinson Montaña compañero y amigo, quien fue testigo desde un comienzo de este proceso y con su ayuda hizo que los momentos difíciles se tornaran menos complicados. A Jenny Patricia Vargas quien desde un inicio estuvo apoyándome y a pesar de la distancia siempre me alentó a continuar con mi carrera a pesar de los momentos difíciles que se presentaron en varias ocasiones. A mis amigos y compañeros de la Clinica Veterinaria Zoomedica Andrea Ríos, Jackie, Erika, Maria Camila, Dianita, Sra Clemencia, Yerickson, Juan Carlos, David y Javier por su colaboración y amistad. A todas las personas que de una u otra forma contribuyeron al desarrollo de este trabajo. 7

A Dios por guiarme en todo momento, y por permitirme llegar a esta etapa de mi vida, ya que sin su ayuda nada hubiese sido posible. A mi hija Ariadna, por regalarme la oportunidad de seguir mis sueños en mi formación académica sacrificando el tiempo más precioso de su vida, quien con su amor y ternura fortalece mi alma y me da fuerzas para seguir adelante en mis proyectos.. A mi abuelita Ana Rita, por formar parte de mi vida brindándome su apoyo y cariño de manera incondicional.

NOTA DE ACEPTACIÓN

Dr. MAURICIO BOYACÁ QUINTANA Jurado

Dra. ANA CONSUELO GONZÁLEZ PATIÑO Directora Tesis

ARLETH JOHANNA TÉLLEZ ACOSTA Estudiante 9

GLOSARIO

CÁRCAVA: socavones producidos en rocas y suelos de lugares con pendiente a causa de las avenidas de agua de lluvia. CONTAMINACIÓN: Inclusión en el medio ambiente de microorganismos o sustancias nocivas que alteran el equilibrio ecológico, provocando trastornos en el medio físico y en los organismos vivos. ENFERMEDAD EMERGENTE: Enfermedad infecciosa que surgen en lugares y momentos específicos y se convierten, o amenazan con convertirse, en nuevas epidemias. El concepto no se aplica sólo a enfermedades que afligen a las poblaciones humanas. El fenómeno está en el origen de buena parte de la legislación que restringe el tráfico de muestras o especímenes biológicos a través de las fronteras. ENTEROCITO: Células epiteliales del intestino encargadas de absorber diversas moléculas alimenticias y transportarlas al interior del organismo. Se encuentran en el intestino delgado, intestino grueso y en el colon. Las microvellosidades del polo apical incrementan el área para la digestión y el transporte de moléculas desde el lumen intestinal. Estas células tienen también una función secretora. Cumplen también funciones de barrera biomecánica, bioquímica e inmunológica en simbiosis con la microbiota normal que los limitan por su polo apical, situado en la luz intestinal. ESPECIE: Categoría taxonómica que agrupa al conjunto de seres que presentan las mismas características. INFECCIÓN: Ingreso y desarrollo de microbios en un organismo vivo. PREPATENCIA: Fase de una afección parasitaria que se extiende desde la contaminación hasta la aparición de los parásitos en el enfermo. PREVALENCIA: proporción de individuos de un grupo o una población que presentan una característica o evento determinado en un momento o en un período determinado. 10

PROTOZOARIO: Organismos unicelulares: heterótrofos, fagótrofos, depredadores o detritívoros, a veces mixótrofos (parcialmente autótrofos); que viven en ambientes húmedos o directamente en medios acuáticos, ya sean aguas saladas o aguas dulces; la reproducción puede ser asexual por bipartición y también sexual por isogametos o por conjugación intercambiando material genético.

ZOONOSIS: Fase de una afección parasitaria que se extiende desde la contaminación hasta la aparición de los parásitos en el enfermo. Si se puede transmitir de personas a animales se trata de una zooantroponosis. Aunque estrictamente hablando se tiende a definir como zoonosis solo a las enfermedades infectocontagiosas que se transmiten desde otros vertebrados a los seres humanos

RESUMEN El presente estudio determinó la presencia de Cryptosporidium spp. en 159 muestras de suelos en 12 parques de la ciudad de Tunja, Boyacá, Colombia; por el alto grado de contaminación con heces y por ser el suelo una fuente importante de contaminación. Este estudio es de corte transversal a conveniencia desarrollándose en tres fases: selección de unidades de estudio y toma de muestras; montaje y observación de las muestras mediante la técnica de sedimentación espontánea, para la identificación de ooquistes se realizó coloración de Ziehl Neelsen modificada; procesamiento y análisis de datos; en el periodo comprendido entre el 24 de septiembre y 15 de octubre de 2012. La selección de los parques se hizo con base a aspectos como: estado de conservación de los parques, presencia de señalizaciones y cerramientos que impidan la entrada de animales domésticos ya sean población canina o animales para pastoreo (bovinos, equinos entre otros) y la alta concentración de personas en estos sitios, debido al déficit de espacios de este tipo, para determinar el contacto y diseminación de este parásito en los suelos de este tipo de espacios en la ciudad de Tunja. En el desarrollo de la investigación se tuvieron en cuenta las variables textura, pH del suelo y temperatura ambiental. De los parques públicos intervenidos en esta investigación, el 80,5 % presentó áreas contaminadas por este protozoario. En el análisis, para las variables temperatura, textura y pH, mediante la prueba de chi2 y prueba exacta de fisher usando un nivel de significancia del 0.05, se halló asociación significativa (p<0.05) entre la variable textura del suelo con la presencia de Cryptosporidium spp; mientras las variables temperatura ambiental y pH; no se halló asociación significativa. El alto porcentaje de parques contaminados 80,5 % (n= 128), indica que estos sitios constituyen un factor de riesgo para la presentación de esta y otras enfermedades parasitarias zoonóticas de importancia en salud pública, es necesario tomar medidas por parte de las autoridades locales, que para disminuir la contaminación de los espacios públicos, además es necesario desarrollar estrategias adecuadas para el control de la población canina callejera. PALABRAS CLAVE: Cryptosporidium spp, protozoario, zoonosis, parques públicos, perros, salud pública, contaminación fecal. 12

CONTENIDO

Pág

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 15 1.

OBJETIVOS ............................................................................................................. 17

1.1 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 17 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ..................................................................................... 17 2.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 18

2.1 Caracterización del problema ................................................................................... 18 2.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ........................................................................... 18 3. JUSTIFICACIÓN......................................................................................................... 19 4. MARCO DE REFERENCIA......................................................................................... 21 4.1 ESTADO DEL ARTE................................................................................................. 21 4.2 MARCO TEÓRICO ................................................................................................... 25 4.2.1 Generalidades del parásito .................................................................................... 25 4.2.2 Taxonomía ............................................................................................................. 28 4.2.3. Morfología del parásito.......................................................................................... 29 4.2.4 Ciclo biológico. ....................................................................................................... 31 4.2.5 Inmunología ........................................................................................................... 34 4.3 FISIOPATOLOGÍA .................................................................................................... 37 4.4 EPIDEMIOLOGÍA ..................................................................................................... 38 4.4.1 Prevalencia de criptosporidiosis. ............................................................................ 38 4.4.2 Fuentes de contagio y vías de transmisión. ........................................................... 40 4.5 FACTORES EPIDEMIOLÓGICOS ASOCIADOS AL PARÁSITO .............................. 41 4.5.1 Resistencia de los ooquistes. ................................................................................. 41 4.5.2 Dosis infectante, características del aislado y especie. ........................................... 41 4.6 SIGNOS CLÍNICOS .................................................................................................. 42 4.6.1 Lesiones. ............................................................................................................... 43 13

4.7 DIAGNÓSTICO ......................................................................................................... 44 4.8 TRATAMIENTO ........................................................................................................ 45 5. DESCRIPCIÓN GEOGRÁFICA Y CLIMATOLÓGICA ................................................. 47 6. DISEÑO METODOLÓGICO........................................................................................ 49 6.1 TIPO DE ESTUDIO................................................................................................... 49 6.2 HIPOTESIS............................................................................................................... 49 6.3 DISEÑO EXPERIMENTAL........................................................................................ 49 6.3.1 Descripción Del Universo ....................................................................................... 50 6.4 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 52 6.4.1 Procesamiento De Las Muestras ........................................................................... 54 7. RESULTADOS ........................................................................................................... 60 8. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................. 66 9.CONCLUSIONES ......................................................................................................... 69 10. IMPACTO ................................................................................................................. 72 11. RECOMENDACIONES ............................................................................................. 73 12. BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................... 75 13. ANEXOS................................................................................................................... 81

INTRODUCCIÓN

La criptosporidosis constituye uno de los mayores problemas de salud pública en el mundo, hasta el punto de ser considerada en la actualidad como una enfermedad emergente, aunque puede presentarse de forma esporádica, los brotes epidémicos de esta zoonosis son más frecuentes y están relacionados con el consumo de agua contaminada debido al control deficiente de los sistemas de tratamiento de agua potable (Almeida, et al., 2010; Villeneuve, 2009). Así mismo, se han realizado estudios en los últimos años sobre Cryptosporidium spp. y su interacción con el suelo; en especial aquellos destinados para usos agrícolas, donde se ha demostrado que este es un importante foco de infección debido al uso de aguas residuales para riego de cultivos, el cual tiene un importante impacto en la salud pública (Peng, et al., 2011; Flores, et al 2010) Actualmente, los animales de compañía representan beneficios para las personas y para la sociedad. Sin embargo, sus dueños desconocen las obligaciones que involucran sus cuidados dentro de los cuales está la disposición adecuada de excretas en los espacios públicos. Agregado a esto, el deficiente control de la población canina callejera y el uso de estas áreas para pastoreo de bovinos y equinos afectan a la comunidad en general ya que el suelo es una fuente de contaminación de enfermedades gastrointestinales zoonóticas. Las infecciones o enfermedades parasitarias en los animales domésticos son extraordinariamente frecuentes, sobretodo en países de desarrollo. De las existentes en el país, algunas son zoonosis, lo cual ocurre por la estrecha convivencia entre el hombre y los animales domésticos, y un ambiente favorable para dicho intercambio (Peng, et al., 2008; Robertson et al., 1992; Barwick, et al., 2003). Las enfermedades parasitarias intestinales zoonóticas son definidas por la Organización Mundial de la Salud, como enfermedades tropicales desasistidas (ETD). Incluye a trece enfermedades parasitarias y bacterianas en las que se incluyen las geohelmintiasis (ascariosis, anquilostomídeos y trichuriosis), filariasis linfática strongiloidosis, neurocisticercosis, trematodiosis por alimentos, leptospirosis, protozoarios intestinales, entre ellas la giardiasis y criptosporidosis entre otras (Acha, et al., 2003; Chacón, et al., 2009). 15

La criptosporidosis es una enfermedad parasitaria del tracto digestivo producida por protozoos del género Cryptosporidium. Aunque las especies de Cryptosporidium se han descrito desde comienzos del siglo veinte, a fines de éste se ha reconocido como un agente patógeno ampliamente distribuido en diferentes especies animales como aves de corral, ganado, animales de compañía y de vida silvestre (Cordero et., al 1999, Gómez et al., 2010). Se ha demostrado que es una de las parasitosis más frecuentes en humanos y animales, y se ha transformado en una amenaza para la salud pública (Vergara et al., 2004) Además este protozoario es causante de un proceso diarreico agudo autolimitante en individuos inmunocompetentes con una duración aproximada de dos semanas y una patología crónica en pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, en otros estudios se encontraron casos de parasitismo por protozoarios en pacientes inmunocompetentes y con evacuaciones no diarreicas (Chacón, et al., 2009). Cryptosporidium ha sido estudiado con mayor interés en animales para comercialización (bovinos, pequeños rumiantes (Castro-Hermida 2011; Paraud et al., 2012), porcinos, pollos (Quah, 2010); avestruces, ñandúes, peces y búfalo asiático) y en algunos animales silvestres: elefantes y focas (Rengifo et al., 2012); marsupiales (Power, 2010). También se han estudiado animales de interés en peletería como el visón, animales de zoológicos búfalos de agua y ganado cebuino (Feng 2012), primates (Matsubayashi et al., 2011); carnívoros y herbívoros, animales de compañía (perros y reptiles) y fauna silvestre (jabalíes, zorros, nutrias, búhos palomas (Martínez et al., 2011). La investigación más reciente en Boyacá, fue en al año 2011 desarrollada por Torres, donde se tomaron 121 muestras fecales de caninos pertenecientes a la fundación S.O.S animal y ambiental en el municipio de Villa de Leyva, para detectar la presencia de parásitos gastrointestinales; hallándose un porcentaje de parasitación de un 74% por nematodos y un 88% a protozoarios, pertenecientes a Isospora Canis y Cryptosporidium spp, de lo cual el autor asumió que los factores medio ambientales y los suelos contaminados por las heces de los animales, puede favorecer la transmisión de nematodos y protozoarios. En el año 2009 se colectó y analizó materia fecal de 132 perros en 3 consultorios veterinarios de la ciudad de Tunja - Boyacá. El análisis de los animales estudiados fue estratificado El 16.38% de muestras fueron positivas para Cryptosporidium spp.; así mismo se observó mayor frecuencia en animales menores de un año. (Rodríguez, et al., 2009). 16

1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL Establecer la contaminación por Cryptosporidium spp. en suelos de los parques públicos de la ciudad de Tunja, departamento de Boyacá.

1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Adaptar la técnica diagnóstica parasitológica de concentración para Cryptosporidium spp. en muestras de suelo (técnica de sedimentación espontánea). Determinar de manera cuantitativa el grado de contaminación Cryptosporidium en los parques y zonas verdes de la ciudad de Tunja

por

Caracterización de suelos de los parques de la ciudad de Tunja (textura, ph) Identificar la interacción entre los ooquistes de Cryptosporidium presentes y la composición físico-química del suelo. Identificar los parques que constituyan mayor riesgo por la contaminación con esta forma parasitaria y proponer medidas de prevención en ellos. Relacionar la presencia de Cryptosporidium en suelos de los parques con la temperatura ambiental.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2.1 Caracterización del problema

El conocimiento en los últimos años sobre las zoonosis ha cobrado interés en el área de salud pública, por su prevalencia, distribución y consecuencias; dentro de las cuales las zoonosis de tipo parasitario no han tenido gran relevancia, ya que estas aun no originan emergencias epidemiológicas importantes por lo tanto, no se consideran de reporte obligatorio. El estudio de Cryptosporidium spp. Se ha enfocado en la industria del agua, por ser un vehículo para la transmisión de este parásito a través de la ingestión de agua contaminada entre otros usos (agua para consumo humano, agua para recreación y agua para irrigación de vegetales de consumo directo), su infectividad y los mecanismos de resistencia que aún se desconocen frente a las condiciones ambientales y tratamientos físico-químicos contra este protozoario. Se asume que la contaminación en los parques y zonas verdes de Tunja está relacionada con los excrementos constituyendo un factor de riesgo para la población que permanece en mayor contacto con estos sitios: niños, ancianos y personas inmunocomprometidas; sumado a esto la falta de compromiso de las autoridades locales quienes no cumplen o realizan de manera deficiente los protocolos de aseo en dichos sitios, este estudio, pretende determinar el grado de contaminación por Cryptosporidium spp en el suelo de los parques, ya que estos sitios son comunes para la recreación y esparcimiento tanto del hombre como de sus mascotas. 2.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Existe contaminación en los suelos de los parques públicos de la ciudad de Tunja con Cryptosporidium spp?

3. JUSTIFICACIÓN

La criptosporidosis es una enfermedad zoonótica emergente desde el punto de vista de salud pública y debido a las diferentes causas que favorecen su presentación en el hombre, este estudio se realiza en base a aspectos como: La contaminación de las zonas públicas con excrementos de animales y personas indigentes contribuyen a la aparición de enfermedades zoonóticas. Las condiciones socioeconómicas en la comunidad y el continuo cambio de las condiciones medioambientales son factores predisponentes, que sumadas al deterioro de los programas de prevención y control de las enfermedades zoonóticas y al debilitamiento de las políticas en Salud Pública, hacen necesario replantear nuevas acciones y fortalecer las medidas de protección en lo que se refiere a la aparición de enfermedades zoonóticas. Falta de áreas verdes y espacio público, ya que según el plan de ordenamiento territorial del municipio, en el reporte del DANE del año 2000 la densidad por habitante era de 1,35 mt. Estas cifras nos demuestra el déficit tan elevado que hay en la ciudad en cuanto a parques, zonas verdes, espacios para la recreación y esparcimiento, etc, en una ciudad habitada en gran parte por estudiantes teniéndose en cuenta la densidad parque /habitante en la actualidad debe ser de 10 mt/hab. Aunque algunas enfermedades intestinales zoonóticas cuyo reservorio es el suelo, se han caracterizado y estudiado a fondo, como en el caso de los parásitos geohelmintos, las enfermedades entéricas y su relación con el suelo han sido poco estudiadas y probablemente subestimadas, sin embargo está comprobada su relación cuando se riega con aguas residuales en especial Giardia Lamblia y Cryptosporidium spp. (Flores et al., 2010). En Colombia los datos que se tienen con relación a contaminación de ambientes y suelos de los espacios públicos esta limitado a la detección de geohelmintos sin tener en cuenta los estudios de seroprevalencia que se han hecho en niños y comunidades en donde se ha detectado la presencia de este protozoario; esto puede atribuirse al desconocimiento o estandarización de un método de

concentración fiable para la detección de Cryptosporidium spp. dadas las características extrínsecas del suelo. La investigación acerca de la determinación de la contaminación de los suelos en los parques públicos tiene un papel importante en el desarrollo del conocimiento de la epidemiología de las enfermedades zoonóticas, lo cual permite diseñar e implementar mejores programas de prevención y control.

4. MARCO DE REFERENCIA

4.1

ESTADO DEL ARTE

La prevalencia de la criptosporidosis en Sudamérica no se conoce exactamente, pues los estudios epidemiológicos realizados son escasos, aunque el parasito ha sido identificado en todos los países en los que se investigó su presencia mediante técnicas coprológicas. En cuanto a la detección de este protozoario mediante muestras tomadas del suelo se ha realizado de manera asociada con la identificación de otros parásitos (nematodos) o por hallazgos incidentales (Polo, 2006). El estudio de los protozoos se ha enfocado en la industria del agua, por ser un vehículo para la transmisión de la mayoría de estos parásitos a través de la ingestión de agua contaminada entre otros usos (agua para consumo humano, agua para recreación y agua para irrigación de vegetales frescos de consumo directo), su infectividad dadas las condiciones de resistencia frente a las condiciones ambientales y tratamientos físico-químicos. De igual forma, la aparición de nuevos genotipos, demuestra el impacto negativo en salud pública tanto en naciones industrializadas como en los países en desarrollo (Solarte, et al., 2006; Almeida, et al., 2010; Flores, et al 2010; Alyousefi, et al., 2011; Barboni, et al., 2008). A nivel mundial se empezó a investigar la presencia de Cryptosporidium Como agente zoonótico en partículas del suelo de las granjas. Se realizó primeramente en estos lugares, debido a la alta epidemiología y asociación con enfermedades de tipo diarreico en bovinos menores de un año. Barwick et al., 2003; y al manejo de aguas residuales en cultivos agrícolas (Flores, et al., 2010). Estos últimos realizaron un estudio con el objetivo de detectar la presencia de ooquistes de C. parvum y quistes de G. lamblia mediante inmunomagneto-separación e inmunofluorescencia en suelos agrícolas regados con aguas negras o residuales de tratamiento primario en la frontera México-Estados Unidos en las regiones agrícolas de Ciudad Juárez, Chih y El Paso, Texas, como indicadores de contaminación fecal, durante el ciclo primavera-verano 2006 y 2007; de igual manera se determino humedad, alcalinidad y salinidad. El rango detectado fue 21

entre 3 y 9 organismos de Cryptosporidium y Giardia en 25 gr de suelo en los terrenos del Valle de Juárez, mientras que en El Paso, Texas varió de 1 a 5 ooquistes. Esta diferencia fue explicada por la menor calidad de sistema de tratamiento de agua negra en Ciudad Juárez. Los parásitos detectados en canales e implementos agrícolas del Valle de Juárez vario entre 22 y 74 quistes u ooquistes por 25 gr de suelo. Estos resultados hacen evidente el riesgo a la salud para los habitantes de las zonas rurales, a su vez sugieren la necesidad de mejorar los sistemas de tratamiento de agua e incrementar programas de educación ambiental y orientación de mejores hábitos de saneamiento personal. En el año 2010 se reporta un estudio en caninos criados en comunidades campesinas de tres distritos del departamento de Puno Perú, De un total de 123 muestras fecales analizadas, se encontraron 33 muestras de caninos que resultaron positivas a Cryptosporidium spp. mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada, obteniendo una prevalencia general de 26.8±7.8% (33/123) (Celis, 2010). Además estos estudios han concluido que la estrecha relación perrohombre favorece la transmisión de enfermedades parasitarias entre el hombre y los animales (Xiao, et al., 2007). En el año 2008 Dado et al., determinaron la presencia de parásitos zoonóticos a través de 625 muestras de suelo y 79 muestras fecales en 67 parques de la ciudad de Madrid. La presencia de parasitosis intestinales fue detectada en 27 parques contaminados con Giardia spp (19.4%), Microsporidia (19.4%), Toxocara spp. (16.4%), Cryptosporidium spp. (6%), Entamoeba histolytica (3%) y Ancylostomidae (3%). Con referencia a lo anterior, se encontró la combinación de uno o más parásitos intestinales en 11 parques; el hallazgo más común en las muestras tomadas fue el de Giardia y microsporidia. En cuanto a las muestras se suelo, se hallo en 112 muestras (18%) la presencia de parásitos intestinales; la especie más encontrada en estas muestras fueron Toxocara spp. (16.4%), seguido por Giardia spp. (4.5%) y larvas de Strongyloides spp.(3%). La presencia de parásitos zoonóticos se encontró en las 79 muestras fecales: Giardia spp. (17.7%), Cryptosporidium spp. (9%), E. histolytica (2.5%), Trichuris vulpis (1.3%), Toxascaris leonina (1.3%) y esporas de microsporidia (28%). Una revisión realizada por Peng, et al., En el año 2008, evaluaron el efecto de la temperatura en la supervivencia de C. parvum en suelo, agua y heces; factor más estudiado por considerarse uno de los más críticos en la supervivencia de los ooquistes del protozoario en el ambiente. Pues la temperatura, condiciona otros factores como carga electrostática, pH, textura del suelo, cantidad de agua entre 22

otros; de igual importancia para la habilidad del ooquiste para desencadenar una infección, su supervivencia y transporte. En el primer estudio, realizado en muestras de agua marina, de rio y de grifo/ potable, se manipuló la temperatura en ambiente natural y de autoclave; Peng et al compararon que el rango de supervivencia del ooquiste en una temperatura de 5°C y 15°C; tanto ambiental como manipulada en un autoclave varía; esto se debe a la habilidad del ooquiste para desencadenar una infección, ya que su potencial infectivo fuera del hospedador se relaciona con las reservas energéticas de carbohidratos en forma de amilopectina el cual se metaboliza solo bajo las condiciones de temperatura adecuadas y de la presencia o ausencia de otros microorganismos. En cuanto a la inactivación del ooquiste en el suelo, Peng et al, 2008 estableció que es mucho más compleja en comparación a la inactivación del protozoario en el agua debido a microorganismos, macrofauna, plantas y un amplio rango de propiedades físicas y químicas; convirtiéndose en factores estresantes que, al interactuar con el agua y textura del suelo, indican un estímulo al ooquiste cuando este se encuentra expuesto en condiciones de humedad o sequía. Peng et al 2008 establece que la textura, una propiedad estática del suelo, también afecta la supervivencia del ooquiste. Jenkins. 2002 (en: Peng. et al., 2008), reportaron que el rango de supervivencia de un ooquiste en un suelo limoso es mayor que en suelo con altas cantidades de humus (50%) o arcillosos (16%). De la misma manera, King and Monis (en: Peng, et al., 2008; Peng, et al., 2011), establece que la identificación de los suelos es un importante factor para la supervivencia del ooquistes, pero la manera como este influye aún es desconocida. Probablemente las partículas contenidas modifican de alguna manera la actividad metabólica del protozoario a través de cambios fisicoquímicos, biológicos y sus propiedades de adherencia a estas partículas; lo cual es necesario confirmar. En cuanto al estudio de la supervivencia del ooquiste de C. parvum en heces, se estableció que este se basa en la composición del estiércol, la concentración de amonio y la manera como éste se distribuya en la superficie (Peng et al 2008). Del mismo modo trabajos realizados por Mohanram A. 2011, Peng, et al., 2011 y Xin y Boll 2003 en diferentes tipos de suelo, coinciden en que la interacción del suelo con los ooquistes en general envuelven otros mecanismos; uno de ellos es la carga electrostática aunque aún es deficiente el conocimiento certero de las 23

propiedades tanto físicas como bioquímicas de la pared del ooquiste; factor que influye en el transporte de este en el medio en que se inocule. En un estudio realizado por Barwick et al., en el 2003, se identificaron tres factores categóricos relevantes para asociar la posibilidad de detectar Cryptosporidium en el suelo. El primero es el uso dado a los suelos el cual es frecuentemente asociado con el riesgo de detectar Cryptosporidium spp. Los hallazgos alrededor de áreas con sembradíos presentaron un riesgo mayor comparado con los suelos que no fueron utilizados para estos fines. Este comportamiento se atribuye al manejo de grandes concentraciones de humus, particularmente cuando estos cultivos han sido regados con aguas de estercoleros o similares. De igual manera, no se demostró una asociación significativa de la prevalencia de ooquistes de Cryptosporidium en los animales de granja y la posibilidad de encontrar el microorganismo en el suelo. Una posible explicación es, que las muestras tomadas de los animales se hace directamente, mientras que las muestras tomadas del suelo pueden tener cantidades de ooquistes de Cryptosporidium acumuladas. El segundo factor se encuentra relacionado con el pH del suelo. El riesgo de encontrarlo decrece con el aumento de los niveles de pH (pH neutro (6,5 - 7,5) 0.53 veces de menor probabilidad, y en un pH básico, (7,6 - 9,5) 0.35 veces); comparado con muestras tomadas de suelos con un pH de 3.7 a 6.4); aunque este hallazgo no coincidía con reportes de literatura anteriores, y que dichos estudios demostraron que los ooquistes de Cryptosporidium spp son incapaces de sobrevivir en condiciones extremamente bajas de pH (Robertson et al., 1996 en: Barwick et al., 2003). Wolyniak, 2011, en su trabajo acerca del impacto de las biopelículas y la presencia del Carbón orgánico disuelto (DOC) en su papel como reservorio, distribución y transporte de los ooquistes de Cryptosporidium spp. describe que la presencia de biopelículas afectan positivamente la adherencia del ooquiste a las diferentes partículas en las superficies, ya que éstas no son fácilmente destruidas o penetradas por desinfectantes, y permiten el transporte de una concentración infectiva más elevada de ooquistes, además protegen la integridad y permeabilidad de la pared del protozoario durante la exposición a rayos UV y otros agentes que puedan afectar su integridad. Aunque la interacción entre las biopelículas y Cryptosporidium spp. no ha sido estudiada extensivamente; es un importante componente en el destino y transporte del ooquiste.

En cuanto a la presencia del carbono orgánico disuelto en el entorno, la supervivencia de los ooquistes de Cryptosporidium spp., también depende de la cantidad de materia orgánica disponible ya que la variación de la concentración del carbón orgánico se expresa en la acidez o alcalinidad del ambiente en el que se desarrolle el protozoario. Teniendo en cuenta estos estudios, se pretende demostrar la prevalencia de Cryptosporidium spp. en el suelo. Teniendo en cuenta que no existe una cultura de manejo adecuado de las excretas por parte de los ciudadanos que tienen mascotas y el alto riesgo que representan los perros callejeros en la ciudad de Tunja.

4.2 MARCO TEÓRICO 4.2.1 Generalidades del parásito La criptosporidosis es una enfermedad parasitaria del tracto digestivo producida por protozoos del género Cryptosporidium. Aunque las especies de Cryptosporidium se han descrito desde comienzos del siglo veinte, a fines de éste se ha reconocido como un agente patógeno ampliamente distribuido en diferentes especies animales como aves de corral, ganado, animales de compañía y de vida silvestre (Cordero et al., 1999). Se empezó a dar importancia en los comienzos de los años 1980, lo cual nos sugiere que la enfermedad es relativamente reciente. Se ha demostrado que es una de las parasitosis más frecuentes en humanos y animales, y se ha transformado en una amenaza para la salud pública (Casemore et al., 1997 en: Vergara et al., 2004; Torres-Olave et al,. 2008). Además es causante de un proceso diarreico agudo autolimitado en individuos inmunocompetentes con una duración aproximada de dos semanas y una patología crónica en pacientes inmunodeficientes. El género Cryptosporidium comprende protozoos que se desarrollan y multiplican en las células epiteliales del intestino grueso y delgado y ocasionalmente, puede infectar otros epitelios como el respiratorio y renal, especialmente en individuos inmunocomprometidos. Tiene una ubicación particular dentro de la célula ya que se sitúa en el borde luminal de los enterocitos, localización que se ha definido como intracelular, pero extracitoplasmática (Cordero del Campillo et al., 1999).

Este parásito, fue encontrado por primera vez por Clark en 1895 en el epitelio gástrico de ratones, e identificado años después por Tyzzer en el laboratorio. En 1955 se describe la primera especie de este género que causa enfermedad y muerte en aves. Sin embargo, permaneció como una curiosidad biológica hasta los años setenta, ya que al comienzo de esta década se reporta el primer caso de criptosporidiosis clínica en un ternero, el que fue publicado en 1971 (Zanaro et al., 2008). En cuanto a los primeros reportes de infección en humanos se dieron en 1976 y sólo se tomó conciencia del organismo a principios de los 80 debido al alto índice de pacientes portadores del VIH (virus de inmunodeficiencia humana) con enfermedad gastrointestinal, causada por Cryptosporidium spp. como parásito oportunista, lo cual sugiere que la enfermedad es relativamente reciente. Su diagnóstico se realiza exclusivamente en casos de enfermedades gastroentéricas de tipo diarreico sin resolución en pacientes inmunocomprometidos. (Sanz, 2010). En la Actualidad se reportan 20 especies del género Cryptosporidium de las cuales se describen: 1en anfibios, 2 en reptiles, 2 en peces, 3 en aves y 12 reportadas en mamiferos (Fayer, 2010). De las especies de Cryptosporidium que infectan mamiferos C. parvum and C. hominis son las responsables de infección zoonótica y antropozoonótica. C. felis, C. muris y C. canis han sido reportadas en infecciones humanas pero son menos comunes (Quah et al, 2011; Celis, 2010; Vergara et al , 2004, Greene, 2008). De la misma manera, se ha comprobado que C. parvum no causa infección en aves, pero se consideran un vector mecánico en el transporte de este parasito zoonótico (Quah et al 2011). La caracterización genética con técnicas especificas y fiables como la reacción en cadena de la polimerasa, acoplada al polimorfismo de restricción de RNA, la longitud del fragmento PCR-RFLP) y la secuencia analítica se usaron, a finales del siglo pasado, para diferenciar los aislamientos de Cryptosporidium y para confirmar la validez de las especies de este género. Los análisis de la subunidad pequeña del gen del DNA ribosómico (18S rDNA) han puesto de manifiesto la existencia de distintos genotipos llamados, arbitrariamente, tipos “humano”, “bovino”, “vacuno”, “porcino”, “felino”, “murino”, “canino”, “simio”, “hurón”, y “marsupial”. Análisis posteriores han demostrado que los genotipos humano, bovino, felino y canino son especies diferentes, pero todavía no puede afirmarse que el resto de los genotipos constituyan una sola especie. La valoración y en su caso separación de estas especies y genotipos, requiere el apoyo de investigaciones morfológicas, biológicas (fenotípicas) y genéticas (Sanz, 2010; Fayer, 2010).

Tabla 1. Especies de Cryptosporidium, hospedadores, autores. Hospedador

Peces

Anfibios y reptiles

Aves

Mamiferos

Nombre Piscicryptosporidium cichlidis Piscicryptosporidium reichenbachklinkei Cryptosporidium molnari C. scophthalmi C. serpentis C. varanii C.fragile C. meleagridis C. baileyi C. galli C. muris C. parvum C. wrairi C. felis

Ubicación primaria Gástrico Gástrico

C. andersoni C. canis C. hominis C. suis C. bovis C. fayeri C. ryanae

Gástrico Intestinal Gástrico Gástrico Gástrico Intestinal Intestinal Proventrículo Gástrico Intestinal Intestinal Intestinal Gástrico (abomaso) Intestinal Intestinal Intestinal Desconocido Desconocido Desconocido

C. macropodum

Desconocido

Autor Parperna y Vilenken (1996) Parperna y Vilenken (1996) Alvarez-Pellitero y SitjaBobadilla(2002) Alvarez-Pellitero et al (2004) Levine (1980) Pavlásek et al. (1995) Jirku et al. (2008) Slavin (1195) Current et al. (1986) Pavlásek (1999) Tyzzer (1907) Tyzzer (1912) Vetterling et al. (1971) Iseki (1979) Lindsay et al. (2001) Fayer et al. (2001) Morgan Ryan et el. (2002) Ryan et al. (2004a) Fayer et al. (2005) Ryan et al. (2008) Fayer et al. (2008) Power and Ryan (2008)

Fuente, Fayer 2010. Las especies de Cryptosporidium relacionadas con formas endémicas y epidémicas de la infección son C. hominis y C. parvum. Estas especies están más ligadas a producir infecciones en humanos. C. parvum ha aumentado su importancia en salud pública, considerándosele actualmente un parásito emergente, y de acuerdo a especialistas se pronostica que su incidencia aumente. Este parásito afecta a una gran cantidad de animales e inicialmente la infección en humanos ocurría solo en pacientes inmunocomprometidos. (Chacón et al., 2009). C. meleagridis, C. muris, C. felis, C. canis, C. suis y los genotipos de ciervo, mono, caballo, conejo y zorrino han desencadenado infección en humanos, generalmente asociada al contacto directo con el hospedador (Del Coco et al., 2009). Así 27

mismo, estudios epidemiológicos recientes, reportan que un pequeño número de humanos inmunocomprometidos, portadores del VIH fue infectado con C. canis y C. felis, sin embargo se afirma que su transmisión, más que zoonótica fue antroponótica (Xiao, et al., 2007). Se pensaba que las genoespecies de animales descritas recientemente eran específicas de huésped. Sin embargo, la restricción del huésped puede ser menos estricta dada la evidencia de una circulación compleja de especies de criptosporidosis en el medio ambiente (Greene 2008). Quah et al., 2010, describe que se han realizado estudios experimentales intentando infectar aves silvestres y de zoológico con C. parvum con resultados inconsistentes que van desde leves infecciones hasta establecimiento del parásito sin éxito. Se piensa que la detección de C. parvum en las heces de las aves son el resultado de una transmisión mecánica que puede establecer la infección en especies mamíferas y así C. parvum conserva la viabilidad y la infectividad siguiendo un pasaje a través de los hospedadores aviares.

4.2.2 Taxonomía Reino: Protozoa Subreino: Biciliata Infrareino: Alveolata Phylum: Myzozoa Subphylum: Apicomplexa Clase: Conoidasida Subclase: Coccidiasiana Orden: Eucoccocidiorida Suborden: Eimeriorina Familia: Cryptosporidiidae Género: Cryptosporidium Especies: C. parvum, C. serpentis,C. muris, C. meleagridis, C. bailey. A pesar de las similitudes en sus ciclos de vida, varias características distinguen al género Cryptosporidium del resto de los coccidios: a. El desarrollo de las formas endógenas en la celula hospedadora, la cual se limita a las superficies apicales de las células epiteliales, es decir localización intracelular y extracitoplasmática (Tizard, 2009; Flores, et al 2010). La fijación del 28

parasito a la celula tiene lugar por una organela multimembranosa, u organela nutricia, que se forma en la base de la vacuola parasitófora para facilitar el aporte de nutrientes desde la celula hospedadora (Tizard, 2009). b. La presencia de dos tipos de ooquistes morfofuncionales, uno de pared gruesa y otro de pared fina (o delgada); este con la mision de iniciar el ciclo autoinfectante en el hospedador parasitado. c. El pequeño tamaño del ooquiste que carece, además, de estructuras morfológicas, como esporocito, micropilo y gránulos polares. d. La gran resistencia de Cryptosporidium a casi todos los biocidas anticoccidiosicos ensayados hasta ahora. Dado que Cryptosporidium no necesita invadir célula hospedadora alguna para completar su ciclo, la mayor parte de las especies y los genotipos demuestran adaptación, y no necesariamente especificidad de hospedador. Para determinar el rango de hospedadores para una especie o un genotipo dado, es necesario obtener los ooquistes a partir de un hospedador e inocularlos en otro de una especie diferente. Si en este último hospedador el parásito puede desarrollar su ciclo de vida y los ooquistes excretados son genéticamente idénticos a aquellos inoculados, se extiende el rango de hospedadores para esa especie de Cryptosporidium. Esto permitió conocer que la mayor parte de las especies y los genotipos demuestran adaptación, y no necesariamente especificidad de hospedador. Es común que se produzca transmisión cruzada, sobre todo cuando los animales comparten un mismo hábitat (Zanaro et al., 2008; Bonagura, 1995; Sanz 2010). Cabe anotar que estudios in vivo, el Cryptosporidium necesita de un hospedador diferente, y la concentración infectiva a nivel extracelular de ooquistes varía dependiendo del estatus inmunológico entre otros factores del hospedador (Sanz 2010).

4.2.3. Morfología del parásito

Cryptosporidium presenta un ooquiste de forma subesférica u ovalada con un tamaño aproximado según la especie de 3,5 a 8 μm de diámetro, esporulado y posee cuatro esporozoitos en su interior, presenta una pared que puede ser fina o gruesa, lo cual se relaciona con diferentes vías de desarrollo esporogónico y de infección. La pared está compuesta por tres capas visibles al microscopio 29

electrónico y presenta una línea de sutura por donde emergen los esporozoítos que al ser excretado, permite la diseminación de la infección. (Del Coco et al., 2009; Flores, et al 2010). El cuerpo residual presenta elementos esenciales para la supervivencia del parásito, en su interior se encuentran una vacuola lipídica característica, inclusiones proteicas, ribosomas, citomembranas y gránulos de amilopectina, los que proveen nutrición a los esporozoítos. La concentración de amilopectina ha servido como marcador indirecto de la viabilidad, ya que a mayor tiempo y temperatura de conservación, su concentración disminuye (Del Coco et al., 2009).

Foto. 1. Identificación del protozoario tinción ZN modificada 40X.

Fuente: autor 2012.

La estructura de los zoítos (merozoítos y esporozoítos) sólo se distinguen con el auxilio de la microscopía electrónica. Se trata de elementos de cuerpo oval alargado, con forma de coma, con el extremo apical afinado y el posterior redondeado. Los microtúbulos, situados lateralmente por debajo de la membrana plasmática o película, recorren longitudinalmente el cuerpo del zoíto. Estos microtúbulos finalizan en sus extremos en unas estructuras anulares, el anillo polar anterior, muy próximo a su región apical y el anillo polar posterior, cercano al extremo posterior del zoíto permiten su desplazamiento y actúan durante el proceso de invasión. La pared está formada exclusivamente por la membrana 30

plasmática o película en donde se abre uno o más microporos. El complejo apical, compuesto por organelas secretorias (roptrias, micronemas, gránulos densos) le permiten al zoíto adherirse e invadir la célula del hospedador e inducirla a envolver al parásito en la vacuola parasitófora; y componentes no vesiculares (conoide y microtúbulos subpeliculares). Las roptrias y los (Zanaro et al 2008; Gómez et al 2010).

4.2.4 Ciclo biológico. El Cryptosporidium tiene un ciclo de vida típico de los coccidios, con un periodo de prepatencia de 5 a 15 días en humanos y de 2 a 14 días en la mayoría de animales domésticos y silvestres, presentando estados de merogonia o esquizogonia, gametogonia y esporogonia. Aunque como Sarcocystis, la esporulación tiene lugar en el hospedador, sus etapas de desarrollo (sexual y asexual) se completan dentro del trato gastrointestinal de un único hospedador (monoxeno) (Del Coco, et al 2009). El ciclo comienza una vez que el hospedador ingiere los ooquistes que se encuentran en el ambiente, que contienen cuatro esporozoítos, los cuales escapan a través de una fisura que se abre en la pared del ooquiste, en el tracto gastrointestinal del hospedador. Al parecer las fluctuaciones de pH en el tracto gastrointestinal, las sales biliares, la tripsina (enzima pancreática) y la temperatura corporal (en torno a 37ºC) favorecen el desenquistamiento probablemente, a causa del aumento de la permeabilidad de la pared del ooquiste, la movilidad de los esporozoítos dentro del ooquiste y la consecuente exposición de receptores (Del Coco, et al 2009). Una vez librados, los esporozoítos alcanzan el borde luminal de los enterocitos (las microvellosidades del intestino delgado), mediante movimientos de contracción-extensión y el deslizamiento; luego se adhiere a receptores de la membrana apical de la célula, para formar una vacuola parasitófora, donde el microorganismo permanece en posición intracelular pero extracitoplasmática. Dentro de la vacuola, el parásito se redondea transformándose en un trofozoíto y comienza un ciclo de multiplicación asexual (merogonia o esquizogonia) y luego continúa con una multiplicación sexual (gametogonia) (Gómez et al., 2010; Greene, 2008). Durante el ciclo de proliferación asexual se forman merontes tipo I de los cuales emergen 8 merozoítos, que se liberan a la luz intestinal tras la ruptura de la vacuola parasitófora y penetran en las células adyacentes. Los merozoítos del tipo 31

I pueden generar nuevas merogonias de primera generación o formar merontes del tipo II, que contiene 4 merozoítos. La reproducción sexuada o gametogonia se inicia cuando éstos últimos parasitan nuevas células dando lugar a la formación de macrogamontes, que luego se transforma en gametos femeninos o macrogametos y unos pocos se transforman en microgamontes, que contiene 16 microgametos en su interior (Cordero et al., 1999; Gómez et al., 2010). Los macrogametos poseen cuerpos formadores de la pared en la periferia, mientras que los microgametos carecen de flagelo y se dirigen hacia los macrogametos siguiendo el flujo intestinal o mediante la contracción y extensión de los microtúbulos intracitoplasmáticos. La fertilización se acompaña de la penetración del microgameto, a través de la vacuola parasitófora y de la membrana del macrogameto. Luego se inicia el proceso de esporogonia mediante dos divisiones asexuales del cigoto, formando un ooquiste la forma infectiva y a la vez el único estado exógeno de Cryptosporidium, que permite la diseminación de la infección que contiene cuatro esporozoítos infectivos (Del Coco, et al., 2009; Vergara, et al 2004; Zanaro, et al., 2008). La formación de la pared del ooquiste acontece antes que la esporulación (formación de 4 esporozoítos). El 80% aproximadamente de los ooquistes formados al terminar el ciclo son ooquistes de pared gruesa; el hospedador los expulsa con las heces si se localizan en el tracto gastroentérico, constituyendo las formas de resistencia que encontramos en el ambiente y cuando se eliminan con las heces son directamente infectantes o vía aerosoles y secreción nasal, si se ubican en el respiratorio. Sin embargo, un 20%, aproximadamente, de los ooquistes no desarrollan pared gruesa por lo que se denominan ooquistes de pared delgada. Son los responsables de autoinfecciones debidas al reciclado continuo de esporozoítos por exquistación de los ooquistes de pared delgada y pueden ingresar en nuevos enterocitos, reiniciándose el ciclo. Por lo expuesto, Cryptosporidium tiene dos ciclos autoinfectantes mediados por los merozoitos de tipo I y por los ooquistes de pared delgada que permite la persistencia de la infección (Del Coco, et al 2009; Cordero et al., 1999; Gómez, et al., 2010). Pereira et al, 2002 demostró con ensayos in vivo e in vitro que la ubicación de las distintas formas de desarrollo del parásito en las células intestinales del hospedador y su unión a la superficies apicales depende del genotipo del protozoario. Sin embargo, todavía es mucho lo que se desconoce sobre mecanismos usados para invadir las células hospedadoras del epitelio intestinal y situarse en ellas. Al principio se desplaza con movimientos deslizantes suaves que son actina-dependientes y, siguiendo probablemente un camino marcado por 32

el propio parásito, penetra en la superficie apical de las células intestinales (borde en cepillo), donde descansa en un lecho de proteínas del hospedador, ligadas a la actina (Sanz, 2010). Figura 1. Representación del ciclo biológico de C. parvum en el epitelio de la mucosa intestinal de un mamífero parasitado.

Fuente: Greene, 2008.

Si bien se asume que la localización normal en un hospedador inmunocompetente es el tracto gastrointestinal, en individuos inmunodeprimidos se han descrito fases extraintestinales en vías aéreas (bronco pulmonar), árbol biliar, hígado, vejiga y páncreas (Bowman, 2004). El periodo de prepatencia en los rumiantes domésticos es de 3-4 días, aunque puede ser superior cuando la dosis infectante es baja o conforme se incrementa la edad del animal en el momento de la primoinfección, donde puede prolongarse hasta 6-7 días (Quilez et al., 2003), en perros 2-14 días, en alpacas de 3-4 días y en humanos de 5-21 días (Del Coco, et al., 2009). La duración del periodo de eliminación de ooquistes (periodo patente) es de 3-33 días en perros, en alpacas 11-14 días y en humanos de 8-31 días, aunque puede prolongarse de forma intermitente (Cordero et al., 1999).

4.2.5 Inmunología Inmunidad innata. Ésta constituye un sensor primario en la detección del parásito. Las “células centinela” tales como macrófagos, células dendríticas (DC) y mastocitos, presentan receptores que pueden unirse a los PAMP (patrones moleculares asociados a patógenos) expresados en los diferentes agentes patógenos. Estos microorganismos no solamente se multiplican de manera rápida, sino que son diversos, pueden mutar y cambiar sus estructuras moleculares más rápido de lo que un animal infectado pueda responder. Por esta razón los receptores de las células centinela, además de reconocer la mayoría de moléculas microbianas, utilizan sus receptores en la detección de moléculas altamente conservadas que se encuentran en muchos grupos diferentes de microorganismos (Tizard, 2009). Los receptores tipo Toll (TLR) de la inmunidad innata, ubicados tanto en la superficie de las células como a nivel intracelular, se expresan en diferentes tipos de células dentro de las que se encuentran las células centinela, eosinófilos y células intestinales del tracto respiratorio y gastrointestinal, cuyos ligandos son componentes bacterianos diversos, inducen la activación y migración hacia el núcleo del factor de transcripción nuclear Kappa B (NF-kB). Además de la liberación y secreción de citoquinas proinflamatorias, este factor induce la producción de moléculas que impiden la apoptosis de la célula parasitada, a fin de que el parásito culmine su ciclo evolutivo (Tizard, 2009). El NF-kB promueve la expresión de moléculas proinflamatorias tales como prostaglandinas (PG) y 34

citoquinas. Este factor nuclear está involucrado en la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa, presente en las células de la superficie y del subepitelio intestinal y encargada de la producción de óxido nítrico. Dicha sustancia, de conocida actividad citotóxica, afecta la viabilidad de los esporozoítos de Cryptosporidium in vitro. Se ha demostrado un aumento en el número de parásitos intracelulares al utilizar antagonistas de su acción (Gómez et al 2010). Por otro lado, la producción de PGE2 estimula la producción de mucina y regula la respuesta celular T. La b2 defensina, una sustancia que ayuda a proteger al epitelio intestinal ante la invasión, también se ve aumentada en este contexto, a diferencia de su homónima a1 defensina (Del Coco,et al 2009; Greene 2008). Durante el curso de la infección se producen las siguientes moléculas: interleuquina 8 (IL-8), oncogén relacionado con el crecimiento a (GRO a), quimiocina ligando 5 (CCL5 o RANTES), proteína quimiotáctica de monocitos- 1 (MCP-1) y proteína inflamatoria macrofágica- 2 a (MIP-2 a). Estas sustancias presentan función quimiotáctica. Diferentes tipos celulares (linfocitos T, células natural killer o NK, células dendríticas, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos) serán atraídos hacia el sitio de infección según interacciones específicas entre dichas moléculas y sus receptores. Las células que son reclutadas hacia el intestino en mayor cantidad son linfocitos, macrófagos y neutrófilos, aunque estos últimos no tendrían una función muy relevante en el control de Cryptosporidium spp. En cuanto al complemento, la manose binding lectin(MBL) y el componente C4 se unirían a la superficie del esporozoíto y bloquearían la adherencia del parásito a las células epiteliales y activarían el complejo de ataque de membrana (MAC). Las células NK, activadas por células dendríticas y macrófagos, presentan actividad antimicrobiana mediante la lisis por citotoxicidad que desencadenan sobre las células infectadas y la producción de citoquinas proinflamatorias que estimulan mecanismos antimicrobianos de otras células en el sitio de infección. Una citoquina clave producida por los NK para el control de infecciones intracelulares es el interferón g (IFNg). Este es un mediador crítico de las respuestas innatas y adquiridas frente a la infección por Cryptosporidium. Algunos estudios recientes sugieren que el IFN g, inducido por el factor de necrosis tumoral a (TNF a), actúa directamente estimulando al enterocito a generar resistencia contra la infección (Tizard, 2009; Del Coco, et al 2009).

Inmunidad específica. Al igual que otros agentes, este protozoario estimula tanto la inmunidad innata como la mediada por células. En general los anticuerpos 35

controlan la carga parasitaria en sangre y fluidos tisulares, mientras que la respuesta mediada por células se ocupan de los parásitos intracelulares (Greegne, 2008; Tizard, 2009). El control inmunológico de la infección por Cryptosporidium probablemente es dependiente de la inmunidad Th1 y requiere interferón g, células T a/b y, fundamentalmente, células T CD4+. Las células g/d y CD8+ parecen ser irrelevantes en el control de la infección (Tizard, 2009; Gómez et al., 2010). Las células T CD4+ son el principal componente de la lámina propia. Constituyen la primera línea celular que desciende en la infección por el VIH. Es sabido que los pacientes con SIDA, cuyo recuento de células CD4+ se encuentra muy disminuido, padecen formas graves e incluso letales de criptosporidiosis. El número de células T aumenta considerablemente con la presencia del parásito en el tracto intestinal. Estas células inducen, a través de la secreción de diversas citoquinas proinflamatorias, profundas alteraciones estructurales de la mucosa, tales como atrofia vellositaria e hiperplasia críptica. Se ha informado un incremento en el número de linfocitos T y B durante la infección. Las placas de Peyer son sitios clave en el disparo de la respuesta inmune adaptativa (Tizard, 2009). Existen células epiteliales especializadas denominadas células M, las cuales transportan antígenos particulados desde la luz intestinal al tejido linfoide, donde serán fagocitados por células dendríticas para ser presentados posteriormente a las células T. Se han detectado Cryptosporidium spp. en los nódulos linfáticos mesentéricos (NLM). Se cree que éstos también son sitios disparadores de la respuesta inmune adaptativa. En la infección por Cryptosporidium, la secreción de quemoquinas por parte de las células epiteliales produce un gran reclutamiento de células T activadas hacia la lámina propia provenientes de las placas de Peyer, vía NLM y a través de la circulación han hallado inmunoglobulinas específicas del tipo IgG, IgM, IgA e IgE en pacientes infectados y convalecientes, diversos estudios han demostrado que ratones con depleción de células B pudieron resolver la infección por Cryptosporidium. De todas maneras, la IgA secretoria colaboraría en el control de la infección bloqueando la entrada de los estadios luminales del parásito (Del Coco, et al., 2009).

4.3 FISIOPATOLOGÍA

Las células intestinales se infectan con los esporozoítos que emergen de los ooquistes de pared gruesa, que se ingieren con los alimentos y también con los que producen los ooquistes de pared delgada, que se originan en los enterocitos infectados, en los que ha tenido lugar la reproducción sexual y asexual. Otras formas extracelulares que se desarrollan en el lumen intestinal, también pueden infectar a las células epiteliales del intestino delgado. (Sanz, 2010). Después de la infección inicial las formas endógenas se desarrollan y diseminan la infección por todo el intestino delgado y grueso. Una vez producido el desenquistamiento en el tracto gastrointestinal, los esporozoítos se liberan e inician la adhesión y la invasión, de las microvellosidades del enterocito disminuyendo la superficie de absorción. Por consiguiente, se desarrolla una reparación de las criptas intestinales, con sustitución de los enterocitos dañados por una población celular inmadura. Estos enterocitos inmaduros tienen baja capacidad enzimática especialmente de lactasa, generando cambios de presión osmótica que se traduce en hipersecreción de fluidos a la luz intestinal. Las proteínas de superficie del esporozoíto y las proteínas secretadas por las organelas especializadas del complejo apical facilitan la adhesión y la invasión, y estimulan la formación de la vacuola parasitófora. En respuesta mediada por citoquinas estimuladas por el parásito invasor, se ejerce un efecto amplificador sobre la respuesta secretoria regulando el aumento de su tamaño a través de la modificación de la permeabilidad de la membrana al agua y a ciertos iones. Cryptosporidium recluta un cotransportador de Na+/glucosa posibilitando el ingreso de glucosa y agua a la célula hospedadora, lo que permite lograr una mayor protrusión de la membrana plasmática (Celis 2010, Del Coco, et al., 2009). Al disminuir el tamaño de las vellosidades, aumentan de longitud las criptas intestinales por la aceleración de la división celular a fin de compensar la muerte celular. La apoptosis celular secundaria a la infección constituye un mecanismo defensivo de la mucosa, pero se conoce que Cryptosporidium tiene la capacidad de inhibir la muerte celular programada de las células parasitadas. Entre las 6 y las 24 horas posinfección predomina un efecto antiapoptótico; a las 24-48 horas posinfección se hacen más evidentes las señales proapoptóticas, lo cual permite que el parásito complete su ciclo de vida (24-48 horas) antes de que la célula hospedadora entre en apoptosis. El efecto sobre la apoptosis varía según el momento del período de invasión (Del coco et al., 2009). 37

4.4 EPIDEMIOLOGÍA

4.4.1 Prevalencia de criptosporidiosis. La criptosporidosis es una enfermedad parasitaria producida por protozoos del género Cryptosporidium spp. que afectan a una gran variedad de vertebrados, que se añade a la larga lista de zoonosis parasitarias, siendo frecuente entre todos los grupos de edad y tanto en individuos inmunocompetentes como inmunodeprimidos (Fayer, 2010; Vergara, et al., 2004; Zanaro, et al., 2008). Los más susceptibles a adquirir infecciones transmitidas por mascotas son los niños, ancianos, personas carentes de cuidados sanitarios e higiene personal y personas inmunodeprimidas de diversos orígenes. También se da en domicilios de pacientes infectados, guarderías de niños, homosexuales sanos, el personal médico, y personas que viajan a países en desarrollo, esto indica que Cryptosporidium es altamente infeccioso y transmisible de persona a persona (Celis, 2010). Actualmente Cryptosporidium parvum es reconocido como uno de los principales causantes de infección gastrointestinal y diarrea, sobre todo en enfermos con algún grado de disfunción inmunológica. En los niños, Cryptosporidium spp. es la tercera causa de diarrea infecciosa, generalmente después de los rotavirus y de Escherichia coli (Chacón, et al., 2009). La criptosporidosis es una infección entérica en humanos de considerable incidencia tanto en países desarrollados como en desarrollo. Los dos primeros casos fueron notificados en 1976, adquiriendo mayor relevancia en 1993 en Milwaukee, EE.UU con el brote epidémico más importante a nivel mundial, afectando a más de 400.000 personas; por lo cual la enfermedad se ha reportado en más de 40 países, tanto en individuos inmunocompetentes como inmunocomprometidos. La prevalencia de infecciones humanas es menor en los países industrializados en los cuales la población tiene acceso a mejores servicios sanitarios y agua de bebida más limpia que en los países menos desarrollados. En varias encuestas, se encontró que la prevalencia de ooquistes en las heces varía de 1 a 2% en Europa, de 0,6 a 4,3% en América del norte hasta cifras que cubren el rango 3,2-31,5% en América Central y del Sur. (Zanaro, et al., 2008, Sanz 2010). 38

En Colombia, los porcentajes oscilan entre el 4% en niños con diarrea en la ciudad de Medellín, y el 5.1 % observado en un estudio realizado sobre 1023 muestras fecales en niños menores de 14 años con diarrea en la ciudad de Cali. No obstante, los porcentajes observados se incrementan considerablemente cuando se investiga la presencia de anticuerpos séricos, ELISA (Elgun, et al 2011), WESTERN BLOOD (Nichols, et al., 2006); lo cual sugiere que la exposición al parásito es mucho más frecuente de lo que pudiera deducirse de los estudios coprológicos. En un estudio realizado sobre 1778 muestras séricas de población urbana y rural en varios departamentos de Colombia utilizando una técnica ELISA, se observó una seroprevalencia del 83,3%, encontrándose los mayores porcentajes de seropositividad en mujeres, personas de 30 años y residentes en zonas rurales (Vergara et al., 2004). Los reportes sobre prevalencia de Cryptosporidium en animales, se enfoca mas en bovinos de diferentes partes del mundo (Canadá 40.6% en 2005; Estados Unidos 8.7% en 2000; España 8.4%, 2007; Australia 48%, 2004; Japón 12%, 2003; Vietnam 33.5%, 2007; Malasia 36% 2008; y norte de Tailandia 7% utilizando la técnica de coloración acido resistente (Inpankaew et al., 2010). Así mismo estudios de la infección por Cryptosporidium parvum en animales, reporta prevalencias del 80% en terneros de menos de un mes y 62% en vacunos adultos asintomáticos. Esto muestra que los vacunos desarrollan suficiente inmunidad como para evitar la patología, pero no para eliminar la infección (Celis, 2010). En Tunja Boyacá, en el 2009 se reportó una prevalencia de 16,38% en heces de caninos obtenidas de diversas clínicas veterinarias (Rodríguez, et al., 2009); en el municipio de Villa de Leyva, se reporto una prevalencia en perros clínicamente sanos de 88% de protozoarios entre los que se halló Cryptosporidium spp. En el año 2010 se reporta un estudio en Perú, mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada, obteniendo una prevalencia general de 26.8±7.8%. En el año 2008 Dado et al, determinaron la presencia de parásitos zoonóticos a través de 625 muestras de suelo y 79 muestras fecales en 67 parques de la ciudad de Madrid. La presencia de parasitosis intestinales fue detectada en 27 parques contaminados con Cryptosporidium spp. (6%). En el año 2009 se colectó y analizó materia fecal de 132 perros en 3 consultorios veterinarios de la ciudad de Tunja - Boyacá. El análisis de los animales estudiados fue estratificado El 16.38% de muestras fueron positivas para Cryptosporidium 39

spp.; así mismo se observó mayor frecuencia en animales menores de un año. (Rodríguez, et al., 2009). Según Sanz 2010, en personas adultas con buen estado de salud no hay pruebas que indiquen una posible transmisión zoonótica de la criptosporidosis a partir de los animales de compañía, sin embargo si se ha descrito la transmisión del biotipo bovino de C. parvum (de gatos y perros) a personas enfermas de HIV.

4.4.2 Fuentes de contagio y vías de transmisión. En mamíferos la infección por C. parvum es adquirida por ingestión del ooquiste. La fuente de contagio son individuos de la misma especie inmunocompetentes o inmunodeprimidos; de igual manera en individuos de otras especies en las que se ha demostrado la infección (Cordero et al., 1999; Zanaro et al., 2008). Durante la fase aguda de la enfermedad, los animales y humanos infectados eliminan con sus heces grandes cantidades de ooquistes que tienen una gran resistencia a las condiciones ambientales y desinfectantes habituales manteniéndose en estado infectivo por largos periodos. Esta característica, unida a su baja dosis para infectar y la ausencia de un tratamiento farmacológico eficaz, facilitan la difusión de la enfermedad (Peng et al., 2008; Nichols et al., 2006) En los rumiantes domésticos, la principal fuente de infección son las heces excretadas por los animales neonatos con diarrea (en esta fase se presenta un elevado número de ooquistes excretados), por esta circunstancia, la prevalencia suele ser superior en explotaciones con un elevado número de neonatos aunque también hay que considerar la eliminación de ooquistes por los animales adultos que actúan como portadores asintomáticos (Ortega et al., 1999; Quilez et al., 2003). La transmisión indirecta por alimentos y agua, contaminados con ooquistes, también deben considerarse; sobre todo desde el punto de vista de la salud pública. Siendo cada vez más frecuente los hallazgos de Cryptosporidium en aguas para consumo humano y su asociación con brotes de diarrea en la población inmunocompetente (Thompson et al., 2003; Vergara y Quilez, 2004; Flores et al., 2010).

4.5 FACTORES EPIDEMIOLÓGICOS ASOCIADOS AL PARÁSITO

4.5.1 Resistencia de los ooquistes. Los ooquistes de Cryptosporidium son infectantes desde el momento de ser excretados con las heces y están perfectamente adaptados para la supervivencia en el medio ambiente, siendo muy resistente a las condiciones variables de éste, con la única excepción de la desecación y la congelación; pudiendo conservar su infectividad durante 2-6 meses a 4 ºC (Cordero et al., 1999). Estudios realizados en laboratorios han demostrado que muchos ooquistes se mantienen viables en soluciones acuosas entre 3 y 6 meses a temperatura ambiente (15-20ºC), siendo necesario temperaturas extremas para inactivarlos. A 15ºC algunos ooquistes pueden mantenerse infectantes hasta 7 días y se precisan temperaturas de -22ºC y -70ºC durante 8 y 1 hora, respectivamente, para asegurar su destrucción (Peng, et al., 2008) Cryptosporidium Parvum se considera uno de los microorganismos de transmisión hídrica más resistentes. En comparación con los quistes de otros entero patógenos como Giardia duodenalis, se ha demostrado que la resistencia de los ooquistes de C. parvum es hasta 14 y 30 veces superior a desinfectantes como el cloro o el ozono, respectivamente (Quilez et al., 2003). La extracción física de los ooquistes durante el proceso de potabilización del agua puede conseguirse mediante la sedimentación de estos (Moghadam 2006),aunque el elevado número de brotes de criptosporidiosis humana de transmisión hídrica, ya que en el agua permanecen en viables 140 días y son muy resistentes a la mayoría de desinfectantes corrientes permiten concluir que éstos métodos no son completamente eficaces en la separación o inactivación de los ooquistes (Solarte et al., 2006; Quilez et al., 2003).

4.5.2 Dosis infectante, características del aislado y especie. La infección no es dependiente de la dosis infectante, sin embargo, el periodo de prepatencia se alarga en infecciones experimentales con dosis bajas. La dosis mínima infectante en corderos puede ser un sólo ooquiste (Cordero et al., 1999). Las diferencias de virulencias entre aislados han sido atribuidas a la posible existencia de variaciones entre cepas y a variaciones en la receptividad del 41

hospedador. Recientemente, se ha demostrado diferencias genéticas y proteicas entre aislados (Sanz, 2010). La infección por Cryptosporidium spp. se ha señalado en más de 150 especies de mamíferos, lo que unido a su falta de especificidad, hace considerar que tanto individuos de la misma especie como individuos de otras especies en las que se ha demostrado la infección, pueden actuar como fuente de contagio (Fayer, 2010).

4.6 SIGNOS CLÍNICOS No existen signos patognomónicos que diferencien a la criptosporidosis de procesos patológicos causados por otros enteropatógenos. El principal signo clínico es la diarrea, de consistencia variable, entre heces aparentemente formadas y acuosas, color amarillento. En humanos, La duración y severidad de los síntomas clínicos son variables y dependen en gran parte de la edad y del estado inmunológico de la persona infectada (Greene, 2008). En individuos inmunocompetentes la infección con Cryptosporidium es asintomática o cursan como una enfermedad autolimitante, caracterizada por diarrea acuosa, profusa y de mal olor. Los síntomas comienzan explosivamente uno o dos semanas después de la infección. La duración del cuadro clínico es de 9 a 15 días, y la eliminación de ooquistes, a menudo intermitente, puede persistir aun en la etapa de convalecencia. A menudo hay dolor abdominal, náusea, vómito, anorexia, fiebre leve de menos de 39ºC y pérdida de peso (Del Coco et al., 2009), además la importante pérdida de fluidos puede provocar una deshidratación intensa. En las personas inmunodeficientes (infecciones virales como sarampión y SIDA; en pacientes con cáncer, transplantados con tratamiento inmunosupresor, con malnutrición u otras enfermedades que afectan al sistema inmunológico); los síntomas son más severos, con diarrea acuosas, profusa y con una frecuencia de 50 o más deposiciones y pérdidas de hasta 25 litros de agua por día pudiéndose convertir en una enfermedad crónica y prolongarse desde meses hasta años principalmente en pacientes con SIDA; pues en éstos pacientes la enfermedad puede persistir hasta la defunción del enfermo (Zanaro et al., 2008). La ubicación extraintestinal más frecuente de criptosporidosis es en la vía biliar extrahepática, con desarrollo de colecistitis aguda gangrenosa. También se han descrito casos de criptosporidosis en la vía biliar intrahepática, gástrica, esofágica, pancreática, respiratoria y en el oído medio Del Coco et al., 2009; Sanz 2010). 42

En animales, el principal signo clínico es la diarrea, asociada a la excreción de un gran número de ooquistes en las heces. En condiciones naturales, la mayoría de los animales se infectan durante los primeros días de vida, por lo que los brotes de la enfermedad se manifiestan durante el período neonatal; especialmente entre la primera y tercera semana de vida (Quilez et al., 2003). Generalmente en rumiantes se presenta diarrea, tenesmo, anorexia, pérdida de peso, dolor abdominal, fiebre, depresión y deshidratación (Jubb et al., 1990). En perros, la infección suele ser asintomática. En algunos casos pueden aparecer cuadros diarreicos. Se ha descrito asociado con condiciones de estrés e inmunodeficiencias, como: el moquillo canino, parvovirus, linfoma gastrointestinal; así como asociado a virus entéricos (Rotavirus), bacterias (Campylobacter, Salmonella) y otros protozoos (Giardia) (Greene 2008). Es menos frecuente la diarrea y vómitos crónicos.

4.6.1 Lesiones. La gravedad de los cambios morfológicos se correlaciona con el número de parásitos presentes en el sitio de infección. Hay una enteritis catarral aguda, con congestión y edema del intestino afectado, que aparece distendido por la acumulación de gas y con un contenido generalmente amarillento y acuoso. A nivel histológico se evidencian como macro y microgamontes basófilos, de 4-5 μm de diámetro, adheridos a la superficie de las células intestinales formando cadenetas (Del Coco et al., 2008). Los hallazgos histológicos de la mucosa intestinal se asocian con una atrofia leve, moderada o intensa de las vellosidades, que se presentan acortadas y ensanchadas, hiperplasia y elongación de las criptas intestinales e intensa apoptosis. En la lámina propia se evidencia un infiltrado inflamatorio con predominio de linfocitos, macrófagos y neutrófilos. En inmunocomprometidos se produce infección crónica del intestino, con una profunda y gradual desorganización de la arquitectura que incluye desestructuración de la superficie epitelial, fibrosis, infiltrado celular y abscesos crípticos Las lesiones microscópicas en el intestino grueso son menos frecuentes, aunque puede estar afectado de forma focal, con presencia de epitelio columnar bajo o cuboide, núcleos no alineados y superficie irregular (Jubb et al., 1990).

4.7 DIAGNÓSTICO La detección de ooquistes más económicas, se realizan en muestras de heces, aunque el pequeño tamaño de los ooquistes y su similitud con diversas levaduras exigen el empleo de técnicas coprológicas y tinciones específicas. La utilización de métodos de concentración de materia fecal aumenta la sensibilidad del diagnóstico microscópico. En este grupo se incluyen las técnicas de flotación con diferentes soluciones (sacarosa de Sheather, sulfato de zinc, sulfato magnésico, cloruro sódico), siendo aconsejable en este caso el empleo de microscopio de contraste de fases para identificar los ooquistes; así como las técnicas de sedimentación con formol-éter o formol-acetato de etilo, que ofrecen la posibilidad de identificar el parásito en visión directa o realizar tinciones diferenciales (Vergara, Quilez ., 2004; Del Coco, et al 2008) Los métodos de sedimentación son los más usados en el diagnóstico parasitológico de rutina, y se considera a la técnica de Sloss y Telemann métodos de elección. Sin embargo, Del Coco, et al, en el 2008, realizó un estudio comparando la recuperación de ooquistes mediante las técnicas de Telemann modificada, agua-éter y tris-Tween 80. De acuerdo con los resultados obtenidos, las tres técnicas pueden ser empleadas para concentrar ooquistes de Cryptosporidium. Si bien los tres métodos presentaron igual sensibilidad y especificidad diagnóstica, la técnica de agua-éter demostró ser sencilla, de bajo costo y efectiva para recuperar ooquistes, particularmente si se requiere conservar la viabilidad de éstos con fines epidemiológicos o experimentales. De la misma manera, se han desarrollado diversas técnicas en humanos y animales de inmunomarcado, que utilizan anticuerpos mono o policlonales, pero son costosas y su sensibilidad y especificidad viene a ser igual. De la misma manera, se dispone comercialmente de inmunoensayos rápidos que requieren escasa experiencia, que aunque no sustituyen a los métodos de diagnostico rutinario, pero por su gran sensibilidad y especificidad pueden ser útiles para confirmar las infecciones por especies de Cryptosporidium en enfermos con un número pequeño de parásitos y para diferenciar al género Cryptosporidium de otros protozoos que también son transmisibles por el agua, como Giardia lamblia y Entamoeba histolytica/E. dispar. (Sanz, 2010). También se dispone de técnicas serológicas como ELISA y WESTERN BLOOD (Nichols et al., 2006). La importancia adquirida como enfermedad zoonótica de transmisión hídrica en los últimos años, ha desarrollado numerosos métodos para su detección (filtración a través de membranas (Peng et al., 2008 – 2011), floculación con carbonato cálcico, centrifugación de flujo continuo, separación inmunomagnética (Flores et 44

al., 2010), microscopía, citometría de flujo (Zilberman et al., 2008), hibridación fluorescente in situ, permiten obtener información sobre los genotipos y especies de Cryptosporidium presentes en tejidos y heces animales. Entre las técnicas de tinción más usadas se encuentran las tinciones diferenciales, basadas en las propiedades ácido-resistentes de los ooquistes (Ziehl-Neelsen modificada, safranina modificada), las tinciones negativas, entre las que destaca la tinción de Heine que tiñen las levaduras y las bacterias pero no los ooquistes y las tinciones fluorescentes, con fluorocromos como auramina-rodamina, que requieren el empleo de microscopio de fluorescencia (Quilez et al., 2003; Zanaro et al, 2008). La técnica de Ziehl-Neelsen modificada ha demostrado tener una alta sensibilidad y especificidad para la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp.

4.8 TRATAMIENTO La rehidratación oral o intravenosa y el aporte de electrolitos es el tratamiento sintomático más sencillo e importante hasta que los enfermos (humanos o animales) adquieren suficiente inmunidad especifica; de la misma manera, debe administrarse antidiarreicos inespecíficos (caolín, pectina y loperamida). Son muchos los quimioterapéuticos ensayados contra la criptosporidiosis, pero ninguno ha respondido con la eficacia deseada. Por la singular ubicación intracelular del parasito que le permite utilizarla como “mecanismo de escape” y como protección contra los fármacos anticriptosporidiósicos (Sanz, 2010). La nitaxozanida, fármaco tiazólico se ha utilizado para tratar la diarrea infantil, debida a C. parvum y Giardia lamblia. La eficacia de este antiprotozooario sintético ha sido exitoso. Este fármaco, necesita profundizar su estudio en animales ya que en estudios realizados en caninos y felinos ha demostrado eficacia, sin embargo su administración se complicó por la presentación de vómitos luego de su administración (Greene, 2008). Aminoglicósidos, como la paromomicina combinada con la azitromicina un antibiótico macrólido en los terneros y ratones infectados con C.parvum y en las aves parasitadas con C. baileyi, disminuyen la duración del periodo ente, la difusión de ooquistes y los síntomas clínicos (Gómez et al 2010). La paromicina no se absorbe vía gastrointestinal a menos que exista lesión en el epitelio; con lo cual su absorción puede resultar en daño renal o sordera similar a la causada por los 45

aminoglicósidos (Greene 2008; Sumano et al 1997) .El toltrazuril es una triazina de amplio espectro anticoccidiósico y antiprotozoario, en dosis de 20 a 30 mg /kg en caninos se considera un agente promisorio para el tratamiento de Cryptosporidium (Gómez et al ,2010).

Otras terapias alternativas, como el suero hiperinmune y el calostro bovino hiperinmune que contienen anticuerpos contra las proteínas de superficie de C. parvum; frente a esporozoítos se han ensayado; asimismo, anticuerpos monoclonales con resultados positivos (Greene, 2008). De otra parte, estudios in vitro han demostrado que los caldos de cultivo de bacterias lácticas, libres de células, reducen significativamente la viabilidad de los ooquistes. Aunque no se conocen suficientemente los mecanismos implicados en la protección contra las criptosporidiosis, los estudios realizados sugieren que las bacterias probióticas podrían usarse como agentes terapéuticos frente a las especies de Cryptosporidium (Sanz 2010). Tilosina en dosis de 10 mg/kg cada 12 horas durante 10 días ha sido utilizada con éxito por Gómez et al, 2010; además puede ser suministrada por vía oral ya que permite su dosificación y toma en cachorros (Sumano, et al., 2006)

5. DESCRIPCIÓN GEOGRÁFICA Y CLIMATOLÓGICA

Tunja se encuentra a una altura de 2.782 m.s.n.m y dada la posición geográfica, el área de estudio se ubica en la formación Bosque Seco Montañoso Bajo con clima frío subhúmedo, precipitación media anual de 630.1 m.m y presenta como características límites físicas; una biotemperatura media entre 12º y 18ºC y lluvias promedios anuales entre 500 y 1000 m.m; su altitud de localización es entre los 2.000 a 3.000 m.s.n.m. con variaciones locales La humedad relativa promedio anual es de 80% que permanece constante tanto en sus valores mensuales como anuales. (Plan de ordenamiento territorial 2012). El régimen normal de precipitación se caracteriza por una distribución de tipo bimodal, presentándose dos épocas húmedas que comprende los meses de Marzo, Abril, Mayo y Octubre, Noviembre y Diciembre; entre éstos dos períodos se presentan las épocas secas, una con menor precipitación de Junio a Agosto y un periodo bien seco de Diciembre a Marzo. Según el IDEAM (Instituto de Hidrología Meteorología y Estudios Ambientales), el balance hídrico resultante de las precipitaciones y evaporaciones que se presentan a lo largo del año no generan saturaciones de agua en los suelos; sin embargo, Los fenómenos acentuados de erosión hídrica superficial presentados en áreas verdes y suelos destinados para agricultura (EROSIÓN LAMINAR, CÁRCAVAS) puede obedecer primordialmente a un intensivo y mal manejo de suelos en épocas pretéritas y condiciones edáficas de la zona.

Figura 2. Mapa de la ciudad de Tunja.

Fuente: Plan de ordenamiento territorial 2012

6. DISEÑO METODOLÓGICO

6.1 TIPO DE ESTUDIO El estudio es de tipo descriptivo transversal a conveniencia; ya que pretende mostrar a través de una técnica de diagnostico en laboratorio conocer la prevalencia de este protozoario en los principales parques públicos de la ciudad de Tunja.

6.2 HIPOTESIS Las condiciones físico-químicas de los suelos de parques públicos y zonas verdes de la ciudad de Tunja favorecen la contaminación por Cryptosporidium spp. resultante del manejo inadecuado de las excretas de animales, personas indigentes, caninos deambulantes y otros animales.

6.3 DISEÑO EXPERIMENTAL

El desarrollo del trabajo de investigación tuvo una duración de 3 semanas comprendido entre el 24 de septiembre y 15 de octubre de 2012. El trabajo se dividió en tres fases; la primera consistió en seleccionar las unidades de estudio y toma de muestras. En la segunda fase se procesaron las muestras obtenidas y se observaron microscópicamente. La tercera fase consistió en el procesamiento y análisis de los datos. En la fase de campo se tomaron en cuenta como unidades de estudio 12 parques entre los que se encuentran: parque Santander (parque de los semáforos), Santander- la Esperanza, Pinzón, Recreacional de Tunja, Los Muiscas, Remansos de Santa Inés, El Consuelo, San Antonio, Bosque de la República, Los Mártires, Pozo de Donato (Hunzahúa),Parque la Florida. Por motivos ajenos al estudio como la discriminación de áreas verdes en los parques y zonas verdes de la ciudad, y cambios estructurales en especial del parque el Bosque, donde se eliminaron zonas verdes para la realización de canchas y en el Parque 49

recreacional donde no hay acceso a ciertas zonas verdes por cercamiento, para la determinación del área a muestrear, se midieron las áreas verdes de mayor concurrencia ya que estos reportes aun no se encuentran consignados en el POT actual. Foto 2. Parque San Antonio.

Fuente: autor 2012 6.3.1 Descripción Del Universo De acuerdo con el plan de ordenamiento territorial (POT), a excepción del Parque Recreacional del Norte, cuyo estado de abandono es lamentable, el resto de parques urbanos corresponden a parques de barrio, los cuales no superan el área de una manzana. Además, no todos los parques se encuentran construidos, amoblados y dotados como tal, pues algunos solamente llegan a la categoría de zonas de cesión pero sin ningún tratamiento convirtiéndose en zonas inutilizadas o áreas sobrantes dentro del diseño de la urbanización.

6.3.1.1 Características de los parques. Según el acuerdo municipal 014 de 2001 en su artículo 141 del POT los parques hacen parte de las áreas de cesión al Municipio. y deben cumplir con unas especificaciones mínimas en las que se contempla la dotación de los elementos necesarios para que cumpla su función a la comunidad, como sillas, juegos infantiles, sistemas de acueducto, alcantarillado, 50

alumbrado público, recolección de basuras, seguridad y equipamientos comunales. De acuerdo a su área y cobertura los parques se clasifican en: parques de cobertura urbana, parques sectoriales y parques de barrio. De igual manera en su artículo 50 describe que las áreas de cesión al municipio el 100% del área se podrá utilizar para la recreación pasiva adecuada como área verde o área dura arborizada. Mínimo el setenta por ciento (70%) del área total del predio se destinará a áreas verdes o plazoletas arborizadas. Se incluye en este porcentaje la zona para juegos de niños. Hasta el treinta por ciento (30%) del área total del predio se podrá destinar a la recreación activa o zona deportiva al aire libre. Foto 3. Parque el Bosque.

Fuente: Autor 2012

6.3.1.2 Relación parque/ habitante Según el POT la ciudad de Tunja presenta un déficit de parques, zonas verdes, espacios para la recreación y esparcimiento, etc., en una ciudad habitada en gran parte por estudiantes con una densidad de 1.35 Mt2 de parque/hab. Pues en el Decreto 1504 de Agosto 4 de 1998 exige 15 Mt2 de espacio público/hab, lo cual plantea la necesidad de desarrollar políticas y proyectos importantes tendientes al mejoramiento integral del espacio público en nuestra ciudad.

Foto 4. Parque Recreacional.

Fuente: Autor 2012 6.4 MATERIALES Y MÉTODOS El análisis de las muestras de suelos se realizó en el Laboratorio de Suelos de la Universidad Pedagógica y tecnológica de Colombia (UPTC); de la misma manera se tomaron muestras aleatorias para interpretación de pH las cuales se realizaron en el laboratorio de microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos (JDC) de la ciudad de Tunja, Boyacá. La estandarización del proceso, preparación, montaje y lectura de las muestras se realizaron en el Laboratorio Veterinario Microzoo, JDC y clínica Veterinaria Zoomédica. La información meteorológica consultada fue de la estación de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (U.P.T.C.), localizada en la ciudad de Tunja, con coordenadas 5º 34’ de longitud norte y 73º 22’ de longitud oeste y una elevación de 2.690 m.s.n.m, la cual es operada actualmente por el Instituto de Hidrología Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM). Para el análisis y tabulación de la información obtenida de los resultados de cada una de las muestras se creó una base de datos utilizando el programa Excel 2007. Una vez terminada la base de datos se procedió a realizar el análisis estadístico en base a los resultados de las muestras. De la misma manera para evaluar las posibles asociaciones de Cryptosporidium spp. con textura, temperatura y pH, se aplicó la prueba de Chi cuadrado y prueba exacta de Fisher, con un nivel de significancia de 0.05 52

Teniendo en cuenta los aspectos descritos por Polo 2006, la selección de los parques para el presente estudio se baso en los siguientes aspectos:

Estado de conservación de los parques, que para el período en que se tomaron las muestras, la mayoría de estos espacios tenían el césped recién cortado; además se tuvo en cuenta la conservación de los parques: bien conservados (césped en toda su área), medianamente conservados (césped en cerca del 50% del área), y mal conservados: sin césped. Concurrencia de mascotas, caninos callejeros y otros animales en los parques con el fin de determinar la materia fecal presente en los suelos de los parques. Afluencia de niños y personas para determinar el contacto y diseminación de la materia fecal. Presencia de señalizaciones y cerramientos que impiden la entrada de población canina callejera.

Foto 5. Parque los Muiscas.

Fuente: Autor 2012

Foto 6. Recolección de muestras parque la Florida.

Fuente: Autor 2012

6.4.1 Procesamiento De Las Muestras Se realizó la técnica de recolección de muestras descrita por Polo 2006, y adaptada por Boyacá 2012, donde se tomaron 159 muestras de suelo como se describe a continuación: Descapotar (quitar el pasto) con una pala en un área de 10cm de ancho por 10cm de largo. Recoger el suelo correspondiente al cuadrado de 10cm x 10 cm a una profundidad de 1 cm. Esta muestra se tomó cada 100m2 para obtener una muestra más representativa de la contaminación posible. Depositar la muestra en bolsas resellables. Mantener en refrigeración (4°) hasta su procesamiento en laboratorio.

Foto 7. Recolecci贸n de muestras zona verde los Muiscas.

Fuente: Autor 2012

Foto 8. Pozo de Hunzah煤a.

Fuente: Autor 2012

Luego de la recolección de las muestras, se realizó la concentración de los ooquistes de la siguiente manera: Tamizaje del suelo en un tamiz de malla de 2mm x 2mm. Fragmentar las partículas de suelo gruesas que quedaron en el tamiz junto con raíces e impurezas. El tamizado se sometió nuevamente a fragmentación. Tamizar nuevamente en un tamiz de malla de 1mm x 1mm. Pesar 40 gr de suelo. Mezclar con 50 ml de agua destilada. Homogenizar y tamizar la mezcla (tamiz de 0,5mm x 0,5mm) Verter la mezcla en en tubos de 25 ml; tapar y agitar fuertemente. Dejar reposar por 1 hora. Retirar el sobrenadante dejando 1 ml por encima del sedimento. Se extrae con una pipeta Pasteur una muestra consistente en cuatro gotas las cuales se colocan en una lámina portaobjetos dejándose secar a temperatura ambiente. Aplicar proceso de tinción. La identificación de ooquistes de Cryptosporidium spp. se realizó mediante coloración de Ziehl Neelsen modificada. Las muestras consideradas positivas para Cryptosporidium spp. fueron aquellas en las cuales los ooquistes visualizados presentaron las propiedades ópticas (tamaño, morfología y coloración rosada) compatibles con el protozoario (Boyacá 2012). La tinción de Ziehl Neelsen Modificada se realizó de acuerdo al protocolo del Laboratorio Veterinario Microzoo. REACTIVOS Fucsina Básica fenicada Alcohol Ácido Para Ziehl Neelsen 56

Azul de metileno de Loaffer PROCEDIMIENTO Se colorea el extendido agregando fucsina fenicada. Se calienta la placa hasta que emita vapor. Se deja por 3 minutos y se lava la placa con agua corriente. Se agrega alcohol รกcido a la lamina previamente inclinada hasta observar que no desprenda fucsina Se lava la placa con agua del grifo. Se agrega azul de metileno de Loaffer por 30 segundos. Se enjuaga hasta retirar el colorante y se deja secar para su posterior lectura. Las lรกminas positivas se conservan; de la misma manera se tiene un archivo fotogrรกfico.

Foto 9. Preparaciรณn de muestras para tamizaje.

Fuente: Autor 2012

Foto10. Sedimentaci贸n espontanea.

Fuente: Autor 2012 Foto 11. Retiro sobrenadante.

Fuente: Autor 2012 Foto 12. Tinci贸n Zielh Neelsen modificada.

Fuente: Autor 2012 58

Para la medición de pH en las muestras de suelo, este se determino según el método potenciométrico descrito por Castro 1998: Pesar 1 gr de suelo seco y colocarlo en un vaso de precipitado de 25 ml. Agregar 10 ml de agua destilada. Agitar y dejar reposar 10 minutos. Ajustar el potenciómetro con las soluciones amortiguadoras. Pasados los 10 minutos, medir el pH con el potenciómetro. Foto 13. Medición pH muestras de suelo.

Fuente: Autor 2012 Foto 14. Laminas para lectura.

Fuente: Autor 2012 59

7. RESULTADOS

Para la recopilación y evaluación de datos se diseño una tabla para consignar los datos referentes a la zona intervenida, numero de muestras tomadas y se designo la presencia o ausencia de ooquistes de Cryptosporidium spp mediante las siguientes convenciones: - ausencia de C. spp; (+) presencia de 1 a 3 ooquistes; (++) 4 a 6 ooquistes; (+++) presencia de 7 a 10 ooquistes y (++++) para presencia mayor a 10 ooquistes en cada muestra tabla. Igualmente, para el análisis de la relación de presencia de ooquistes con el tipo de suelo (textura y pH) temperatura se manejo un cuadro con dichas características anexo 1. Tabla 2. Clasificación de muestras según conteo de ooquistes. PRESENCIA DE OOQUISTES DE CRYPSTOSPORIDIUM SPA + ++ +++ 11 6 6 2 7 3

Parque RECREACIONAL EL BOSQUE SANTANDER SEMAFOROS

3 4 3

ESPERANZA

0 9 2 2 0 3 1 0 31

0 5 2 4 0 1 1 3 39

1 1 4 2 4 1 2 1 32

5 2 0 2 1 2 1 2 33

MUISCAS HUNZAHUA MARTIRES SAN ANTONIO FLORIDA PINZON SANTA INES EL CONSUELO TOTAL MUESTRAS

++++ 4 1

NUM DE MUESTRAS TOMADAS 30 17

3 0 4 2 2 3 3 1 1 0 24

16 16 10 19 10 13 8 8 6 6 159

De los parques públicos intervenidos en esta investigación, el 80,5 % presentó áreas contaminadas por este protozoario. El lugar que presentaba mayor concentración de muestras positivas se observó en los parques de El consuelo, los Muiscas y la Florida.

Así mismo el parque

- zona verde con menor contaminación fue el Pozo de

Hunzahúa; pues de las 19 muestras tomadas, solamente el 52% demostró la presencia de ooquistes; figura 3. Figura 3. Presencia de Cryptosporidium spp. en cada parque.

84,6 83,3 81,25 80

76,5

75 62,5

HUNZAHUA

PINZON

ESPERANZA

EL BOSQUE

MARTIRES

SANTANDER SEMAFOROS

SANTA INES

SAN ANTONIO

RECREACIONA L

EL CONSUELO

FLORIDA

52,6

MUISCAS

Porcentaje

100 100 100 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Fuente: Autor 2012.

La mayor presencia de ooquistes por muestra se observó en los Muiscas (40%), la Florida (38%) y San Antonio (23%) figura 4.

Figura 4. Porcentaje de muestras según el número de ooquistes de Cryptosporidium spp. en cada parque 60 50 40 30

20 10

23 0

+++ ++++

Fuente: Autor 2012 En el desarrollo de la investigación se tuvo en cuenta la diferencia en cuanto al tipo de suelo; en la tabla 3 identifican los porcentajes de muestras tomadas según el tipo de suelo; de las 159 muestras tomadas, el 28,9% pertenecen a muestras en suelos francos, de las cuales el 70% de estas presentan uno o más ooquistes de Cryptosporidium spp. seguidas por suelo de tipo franco limoso con un 21,4% y suelos orgánico y franco a franco- limoso con una prevalencia del 15,1%. Como se observa en la tabla, en estas cuatro clasificaciones se encuentra la mayor cantidad de muestras positivas a Cryptosporidium spp. Tabla 3. Porcentaje de muestras tomadas según el tipo de suelo. PRESENCIA EN CADA MUESTRA

28,9

70%

FRANCO LIMOSO

21,4

79%

ORGANICO

15,1

100%

FRANCO - FRANCO LIMOSO

15,1

96%

FRANCO ARENOSO

8,2

69%

FRANCO-ARCILLO ARENOSO

6,9

91%

ARENOSO

2,5

25%

ARCILLOSO

1,9

67%

Total muestras

159

100

TEXTURA DEL SUELO FRANCO

+++ ++++ TOTAL

% Muestras tomadas segun tipo de suelo

Fuente: Autor 2012 62

En la figura 5 se observa la distribución de ooquistes con respecto a las muestras tomadas en cada tipo de suelo. Aunque la carga parasitaria difiere, la distribución en la presencia de ooquistes es relativamente homogénea; sin embargo, en la figura 6 la relación de ausencia- presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp. Con respecto al tipo de suelo; se observa la afinidad del protozoario en suelos donde la presencia de material orgánico es mayor.

10 8 6 4 2 0

ARENOSO

ARCILLOSO

FRANCO ARENOSO

FRANCO

FRANCO LIMOSO

FRANCOARCILLOSO ARENOSO

FRANCO - FRANCO LIMOSO

++ ORGANICO

Porcentaje

Figura. 5. Porcentaje de muestras según el numero de ooquistes de Cryptosporidium spp. en cada suelo.

+++ ++++

Fuente: Autor 2012

67 33

Fuente: Autor 2012 63

Presencia

FRANCOARCILLOSO ARENOSO FRANCO FRANCO LIMOSO

FRANCO LIMOSO

FRANCO

FRANCO ARENOSO

Ausencia

100

0 ORGANICO

ARCILLOSO

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

ARENOSO

Porcentaje

Figura 6. Relación ausencia - presencia de Cryptosporidium spp.

Al realizar el análisis mediante la prueba de Chi cuadrado, para las variables temperatura y textura. Con un nivel de significancia del 0.05, y confiabilidad del 95% se halló asociación significativa (p<0.05) entre la variable textura del suelo con la presencia de Cryptosporidium spp. como se muestra en la tabla 4; mientras con la variable temperatura ambiental (tabla 5),no se halló asociación significativa. Tabla 4. Prueba de chi2 para variable suelo. SUELO

TOTAL

ESPERADO

CHI

24 24

19,875 19,875

0,856132075 0,856132075

19,875

3,963050314

34 46 13 3 4 159

19,875 19,875 19,875 19,875 19,875

10,03852201 34,34040881 2,378144654 14,32783019 12,68003145 79,44025157 1,79147E-14 <0,05

ORGANICO FRANCO - FRANCO LIMOSO FRANCO-ARCILLOSO ARENOSO FRANCO LIMOSO FRANCO FRANCO ARENOSO ARCILLOSO ARENOSO

P Chi

Tabla 5. Prueba de chi2 para variable temperatura ambiental

Temperatura 12.1 - 12.4 13.2 - 13.3

TOTAL MUESTRAS AUSENTES A C. spp 12 19

TOTAL MUESTRAS CON PRESENCIA DE C. Temperatura spp 12.1 - 12.4 71 13.2 - 13.3 57

ESPERADO 16,1823899 14,8176101

CHI 1,08095193 1,18051329 2,2614652

ESPERADO 66,8176101 61,1823899

CHI 0,26179305 0,28590556 0,547698607 0,09372724 2,80916382

P Chi

Para relacionar la asociación significativa de la variable pH con la presencia de Cryptosporidium spp. en el suelo, y dado que todas las muestras de suelo fueron 64

de tipo ácido, con valores desde 5.9 hasta 7.12, lo cual es típico de los suelos de la ciudad de Tunja dada su caracterización (cárcavas), se realizó la prueba exacta de Fisher con un nivel de significancia del 0.05, y confiabilidad del 95% manejándose dos rangos de pH como se muestra en la tabla 6; en esta no se halló asociación significativa (p<0.05) de la presencia del protozoario en el suelo y la variable Tabla 6. Prueba exacta de fisher para variable pH

PH 5,6 - 6,0 6,1 - 7,12

PRUEBA EXACTA DE FISHER AUSENCIA PRESENCIA TOTAL 1,0 2,0 3,0 3,0 19,0 22,0 4 21,0 25,0 0,0 4,0 4

3,0 18,0 21,0

3,0 22,0 25,0

Fuente: Autor 2012

SIGNIFICANCIA 8,26938E+42 2,26424E+43 0,365217391 8,26938E+42 1,43004E+43 0,57826087 0,943478261

8. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En este estudio se encontró la presencia de Cryptosporidium. spp. en una de las muestras de tipo arenoso lo que resulta ser interesante; ya que la literatura reporta que no se puede determinar la presencia del protozoario dadas las características de este suelo (Barwick et al., 2003), cabe aclarar que la detección del parásito en la muestra puede deberse al transporte por fómites o por descargas recientes de origen intestinal; esto es de gran importancia pues las partículas del suelo en constante contacto con seres y objetos favorece su diseminación. Así mismo, deben tenerse en cuenta aspectos descritos por Castro 1998 como la precipitación y temperatura ya que estos tienen efecto en muchas propiedades intrínsecas del suelo con las cuales la presencia del protozoario en el suelo puede variar.

De la misma manera, Kuczynska et al., 1999 describe que la recuperación de ooquistes disminuye cuando el contenido de arcilla en el suelo aumenta, para lo cual se acude al uso de soluciones dispersadoras (tris 80, Sheather). Debe tenerse en cuenta que dadas las características coloidales del suelo arcilloso descritas por Barwick et al (2003) en su estudio, el Cryptosporidium recurre a mecanismos de transporte a través de la carga electrostática interactuante con las partículas de suelo; y aunque el avance de las técnicas de concentración y detección de ooquistes de Cryptosporidium

permite nuevos abordajes en el

desarrollo de esta enfermedad y su transmisión, no excluyen el hecho de continuar realizando diagnósticos de manera simple y práctica, como se describió en el presente trabajo.

La alta presencia de ooquistes en las muestras de suelo de los parques y zonas verdes de Tunja se debe a aspectos como estado de conservación de los parques, presencia de señalizaciones y cerramientos que impidan la entrada de animales domésticos ya sean población canina o animales para pastoreo (bovinos, equinos 66

entre otros) y la alta concentración de personas en estos sitios, debido al déficit de espacios de este tipo, lo cual refleja el descuido por parte de las autoridades locales

en estos espacios. Aunque el pozo de Hunzahúa es la única zona verde con menor contaminación, y puede atribuirse a la preocupación por parte del ente privado que se encarga de su mantenimiento, con lo cual se puede afirmar que esta carga parasitaria puede disminuirse si se tienen cuidados habituales, debe tenerse en cuenta que dadas las características de esta zona se puede presentar un efecto lavado por escorrentía hacia el pozo.

El alto índice de muestras positivas a Cryptosporidium spp. en suelos de tipo orgánico y limoso, confirma que son texturas optimas para el mantenimiento de la humedad, temperatura, flujo de oxigeno y gas carbónico, así mismo del transporte a través de las biopelículas y la filtración de los ooquistes al subsuelo con lo cual se perpetua la contaminación de los suelos con este parasito, concordando con lo descrito por Peng et al 2008 – 2011 “Las partículas del suelo probablemente no afectan directamente a la supervivencia de ooquistes, pero puede modificar la actividad metabólica a través de ooquistes cambiar otras propiedades físicoquímicas y biológicas del suelo”. El pH en todas las muestras de suelo fue acido con valores desde 5,9 hasta 7,2. Dai et al., 2003 en su estudio confirman que aunque el pH alcalino no es bueno para la supervivencia del ooquiste, el pH no es un factor que influya mucho en la presencia de este parásito en el suelo, sin embargo, Peng et al 2011 describe la necesidad de realizar estudios comparativos entre pH y temperatura en campo que permitan definir su relevancia ya que la adherencia del ooquiste a las partículas del suelo y el transporte de este en diferentes superficies es debido a su carga electrostática que mejora en suelos con pH ácidos a neutro; por lo que vale la pena destacar que factores como el pH y

la temperatura ambiental son

importantes ya que Cryptosporidium. depende de procesos como alimentación y metabolismo para el desenvolvimiento y supervivencia. 67

En cuanto a la temperatura, aunque no se presentó asociación con la presencia de Cryptosporidium spp. Barwick et al 2003 y Peng et al 2008 – 2011 establecen que en un rango de 4° y 22° es una temperatura óptima para el mantenimiento de este. Igualmente, Castro 1998, afirma que la temperatura y la precipitación son factores que regulan las propiedades intrínsecas del suelo como presencia: de materia organica, tipo de arcilla y acidez del suelo intercambiable.

Respecto al conteo de ooquistes de Cryptosporidium spp. aunque varíe la cantidad y número de ooquistes por muestra, todos los parques y zonas verdes muestreados están contaminados y no disminuye el riesgo de infección al que se encuentran expuestos los habitantes de la ciudad de Tunja.

9. CONCLUSIONES

La contaminación de los suelos de los espacios públicos con Cryptosporidium spp. tiene gran impacto en todas las especies incluyendo el hombre ya sea de manera directa o indirecta teniendo en cuenta que esta enfermedad emergente en muchos casos no es diagnosticada por situaciones desconocidas, aun más sabiendo que esta enfermedad ya no se remite solo a individuos inmunocomprometidos sino a pacientes inmunocompetentes.

La presencia de Cryptosporidium spp. en los parques y zonas verdes de la ciudad de Tunja es elevado; debe tenerse en cuenta que el tiempo de supervivencia del parásito en el suelo en condiciones adecuadas es muy largo (hasta dos años) con lo que el parásito puede acumularse en el suelo.

El mecanismo de transmisión de este protozoario es oral-fecal; en el área urbana se destacan las parasitosis intestinales causadas por las heces de mascotas (gatos y perros), que infectan accidentalmente al hombre por ingestión al manipular objetos que estuvieron en contacto con los excrementos de los animales. Cabe recalcar que en varios de los parques muestreados se encontraron especies como bovinos y asnales excretando, lo que aumenta la contaminación por Cryptosporidium; más aun sabiéndose que los reportes de la transmisión de esta zoonosis en el humano es más común por bovinos.

La mayoría de los parques muestreados estaban en condiciones adecuadas, por lo que sugiere que la carga parasitaria aumenta cuando estas áreas carecen de cuidados. Teniendo en cuenta las características de los suelos y ambientales de la ciudad, Tunja constituye un ambiente favorable para la supervivencia de los ooquistes. 69

El pozo de Hunzahúa, al presentarse como la zona verde con menor contaminación es el único ejemplo de la preocupación por el mantenimiento de estas áreas limpias pudiéndose atribuir a este aspecto, que la carga parasitaria en esta zona verde este disminuida.

La presencia de materia fecal en los parques, la disposición deficiente o nula de esta y mecanismos de dispersión accidental ya sea por los transeúntes, niños en la zona entre otros, aumenta el riesgo por contaminación en suelos. De esta manera es importante educar a la comunidad desde una problemática de salud pública mediante estrategias efectivas que permitan dar a conocer la reglamentación vigente, sobre la regulación y tenencia de animales en las zonas urbanas con el fin de proteger la integridad de las personas, la salubridad pública y el bienestar de los animales en el área urbana y con ello, mejorar el cumplimiento de las leyes.

Con lo anterior no se quiere estigmatizar a los animales en especial mascotas, pues para adquirir la enfermedad, deben presentarse ciertas circunstancias que desarrollen una infección.

La condición socioeconómica y la cultura de los

ciudadanos son importantes en la contaminación de los suelos, pues sin una conciencia sobre las amenazas que se presentan por la falta de compromiso en estos temas, y la deficiencia en la sensibilización al no recoger los excrementos de sus mascotas cuando los sacan a lugares públicos debido a desinformación o desacato de las normas establecidas para el uso del espacio público, constituyen un factor de riesgo para la población que permanece en mayor contacto con las mascotas: niños, ancianos y personas inmunocomprometidas.

Dado que la presencia de Cryptosporidium spp. en el suelo depende de tantos factores que no tienen que estar relacionados directamente con la presencia de este parásito en el suelo, este estudio es útil para valorar la necesidad de

asistencia sanitaria y ambiental, informar a los servicios de salud y estimar las necesidades asistenciales de la poblaci贸n tunjana.

Los aspectos medioambientales son de gran importancia, ya que la alteraci贸n del medio y el continuo contacto del hombre con los animales y cada vez m谩s con otros ecosistemas son la causa de que muchas enfermedades aparezcan en humanos

10. IMPACTO

Las personas tienen riesgo de contraer zoonosis parasitarias, por la tenencia de una mascota que en muchos casos no ha tenido los mínimos cuidados veterinarios y su estatus inmunológico puede estar comprometido. Es bien sabido que existen enfermedades que se transmiten a través del agua, suelo, alimentos contaminados y contacto con mascotas. Por lo cual se hace necesario conocer e informar a la comunidad el estado de contaminación con estos microorganismos en los lugares de esparcimiento público; de igual manera, es necesario

identificar los sectores con mayor contaminación de los suelos,

dados los hábitos higiénicos y socioculturales de sus habitantes. Con el fin de disminuir el riesgo de contaminación. El presente estudio, tiene como uno de sus objetivos adaptar y comparar técnicas de concentración de ooquistes en heces en muestras de suelos ya que en la actualidad aunque el método de elección para concentrar ooquistes de Cryptosporidium en muestras de suelo es la técnica de Sloss con NaCl (Kuczynska et al., 1999) o soluciones dispersadoras (Barwick et al., 1999); donde se hace necesario tener una centrifuga, así mismo el proceso lleva mas tiempo y herramientas, la técnica descrita en el presente trabajo permite recuperar, concentrar y detectar ooquistes de C. spp en suelos de manera fácil y puede implementarse en futuros estudios de prevalencia sobre este parásito. Este estudio representa uno de los primeros escritos reportados sobre la contaminación del suelo con formas de protozoarios

gastrointestinales de

importancia zoonótica en los parques públicos de la ciudad de Tunja.

11. RECOMENDACIONES

Las recomendaciones que se pueden hacer de acuerdo a los resultados por contaminación en suelos de los principales parques y zonas verdes de Tunja con Cryptosporidium spp. están básicamente asociadas a la falta de conciencia ambiental, la aplicación de las leyes que regulan y protegen el espacio público, el manejo adecuado de las excretas de las mascotas por parte de los propietarios y las autoridades locales encargadas de estos espacios:

Los estudios presentes sobre la fisicoquímica de los suelos en Tunja, suelen limitarse a las zonas destinadas a cultivos por lo que sería recomendable que para futuros estudios, se tuvieran en cuenta los suelos de las áreas urbanas destinadas a zonas verdes y de recreación.

Se recomienda realizar un estudio en épocas donde las condiciones ambientales sean diferentes y permitan comparar si estas características influyen en el aumento o disminución de este protozoario en los suelos de los parques y zonas verdes de la ciudad de Tunja, ya que factores como la precipitación y los cambios de temperatura definen las propiedades intrínsecas del suelo.

Es de vital importancia continuar los muestreos de otros microorganismos de importancia en salud pública en los suelos de espacios públicos.

Con base a estos resultados las autoridades tomen medidas para disminuir la contaminación de los espacios públicos, además es necesario desarrollar estrategias adecuadas para el control de la población canina callejera.

Se necesitan desarrollar campañas de concientización que den a conocer datos básicos sobre esta enfermedad, principalmente las vías de transmisión. Este tipo de educación puede presentarse como medida preventiva. A través de la Universidad continuar con las capacitaciones que involucre medios masivos de comunicación para dar a conocer aspectos de esta enfermedad asi mismo de la importancia del manejo adecuado de las excretas de las mascotas Estas capacitaciones deben ser con mayor enfoque a la población joven e infantil. Hacer ver la importancia de manejar un control preventivo y chequeo de nuestras mascotas por parte de personal médico veterinario. Proponer a través de la educación popular el afianzamiento de la reglamentación vigente, actitudes y valores que permitan la comprensión y toma de conciencia acerca del manejo adecuado de las excretas las mascotas con el fin de disminuir la contaminación de los sitios de esparcimiento público en la ciudad de Tunja.

12. BIBLIOGRAFIA

Acha P.N, Szyfres B. 2001. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Publicacion cientifica 580 3a ed. Washington D.C., USA. [en línea] Disponible en <books.google.com.co/books?id=_mH8um0UWwgC&pg=PR4&hl=es&source=gbs _selected_pages&caf=3#v=onepage&q&f=true> [citado el 22 de abril de 2012]. Almeida A., et al., 2010. Presence of Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis in Drinking Water Samples in the North of Portugal. Korean J Parasitol. Vol. 48, No. 1: 43-48, March 2010. Alyousefi N.A., et al., 2011. Factors associated with high prevalence of intestinal protozoan infections among patients in Sana’a city, Yemen. [en línea]. Disponible en: <http//www.10.371/journal.pone.0022044> [citado el 8 de abril de 2012]. Arrowood M.J. and Sterling C.R. Comparison of conventional staining methods and monoclonal antibody-based methods for Cryptosporidium oocyst detection Journal Of Clinical Microbiology, July 1989, Vol. 27, No. 7 P. 1490-1495. Barboni G., et al., 2008. Criptosporidosis intestinal en niños con HIV/SIDA. Medicina (Buenos Aires)2008; 68: 213 – 218. Barwick R.S.; Mohammed H.O.;White M.E; Bryant R.B.1999. Detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium muris in soil samples. Biol Fertil Soils (2000) 31:385–390. Barwick, R.S-, et al 2003. Factors associated with the likelihood of giardia spp. and Cryptosporidium spp. in soil from dairy farms Journal of Dairy Science; Mar 2003; 86, 784-791. Bonagura JD. KIRK Terapeutica Veterinaria de pequeños animales. 12a edición. Mc Graw Hill – interamericana. Mexico.1995.

Boyacá M. Manual de procedimientos en laboratorio. Adaptación de la técnica de concentración de ooquistes de Cryptosporidium en muestras de suelo. Laboratorio Médico Veterinario Microzoo. Tunja 2012. Dwigh B, Eberhard M y CARL LYNN, R. Parasitología Para Veterinarios De Georgis. Octava edición. Elsevier España. 2004. Casemore D.P., et al., 1985. Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis. Pathol 1985;38:1337-1341.

J Clin

Castro Franco H.E. Fundamentos para el conocimiento y manejo de suelos agrícolas. Instituto Universitario Juan de Castellanos. Tunja, 1998. Castro-Hermida JA et al 2011. Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis in two areas of Galicia (NW Spain). Science of the Total Environment 409 (2011) 2451– 2459. Celis Samanez N. Criptosporidiasis en caninos críados en comunidades campesinas de tres distritos del departamento de Puno. Lima, Perú 2010. Tesis (E.A.P. De Medicina Veterinaria) Universidad Nacional Mayor De San Marcos Facultad De Medicina Veterinaria. Chacón, N., et al., 2009. Ocurrencia de Isospora Belli, Cryptosporidium Spp y Cyclospora Cayetanenesis en pacientes urbanos evaluados por síntomas gastrointestinales con o sin inmunosupresión. Revista de la Facultad de Medicina, Volumen 32 - Número 2, 2009 (124-131) Cordero del Campillo, F.A. Rojo Vásquez. Parasitología Veterinaria. Mc Graw Hill Interamericana. España. 1999. Couto G; Richard N. 2004. Medicina interna de Animales Pequeños. Intermédica, Buenos Aires. 2005. Dado D. et al 2010. detection of zoonotic intestinal parasites in public parks of spain. Potential epidemiological role of Microsporidia. Zoonoses Public Health. 59 (2012) 23–28.

Dai Xin, Boll Jan 2003. Evaluation of attachment of Cryptosporidium Parvum and Giardia Lamblia to soil particles Journal of environmental quality; Jan /feb 2003; 32, p. 296- 304. Del Coco V.F., et al 2008. comparación de tres técnicas de concentración de heces para recuperar ooquistes de Cryptosporidium. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2008; 42 (3): 333 -7. Del Coco V.F., et al 2009. Criptosporidiosis: una zoonosis emergente. Revista Argentina de Microbiología (2009) 41: 185-196. Elgun G. y Koltas IS. Investigation of Cryptosporidium spp. antigen by ELISA method in stool specimens obtained from patients with diarrhea. Parasitol Res (2011) 108:395–397 Fayer Ronald. Taxonomy and species Experimental Parasitology 124 (2010) 90–97.

delimitation

Cryptosporidium.

Flores, M.J.P., E. Olivas E., J. Iglesias O., B. Corral D., Y.N. Rocha G. y J. A. Gómez C. 2010. Detección de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia en suelos irrigados con aguas residuales. Capítulo de Libro: Agricultura Orgánica, 3a. edición, Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo. Aceptado para publicación el 13 de Agosto de 2010.[en línea]. [consultado el 7 de mayo de 2012]. Disponible en http://www.uacj.mx/docentes/juflores/Documents/JuanPedroFMCapLibroAbonosOrganicos2010.pdf Greene, Craig E., et al. Enfermedades infecciosas Del perro y el gato. 3ra edición. Intermédica. Buenos Aires. 2008 Gómez Nélida, Guida Nora. Enfermedades infecciosas de los caninos y felinos. 1ra edición. Editorial Intermédica. Buenos aires. 2010. Kuczynska E, Shelton D. Method for Detection and Enumeration of Cryptosporidium parvum Oocysts in Feces, Manures, and Soils Applied and environmental microbiology, vol 65. July 1999, p. 2820–2826 Rengifo-Herrera, C., et al 2012. Detection of a novel genotype of Cryptosporidium in Antarctic pinnipeds, Veterinary Parasitology (2010) doi:10.1016/j.vetpar.2012.08.021 77

Inpankaew T., et al., 2010. Prevalence and genotyping of Cryptosporidium spp from dairy cow fecal samples in western Thailand. Southeast Asian Journal Tropical Med Public Health. July 2010. Vol 41 No. 4. Navarro Martínez L, Del Águila C, Bornay-Llinares Fo. Cryptosporidium: un género en revisión. Situación en España. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(2):135– 143. Matsubayashi M, et al 2011. Effect of low pH on the morphology and viability of Cryptosporidium andersoni sporozoites and histopathology in the stomachs of infected mice. International Journal for Parasitology 41 (2011) 287–292 Mohanram A. 2011. Transport of Cryptosporidium Parvum Oocysts through disparate agricultural soils. [ProQuest]. [consultado el 7 de mayo de 2012]. Disponible en http://search.proquest.com/docview/891771447/previewPDF/138D9B5AD2475882 908/1?accountid=38880 Nichols G., et al 2006. Criptosporidosis: a report on the surveillance and epidemiology of cryptosporidium infection in England and Wales. Cryptosporidium Epidemiology Final version 8th September 2006. Peng X., et al., 2011. The fate and transport of Cryptosporidium Parvum Oocysts in the soil [en línea]. Disponible en: <http//www.intechopen.com/statistics/24775> [citado el 22 de abril de 2012]. Peng. X., et al 2008. Evaluation of the effect of temperature on the die-off rate for Cryptosporidium Parvum Oocysts in water, soils, and feces. Applied and environmental microbiology, Dec. 2008, Vol. 74, No. 23 p. 7101–7107. Polo Terán 2006. Determinación de la contaminación de los suelos de los parques públicos de la localidad de Suba, Bogotá D.C con nematodos gastrointestinales de importancia zoonótica. Bogotá 2006. 135 páginas. Trabajo de grado (Maestría en Salud Pública) Universidad Nacional De Colombia. Facultad de Medicina. Quah J. X., et al 2010. Molecular identification of Cryptosporidium parvum from avian hosts. Parasitology (2011), 138, 573–577. 78

Quiroz, R. H. Parasitología y enfermedades parasitarias de animales domésticos. Editorial Limusa. 1984. Robertson L. J., et al., 1992. Survival of Cryptosporidium Parvum Oocysts under various environmental pressures. Applied and Environmental Microbiology, nov. 1992, vol. 58, No. 11 p. 3494-3500. Rodríguez, Elkin et al. Frecuencia de Cryptosporidium spp en caninos de la ciudad de Tunja-Colombia Rev.MVZ Córdoba, [en línea] vol. 14, núm. 2, mayo – agosto, 2009. pp. 1697-1704. Disponible en <http:apps.unicordoba.edu.do/revistas/revistamvz/mvz-142/v14n2a5.pdf> [consultado el 8 de marzo de 2012]. Sanz Pérez B. Cryptosporidium y Toxoplasma. Dos importantes protozoos parásitos transmisibles por los alimentos y el agua. Biblioteca Virtual de la Real Academia Nacional de Farmacia España [base de datos en línea] [consultado el 6 de marzo de 2012]. Disponible en <bibliotecavirtual.ranf.com/i18n/consulta/búsqueda_referencia.cmd?campo=idtitulo &idvalor=45335>. Solarte Y., et al., 2006. Transmisión de protozoarios patógenos a través del agua para consumo humano. Colombia Médica [en línea] 2006, vol 37. Disponible en <http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?¡Cve=28337111. ISSN 0120-8322. [citado el 22 de abril de 2012]. Sumano López H, Ocampo C.L. Farmacología Veterinaria. Tercera edición. Mc Graw Hill – Interamericana. México, 2006. Thompson A., et al., 2003. Cryptosporidium: From Molecules to Disease. Elsevier. Amsterdam. 2003. Tizard I. Introducción a la Inmunología Veterinaria. Octava ed. Elsevier. España. 2009. Torres Corredor M. Prevalencia de parásitos gastrointestinales (nematodos, protozoarios) en caninos pertenecientes a la fundación S.O.S animal de la ciudad de Villa De Leyva (Boyacá).Colombia 2011. Programa de medicina Veterinaria. Fundación Universitaria Juan de Castellanos. Facultad de Ciencias agrarias. 79

Vergara C, Quilez J, 2004. Criptosporidosis: una zoonosis parasitaria. Revista MVZ Córdoba, enero – junio, año/vol 9. Número 001. Villeneuve A. 2009. Giardia and Cryptosporidium as emerging infections in pets. Veterinary focus 2009. Vol 19 No. 1. Wolyniak DiCesare E.A., 2011. Impact of biofilm and other environmental factors on the fate and transport of Cryptosporidium Oocysts. [ProQuest]. [consultado el 7 de mayo de 2012]. Disponible en http://search.proquest.com/docview/851647465/138D9B76F253A0525DA/1?accou ntid=38880 Zanaro N.L, Garbossa G., 2008. Cryptosporidium: cien años después. Acta Bioquím Clín Latinoam 2008; 42 (2): 195-201. Xiao Lihua, et al,. 2007. Possible transmission of Cryptosporidium Canis among children and a dog in a household. Journal of clinical microbiology, June 2007, Vol. 45, No. 6 P. 2014–2016. Zilberman Alla, et al., 2008. A two phase separation method for recovery at Cryptosporidium Oocysts from soil samples. Water air Soil Pollut 2009, 203:325334.

13. ANEXOS

ANEXO 1. Fotograf铆as identificaci贸n de Cryptosporidium spp. Objetivo 40x.

Fuente autor 2012

ANEXO 1. Continuaci贸n.

Fotograf铆as identificaci贸n de Cryptosporidium spp.

Objetivo 40x.

Fuente autor 2012 82

ANEXO 2. Tabulación De Datos

PARQUE

FECHA

Temp Amb

Temp Min

Temp Max

Cant Textura MUESTRA Ooquistes suelo

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

+++

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

+++

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

Franco-Franco limoso

7,02

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

Franco-Franco limoso

6,98

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 10

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 11

++++

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 12

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 13

++++

Franco-Franco limoso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 14

Franco-Franco limoso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 15

++++

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 16

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 17

+++

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 18

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 19

++++

orgánico

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 20

Arcilloso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 21

orgánico

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 22

orgánico

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 23

Franco-Franco limoso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 24

Franco-Franco limoso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 25

+++

Franco-Franco limoso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 26

Franco-Franco limoso

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 27

+++

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 28

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 29

+++

orgánico

RECREACIONAL

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 30

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 31

Arcilloso Franco-Arcilloso Arenoso

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 32

orgánico Franco-Franco limoso Arcilloso

5,9 6,4 6,7

Franco Arenoso Franco-Franco limoso orgánico Franco-Franco limoso orgánico Franco-Franco limoso orgánico

orgánico Franco-Franco limoso orgánico Franco-Franco limoso

7,12

orgánico Franco-Franco limoso

Franco Arenoso

6,3 6,6

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 33

Arenosos

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 34

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 35

+++

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 36

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 37

+++

Arenosos Franco-Arcilloso Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 38

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 39

++++

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 40

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 41

Franco Arenoso

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 42

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 43

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 44

+++

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 45

Franco Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 46

Franco Arenoso

EL BOSQUE

24/09/2012

13,3

8,0

18,2

M 47

Franco Arenoso

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 48

Franco Limoso

6,6

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 49

Franco

5,6

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 50

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 51

Franco Limoso

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 52

++++

Franco Limoso

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 53

Franco Limoso

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 54

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 55

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 56

+++

Franco Limoso

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 57

++++

Franco Limoso

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 58

+++

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 59

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 60

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 61

+++

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 62

+++

Franco

SEMAFOROS

25/09/2012

12,3

9,2

15,8

M 63

++++

Franco

Franco Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 64

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 65

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 66

+++

Franco Limoso

7,01

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 67

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 68

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 69

+++

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 70

+++

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 71

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 72

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 73

Franco-Franco limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 74

+++

Franco-Franco limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 75

+++

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 76

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 77

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 78

Franco Limoso

ESPERANZA

29/09/2012

12,1

7,4

17,4

M 79

Franco Limoso

Franco-Franco limoso

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 80

+++

orgánico

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 81

+++

orgánico

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 82

++++

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 83

+++

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 84

orgánico Franco-Arcilloso Arenoso Franco-Arcilloso Arenoso

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 85

++++

orgánico

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 86

+++

orgánico

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 87

++++

orgánico

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 88

+++

orgánico

MUISCAS

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 89

++++

orgánico

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 90

Franco

5,8

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 91

Franco

6,9

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 92

++++

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 93

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 94

++++

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 95

+++

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 96

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 97

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 98

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 99

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 100

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 101

Franco

6,3

6,79

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 102

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 103

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 104

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 105

+++

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 106

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 107

Franco

HUNZAHUA

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 108

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 109

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 110

++++

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 111

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 112

++++

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 113

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 114

Franco-Franco limoso

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 115

Franco-Franco limoso

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 116

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 117

Franco

MARTIRES

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 118

Franco

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 119

orgรกnico

6,4

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 120

++++

orgรกnico

6,8

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 121

orgรกnico

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 122

+++

Franco

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 123

Franco

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 124

+++

Franco

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 125

++++

Franco Limoso

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 126

Franco Limoso

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 127

++++

Franco Limoso

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 128

Franco Limoso

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 129

Franco Limoso

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 130

Franco Limoso

SAN ANTONIO

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 131

Franco Limoso

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 132

Franco

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 133

+++

Franco

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 134

++++

Franco

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 135

Franco

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 136

orgรกnico

6,3

6,75

6,8

7,1

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 137

++++

Franco

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 138

Franco

FLORIDA

30/09/2012

12,4

8,4

18,4

M 139

++++

orgรกnico

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 140

Arenosos

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 141

Franco Arenoso

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 142

+++

Franco Arenoso

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 143

++++

Franco Arenoso

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 144

Franco Arenoso

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 145

+++

Franco Arenoso

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 146

PINZON

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 147

SANTA INES

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 148

+++

Franco-Franco limoso

6,97

SANTA INES

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 149

++++

Franco-Franco limoso

6,63

SANTA INES

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 150

Franco-Franco limoso

SANTA INES

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 151

Franco-Franco limoso

SANTA INES

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 152

Franco Limoso

SANTA INES

28/09/2012

13,2

7,6

17,0

M 153

Franco Limoso

EL CONSUELO

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 154

Franco Limoso

EL CONSUELO

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 155

Franco Limoso

EL CONSUELO

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 156

+++

Franco Limoso

EL CONSUELO

26/09/2012

13,2

6,4

17,4

M 157

Franco Limoso

EL CONSUELO

26/09/2012

17,4 17,4

Franco Limoso

26/09/2012

6,4 6,4

M 158

EL CONSUELO

13,2 13,2

M 159

+++

Franco Limoso

6,3 7,1

Arenosos Franco Arenoso