Prevalencia de brucella abortus en hembras bovinas mayores de 36 meses de edad en el municipio de mi by Medicina Veterinaria JDC

PREVALENCIA DE BRUCELLA ABORTUS EN HEMBRAS BOVINAS MAYORES DE 36 MESES DE EDAD EN EL MUNICIPIO DE MIRAFLORES (BOYACÁ)

WENDY DAYANNA SAENZ COD: 1101052049

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011

PREVALENCIA DE BRUCELLA ABORTUS EN HEMBRAS BOVINAS MAYORES DE 36 MESES DE EDAD EN EL MUNICIPIO DE MIRAFLORES (BOYACÁ)

WENDY DAYANNA SAENZ COD: 1101052049

DIRECTOR: DR. MAURICIO BOYACA QUINTANA MV.ESP. LABORATORIO CLINICO PROYECTO REALIZADO PARA OBTENER EL TITULO DE MEDICO VETERINARIO

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011 2

Nota de aceptaci贸n ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________

____________________________________ Firma del Presidente del Jurado

_____________________________________ Firma del Jurado

_______________________________________ Firma del Jurado

Tunja, Abril de 2011

RESUMEN

La brucelosis bovina es una enfermedad infectocontagiosa, producida por la bacteria Brucella abortus, la cual se caracteriza por causar abortos en el último tercio de la gestación (entre 5 y 7 mes), retención de placenta; infertilidad, orquitis, epididimitis, la cual al ser una enfermedad zoonotica, al infectar al hombre trae consigo infertilidad y degeneración articular irreversible.

El municipio de Miraflores Boyacá fue escogido para realizar este trabajo, por la presencia de casos esporádicos de abortos; razón por la cual se quiso conocer la causa de estos, por lo tanto se tomo una población total a muestrear de 345 animales y para su diagnostico se utilizo la prueba Rosa de Bengala, la cual cuenta con una sensibilidad del 75% y una especificidad del 95% y al realizar el trabajo de campo se logro determinar que muchos de los dueños de los animales no tenían conocimiento de la enfermedad y mucho menos de las consecuencias que esta trae consigo, lo cual es muy grave, ya que al desconocer esto, no ejercen control sobre las medidas de higiene y el protocolo de vacunación necesario para evitar la enfermedad de brucelosis

Al realizar esta investigación se llego a determinar que en los próximos años si no se ejercen medidas de control estricto en cuanto a higiene y vacunación, se vera incrementado el porcentaje de animales positivos a la enfermedad, el cual actualmente es de un 7%, es decir que 23 animales son positivos de 345 muestreados.

Se observa que las veredas de Ayatá, Centro Mira y Rusita no presentaron positivos, esto se puede deber a que en estas veredas se tiene un control estricto en la vacunación y en las medidas de higiene, tales como cambio de agua

constantemente, evitando que las vacas estén en contacto directo y se contagien por fluidos como saliva y orina, o también, con heces contaminadas con la bacteria, realizando rotación de potreros, manteniendo aparte las vacas del horro, levante, y novillas. Por otra parte las siguientes veredas presentaron los valores mas altos de positivos; Estancia y Tablón presento 4 animales positivos, Pueblo y Cajón presento 4 animales positivos y Tunjita presento 5 animales positivos. Esto se debe al desconocimiento de la enfermedad y su gravedad, por lo tanto no ejercen medidas de control y jornadas de vacunación, como en las anteriores veredas; cabe resaltar que las veredas se Suna abajo y Guamal, tienen la mayor probabilidad de contraer la enfermedad brucelosis, por lo anteriormente descrito.

PALABRAS CLAVES: brucella abortus, bovina, hembra, infertilidad, degeneración articular, zoonosis, infectocontagiosa, machos, orquitis, epididimitis

ABSTRACT

Bovine brucellosis is an infectious illness caused by the bacterium Brucella abortus, which is characterized by causing abortions in the last third of pregnancy (between 5 and 7 months), retained placenta, infertility, orchitis, epididymitis, which at be a zoonotic disease, to infect humans brings irreversible infertility and joint degeneration.

The municipality of Miraflores, Boyacรก was chosen for this work, the presence of sporadic cases of abortions, which is why we wanted to know the cause of these, so it took a total population sample of 345 animals and their diagnosis test was used Rose Bengal, which has a sensitivity of 75% and a specificity of 95% and to perform field work it was determined that many pet owners had no knowledge of the disease, much less the consequences that this entails, which is very serious because by ignoring this, no control on hygiene measures and vaccination protocol necessary to prevent disease brucellosis.

In conducting this research was not determined in the coming years if not exercised strict control measures in terms of hygiene and vaccination will increase the percentage of positive animals to the disease, which is currently at 7%, say that 23 animals were positive of 345 sampled.

It is noted that the paths of Ayat, Mira and Rusita Center showed no positive, this can occur in these villages have a strict control on vaccination and hygiene measures, such as changing water constantly, preventing cows are in direct contact and is spread by fluids such as saliva and urine, or, with feces contaminated with the bacteria, by rotational grazing, keeping aside the horrors cows, raise, and heifers.

Moreover the following villages had the highest values of positive, Estancia and Board 4 animals presented positive people and positive drawer and 4 animals presented Tunjita 5 animals presented positive. This is due to ignorance of the disease and its severity, so do not exercise control measures and vaccination campaigns, as in the previous paths, it should be noted that the sidewalks below and Guamal Suna, have the greatest chance of getting the disease brucellosis, as described above.

KEYWORDS: Brucella abortus, cattle, female infertility, degenerative joint disease, zoonoses, infectious, males, orchitis, epididymitis.

INTRODUCCIÓN

El municipio de Miraflores Boyacá actualmente no cuenta con reporte alguno referente a interés

enfermedades con síntomas reproductivos, por tanto es de vital

descartar si la causa de los abortos

presentados actualmente en el

municipio; en la brucelosis bovina. Por lo cual se ve la necesidad de realizar un trabajo de investigación en el municipio, realizando un muestreo de 345 hembras bovinas mayores de 36 meses de edad y de esta manera establecer si hay presencia de dicha enfermedad, en la población bovina determinando así, si esta es la etiología causante de los abortos en dicha especie. Es importante descartar o confirmar la existencia de Brucellosis bovina en el municipio, para que se tomen las medidas correctivas necesarias para que no se vean afectados sus pobladores, puesto que no solo conlleva problemas reproductivos para el animal, sino también se debe tener en cuenta el problema de salud pública que traería consigo, dado que la leche del municipio se vende para consumo interno, sin determinar si el animal este o no infectado, por otro parte las personas al no tener conocimiento de la enfermedad, no cuentan con la precaución de evitar el contacto con los fluidos y desechos del animal, siendo esta una de las principales vías de transmisión, por lo tanto, es de vital importancia la realización de este trabajo de investigación, con el fin de determinar el numero de animales positivos a la enfermedad, buscando que las autoridades competentes , posteriormente tomen las decisiones pertinentes, y el concientizar a la comunidad de Miraflores respecto a la gravedad de la enfermedad, dándoles a conocer como se puede prevenir y por tanto evitar las consecuencias que esta trae consigo. Asegurando a la población del municipio el consumo de leche libre de la bacteria, lo cual asegurara la no diseminación posterior de la enfermedad; pues con este

proyecto se busca el diagnostico de la enfermedad, logrando de esta forma proporcionar tranquilidad

a los pobladores frente a los productos lácteos que

consumen y sobre el estado en el que se encuentran sus animales frente a la enfermedad. La brucelosis es una zoonosis cuya incidencia y prevalencia varían de un país a otro. La infección causada por la especie Brucella abortus, frecuentemente afecta al ganado bovino, causando esterilidad en machos y abortos en hembras preñadas en el tercer tercio de la gestación1, lo que conduce a graves pérdidas económicas en países en los que es endémica. En países no desarrollados constituye además un problema sanitario para la población humana. B. abortus es una bacteria Gram negativa con un lipopolisacárido (LPS) fuertemente inmunodominante, el cual cuenta con la capacidad de sobrevivir en el interior de células fagocíticas las cuales constituyen sus principales factores de virulencia. La infección en humanos conduce a una enfermedad con tendencia a la cronicidad, con fiebre y malestar recurrentes que deterioran su calidad de vida y que además puede presentar complicaciones como artritis, meningitis, entre otras2. En el ganado bovino la bacteria se ubica en la placenta y órganos reproductores por su afinidad por el eritritol. La respuesta inmune frente a B. abortus, patógeno intracelular facultativo, depende principalmente de la activación de la inmunidad mediada por células, con la participación de células T CD4+ de tipo Th1, que secretan interferón gama (INF-γ), citoquina que estimula tanto la actividad bactericida de macrófagos como la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+. Estos últimos son capaces entonces de destruir células infectadas con Brucella3.

GARCIA, Brucelosis animal y humana en las Américas. Medicina Veterinaria. 2002. Pp. 345 GUZMAN. Andrews. Una vacuna ADN para la brucelosis bovina. Resúmenes del XIII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, 2004. pp. 30. 3 MANCILLA, I Lopez-Goni, I Moriyonrch. med. vet., Journal of Bacteriology. vol.38, 2006. pp. 8 2

La identificación de proteínas con demostrada capacidad inmune, entre las que se ha identificado la superóxido dismutasa Cu/Zn de B. abortus Superoxido de Dismutasa (SOD), ha permitido diseñar estrategias de vacunación basadas en componentes subcelulares, ya que la prevención de la diseminación de la brucelosis, basada en la vacunación con bacterias atenuadas de Brucella abortus cepa 19, cepa RB51 y cepa 45/20, no ofrece garantías de seguridad en su administración,

tampoco

permite

completa

erradicación

del microorganismo patógeno4. Debido a que la brucelosis bovina es una enfermedad zoonótica muy contagiosa, se vio la necesidad de investigar la situación de la población humana frente a la enfermedad en un municipio como San Miguel de Sema que es zona endémica. Ya que la atención se ha centrado ganaderías y han dejado a un lado la salud de los trabajadores pecuarios5.

La prevalencia serológica de Brucella spp. Encontrada fue de un 7.3% para el año 2003, lo que muestra que la vacunación contra brucelosis bovina esta funcionando, protegiendo a la población humana de posibles contagios 6.

GUZMÁN, Op cit. P. 31 Ibíd. , p. 32 6 CAMACHO G., Hugo Felipe y TAMBO Maldonado, N. Estudio de prevalencia serológica de Brucella spp. en ordeñadores de hatos lecheros del municipio de San Miguel de Sema-Boyacá en el año 2003 .Salud Pública, salud ocupacional, enfermedades zoonótica, ecología de la enfermedad, enfermedades reproductivas. Universidad Cooperativa de Colombia. Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). Bogotá .2003 5

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El propósito fundamental de este proyecto

es determinar la prevalencia de

Brucella abortus, en el municipio de Miraflores Boyacá en hembras bovinas mayores de 36 meses. Este municipio cuenta con ganadería extensiva en praderas, con pastos mejorados donde actualmente se están presentando gran número de abortos con etiología inespecífica por tanto es de suma importancia determinar si la bacteria Brucella abortus es la causante de tal situación. A través de la realización de este trabajo, donde se utiliza la prueba rosa de bengala, la cual cuenta con una sensibilidad de 75%, una especificidad del 95%, determinando de esta forma el número de animales infectados por la bacteria y el porcentaje infectado por la enfermedad en el total de la población muestreada. Aunque en algunos casos las hembras infectas con la Brucella abortus y en estado de gestación, lleguen a tener sus crías aparentemente sanos y con una producción de leche normal; estos animales terminan siendo la principal fuente de infección para los reactores, que al infectarse presentaran posteriormente problemas tales como: infertilidad, disminución en la producción de leche, perdidas de crías, de lactancias

y eliminación de vacas infectadas, generando grandes perdidas

económicas para el ganadero, por los elevados costos y asistencia técnica , perdidas de producción y de animales. Esto conllevara a que el municipio se enfrente a una alta problemática de salud pública, pues es bien sabido el carácter zoonotico de la brucelosis y los problemas que trae consigo para el ser humano.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Establecer la prevalencia de brucelosis (Brucella abortus) en hembras bovinas mayores de 36 meses de edad, en el municipio de Miraflores (Boyacá)

OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Estimar la población objeto estudio  Decretar el porcentaje de animales positivos a la bacteria Brucella abortus, en hembras bovinas mayores de 36 meses en el municipio de Miraflores (Boyacá).  Determinar el porcentaje de fincas positivas dentro del municipio, por medio la prueba rosa de bengala.  Determinar la prevalencia por vereda de Brucella abortus en el municipio de Miraflores(Boyacá)  Sensibilizar a la comunidad de Miraflores frente a la gravedad que trae consigo no solo para el animal, sino para las personas la enfermedad de Brucella abortus. por medio de charlas a la población del municipio.

1. MARCO REFERENCIAL

1.1 BRUCELOSIS 1.1.1 Antecedentes La Brucelosis es una enfermedad que afecta a los animales que incidentalmente se transmite al ser humano, quien juega un papel mínimo en su propagación. Esta patología permanece como la mayor y más difundida zoonosis en el mundo 7. En los países del Mediterráneo y Medio Este la incidencia anual de brucelosis humana varía desde <1 a 78 casos por cien mil habitantes.; sin embargo, 550 casos han sido reportados de áreas endémicas en las cuales no han sido aplicadas medidas de control en los animales. Por otra parte, sobre 77 casos por cien mil habitantes. Han sido informados en países del sur de Europa donde las medidas de control de animales son obligatorias8. La brucelosis animal puede generar barreras en la comercialización de los animales y sus productos, lo cual podría alterar seriamente el desarrollo socioeconómico, especialmente de los pequeños ganaderos, el sector más vulnerable en muchas poblaciones rurales. Por esta razón, la organización mundial de la salud OMS y otros organismos han establecido planes para eliminar la Brucelosis de ovinos, caprinos y bovinos tanto en Europa como en América Latina9. Los programas de control y erradicación de la Brucelosis bovina tienen un marcado efecto en la incidencia de la infección humana. Se puede citar como ejemplo lo ocurrido en Dinamarca, donde se notificaban alrededor de 500 casos

ICA. Grupo de Control y Erradicación de Riesgos Zoosanitarios. Boletín divulgativo. pág.22. 2002 Ibíd. , p. 30 9 RAMÍREZ M, J Sigal. Macrophages and Dendritic Cells use the cytosolic pathway to rapidly Cross-Present antigen from live, vaccinia-infected cells. J Immunol 169, 6733-6742.2002 8

por año entre 1931 y 1939, la erradicación de la Brucelosis en animales, condujo a la erradicación de esta enfermedad en humanos en 196210. En Chile, el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) inició el control de la Brucelosis bovina en 1975, como parte del Programa decenal de salud animal, y en 1982 inició el Sistema de Certificación de Predios Libres de Brucelosis en las regiones ganaderas IV a X. El impacto del Programa se evidencia, con la disminución de la prevalencia de la Brucelosis bovina de 7% (1975) a 2.9%(1982). No obstante, la estabilización de la prevalencia (2.4% en 1991 preocupó a las autoridades del SAG razón por la cual en 1991 se inició un Programa de Erradicación de la Brucelosis bovina en el país11.

Esta enfermedad es de notificación obligatoria en muchos países, sin embargo, las estadísticas oficiales no reflejan el número real de personas infectadas, por lo que se estima que la verdadera incidencia sería de 10 a 25 veces más alta que la indicada. Los casos a menudo no son reconocidos y son tratados como “fiebre de origen desconocido12”.

En Chile, en los últimos 17 años, las Tasas de Notificación se han mantenido fluctuantes, entre 0.01 por cien mil hab. (1984 y 1986) y 0.21 por cien mil hab. (1984 y 1986) y 0.21 por cien mil hab.(1991). En 1997, la tasa alcanzó a 0.09 casos, ligeramente superior al año anterior, tal como se indica en el Gráfico Nº 1:

ROCHA. Jornada de actualización sobre la Brucelosis Bovina. 2003 ANUARIO DE ENFERMEDADES DE NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA (1987 – 1996). Base de datos Dpto. de Coordinación e informática. Elaboración Dpto. De epidemiologia. MINSAL.120 p. 1998. 12 Ibíd. Op.c. 120 p. 11

Gráfico 1: Tasas de notificación (por cien mil habitantes) de brucelosis chile 1980-1997

Fuente: Anuario de enfermedades de Notificación obligatoria (1987 – 1996). Base de datos Dpto. de coordinación e informática. Elaboración Dpto. de epidemiología. 1998. MINSAL El aumento en las Tasas de Notificación del último decenio, en relación al anterior, se debe probablemente tanto a una mejoría en la notificación como un mejor diagnóstico de la enfermedad, más que a un aumento real de la misma. En relación a la mortalidad por esta zoonosis, en Chile, entre 1990 y 1996 no se registraron muertes por esta causa13.

1.1.2 Situación de Brucelosis en Colombia En Colombia la brucelosis es una enfermedad zoonótica de notificación obligatoria, sin embargo no tiene un sistema de vigilancia epidemiológica

AGUIRRE. Antonio. CORPAS, Antonio; GOMEZ; Daniel. Epidemiologia de la brucelosis bovina en establecimientos productores de leche. 2000. Pp. 345 - 348

adecuado. No existen estudios de brucelosis humana en el departamento del Cauca.

La cuenca lechera del Departamento del Cauca, suroeste de Colombia, ha sido una de las zonas donde el ICA (Instituto Colombiano Agropecuario) ha realizado estudios para la detección de brucelosis bovina encontrando en el año de 2003 una prevalencia del 5% en los municipios de Piendamó, Timbío, Popayán, Puracé, Sotará, Totoró y Silvia14.

No sucede lo mismo con la brucelosis humana donde existe subnotificación y sub registro de casos, debido entre otras causas, a las formas inespecíficas en las que se presenta de la enfermedad, diagnósticos imprecisos, problemas en la captación de casos a nivel local y a que solo un porcentaje de los enfermos acuden a los centros de salud o clínicas15.

La brucelosis humana, al igual que la tuberculosis, es una infección granulomatosa crónica cuyo agente causal es una bacteria intracelular. Brucella es una proteobacteria clásicamente clasificada en seis especies, cuatro de las cuales son reconocidas como agentes causales de zoonosis humana: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. cannis. La enfermedad, insidiosa y multiforme, necesita tratamiento antibiótico. En los países desarrollados se han desarrollado programas exitosos en la erradicación de la enfermedad y se la considera como una enfermedad importada16.

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO I.C.A. Brucelosis. En: Sistema de información y vigilancia epidemiológica. Colombia Sanidad Animal I.C.A., Informe Técnico. Publicación del Instituto Colombiano Agropecuario. Bogotá D.C. 2004. p. 21- 22. 15 FLOREZ, R. Epidemiología de la brucelosis bovina en México. 2do. Simposio Internacional de Brucelosis Villahermosa, tabasco. México. 13 – 14 de noviembre 2003. 16 PAPPAS. G, Akritidis, N, Bosilkovski, M, Tsianos, E, Brucellosis, N Engl J Med. Pag. 88 .

En Colombia según la literatura se han realizado estudios esporádicos sobre brucelosis humana. En 2003 se notificaron en el país 238 casos 17. En un estudio realizado en el departamento de Caldas, se encontró una prevalencia de brucelosis de 16.3% en los trabajadores de los mataderos. En Casanare se realizó un estudio de incidencia de brucelosis en los vacunadores que participaron en las campañas de vacunación contra la brucelosis bovina, encontrando una tasa de14%18. En el Cauca no existe hasta el momento un programa estructurado de vigilancia epidemiológica de brucelosis humana, al contrario de lo que sucede en la población bovina donde se toman medidas de prevención, vigilancia y control. Se ha observado que la vigilancia epidemiológica en brucelosis bovina tiene efectos positivos en el control de la diseminación de la brucelosis en humanos. El objetivo del presente estudio es determinar la prevalencia de brucelosis humana en la población expuesta –trabajadores de mataderos- de los principales municipios de la cuenca lechera del Cauca, así como determinar los factores de riesgo de tipo biológico posiblemente relacionados con la presentación de esta zoonosis19.

Los resultados de los diagnósticos arroja para el año 2009, una positividad del 3.8% en bovinos y 20 % en predios. Año 2002 positividad en predios 25% y en bovinos 6.5%.el país tiene dos zonas libres año 2009 provincia de García Rovira en el departamento de Santander y año 2010 municipio de Cobeñas sucre. En Boyacá Debido a que la brucelosis bovina es una enfermedad zoonotica muy contagiosa, se vio la necesidad de investigar la situación de la población humana frente a la enfermedad en un municipio como San Miguel de Sema (Boyacá) que

Ibid.opc. p. 52 PARRADO, A. Incidencia de brucelosis en personas que laboran aplicando la vacuna de brucelosis bovina en el Departamento de Casanare. Villavicencio. Trabajo de grado Epidemiología General. Universidad de los llanos. Facultad de Ciencias de la Salud. 2004. 180 P. 19 CORBEL,M. Brucellosis and overview. Emerg infect Dis.1997. pp. 213 – 221. 18

es zona endémica. Ya que la atención se ha centrado ganaderías y han dejado a un Lado la salud de los trabajadores pecuarios20.

La prevalencia serológica de Brucella spp. Encontrada fue de un 7.3% para el año 2003, lo que muestra que la vacunación contra brucelosis bovina está funcionando, protegiendo a la población humana de posibles contagios. Los ordeñadores afectados fueron hombres mestizos con edades entre 19 y 52 años, que asistían partos en fincas con más de 100 animales y consumían lácteos sin pasteurizar. Los síntomas más frecuentes fueron fiebre, dolor de huesos, sudoración excesiva y cefalea21.

La distribución geográfica de la enfermedad encontrada en San Miguel de Sema fue más baja de lo esperado, pues solo se localizo en las veredas Hato Viejo con un 66.7% donde los casos fueron agudos y Sabaneca con un 33.3% Que coincidió con la presentación de los casos crónicos22.

1.2. MARCO TEÓRICO 1.2.1

Origen de la bacteria

La Brucella abortus proviene de las proteo bacterias Alpha genéticamente relacionadas con los fitopatogenos y simbiantes de los géneros agrobacterium y rhyzobium, asi como patógenos animales como bartonella y a bacterias oportunistas del suelo23.

CAMACHO. Garzon. Hugo Felipe, Ninfa Tambo Maldonado; Estudio de prevalencia serológica de Brucella spp. en ordeñadores de hatos lecheros del municipio de San Miguel de Sema-Boyacá en el año 2003. 21 GARZON, Hugo; GARZÓN, Ninfa; TAMBO Maldonado; Estudio de prevalencia serológica de Brucella spp. en ordeñadores de hatos lecheros del municipio de San Miguel de Sema-Boyacá. 2003. P. 35 22 Ibid. 35 p. 23 GONZALEZ, I.; Navarro, M. Prevalencia de la brucelosis en el personal de los mataderos en el departamento de Caldas. Trabajo de tesis de la Facultad de Medicina veterinaria. 1980. 84 p. 20

La brucelosis es una zoonosis cuya incidencia y prevalencia varían de un país a otro. La infección causada por la especie Brucella abortus es la que más frecuentemente afecta al ganado bovino, causando esterilidad en machos y abortos en hembras preñadas, lo que conduce a graves pérdidas económicas en países en los que es endémica. En países no desarrollados constituye además un problema sanitario para la población humana24. B. abortus es una bacteria Gram negativa con un lipopolisacárido (LPS) fuertemente inmunodominante, el que junto con la capacidad de sobrevivir en el interior de células fagocíticas constituyen sus principales factores de virulencia. La infección en humanos conduce a una enfermedad con tendencia a la cronicidad, con fiebre y malestar recurrentes que deterioran su calidad de vida y que además puede presentar complicaciones como artritis, meningitis, entre otras25. En el ganado bovino la bacteria se ubica en la placenta y órganos reproductores por su afinidad por el eritritol. La respuesta inmune frente a B. abortus, patógeno intracelular facultativo, depende principalmente de la activación de la inmunidad mediada por células, con la participación de células T CD4+ de tipo Th1, que secretan interferón gama (INF-γ), citoquina que estimula tanto la actividad bactericida de macrófagos como la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+. Estos últimos son capaces entonces de destruir células infectadas con Brucella26. La identificación de proteínas con demostrada capacidad inmune, entre las que se ha identificado la superóxido dismutasa Cu/Zn de B. abortus (SOD), ha permitido diseñar estrategias de vacunación basadas en componentes subcelulares, ya que la prevención de la diseminación de la brucelosis, basada en la vacunación con bacterias atenuadas de Brucella abortus cepa 19, cepa RB51 y cepa 45/20, no ofrece garantías de seguridad en su administración, ni tampoco permite la 24

GUZMAN I. E. Andrews, A. González. R Rivers, A. Cabrera, A. Oñate. Una vacuna ADN para la Brucellosis Boviba. Resúmenes del XIII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria. Valdivia. P. 325. 2004 25 FLOREZ, R. Epidemiología de la brucelosis bovina en México. 2do. Simposio Internacional de Brucelosis Villahermosa, tabasco. México. 1 Noviembre 2003.PP. 13 – 14. 26 GONZALEZ. Ibid. Opc. p. 85

completa erradicación del microorganismo patógeno. En la actualidad las nuevas tendencias en investigación acerca de vacunas se están desarrollando en base a moléculas de ácidos nucleicos, como las vacunas ADN y las vacunas ARN27.

1.2.2 Distribución geográfica. La brucelosis tiene una distribución geográfica limitada, siendo un problema importante

Mediterráneo,

de África y Latinoamérica,

especialmente

oeste en

de Asia y

países

con

algunas bajos

zonas recursos

económicos. En el centro y norte de Europa y en Australia la infección por Brucella abortus ha sido prácticamente erradicada. En Norteamérica, la brucelosis es especialmente prevalente en las zonas agrícolas del norte y centro de México, mientras que en Canadá y Estados Unidos ha disminuido considerablemente en los últimos años. B. abortus está presente en todos los países de América Central, siendo la prevalencia de un 4 a un 8% . En Sudamérica se encuentra en varios países, donde en muchos casos es endémica y un problema sanitario importante28.

CORBEIL L, T Inzana, K Nielsen, R Jacobson, R Corbeil, A Winter. Killing of Brucella abortus by bovive serum. Infect Immun 56, 1998. Pp. 3251 – 3261. 28 CORBEIL L, T Inzana, K Nielsen, R Jacobson, R Corbeil, A Winter. 1998. Killing of Brucella abortus by bovive serum. Infect Immun 56, 1998. Pp. 3251 – 3261.

1.3 PATOGENIA

El microorganismo llega a las mucosas donde persiste por un tiempo no determinado; estos tejidos vienen a ser la primera barrera de defensa que opone el animal a la infección. Si la Bacteria logra sobrepasarla es transportado, por células sanguíneas hasta los ganglios linfáticos regionales vecinos a la puerta de entrada, los cuales constituyen la segunda barrera de defensa a la infección. Si el microorganismo no es lo suficientemente virulento, es detenido en este sitio por los mecanismos celulares de defensa, la infección desaparece y probablemente no hay una respuesta a pruebas serológicas en el animal. El animal puede desarrollar una inflamación de los ganglios vecinos a las mucosas que han servido como punto de entrada29. Si el número de Brucelas o su virulencia son suficientes, sobrepasa las defensas celulares y así llegar a otros sitios del organismo animal localizándose en órganos, como el hígado, glándula mamaria, bazo y ganglios linfáticos. Si la vaca está en gestación, el útero recibe la bacteria procedente de los órganos infectados. El endometrio gestante produce eritritol, sustancia que estimula el crecimiento de la Brúcela, el cual es entonces responsable de la localización de la infección en estos tejidos, produciendo como consecuencia una endometritis ulcerativa30. Como consecuencia de estas lesiones sobreviene el aborto, que puede presentarse en cualquier época pero más usualmente en los últimos tres meses de gestación, siendo el período de incubación inversamente proporcional al estado de desarrollo del feto al tiempo de la infección, es decir mientras más avanzada esté la 29

GUZMAN I. EAndrews, A. GONZALEZ. R Rivers,A. CABRERA,A. OÑATE. . Una vacuna ADN para la Brucellosis Boviba. Resúmenes del XIII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria. Valdivia. 2004.p. 130 30 ZHAN Y, A Kelso, C Cheers. Differential activation of Brucella-reactive CD4+ T cells by Brucella infection or immunization with antigenis extracts. Infect Immun 63, 969-975. 1995.

gestación el período de incubación para producir el aborto es menor, probablemente debido al efecto protector que ejerce la placenta hasta la mitad de la gestación31. Durante y después que se ha presentado el aborto, Brucella abortas retorna a los ganglios linfáticos y a la ubre, en estos sitios permanece hasta cuando se presenta una nueva preñez, durante la cual los organismos pasan al sistema sanguíneo y llegan de nuevo al útero con el fin de producir el aborto32.

Durante este segundo ciclo las bacterias se encuentran en la sangre y en diferentes tejidos del feto y la madre una mayor resistencia a la infección. Este fenómeno trae como consecuencia un incremento de las probabilidades que el ternero llegue a término y nazca; por lo tanto, si no existe una lesión secundaria que comprometa el sistema reproductivo, la vaca a pesar de continuar positiva a la infección tiene temeros relativamente sanos y la producción de leche es normal. Obviamente estos animales constituyen la principal fuente de infección para los animales jóvenes susceptibles, perpetuándose de esta manera la infección en el hato33. En humanos la infección se produce a través del contacto con secreciones de animales infectados o consumo de leche cruda o queso contaminado. El consumo de carne no es una fuente de contaminación. Brucella puede ingresar al organismo a través de lesiones de la piel, mientras se manipulan animales infectados o sus desechos34. En países en que la infección por Brucella es endémica en la población animal, la infección por Brucella en humanos es

MANDELL G, J Bennet, R Dolin. Principles and practice of infectious diseases. 4 th ed. Vol 2. Churchill Livingstone. Philadelphia, USA, 1995. Pp. 2053-2057. 32 GUZMAN I. EAndrews, A. GONZALEZ. R Rivers,A. CABRERA,A. OÑATE. . Una vacuna ADN para la Brucellosis Boviba. Resúmenes del XIII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria. Valdivia. 2004.p. 130 33 GUZMAN I. Ibid. P. 131 34 MANDELL. Ibid. p. P. 2055

frecuente35, sin embargo, la transmisión persona a persona es extremadamente inusual36. La enfermedad puede ser adquirida por exposición ocupacional de los trabajadores de mataderos, carniceros y veterinarios, al inhalar aerosoles contaminados o en viajes a lugares donde la infección es endémica37 . Las infecciones asociadas al trabajo de laboratorio representan el 2% de los casos y se ha informado que el período de incubación de la brucelosis adquirida por accidente en el laboratorio puede variar entre seis semanas a cinco meses38 .

ROOP II R,T Fletcher, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Identification of an immunoreactive Brucella abortus HtrA stress response protein homolog. Infect Immun 62, 1000-1007.1994 36 Fiori P, S Mastrandrea, P Rappelli, P Cappuccinelli. Brucella abortus infection acquired in microbiology laboratories. J Clin Microbiol P. 38. 2006. 37 YAGUPSKY P. Detection of Brucellae in blood cultures. J Clin Microbiol 37, 3437-3442.1999 38 Ibid. 28.

1.4 MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMATICO 1.4.1 Mapa de Distribución Geográfica Imagen 1. Mapa de distribución geográfica del Municipio de Miraflores Boyacá

Fuente: Secretaria de Planeación e Infraestructura.39

ALCALDÍA DE MIRAFLORES. Plan de desarrollo 2011. Obtenida el 03 de Marzo de 2011.p. 5 - 6.

El municipio esta localizado al sur oriente del departamento de Boyacá a 1.500 metros sobre el nivel del mar, en la Región Andina y comprende zonas predominante montañosas que hacen parte de la Cordillera Oriental; tiene una extinción de 258 kilómetros cuadrados, limitando al oriente con los municipios de Berbeo y Páez, al occidente con el municipio de Garagoa, por el norte con el municipio de Zetaquira y al sur con el municipio de Campohermoso 40.

Miraflores es el municipio más importante de la Provincia de Lengupá. Esta Provincia comprende los municipios de Berbeo, Campohermoso, Páez, San Eduardo,

Rondón

Zetaquira.

Miraflores

capital

provincia.

La población Mirafloreña está compuesta por 9.901 habitantes distribuidos en la zona rural y urbana, según el dato de población SISBEN año 2005.

Tiene como límites climáticos una temperatura media de 18 a 24 ºC y un promedio anual de lluvias entre 2000 y 3000 mm. 

LATITUD: La población está situada a 5º, 14 minutos y 0 segundos de latitud norte y a 0º, 44 minutos y 0 segundos de longitud del meridiano de Bogotá.



ALTITUD: 1.432 Metros



EXTENSIÓN: 258 Km cuadrados.



POBLACIÓN: 12.450 Habitantes



DISTANCIA DE TUNJA: 84 kms.



TEMPERATURA: 20 Grados centígrados.



VEREDAS: se divide en las siguientes veredas: Ayatá, arrayán, Buenos Aires, Centro, Capellanía, Chapasia, Estancia y Tablón, el Guamal, El Hato, Laderas,

ALCALDIA. Miraflores. Geografía del Municipio de Miraflores Boyacá, Obtenida el 03 de Marzo de 2011. En http://www.alcaldiamiraflores.gov.co/geografia.htm

Matarredonda, Miraflores, El Morro, Pueblo y Cajón, rusa, Suna-Abajo, SunaArriba y Tunjita. 

ESTADISTICA DE SALUD: Miraflores cuenta con un Hospital de Segundo Nivel, para una capacidad de 32 camas.

EXTENSIÓN GEOGRÁFICA41 Miraflores cuenta con una extensión de 265 Km2 de los 23.189 del total del departamento de Boyacá; con una densidad 2 demográfica de 36,46 hab./Km 

CLIMA

El municipio registra las más altas 1.6. Clima. Temperaturas durante los primeros cuatro meses del año

(enero, febrero, marzo y abril),

alcanzado una de

temperatura de 32°C. y las más bajas en el periodo se Junio a Agosto, llegando a los 17.5°C, considerando que el municipio conserva una temperatura bastante uniforme42. El clima en promedio es de 23°C en el casco Urbano; en la zona Rural es muy variado, ya que cuenta con, es cuatro pisos térmicos: páramo, frío, medio y cálido de tener en cuenta que en los últimos cinco años el clima ha variado grandemente debido al fenómeno del calentamiento global43 

SECTOR PECUARIO

El renglón pecuario genera un 40% de los ingresos brutos del sector rural. 

Bovinos

En bovinos predomina la explotación de doble propósito, que produce terneros para ceba dentro y fuera del municipio (Páez y Barbeo),

la leche se la

CONSEJO MUNICIPAL DE MIRAFLORES. Plan de Desarrollo 2008 – 2011. Acuerdo N° 010 del 5 de Junio de 2008. Tomado el dia 12 de Mayo de 2011. En: www.alcaldia.mirafloresboyaca.gov 42 Ibid. 43 Ibid.

comercializa cruda para la población urbana y para elaboración de quesos y cuajadas44. Predominan las razas normandas, cruces con Cebú, pardo suizo, holstein y criollos; la población ganado del municipio se encuentra en 13000 bovinos según Comité de Ganaderos45. Reportados por el Comité de Ganaderos según programa de vacunación de noviembre y diciembre de os 2007 se reportaron un total de 10.943 bovinos, de los cuales 58% son hembras y el 42% son machos, existe alrededor de 2.057 bovinos no reportados al Comité46. Los últimos 10 años la Administración han desarrollado la inseminación Artificial, teniendo un cubrimiento anual de 30 inseminaciones efectivas. También el comité de ganaderos con la coordinación de FABEGAN y el apoyo del municipio realiza la vacunación contra fiebre aftosa y brucella, siendo incluido para declarar el municipio como libre de aftosa con vacunación47.

PLAN DE DESARROLLO 2008 – 2011.Alcaldia Municipal Miraflores. Tomado el día 02 de Abril de 2011 45 CONSEJO MUNICIPAL DE MIRAFLORES. Plan de Desarrollo 2008 – 2011. Acuerdo N° 010 del 5 de Junio de 2008. Tomado el dia 12 de Mayo de 2011. En: www.alcaldia.mirafloresboyaca.gov 46 PLAN DE DESARROLLO. Ibid. Opc 47 CONSEJO MUNICIPAL. Ibid. Opc. 45

Tabla 1. Ganadería del municipio de Miraflores Boyacá CANTIDAD

EDAD

DESCRIPCION

TERNERAS

Menores de 1 año

992

HEMBRAS

1-2 años

1198

Menores de tres

3141

años

MACHOS

TOTAL HEMBRAS

6442

Menores de 1 año

1010

1-2 años

1074

2-3 años

1339

Mayores de 3 años

1078

TOTAL MACHOS

4501

FUENTE: Comité de Ganaderos Miraflores En los datos presentes del sector bovino, se observa que el mejoramiento genético avanza en 1% anual, lo que se necesita 30 años para avanzar el 30 %. La

producción potencial Láctea es de 12.000 litros con un consumo de 3.000

litros; necesitando incentivar desarrollar la comercialización, procesamiento y

apoyo en infraestructura, nutrición y logística

para explotar este renglón que

genera ingresos permanentes a los productores ganaderos48.

1.5 IMPORTANCIA DE LA BRUCELOSIS.

La brucelosis es una enfermedad endémica en muchos países. Afecta la sanidad, la producción y además tiene una importante repercusión económica en el comercio internacional de animales y productos. Ocasiona significativas pérdidas en la producción pecuaria debido a que induce abortos, metritis, infertilidad y el nacimiento de animales débiles. Por otro lado, constituye un importante problema para la salud pública ya que la mayoría de las bacterias tales como brucella suis, brucella melitensis pertenecientes a dicho género son patógenas para el hombre quien adquiere La infección por el consumo de leche no pasteurizada y sus derivados, o por el contacto con material infeccioso49 .El control de la brucelosis se apoya en la identificación de los animales infectados y en la eliminación de los mismos.

Así mismo, la vacunación de los animales indemnes constituye un importante pilar en un plan de control para que en una etapa posterior, la enfermedad pueda ser erradicada50.

1.6 IMPORTANCIA ECONÓMICA Pérdidas de 10 a 20% en la producción animal, aborto, nacidos muertos, repetición de celos, distocias, retención de placentas, terneros débiles, caquéxicos, disminución en la producción de leche, reducción de vida productiva, 48

CONSEJO MUNICIPAL DE MIRAFLORES. Plan de Desarrollo 2008 – 2011. Acuerdo N° 010 del 5 de Junio de 2008. Tomado el dia 12 de Mayo de 2011. En: www.alcaldia.mirafloresboyaca.gov 49 OLSEN & STOFFREGEN, Responses of adult cattle to vaccination with a reduced dose of Brucella abortus strain RB51. Res Vet Sci 69, 2005. 135-140. 50 NICOLETTI P, ; Minas.A short history of brucellosis.vet.microbiol, 2002. P. 1-4

costos de reposición de animales, limitación en el comercio de animales y productos51.

1.7 INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD EN COLOMBIA

Por datos recogidos en diversas entidades y teniendo en cuanta el número de muestras examinadas, se puede apreciar que el índice de infección en el ganado bovino fluctúa entre un 15 y un 20%, lo cual trae consigo, disminución en la producción de leche, perdidas de crías , pérdidas de lactancias, eliminación de toros y vacas. Elevados costos en asistencia técnica y tratamientos infectivos, si la población actual se calcula en 20 millones de bovinos, se puede afirmar que 3 a 4 millones están infectados52. 1.8 IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA Zoonosis mas diseminada en el mundo, el hombre se infecta por contacto directo; los mayores grupos de riesgo son pastores, veterinarios, trabajadores de la industria de carne, y trabajadores de laboratorios53.

1.9 MECANISMOS DE TRASMISIÓN Fuente de infección: animales infectados, Vías de transmisión: agua, pasturas, y fómites contaminados, semen, leche, derivados crudos, Vías de eliminación: feto y anexos fetales, secreciones vaginales, leche, semen, heces, orina54. 51

ADEMIR. de Lucas, “Simulação de impacto económico da brucelose bovina em rebanhos produtores de leite das regiões Centro Oeste Sudeste e Sul do Brasil” (São Paulo: São Paulo, 2006 52 INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO. ICA. Brucelosis. En: Sistema de información y vigilancia epidemiológica. Colombia Sanidad Animal. I.C.A., Informe Técnico.Publicación septiembre de 2004. 53 SIMULAÇÃO DE IMPACTO ECONÔMICO DA BRUCELOSE BOVINA. em rebanhos produtores de leite das regiões Centro Oeste Sudeste e Sul do Brasil” São Paulo: São Paulo, 2006. p. 452 .

1.10 INMUNIDAD FRENTE A BRUCELLA

1.10.1 Inmunidad natural. En estados tempranos de la infección por Brucella, el rol de la respuesta innata es reducir el número inicial de bacterias promoviendo una respuesta Th1 en el huésped55. Los macrófagos, los neutrófilos, las células Natural Killer (NK) y el complemento juegan un rol clave en esta fase temprana de la respuesta a la invasión frente a este microorganismo56. 1.10.2. Macrófagos. Los macrófagos juegan un rol central en la respuesta inmune frente a Brucella, ya que actúan como células fagocíticas profesionales y como células presentadoras de antígenos. Procesan antígenos en sus compartimentos intracelulares y los presentan en el contexto del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) a linfocitos T, promoviendo de esta manera la respuesta inmune adaptativa 57 . En este sentido, se ha encontrado que el LPS de Brucella interfiere con la vía de presentación de antígenos por MHC clase II58. Las funciones bactericidas de los macrófagos frente a Brucella se encuentran centradas en la actividad de las

Ibid. Opc. p. 452. KO J, G SPLITTER. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin Microbiol Rev 16. 2003,pp. 65-78. 56 GOLDING B, D SCOTT, O Scharf, L Huang, M Zaitseva, C Lapham, N Eller, H Golding. Immunity and protection against Brucella abortus. Microbes Infect 3, 2001. Pp. 43-48.. 57 FROLOV I, T Hoffman, B Pragai, S Dryga, HV Huang, S Schlesinger, CM Rice. Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications.Proc Natl Acad Sci USA 93, 1996. Pp. 11371-11377. 58 MURPHY E, G Robertson, M Parent, S Hagius, R Roop II, P Elzer, C Baldwin. Major histocompatibility complex class I and II expression on macrophages containing a virulent strain of Brucella abortus measured using green fluorescent protein-expressing brucellae and flow cytometry.FEMS Immunol Med Microbiol 33, 2002. Pp. 191-200. 55

especies reactivas de oxígeno59 y las especies reactivas de nitrógeno, las cuales son inducidas por IFN-γ y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α ) 60. Los receptores Toll-like (TLR) juegan un rol importante en el inicio de la respuesta inmune innata. Estos receptores presentes en células fagocíticas profesionales reconocen productos microbianos

uniéndose

directamente

ellos

inducen señales intracelulares que activan factores de transcripción (como NF-kB) que modulan la producción de citoquinas. Estos receptores pueden ser activados por diversos productos microbianos; el receptor Toll-like 4 (TLR4) es activado por LPS, el TLR9 por ADN bacteriano, el TLR2 por productos de la pared celular de bacterias Gram positivas y TLR5 por flagelina 61. 1.10.3. Neutrófilos. Los neutrófilos están implicados en el desarrollo de una defensa temprana frente a una infección por Brucella mediante la fagocitosis y posterior destrucción del microorganismo. En primer lugar, los neutrófilos son atraídos al sitio de la infección por estímulos químicos originados o derivados del microorganismo62 , para posteriormente fagocitar la bacteria, preferentemente opsonizada63 . Una vez que el patógeno es fagocitado, se desarrolla una serie de mecanismos destructivos en el neutrófilo, con el fin de eliminar la bacteria, mediante el aumento del consumo de oxígeno que lleva a la aparición de radical superóxido, peróxido de hidrógeno y otros radicales derivados del oxígeno, junto con la activación de la enzima mieloperoxidasa y la fusión del lisosoma con los fagosomas que contienen la bacteria, liberándose hidrolasa ácida, glicosidasa, proteasa y lipasa. Sin embargo, la bacteria ingerida puede sobrevivir al

OLIVEIRA S,N Soeurt, G Splitter . Molecular and cellular interactions between Brucella abortus antigens and host immune responses. Vet Microbiol 90, 2002. Pp. 417-424. 60 KO J, G SPLITTER. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin Microbiol Rev 16, 65-78.2003 61 VASSELON T, P Detmers. Toll receptors: a central element in innate immune responses. Infect Immun 70, 2002..pp. 1033-1041. 62 WILKINSON P. Leukocyte locomotion and chemotaxis: effects of bacteria and viruses. Rev Infect Dis 2, 1980.pp. 293-318. 63 YOUNG E, J BORCHERT, F KREUTZER, D Musher. Phagocytosis and killing of Brucella by human polymorphonuclear leukocytes. J Infect Dis 151, 1985..pp. 682-690.

mecanismo destructivo de los fagocitos64, gracias a moléculas de bajo peso molecular que inhiben el sistema antibacteriano mieloperoxidasa-peróxido de hidrógeno-haluro65. Por ello, aunque los neutrófilos son las primeras células relacionadas con la eliminación de patógenos extraños, ellos son considerados de baja eficiencia contra Brucella, ya que esta bacteria puede crecer y sobrevivir en su interior y además es diseminada a través de estos leucocitos a órganos y diferentes localizaciones, desarrollándose una infección persistente. 1.10.4. Células Natural Killer. Las células NK forman parte de la primera línea de defensa contra Brucella y una vez que son activadas pueden eliminar células infectadas. B. abortus puede activar la actividad lítica de las células NK, estimulando la producción de interleuquina- 12 (IL-12) por parte de las células presentadoras de antígenos. IL-12 además estimula a las células NK a secretar IFN-γ 66. 1.10.5. Complemento. Uno de los primeros eventos que ocurren después de la entrada de la Brucella al organismo es la activación del complemento por la vía alterna; sin embargo, se ha demostrado que esta vía es incapaz de eliminar la cepa virulenta de Brucella abortus 2308 67. Por lo tanto, la lisis de Brucella estaría mediada principalmente por la vía clásica del complemento, la cual es dependiente de anticuerpos68. 1.10.6 Inmunidad adaptativa. Está ampliamente aceptado que la inmunidad mediada por células es el mecanismo efector más relevante en la protección frente 64

SMITH H, R Fritzgeorge. The chemical basis of the virulence of Brucella abortus. V. The basis of intracellular survival and growth in bovine phagocytosis. Brit J Exp Path 45, 1964. Pp. 174-186. 65 CANNING P, J Roth, L Tabatabai, B Deyoe. Isolation of components of Brucella abortus responsible for inhibition of function in bovine neutrophils. J Infect Dis 1521985,pp. 913-921. 66 FERNÁNDEZ-Prada C, M Nikolich, R Vemulapalli, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig, T Hadfield, D Hoover. Deletion of wboA enhances activation of the lectin pathway of complement in Brucella abortus and Brucella melitensis. Infect Immun 69, 2001. Pp. 4407-4416. 67 EISENSCHENK F, J Houle, E Hoffmann. Mechanism of serum resistance among Brucella abortus isolates. Vet Microbiol 68, 1999. Pp. 235-44. 68 FERNÁNDEZ-PRADA C, M Nikolich, R Vemulapalli, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig, T Hadfield, D Hoover. Deletion of wboA enhances activation of the lectin pathway of complement in Brucella abortus and Brucella melitensis. Infect Immun 69, 2001. Pp.4407-4416.

a Brucella debido a que es un parásito intracelular. Las citoquinas son moléculas clave para una adecuada respuesta inmune mediada por células69 . La exposición prolongada de un animal a Brucella cambiaría la naturaleza de la respuesta inmune, desde una inmunidad mediada por células hacia una respuesta humoral (caracterizada por la producción de IgM e IgG1), respuesta que se relaciona con una disminución en la actividad de las células T ayudadoras tipo 1, con una baja en la producción de INF-γ, favoreciéndose de esta forma un incremento de la actividad de las células T ayudadoras de tipo 2, disminuyendo la respuesta inmune celular, lo que favorecería de esta forma el establecimiento de la enfermedad crónica (Oñate y col 2000). Las funciones de la respuesta inmune adaptativa en la brucelosis se basan principalmente en tres mecanismos. Primero, la producción de IFN-γ por células T CD4+, CD8+, y células T γδ, que activa la función bactericida en macrófagos. Segundo, la citotoxicidad de células T CD8+ y células T γδ que eliminan macrófagos infectados. Y tercero, isotipos de anticuerpos Th1, tales como IgG2a que opsonizan al patógeno para facilitar su fagocitosis70 En general, se considera que los anticuerpos bloqueadores no son efectivos en la respuesta inmune contra Brucella71. Sin embargo, los animales infectados con Brucella producen anticuerpos contra varios componentes bacterianos72, que interfieren en la eliminación del patógeno, especialmente aquellos anticuerpos específicos para el antígeno O y algunas porinas. En este sentido, los anticuerpos serían importantes en bloquear la liberación de cantidades demasiado elevadas de Brucella al medio extracelular.

OLIVEIRA S, J Harms, M Banai, G Splitter. Recombinant Brucella abortus proteins that induce proliferation and gamma-interferon secretion by CD4+ T cells from Brucellavaccinated mice and delayedtype hypersensitivity in sensitized guinea pigs. Cell Immunol 1996. Pp.172, 262-268. 70 KO J, G SPLITTER. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin Microbiol Rev 16 2003. pp, 65-78. 71 CORBEIL L, K BLAU, T Inzana, K Nielsen, R Jacobson, R Corbeil, A Winter. Killing of Brucella abortus by bovine serum. Infect Immun 56, 1988. Pp. 3251-3261. 72 TABATABAI L, S Hennager. Cattle serologically positive for Brucella abortus have antibodies to B. abortus Cu-Zn superoxide dismutase. Clin Diagn Lab Immunol 1, 1994. Pp.506- 510.

1.10.7. Linfocitos T CD4+ y CD8+. Después de la activación de los macrófagos, las células T inmaduras (Th0) se diferencian de células efectoras y de memoria, que están programadas para secretar distintos patrones de citoquinas73. Las células Th1 secretan interleuquina-2 (IL-2) e INF-γ, mientras que los linfocitos Th2 producen interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5) e interleuquina-10 (IL-10) 74. La generación de células Th1 de memoria sólo puede realizarse si la respuesta inicial al estímulo se asocia a la producción de IL-12 e IFN-γ 75. El rol principal de la secreción de IFN- γ por las células Th1 en la inmunidad contra Brucella es activar la función bactericida de los macrófagos y linfocitos T CD8+ citotóxicos, así como la estimulación de la secreción de IgG2a76. En términos numéricos, la población celular predominante es la de linfocitos T CD4+ productores de IFN-γ77 , responsables de la activación de macrófagos y la atracción de células inflamatorias efectoras, de ahí su importancia en promover la respuesta celular adquirida contra Brucella 78. Las células citotóxicas T CD8+ pueden actuar como células efectoras y eliminar macrófagos infectados con Brucella directamente79. Las células blancas son reconocidas por las células citotóxicas en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad de clase I (MHC I) y son eliminadas por la acción de perforinas y granzimas80.

GOLDING B, D Scott, O Scharf, L Huang, M Zaitseva, C Lapham, N Eller, H Golding. Immunity and protection against Brucella abortus. Microbes Infect 32001. Pp. 43-48. 74 ZHAN Y, A KELSO, C Cheers. Differential activation of Brucella-reactive CD4+ T cells by Brucella infection or immunization with antigenis extracts. Infect Immun 63, 1995. Pp. 969-975. 75 SCHARF O, I Agranovich, K Lee, N Eller, L Levy, J Inman, D Scott, B Golding. Ontogeny of Th1 memory responses against a Brucella abortusconjugate. Infect Immun 69, 2001. Pp. 5417-5422. 76 SCHARF O.Ibid. p. 44 77 EISENSCHENK. Ibid . 235. 78 BAE J, G SCHURING, T Toth. Mice immune responses to Brucella abortus heat shock proteins use of vaculovirus recombinant-expressing whole insects cells, purified Brucella abortus recombinant proteins, and a vaccinia virus recombinant as immunogens. Vet Microbiol 88, 2002. Pp. 189- 202. 79 OLIVEIRA S,N Soeurt, G Splitter. Molecular and cellular interactions between Brucella abortus antigens and host immune responses. Vet Microbiol 90, 2002. Pp. 417-424. 80 GOLDING B, D Scott, O Scharf, L Huang, M Zaitseva, C Lapham, N Eller, H Golding. Immunity and protection against Brucella abortus. Microbes Infect 3, 2001. Pp. 43-48.

1.10.8. Linfocitos T γδ. Las células T γδ representan una pequeña población de linfocitos, con un patrón único de reconocimiento de antígenos81 . En humanos, las células T γδ controlan el aumento en el número de microorganismos ya que secretan TNF-α e IFN-γ, después de ser activadas por antígenos no peptídicos, en su mayoría fosfoantígenos, los cuales no son presentados en el contexto del MHC82 . Mediante la secreción de estas citoquinas, activan la función bactericida de los macrófagos y, además, son capaces de lisar células infectadas por citotoxicidad directa in vitro. El rol de estas células in vivo aún no ha sido determinado

, aunque se cree que son parte de la inmunidad innata (Wyckoff

2002). En bovinos menores de un año, la población celular predominante es la de células T γδ y no la de células T αί, lo que sugiere que el rol de este tipo celular es más significativo en la infección del ganado con brucelosis (Ko y Splitter 2003). De todas maneras, en bovinos, la producción de IFN-γ por estas células es menor que la producida por las células CD4+ (Baldwin y col 2002). 1.10.9. Linfocitos B. Las células B son estimuladas directamente por las células T a través de la interacción de moléculas coestimulatorias como CD40 y su ligando CD40L presente en la célula T, lo cual, junto a las citoquinas liberadas, son importantes en promover el cambio de isotipo de IgM a IgG 84. Con respecto al rol que cumplirían los anticuerpos durante la infección por Brucella, se ha visto que tanto IgM como IgG, en bajas concentraciones, son capaces de promover la lisis de Brucella a través de la vía clásica del complemento85. También se han encontrado títulos elevados de IgG anti-SOD Cu/Zn en animales infectados, pero

Dieli F, F Poccia, M Lipp, G Sireci, N Caccamo, C di Sano, A Salerno. Differentiation of effector/memory Vd2 T cells and migratory routes in lymph nodes or inflammatory sites. J Exp Med 198, 2003. Pp. 391-397. 82 GIAMBARTOLOMEI G, M Delpino, M Cahanovich, J Wallach, P Balde, C Velikovsky, C Fossati. Diminished production of T helper 1 cytoquines correlates with T cell unresponsiveness to Brucella cytoplasmic proteins in chronic human brucellosis. J Infect Dis 186, 2002. Pp. 252-259. 83 KO J, G SPLITTER. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin Microbiol Rev 16, 2003. Pp. 65-78. 84 GOLDING B, D Scott, O Scharf, L Huang, M Zaitseva, C Lapham, N Eller, H Golding. Immunity and protection against Brucella abortus. Microbes Infect 32001. Pp. 43-48. 85 CORBEL M. Brucellosis: an overview. Emerg Infect Dis 3, 1997. Pp. 213-221.

aún no se determina si estos anticuerpos juegan un rol importante en la inmunidad contra Brucella 86. La opsonización acoplada al aumento de muerte de Brucella intracelular podría ser considerada como el principal rol de los anticuerpos contra la infección con Brucella87 .

Aunque

paradójicamente

brucelosis

bovina

alta

concentración de IgG durante la infección activa previene la lisis extracelular de la bacteria mediada por complemento y promueve la fagocitosis bacteriana, aumentando la localización intracelular de la bacteria y la extensión de la enfermedad88. 1.10.10. Citoquinas. Las citoquinas son moléculas clave en el control de la brucelosis, ya que permiten dirigir las respuestas hacia una respuesta inmune celular o humoral. B. abortus estimularía a las células presentadoras de antígenos para que secreten IL-12, la que induce a los linfocitos Th0 a diferenciarse en linfocitos Th1, secretores de IFN-γ89 Sin embargo, otros autores señalan que Brucella no es un inductor potente de la secreción de IL- 1290. IFN-γ participa en la regulación de los mecanismos defensivos de los macrófagos y es considerado un factor crucial para el desarrollo de la protección contra la infección por Brucella91. Interleuquina-18 (IL-18) citoquina sintetizada por macrófagos activados, también estimula la producción de IFN-γ, por lo que actúa sinérgicamente con IL-12 sobre las células T en la estimulación de la respuesta mediada por células contra Brucella92 .

TABATABAI L, S Hennager. Cattle serologically positive for Brucella abortus have antibodies to B. abortus Cu-Zn superoxide dismutase. Clin Diagn Lab Immunol 1, 1994. Pp. 506- 510. 87 GOLDING B. Ibid p. 45 88 Ibid opc. p. 46 89 Ibid opc. p. 47 90 PASQUALI P, R Adone, L Gasbarre, C Pistoia, F Ciuchini. Mouse cytokine profiles associated with Brucella abortus RB51 vaccination or B. abortus 2308 infection. Infect Immun 69, 2001. Pp. 6541-6544. 91 SCHARF O Ibid 5418 92 Ibid p. 508

TNF-α contribuye a la resistencia frente a Brucella por una vía independiente de IFN-γ, estimula el influjo de fagocitos al sitio de infección y participa en la activación de los macrófagos93 . IL-10, producida por linfocitos CD4+ Th2, macrófagos activados y algunas poblaciones de células B, inhibe la respuesta Th1, ya que disminuye la capacidad de presentar antígenos de los macrófagos e inhibe la secreción de IFN-γ, por lo tanto, aumenta la susceptibilidad a la infección por Brucella94. 2. VACUNAS CONTRA BRUCELLA ABORTUS. La prevención de la diseminación de la brucelosis se basa en la administración de vacunas adecuadas contra la infección por B. abortus. Con este objetivo se han utilizado clásicamente cepas bacterianas atenuadas y componentes antigénicos propios de la Brucella. La habilidad de un antígeno específico para inducir en forma preferencial una respuesta Th1 es un aspecto importante a considerar en el desarrollo de vacunas contra Brucella abortus95. 2.1. BACTERIAS ATENUADAS 2.1.1. Brucella abortus S19. La cepa 19 de Brucella abortus es una cepa lisa que posee la cadena O del LPS, por ello, en animales inmunizados con esta cepa se pueden observar anticuerpos específicos contra este antígeno del tipo IgG1, IgG2b e IgM96 . El defecto genético que permite la atenuación de esta cepa aún no ha sido definido, pero hace que pierda un mecanismo de virulencia esencial 97. Su

ZHAN Y, Z Liu, C Cheers. Tumor necrosis factor alpha and interleukin-12 contribute to resistance to the intracellular bacterium Brucella abortusby different mechanisms. Infect Immun 64, 1996. Pp. 2782-2786. 94 FERNÁNDEZ D, R Benson, C Baldwin. Lack of a role for natural killer cells in early control of Brucella abortus 2308 infections in mice Infect Immun63, 1995. Pp. 4029-4033. 95 STEVENS M, S Olsen, G Pugh. Lymphocyte proliferation in response to Brucella abortus 2308 or RB51 antigens in mice infected with strain 2308, RB51, or 19. Infect Immun 62, 1994. Pp. 4659-4663. 96 VEMULAPALLI R, Y He, S Cravero, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Overexpression of protective antigen as a novel approach to enhance vaccine efficacy of Brucella abortus strain RB51. Infect Immun 68, 2000. Pp. 3286-3289. 97 BRIONES G, N Iñon de Iannino, M Roset, A Vigliocco, P Silva, R Ugalde.. Brucella abortus cyclic ß-1,2glucan mutants have reduced virulence in mice and are defective in intracellular replication in HeLa cells. Infect Immun 69, 2001. Pp. 4528-4535.

efectividad en el ganado bovino depende de variables como la edad de vacunación, dosis, ruta de administración y de la prevalencia de la brucelosis en el rebaño vacunado98. Los anticuerpos inducidos por la vacunación con esta cepa interfieren con el diagnóstico tradicional de bovinos infectados con cepas silvestres de B. abortus, por lo que tiene un uso limitado en la vacunación del ganado; esta cepa puede también inducir aborto en hembras preñadas y es patógena para la especie humana99. 2.1.2. Brucella abortus 45/20. La cepa 45/20 es una cepa rugosa, fue desarrollada por 20 pasajes repetidos de Brucella abortus 45 en cobayos100. A pesar de que no induce anticuerpos contra la cadena O del LPS e induce una protección significativa contra la infección por Brucella abortus 101, no es muy utilizada porque es inestable y puede revertir a su forma virulenta in vivo . La cepa 45/20 también ha sido utilizada en forma inactiva, pero adicionada junto a un adyuvante oleoso, la que ha demostrado una relativa efectividad, pero provoca una reacción inflamatoria local en el sitio de la inyección102 . 2.1.3. Brucella abortus RB51. Brucella abortus RB51 es una cepa rugosa, resistente a rifampicina, que ha sido derivada de la cepa virulenta Brucella abortus 2308103 . Esta cepa es utilizada desde 1996 contra la brucelosis bovina en Estados Unidos y en otros países, como Chile. Es administrada en dosis que fluctúan entre 1x1010 y 4x1010 UFC por mililitro (Unidades Formadoras de

SCHURIG G,N Sriranganathan, M Corbel. Brucellosis vaccines: past, present and future. Vet Microbiol 90, 2002. Pp. 479- 496. 99 WHO. The Development of New/Improved Brucellosis Vaccines: Report of WHO Meeting with the participation of the Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO) and the Office International des Epizooties (OIE). World Health Organization. Geneva, Switzerland 11-12 December 1997. 100 CORBEIL L, K Blau, T Inzana, K Nielsen, R Jacobson, R Corbeil, A Winter. 1988. Killing of Brucella abortus by bovine serum. Infect Immun 56, 1988. Pp. 3251-3261. 101 BRIONES. Ibid opc. p. 4529 102 MCDONEL J. 1990. Brucella vaccines. In, A. Mizrahi, ed. Advances in Biotechnological Processes, Vol 13.BACTERIAL VACCINES. Pp. 105-122. Wiley-Liss Publishers, New York, NY.1990 103 SCHURIG G,R Roop II, T Bagchi, S Boyle, D Buhrman, N Sriranganathan. Biological properties of RB51: a stable rough strain of Brucella abortus.Vet Microbiol 28, 1991. Pp. 171-188.

Colonias) en bovinos no menores de 4 meses de edad104 . La protección que proporciona la vacunación con esta cepa se debe a la activación de linfocitos T

105

La vacunación induce altos niveles de IFN-γ, lo cual es fundamental en las etapas primarias de la infección106. La inoculación intraperitoneal de B. abortus RB51 en ratones resulta en una colonización del bazo que desaparece luego de cuatro semanas post inmunización107 . La vacunación del ganado permite la diferenciación entre bovinos vacunados y aquellos infectados con cepas silvestres debido a que no induce anticuerpos contra la cadena O del lipopolisacárido 108. Sin embargo, se ha determinado que puede causar placentitis, endometritis e infección fetal, en vaquillas adultas que han sido vacunadas durante la preñez109. Basándose en reportes sobre la efectividad de la proteína SOD Cu/Zn de B. abortus expresada en E. coli DH5α en proteger a ratones vacunados del desafío con la cepa patogénica de B. abortus 2308110, Schurig y col desarrollaron una nueva cepa de B. abortus RB51, que sobre expresa la proteína SOD Cu/Zn de Brucella (B. abortus RB51-SOD)111. La inmunidad protectora proporcionada por la cepaB. Abortus RB51-SOD contra Brucella es superior a la de B. abortus RB51, cepa parental, sin alterar las características de atenuación de la vacuna.

104

OLSEN & STOFFREGEN, Responses of adult cattle to vaccination with a reduced dose of Brucella abortus strain RB51. Res Vet Sci 69, 2005. Pp. 135-140. 105 STEVENS M, S Olsen, G Pugh.Lymphocyte proliferation in response to Brucella abortus 2308 or RB51 antigens in mice infected with strain 2308, RB51, or 19. Infect Immun 62, 1994. Pp.4659-4663. 106 PASQUALI P, R Adone, L Gasbarre, C Pistoia, F Ciuchini. Mouse cytokine profiles associated with Brucella abortus RB51 vaccination or B. abortus 2308 infection. Infect Immun 69, 2001. Pp. 6541-6544. 107 SCHURIG G,R Roop II, T Bagchi, S Boyle, D Buhrman, N Sriranganathan. Biological properties of RB51: a stable rough strain of Brucella abortus.Vet Microbiol 28, 1991. Pp. 171-188. 108 SCHURIG. Ibid p. 88 109 LOPETEGUI P. Erradicación de brucellosis bovina en Chile. Experiencia en el uso de la vacuna cepa RB51. En: Luna- Martínez E, F Suárez-Guemes (eds). III Foro Nacional de brucelosis, Acapulco. Anonymous. México.1998 Pp 159-179. 110 OÑATE A, R Vemulapalli, E Andrews, G Schurig, S Boyle, H Folch. Vaccination with live Escherichia coli expressing Brucella abortus Cu/Zn superoxide dismutase protects mice against virulent B. abortus. Infect Immun 671999. Pp. , 986-988. 111 VEMULAPALLI R, Y He, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Brucella abortus RB51: enhancing vaccine efficacy and developing multivalent vaccines. Vet Microbiol 90,2002.pp. 521-532.

2.2. VACUNAS SUBCELULARES Se han probado distintos antígenos de Brucella en su capacidad de inducir respuesta inmune mediada por células. Estos antígenos forman parte de la estructura de la bacteria, como la lipoproteína de 18 kDa presente en la superficie de Brucella , la proteína periplásmica P39, la proteína bacterioferritina (Al-Mariri y col 2001b) y la proteína ribosomal L7/L12, que produce una protección equivalente a la alcanzada con la cepa 19 de B. abortus en ratones, con activación de células T CD4+ que secretan niveles significativos de IFN-γ

112

. Las proteínas

bacterioferritina y P39 no producen niveles significativos de protección contra Brucella, aunque se utilicen adyuvantes como CpG en su administración113. También se han probado proteínas de choque térmico, como las proteínas UvrA, GroEL, GroES y HtrA de B. abortus114 , ya que se ha encontrado que éstas son altamente inmunogénicas en el curso de la infección con Brucella, estimulando tanto la inmunidad celular como la inmunidad humoral en el huésped infectado 115; sin embargo, no son capaces de estimular una respuesta inmune protectora eficiente frente a la infección con Brucella 116. A partir del extracto de proteínas totales de B. abortus RB51 se purificaron dos proteínas: una de 22,9 y otra de 32,2 kDa, de las cuales sólo la proteína de 22,9 kDa demostró ser capaz de otorgar cierto grado de protección (Céspedes y col 2000). Los mejores resultados se han obtenido con la proteína de 18,5 kDa, SOD Cu/Zn de B. abortus, que es capaz de

112

OLIVEIRA S, Y Zhu, G Splitter. Recombinant L7/L12 ribosomal protein and gammairradiated Brucella abortus induce a T-helper 1 subset response from murine CD4+ T cells. Immunology 83, 1994 . pp. 659-664. 113 AL-MARIRI A, A Tibor, P Mertens, X de Bolle, P Michel, J Godfroid, K Walravens, J Letesson. 2a. Protection of BALB/c mice against Brucella abortus 544 challenge by vaccination with bacterioferritin or P39 recombinant proteins with CpG oligodeoxynucleotides as adjuvant. Infect Immun69, 2001. Pp. 48164822. 114 OLIVEIRA S, G Splitter. Immunization of mice with recombinant L7/L12 ribosomal protein confers protection against Brucella abortus infection.Vaccine 14, 1996. Pp. 959-962. 115 ROOP II R,T Fletcher, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Identification of an immunoreactive Brucella abortus HtrA stress response protein homolog. Infect Immun 62, 1994. Pp.10001007. 116 BAE J, G SCHURING, T TOTH. Mice immune responses to Brucella abortus heat shock proteins use of vaculovirus recombinant-expressing whole insects cells, purified Brucella abortus recombinant proteins, and a vaccinia virus recombinant as immunogens. Vet Microbiol 88, 2002. Pp. 189- 202.

inducir una respuesta celular de tipo Th1, con inducción de la producción de IFN-γ e IL-2, pero no de IL-4117 y además la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora.

NUEVAS

TENDENCIAS

GENERACIÓN

VACUNAS

PARA BRUCELLA. En los últimos años han surgido dos nuevas estrategias de inmunización altamente efectivas, basadas en la vacunación con moléculas de ácidos nucleicos, generándose la aparición de las vacunas de tercera generación, que son las vacunas ADN y las ARN, aplicándose este tipo de estrategia para la infección por Brucella118. 3.1. VACUNAS ADN La inmunización con vectores de expresión plasmidial se basa en la expresión in vivo de algún antígeno seleccionado, que induciría una respuesta inmune protectora, y tienen algunas de las ventajas que presenta el uso de los patógenos viva o atenuada, pero sin el riesgo de la infección119. En principio, el método de vacunación con ácidos nucleicos se basa en el uso de un plásmido bacteriano que tiene un promotor viral fuerte capaz de expresarse en células eucariontes, un gen que codifica para un antígeno seleccionado y una secuencia de término de la transcripción o poliadenilación. El plásmido se replica en una bacteria (E. coli), se purifica y luego se inyecta por una vía determinada en el huésped. Las células del huésped son capaces de sintetizar, procesar y presentar el antígeno a los linfocitos, originando eventualmente una respuesta de células T y B específicas 117

OÑATE A, H Folch. Proteína de 18.5 kDa: un antígeno interesante en Brucella. Arch Med Vet 27, 1995. Pp. 93-102. 118 BAE J, G SCHURING, T Toth. Mice immune responses to Brucella abortus heat shock proteins use of vaculovirus recombinant-expressing whole insects cells, purified Brucella abortus recombinant proteins, and a vaccinia virus recombinant as immunogens. Vet Microbiol 88, 2002. Pp. 189- 202. 119 TANG D, M Devit, S Johnston. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 3561992,pp. 152-4.

para el antígeno seleccionado. El plásmido es fabricado sin su origen de replicación funcional en células eucariontes, por lo tanto nunca se replica en una célula huésped de mamífero, ni se integra al ADN cromosomal del hospedador120.

3.1.1. Mecanismos celulares de captura de ADN. Un paso crucial en el desarrollo de la terapia génica por medio de la inyección de ADN desnudo, es la translocación del ADN a través de la membrana plasmática, esto es importante para determinar el mecanismo real de captura de ADN desnudo por células en tejido animal121. Estudios en el sitio de inyección con heparina, una molécula policatiónica que inhibe la captación de ADN, indican que la inhibición es dosis dependiente y compatible con la unión al receptor o al sitio de unión específico, asumiendo que el mecanismo de captación de ADN plasmidial es la endocitosis mediada por receptores122. Sin embargo, los últimos estudios en keratinocitos humanos muestran que el mecanismo de captación de ADN es a través de diferentes vías, principalmente por macropinocitosis, y se han identificado las proteínas CD44 e ICAM-1 involucradas en la unión y el tráfico de ADN123 . 3.1.2. Mecanismos celulares involucrados en la respuesta inmune generada por la inmunización genética. Algunas de las cualidades de las vacunas ADN son: expresar antígenos de proteínas nativas in vivo para reconocimiento de células B y presentación por moléculas MHC clase I y II para estimular células T ayudadoras, linfocitos T citotóxicos. Así, el modo preciso de estimulación inmune de las vacunas ADN se reduce a una combinación de tres mecanismos por los que las proteínas codificadas por el ADN plasmidial son presentadas y procesadas

120

DONNELLY J, J ULMER, J SHIVER, M Liu. DNA vaccines. Annu Rev Immunol 15, 1997. Pp. 617-48. SATKAUSKAS S, M Bureau, A Mahfoudi, L Mir. Slow accumulation of plasmid in muscle cells: supporting evidence for a mechanism of DNA uptake by receptormediated endocytosis. Mol Ther 4, 2001. Pp 317-323. 122 OLIVEIRA S. ibid p. 960 123 BASNER-TSCHAKARJAN E, A Mirmohammadsadegh, A Baer, U Hengge. 2004. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther 11, pp. 765-74. 121

para generar respuesta inmune: a) estimulación directa por células somáticas (miocitos, keratinocitos, o cualquier célula MHC clase II negativa), b) transfección directa de células presentadoras de antígeno (CPA) profesionales (Ej. células dendríticas) y c) presentación cruzada (crosspriming) en la cual el plásmido ADN transfecta una célula somática y/o CPA profesional y la proteína secretada es tomada por otra célula CPA profesional y presentada a células T124. 3.1.3. Vacunas ADN para B. abortus. Se ha demostrado que vacunas ADN que contienen el gen para la proteína L7/L12125,inducen un significativo nivel de protección contra brucelosis en el modelo ratón. Por otro lado, ratones BALB/c vacunados con un plásmido ADN que tiene el gen (sodC) que codifica para la proteína SOD Cu/Zn de Brucella abortus (pcDNA-SOD), desarrollan anticuerpos específicos contra la proteína SOD recombinante (SODr), exhibiendo una dominancia de inmunoglobulinas de tipo IgG2a sobre IgG1, lo que induce una respuesta proliferativa por parte de células T, con la producción INF-γ pero no de IL-10 o IL-4, demostrando de esta forma que la inoculación con pcDNASOD induce los anticuerpos adecuados y una respuesta inmune celular de tipo Th1, respuesta que es protectora frente al desafío con la cepa patógena de Brucella (Oñate y col 2003). Además, se ha demostrado en el modelo murino que la inmunización intraesplénica con pcDNASOD induce una eficiente respuesta inmune tipo Th1 protectora y que la producción de IFN-γ es realizada por células T CD4+ y la inducción de actividad citotóxica, importante para la eliminación de bacterias facultativamente intracelulares como Brucella, es realizada por las células T CD8+ 126.

124

DONNELLY J, M Liu, J Ulmer. Antigen presentation and DNA vaccines. Amer J Resp Crit Care Med 162, 190-193. 2000 125 KURAR E, G Splitter. Nucleic acid vaccination of Brucella abortus ribosomal L7/L12 gene elicits immune response. Vaccine 15, 1997. Pp. 1851-1857. 126 MUÑOZ-MONTESINO C, E Andrews, R Rivers, A González-Smith, G Moraga-Cid, H Folch, S Céspedes, A Oñate. Intraspleen delivery of a DNA vaccine coding for superoxide dismutase (SOD) of Brucella abortus induces SOD-specific CD4+ and CD8+ T cells. Infect Immun 72, 2004. Pp. 2081-2087.

En bovinos, actualmente el único trabajo que ha estudiado la utilización de una vacuna ADN para Brucella describe que la inmunización con pcDNA-SOD es capaz de estimular una respuesta inmune celular y una eficiente estimulación de células T citotóxicas, respuestas clave en la inducción de protección frente a Brucella. Lo que además destaca el trabajo, es la gran variabilidad de respuesta observada en el ganado bovino, lo que podría atribuirse a la constitución genética de la especie bovina con la cual se trabajó, especies que no son 100% genéticamente puras 127. 3.2. VACUNAS ARN Además de los vectores plasmidiales existen otros vectores de expresión como los basados en el virus Semliki Forest (SFV). Estos vectores son partículas virales suicidas del virus Semliki Forest, cuyo genoma corresponde a un ARN desnudo autorreplicable, cuya secuencia contiene inserto el gen de interés que codifica para la proteína con capacidad inmune. Experimentos previos han demostrado la alta eficiencia de estos sistemas de expresión para expresar proteínas heterólogas en células eucariotas, así como también la capacidad para conferir excelentes niveles de protección en animales inmunizados con estos sistemas de expresión, superando incluso a las vacunas ADN128. 3.2.1. Virus Semliki Forest. El virus Semliki Forest es un Alfa virus que pertenece a la familia Togaviridae. Este virus se transmite principalmente a través de mosquitos y es capaz de infectar al ser humano causándole fiebre, artritis y encefalitis (Willems y col 1979.). El virus Semliki Forest es un virus ARN que puede infectar una gran variedad de hospedadores y se replica de manera efectiva en

células

cultivo.

Este

virus

127

utilizado

estudio

GUZMÁN I, E ANDREWS, A González, R Rivers, A Cabrera, A Oñate. Una vacuna ADN para la brucelosis bovina. Resúmenes del XIII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, 2004. pp. 30. 128 ANDERSSON C, N Vasconcelos, M Sievertzon, D Haddad, S Liljeqvist, P Berglund, P Liljeström, N Ahlborg, S Stahl, K Berzins. Comparative immunization study using RNA and DNA constructs encoding a part of the Plasmodium falciparum antigen Pf332. Scand J Immunol 54, 2001. Pp. 117-24.

la biología molecular de los virus ARN y además se ha investigado su uso como instrumento en la expresión de proteínas recombinantes129.

3.2.2. Entrada del virus a la célula hospedadora. El virus Semliki Forest entra a la célula hospedadora por endocitosis mediada por receptores (probablemente antígenos de histocompatibilidad), que fijan la partícula viral a la membrana plasmática130; estos receptores se concentran principalmente en invaginaciones de la membrana plasmática, recubiertas en su cara citosólica por una red de la proteína clatrina

131

. En el citoplasma, la vesícula endocítica se fusiona con un

endosoma, dentro del cual el pH es ácido, lo cual induce la disociación de la proteína estructural del virus E1E2, lo cual genera la formación del homotrímero E1E1E1, el que facilita la fusión de la membrana viral con el endosoma, liberándose la núcleo cápside al citoplasma de la célula. Finalmente, las proteínas de la cápside liberan el genoma viral, mediante una reacción gatillada por ribosomas que se unen a algunos aminoácidos de esta proteína (residuos 94 al 106), los cuales están directamente implicados en la unión de la cápside con la molécula de ARN 132. 3.2.3. Elaboración de partículas virales suicidas del virus Semliki Forest. A partir del virus Semliki Forest, Smerdou y Liljeström el año 1999 elaboraron una partícula viral recombinante que tiene la capacidad de infectar una célula eucariota animal y liberar su genoma en su interior. Esta partícula viral contiene en su interior un segmento de ARN mensajero, el cual puede ser traducido por la célula

129

OLKKONEN V, P Liljeström, H Garoff, K Simons, C Dotti. . Expression of heterologous proteins in cultured rat hippocampal neurons using the Semliki Forest virus vector. J Neurosci Res 35. 1993. Pp. , 44551. 130 HELENIUS A, B MOREIN, E Fries, K Simons, P Robinson, V Schirrmacher, C Terhorst, J Strominger. Human (HLA-A and HLA-B) and murine (H-2K and H-2D) histocompatibility antigens are cell surface receptors for Semliki Forest virus. Proc Nat Acad Sci USA 75, 1978. Pp. 3846- 3850. 131 DETULLEO L, T KIRCHHAUSEN. The clathrin endocytic pathway in viral infection. EMBO J 17, 1998. Pp. 4585–4593. 132 SINGH I, A HELENIUS. Role of ribosomes in Semliki Forest virus nucleocapsid uncoating. J Virol 66, 1992. Pp. 7049-7058.

hospedera133. Para la construcción del virus se separó su genoma en tres plásmidos (pSFV4.2, pSFV-Helper-Capsid y pSFVHelper- Spike), plásmidos que son transcritos in vitro (transcrito ARNm), utilizándolos luego para transfectar una línea celular eucariota, obteniendo de esta forma partículas virales que son empaquetadas y liberadas al medio de cultivo. Durante el proceso de elaboración de las partículas virales in vitro, sólo el ARNm transcrito a partir del plásmido pSFV4.2 contiene la información necesaria para ser empaquetado al interior de la partícula viral, por ende, sólo éste ARNm formará parte del genoma viral

134

. El

plásmido que codifica este transcrito contiene un gen que codifica para la replicasa viral y un sitio de multiclonaje, en el cual se puede insertar un gen que codifique una proteína heteróloga135. Estas características le confieren una alta bioseguridad al sistema, debido a que permiten elaborar partículas virales con un genoma incompleto, el cual no puede replicarse (partículas virales suicidas), funcionando como un simple pero eficiente vector de expresión de proteínas heterólogas. 3.2.4. Vacunas ARN para B. abortus. Se ha evaluado en un modelo murino la inducción de respuesta inmune y protección, por un ARN recombinante que codifica la proteína SOD Cu/Zn de B. abortus empaquetado en el interior de partículas suicidas del virus Semliki Forest (VSF-SOD). Describiéndose que la inmunización con VSF-SOD estimula preferentemente una respuesta inmune de tipo Th1, con la inducción de proliferación de linfocitos T antígeno específica y activación de células T citotóxicas. Respuesta que fue protectora frente al desafío con

una

cepa

patógena,

indicándose

potencial

uso

como

vacuna

para Brucella136 .

133

SMERDOU C, P LILJESTRÖM. Two-helper RNA system for production of recombinant Semliki Forest virus particles. J Virol 73, 1999. Pp. 1092-1098. 134 GUZMÁN I Ibid pp. 30 135 FROLOV I, T Hoffman, B Pragai, S Dryga, HV Huang, S Schlesinger, CM Rice. Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications.Proc Natl Acad Sci USA 93, 1996. Pp. 11371-11377. 136 OÑATE A,G DONOSO, G MORAGA-Cid, H Folch, S Céspedes, E Andrews. A RNA Vaccine Based on Recombinant Semliki Forest Virus Particles Expressing Cu/Zn Superoxide Dismutase Protein of Brucella abortus Induces Protective immunity in BALB/c Mice. Infect Immun 73, 2005. Pp. 3294-3300.

3.2.5 Control y erradicación: Vacunas tradicionales o convencionales las vacunas tradicionales en brucelosis han seguido dos líneas principales de desarrollo: las vacunas atenuadas vivas y las vacunas inactivadas o bacterinas (homologas o heterólogas)137, en ambos casos se trata de vacunas celulares (bacteria entera).

4. TIPO DE ESTUDIO

La presente investigación corresponde a un estudio explorativo, epidemiológico transversal , dado que, en una primera oportunidad se investiga todo lo relacionado con la bacteria objeto de estudio, en segunda instanciase determina la prevalencia de la enfermedad en un momento establecido y luego se analiza la presencia de la infección en dicho municipio138.

4.1. MUESTRA DE LA POBLACIÓN Se determina por medio de un programa estadístico , win episcope 2,0 el cual determina el porcentaje de animales a muestrear en el municipio de Miraflores, a través de los siguientes datos: tamaño de la población.(3297),prevalencia esperada (50%).error aceptado(5%),nivel de confianza(95%).con los anteriores datos

obtuvieron

los

siguientes

resultados.

fracción

muestreo

(10.436)tamaño de muestra (384.16),tamaño de muestra ajustado(339.08) para un resultado total de 345 animales a muestrear.

137

CAMACHO,G.H . Estudio de prevalencia serológica de brucella spp. En ordeñadores de hatos lecheros del municipio de san Miguel de sema-Boyacá. Trabajo de investigación , universidad cooperativa de Colombia. 2003 138

HERNANDEZ. R;FERNANDEZ,c. ;BAUTISTA, P. Diseños no experimentales de investigación. Metodologia de la Investigacion, 2° Edic. Editorial Mc Graw Hill. Inter Americana. Mexico. 1994. 187 – 206 pp.

Tabla 2. Tamaño de muestra No 1

4.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

Este se determina con las anteriores características las cuales son tamaño de la población que son 3297 animales hembras bovinas mayores de 3 años,(Ica, Tunja, Boyacá) prevalencia esperada que se maneja con un 50 % máximo y mínimo, nivel de confianza el cual según el Ica se maneja con un 95 % de efectividad, y los resultados que son el número de animales a muestrear el cual es de 345(fedegan ,Tunja Boyacá).

Tabla 3. Tama単o de muestra No 2

Error absoluto: con un nivel de confianza del 95 % el porcentaje de error exacto es de 4.99 %(win episcope 2.0 (D.I.E)

Tabla 4. Tamaño de muestra No 3

4.3. CRITERIOS DE SELECCIÓN Criterios de inclusión hembras bovinas mayores de 36 meses, criterios de exclusión machos mayores y menores de 36 meses y hembras menores de 36 meses.

5. METODOLOGÍA

Las muestras se obtendrán a través de la realización de venopunción de la vena coxígea del animal, esta se ubica a lo largo de la cola por ventral, se utilizara una aguja calibre 22 con una longitud de 25 m.m y jeringa de 5 ml, la muestra tomada se almacenara en tubos sin anticuagulante.el procedimiento a seguir es el siguiente:

1. sujeción del animal 2. inmovilización (maneado del animal) 3. la desinfección se hará alternando tres

veces alcohol y yodo en la zona

proximal de la parte ventral de la cola 4. venopuncion de la vena caudal con aguja calibre 22 5. desinfeccion de la zona de la punción alternando tres veces alcohol y yodo 6. identificación y rotulado de la muestra de la sangre 7. almacenamiento de la muestras en la caja de icopor con su respectivo refrigerante Una vez lograda la muestra de sangre se procederá a la obtención y conservación del suero, que en un medio como el nuestro se debe coagular en 20-30 minutos, aunque la literatura recomienda esperar 1-2 horas a temperatura ambiente, de esta se podrá obtener mayor cantidad de suero acercándose a un 40 % del volumen original de la sangre .el tubo que contiene la sangre se debe centrifugar a 1.500 r.p.m durante 10 minutos para separar las células del suero ,con una pipeta pasteur se debe separar el suero o sobrenadante y transferir almacenamiento para la realización de las distintas pruebas

a un tubo de

Luego de la obtención del suero se procederá a tomar una cantidad igual a 30 mcl, que se mezclo con igual cantidad de antígeno, sobre una lamina de vidrio. el diámetro mínimo que se debe alcanzar con la mezcla de estas dos soluciones debe ser de 2cm.agitandose por 4 minutos ,luego de este tiempo se procederá a examinar la reacción en búsqueda de la presencia de aglutinación, la cual ya sea de cualquier intensidad indicara que la muestra es positiva, La prueba rosa de bengala es una prueba sencilla con una especificidad del 98.0%% y una sensibilidad del 94.1% y se recomienda para estudios de prevalencia en lugares donde no se aplica la vacunación contra la brucelosis.la técnica de aglutinación de rosa de bengala o antígeno buferado poseen sensibilidades muy semejante a la fijación del complemento; ya que esto nos da un cierto grado de confianza de la efectividad de la prueba , sabiendo que no es el 100% verídica , ya que no es especifica para la bacteria de Brucella abortus, por lo cual tenemos cierto margen de error , ya que puede darnos como positivos a otro tipo de bacterias.

6. RESULTADOS

En la región de Miraflores Boyacá se presento que la probabilidad de que existan hembras bovinas mayores de 36 meses con la enfermedad de brucella abortus. Presento una probabilidad de 0.067, que equivale al 6,7% de las hembras durante varios años presentaran brucella abortus.

Grafica 1. Prevalencia de Brucella Abortus

PREVALENCIA DE BRUCELLA ABORTUS positivos

Series1; positivos; 23; 7%

negativos

Series1; negativos; 320; 93%

Grafica 2. Prevalencia por Veredas de la región rural del municipio de Miraflores Boyacá

60 50 40 30 20 10 0

POSITIVOS NEGATIVOS

En el diagrama se observa que las veredas Ayatá, Centro Mira y Rusita no presentaron positivos, En cambio las veredas de Estancia y Tablón se presentaron 4 positivos, Pueblo y Cajón 4 positivos y Tunjita 5 positivos siendo estos los valores más altos en positivos también se puede deber a que no se presentan los mismos parámetros o cuidados que en las veredas donde no se presentan positivos

Tabla 4. Matriz de Tasa de prevalencia por veredas

En la tabla se muestra que las veredas de Suna Abajo y Guamal son las que se encuentran con mayor probabilidad de presentar hembras positivas ya que obtuvieron una probabilidad de 0.1428 y 0.1111 respectivamente a comparaci贸n de las veredas Rusita y Ayat谩 que presentaron una probabilidad de 0 hembras positivas. Tabla 5. Contraste de veredas Probabilidad de hembras positivas

Estas veredas presentan valores superiores en la probabilidad con respecto a la probabilidad general de 0.067.

PRUEBA DE NORMALIDAD

Esta prueba se realiza para poder generalizar los análisis que se realizan con la muestra hacia la población Tabla 6. Pruebas de normalidad de Kolmogorov – Smirnov para Positivos y Negativos

Kolmogorov-Smirnov(a) Estadí stico

Sig.

,181

,200(*)

NEGATIVOS ,246

,062

POSITIVOS

provienen de una población

normal, ya que su valor de significancia es mayor que 0.05 con una confiabilidad del 95%. p> 0.05. Teniendo en cuenta que las hembras positivas presentan la mejor normalidad. Podemos argumentar con una confiabilidad del 95% que la media poblacional se encontrará en un intervalo de (0.87 a 3.31). con lo cual se determina que las veredas estancia y tablón, pueblo y cajón, y tunjita cuentan con la mayor probabilidad de presentar hembras positivas a la enfermedad de brucelosis

Tabla 7. Pruebas de normalidad de Kolmogorov – Smirnov para tasa por Vereda

Kolmogorov-Smirnov(a)

TASA

POR

VEREDA *

Estadístico

Sig.

,185

,200(*)

Este es un límite inferior de la significación verdadera. a Corrección de la

significación de Lilliefors Se aplico la prueba de normalidad de Kolmogorov – Smirnov en la cual se obtuvo que los datos la tasa de probabilidad provienen de una población normal, ya que su valor de significancia es mayor que 0.05 con una confiabilidad del 95%. p> 0.05.

Grafica 3. Intervalo para la prevalencia por vereda de hembras bovinas mayores de 36 meses de edad

En la siguiente grafica se muestra el intervalo para la prevalencia por vereda de hembras bovinas mayores de 36 meses de edad, de donde se obtuvo que el intervalo de confianza para la media se debe encontrar en (0.028 a 0.093) de donde las veredas de Suna Abajo y Guamal presentan una tasa de 0.1428 y 0.1111 respectivamente. Las cuales se encuentran por fuera del intervalo de confianza es decir que son las veredas que mas hembras positivas presento por total de hembras muestreadas

7. ANALISIS DE RESULTADOS

En la regiรณn de Miraflores Boyacรก se presento que la probabilidad de que hayan hembras bovinas mayores de 36 meses con la enfermedad de brucella abortus. Es de 0.067, es decir que

23 de animales de 345 muestreados equivalentes

aproximadamente el 7% son positivos a la bacteria de brucella abortus y que 320 animales equivalentes al 93% son negativos a la bacteria brucella abortus. lo cual indica que si no se realizan planes estrictos de control en la vacunaciรณn y la higiene el

porcentaje de hembras infectados por la bacteria irรก aumentando

progresivamente.

Grafica 3 . Prevalencia Brucella Abortus

PREVALENCIA DE BRUCELLA Series1; ABORTUS positivos; positivos

23; 7%

negativos

Series1; negativos; 320; 93%

En esta grafica podemos ver que la prevalencia de la enfermedad de brucella abortus en el municipio de Miraflores (Boyacรก) actualmente tiene un porcentaje de hembras bovinas positivas de un 7%, y un porcentaje de hembras bovinas negativas a la enfermedad

de un 93%.Lo cual es positivo para el municipio,

puesto que aun tomando las medidas sanitarias necesarias y de control se puede llegar a evitar que la enfermedad se siga diseminando, de la misma manera si se

logra controlarla, se evita no solo los problemas que trae consigo para el animal, también evitándose su zoonosis siendo esta un grave problema de salud publica

Grafica 4. Análisis de la prevalencia por Veredas de la región rural del municipio de Miraflores Boyacá 60 50 40 30 20 10 0

POSITIVOS NEGATIVOS

En el diagrama se observa que las veredas Ayatá, Centro Mira y Rusita no presentaron positivos ya que estas veredas cumplen con la vacunación a tiempo de sus animales y por otra cuentan con las medidas de higiene necesarias para prevenir la enfermedad y evitar su diseminación.de esta forma cuidan sus animales, para evitar la enfermedad en sus veredas y de igual forma evitar su diseminación.

En cambio las veredas de Estancia y Tablón presento 2 animales positivos, Pueblo y Cajón 4 animales positivos y Tunjita 5 animales positivos siendo los valores más altos en positivos; debido que en estas veredas no presentan control alguno sobre los machos ya que se prestan estos entre fincas sin exigir la prueba negativa para

Brucella, con la cual se podría ejercer un control para evitar la diseminación entre fincas o entre veredas.

No cuentan con el conocimiento para determinar en qué momento se deben vacunar las hembra también se presentan mayor número de animales positivos, por malas condiciones de higiene y aseo; en los cuales todos los animales tienen contacto y viven compartiendo su comida, agua, fluidos tales como saliva, orina, Sin tener en cuenta que estas son vías de eliminación de la bacteria. Por otra parte no hay control del agua y los pastos ya que estos pueden tener desechos de materia fecal en la cual está la bacteria. Agua y pastos que posteriormente van a consumir todos los animales del hato y por consiguiente pueden adquirir, luego diseminado de la misma manera la enfermedad. Tabla 4. Matriz de Tasa de prevalencia por veredas

En la tabla se muestra que las veredas de Suna Abajo y Guamal son las que se encuentran con mayor probabilidad de presentar hembras positivas ya que obtuvieron una probabilidad de 0.1428 y 0.111 la cual podemos observar en la tasa por vereda, y en comparación de las veredas Centro Mira Rusita y Ayatá que presentaron una probabilidad de 0 hembras positivas. Lo cual se debe que en las 68

veredas de suna abajo y guamal.las personas no cuentan con el conocimiento acerca de la enfermedad, no manejan adecuadamente los planes de vacunación, no tienen distribuido su ganado por edades, ni por sistema reproductivo actual. Indicando que todo el ganado tiene contacto entre sí, lo cual es grave; pues al resultar algún animal positivo este está en continua diseminación a todo el ganado. Por medio de orina, heces, saliva.es decir no cuentan con el manejo y la prevención

adecuada para tener control de la enfermedad y así evitar su

diseminación. Tabla 5. Contraste de veredas Probabilidad de hembras positivas

Las veredas de suna abajo y guamal presentan valores superiores en la probabilidad con respecto a la probabilidad general de 0.067, esto nos quiere decir que estas veredas se salen del rango normal que es de o.67 %.lo cual nos indica que las anteriores veredas al ser de rangos más altos puesto que suna abajo tiene un rango de 0.14% y guamal tiene un rango de 0.11 %.al estar por fuera del rango normal serian nuestras veredas problema, las cuales en primer lugar hay que realizarles controles de sanidad periódicos, jornadas de vacunación constante y jornadas de capacitación a todos aquellos pequeños y grandes ganaderos de estas veredas. Pues estas son las cuales tienen la más alta probabilidad de diseminación a futuro; por otra parte se debe ejercer control en la higiene, en los machos en que se les exijan que sean negativos a Brucella, Antes de servir las hembras.de igual manera ejercer control en los machos y hembras que se compran en ferias ganaderas, y que se traigan de otros municipios.es importante

resaltar que si no se realizan los controles anteriores estos valores se pueden incrementar llevando a que cada vez más hembras, sean positivas a brucella abortus. 7.2 PRUEBA DE NORMALIDAD Tabla 6. Pruebas de normalidad de Kolmogorov – Smirnov para Positivos y Negativos

Kolmogorov-Smirnov(a) Estadístico

Sig.

POSITIVOS

,181

,200(*)

NEGATIVOS

,246

,062

* Este es un límite inferior de la significación verdadera. a

Corrección de la

significación de Lilliefors Se aplico la prueba de normalidad de Kolmogorov – Smirnov en la cual se obtuvo que los datos de hembras positivas y negativas provengan de una población normal, ya que su valor de significancia es mayor que 0.05 con una confiabilidad del 95%. p> 0.05. Teniendo en cuenta que las hembras positivas presentan la mejor normalidad.

Podemos argumentar con una confiabilidad del 95% con lo cual se puede argumentar que entre 1 a 3 animales positivos seria el rango normal, por lo cual podemos ver que las veredas de estancia y tablón al tener 4 animales positivos, pueblo y cajón al presentar 4 animales positivos, y tunjita al tener 5 animales positivos serian nuestras veredas problema por lo cual se debe al no ejercer un estricto control en la vacunación, sin tener un control en las medidas sanitarias necesarias para evitar la diseminación de la enfermedad,lo cual muestra que estas veredas se salen de la media poblacional se encontrará en un intervalo de (0.87 a 70

3.31) es decir que para las anteriores veredas se debe realizar controles clínicos en los síntomas característicos de la enfermedad como abortos en el último tercio de la gestación, orquitis y epididimitis en machos; mayor control sobre los desechos de los animales ya que muchos de estos están en potreros lejos del lugar donde se encuentran los cuidadores: de esta manera estos no saben que pasa del todo con ellos, no tienen conocimiento de que pasa con la placenta cuando el animal pare y mantener medidas de higiene, cambiando el agua constantemente evitando los desechos de materia fecal en esta y así el contagio, realizando rotación de potreros, y fumigando estos ya que por contacto con materia fecal o orina hay contagio, evitar el contacto directo entre animales ya que por fluidos(saliva, lamido de vulvas entre vacas en celo),también puede haber contagio)teniendo

más

control

con

medidas

higiene,

vacunación,

prevención.es posible que disminuya el porcentaje de hembras positivos a la enfermedad

Tabla 7. Pruebas de normalidad de Kolmogorov – Smirnov para tasa por Vereda

Kolmogorov-Smirnov(a)

TASA POR VEREDA

Estadístico

Sig.

,185

,200(*)

* Este es un límite inferior de la significación verdadera. a Corrección de la significación de Lilliefors Se aplico la prueba de normalidad de Kolmogorov – Smirnov en la cual se obtuvo que los datos la tasa de probabilidad provienen de una población normal, ya que su valor de significancia es mayor que 0.05 con una confiabilidad del 95%. p> 0.05.esta prueba se realiza para generalizar la población y determinar si todas las

veredas se encuentran en el rango normal el cual es de (0.028 a 0.093) o si por el contrario no es así, mostrándonos que son las veredas problemas a las cuales debemos prestarle mayor atención por ser las que tienen mayor posibilidad de diseminación de la enfermedad en este caso brucelosis En la siguiente grafica se muestra el intervalo para la prevalencia por vereda de hembras bovinas mayores de 36 meses de edad, de donde se obtuvo que el intervalo de confianza para la media se debe encontrar en (0.028 a 0.093) de donde la veredas de Suna Abajo, Guamal son las que mas que se encuentran por fuera del intervalo de confianza donde suna abajo cuenta con el 0.14 y guamal 0.11 lo cual nos indica que se encuentran por fuera de los rangos normales siendo nuestras veredas problemas razón por la cual es necesario realizar controles constantes en los planes de vacunación y mantener las medidas de prevención necesarias con los animales, cambiando el agua de estos al diario evitando el contacto directo entre animales;

controlando así su diseminación. Evitando el

ingreso ya sea de hembras o machos de procedencia desconocía donde no se cuenta con el certificado de que sea libre de brucella. Mejorando las condiciones de manejo. esto puede ser posible por medio de capacitaciones donde se les indique a los ganaderos de esta vereda la importancia de tener dichos cuidados, que conozcan de la enfermedad y así sepan determinar sus síntomas, concientizándose

de la gravedad de esta. Y de la necesidad de mejorar el

manejo, la vacunación en el momento indicado, junto con la prevención.

Grafica 5. Intervalo

para la prevalencia por vereda de hembras bovinas

mayores de 36 meses de edad

En esta grafica podemos ver que las veredas de suna abajo y guamal se encuentran por fuera del intervalo de confianza para la media se debe encontrar en (0.028 a 0.093) de donde la veredas de Suna Abajo y Guamal son las que mas que se encuentran por fuera del intervalo de confianza donde suna abajo cuenta con el 0.14 y guamal 0.11 lo cual nos indica que se encuentran por fuera de los rangos normales, por lo cual se deben tomar medidas drásticas y rápidas respecto al control en la vacunación, realizando toma de muestras constantes, o si se cuenta con la disposición de los ganaderos un muestreo más amplio de población total, determinado así la prevalencia especifica de las veredas problema por tanto determinar si el número de animales positivos han aumentado o se mantiene igual

8. DISCUSIÓN

En el presente estudio se logro determinar que las veredas de estancia y tablón,pueblo y cajón,y tunjita presentaron el mayor número de animales positivos a la bacteria de brucella abortus. donde estancia y tablón presento 4 animales positivos, pueblo y cajón 4 animales positivos y tunjita 5 animales positivos, lo cual indica que en estas veredas no se realizan las jornadas de vacunación o se realizan fuera del tiempo determinado, y no cumplen con las medidas sanitarias pertinentes para evitar la diseminación de la enfermedad.

Por otra parte se pudo determinar que el municipio actualmente cuenta con una prevalencia de brucella abortus de un 7 % es decir que hay 23 animales positivos de 345 muestreados y por lo tanto hay un 93% de animales negativos a la enfermedad lo cual indica que 320 animales salieron negativos al diagnostico, por medio de la prueba rosa de bengala. Lo cual es positivo para el municipio en este momento ya que su porcentaje de prevalencia no es muy alto para ser la primera vez que se realice dicho trabajo en este, pero que de igual manera se deben ejercer todas las medidas de higiene y control

como jornadas constantes de

vacunación, las cuales son necesarias para evitar la diseminación de la enfermedad y por tanto el aumento constante en el porcentaje de prevalencia.

Aunque es de vital importancia tener en cuenta las veredas que cuentan con la más alta probabilidad de contraer la enfermedad las cuales son suna abajo y guamal ya que estas se encuentran por fuera del intervalo de confianza para la media se debe encontrar en (0.028 a 0.093) de donde la veredas de Suna Abajo y Guamal son las que mas que se encuentran por fuera del intervalo de confianza donde suna abajo cuenta con el 0.14 y guamal 0.11 lo cual nos indica que se encuentran por fuera de los rangos normales, por lo cual se deben tomar medidas drásticas y rápidas respecto al control en la vacunación, evitar el traslado de

ganado de estas veredas hacia otras o a otros municipios, y principalmente concientizando a los ganaderos de la importancia que tiene esta enfermedad no solo frente a la salud de sus animales sino a la de ellos y sus familias siendo una enfermedad zoonotica que trae consigo problemas irreparables tales como infertilidad y degeneración articular entre otras

Se determino que para toda población se debe tener un 95 % de confiabilidad donde es posible argumentar que entre 1 a 3 animales positivos sería normal donde las veredas de estancia y tablón al tener 4 animales positivos, pueblo y cajón al presentar 4 animales positivos, y tunjita al dar como resultado 5 animales positivos se salen del rango normal por lo cual son nuestras veredas problemas, porque si no se les ejerce un control en la vacunación y medidas de prevención tales como evitar contacto directo entre animales, desinfectar los comederos y bebederos de las vacas constantemente, clasificarlas por estado actual reproductivo. realizar rotación de potreros constantes entre otras, estas veredas se encargaran de diseminar la enfermedad rápidamente por lo cual es de vital interés el concientizar al ganadero acerca de la gravedad de la enfermedad para sus animales, su familia y el mismo

9. CONCLUSIONES

La prueba rosa de bengala cuenta con una especificidad del 95%, y una sensibilidad de 75% lo cual indica que efectivamente nos revelara el diagnostico de la enfermedad a tratar. Pero al no ser una prueba altamente sensible no nos da un total eficacia es decir que nos puede arrojar falsos positivos ya que puede reconocer otro tipo de bacterias,arrojandolas como positivas para brucella razón por la cual es importante la realización de una prueba que cuente con un mayor porcentaje de sensibilidad y especificidad que nos pueda garantizar la veracidad del diagnostico o pueda reconocer una prevalencia mayor o menor. Prueba como la Elisa competitiva, la cual también nos determinara si los valores de positividad arrojados son por enfermedad o por vacuna anteriormente realizada al animal

Se determino que la prevalencia de brucella abortus en el municipio de Miraflores Boyacá es de 7% lo cual nos indica que 23 animales de 345 muestreados son positivos a la enfermedad, y que el 93% son negativos es decir que 320 animales de 345 muestreados son negativos a la bacteria, por lo cual para evitar su diseminación se deben realizar jornadas de vacunación, controles constantes lo cual puede lograrse realizando muestreos a la zar y así determinar si la prevalencia de la enfermedad sube o por el contrario se mantiene igual

Se pudo ver que las veredas de suna abajo y guamal, cuentan con una mayor probabilidad de presentar hembras positivos, por lo cual deben ser el objeto de trabajo para la prevención de la enfermedad de brucelosis, disminuyendo de esta forma la diseminación de la enfermedad a futuro

Los factores asociados a la enfermedad incluyen la explotación lechera, la inseminación artificial con o sin monta controlada, la permanencia de becerras de madres positivas a brucelosis y el estado inmunitario; por lo cual es de vital importancia determinar la prevalencia de brucella abortus en toda la población bovina para realizar un control verdadero sobre los animales descartando realmente los positivos

Que se realicen estudios más amplios para brucelosis teniendo en cuenta este trabajo de investigación como estudio preliminar es decir, como estudio base. para determinar si dicha prevalencia está en aumento o se encuentra en el mismo porcentaje.

10. RECOMENDACIONES  Que la alcaldía municipal brinde a los ganaderos jornadas de vacunación constantemente, las cuales vengan acompañadas charlas que les permitan conocer la enfermedad y sus consecuencias no solo para el animal, sino también para ellos y sus familias los cuales se encuentran expuestos a esta día a día  Que se les obligue a las personas de las fincas distribuidoras de leche para el municipio el certificado libre de brucelosis, esto con el fin de darles seguridad y tranquilidad a los consumidores frente al estado del lácteo

 Que se realicen muestreos por veredas generales para brucella abortus para determinar a ciencia cierta el porcentaje de la enfermedad por vereda puesto que en este estudio los animales muestreados solo tenían que ser mayores de 36 meses y fueron tomados a la zar  Que se les incentive a los ganaderos para que apoyen la realización de estudios como el presente, donde se tome toda la población bovina por cada finca de esta forma asegurando realmente que las fincas son libres de brucella abortus  Que a las hembras de diagnostico positivo en este trabajo, se les dé la oportunidad de realizarles una prueba más sensible ya sea la Elisa indirecta o Elisa competitiva. para determinar si es portador latente es decir que posee la enfermedad o esta dio positivo por la vacuna, de esta forma no incurrir en sacrificios de animales sin determina la causa del resultado

 Que se les brinden incentivos económicos o con productos para sus animales a las personas que demuestren buenas prácticas de manejo, que cuentan con medidas de control sanitario y prevención a la enfermedad lo cual motivara a los ganaderos a seguir adelante con estas y de esta forma están previniendo la enfermedad de brucelosis

BIBLIOGRAFÍA



ADEMIR. de Lucas, “Simulação de impacto económico da brucelose bovina em rebanhos produtores de leite das regiões Centro Oeste Sudeste e Sul do Brasil” (São Paulo: São Paulo, 2006



AGUIRRE. Antonio. CORPAS, Antonio; GOMEZ; Daniel. Epidemiologia de la brucelosis bovina en establecimientos productores de leche. 2000. Pp. 345 – 348



ALCALDÍA DE MIRAFLORES. Plan de desarrollo 2011. Obtenida el 03 de Marzo de 2011.p. 5 - 6.



ALCALDIA. Miraflores. Geografía del Municipio de Miraflores Boyacá, Obtenida

Marzo

2011.

http://www.alcaldiamiraflores.gov.co/geografia.htm 

AL-MARIRI A, A Tibor, P Mertens, X de Bolle, P Michel, J Godfroid, K Walravens, J Letesson. 2a. Protection of BALB/c mice against Brucella abortus 544

challenge

vaccination

with

bacterioferritin

P39

recombinant proteins with CpG oligodeoxynucleotides as adjuvant. Infect Immun69, 2001. Pp. 4816-4822. 

ANDERSSON C, N Vasconcelos, M Sievertzon, D Haddad, S Liljeqvist, P Berglund, P Liljeström, N Ahlborg, S Stahl, K Berzins. Comparative immunization study using RNA and DNA constructs encoding a part of the Plasmodium falciparum antigen Pf332. Scand J Immunol 54, 2001. Pp. 11724.



ANUARIO DE ENFERMEDADES DE NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA (1987 – 1996). Base de datos Dpto. de Coordinación e informática. Elaboración Dpto. De epidemiologia. MINSAL.120 p. 1998.



BAE J, G SCHURING, T Toth. Mice immune responses to Brucella abortus heat shock proteins use of vaculovirus recombinant-expressing

whole insects cells, purified Brucella abortus recombinant proteins, and a vaccinia virus recombinant as immunogens. Vet Microbiol 88, 2002. Pp. 189- 202. 

BASNER-TSCHAKARJAN E, A Mirmohammadsadegh, A Baer, U Hengge. 2004. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNAbinding proteins. Gene Ther 11, pp. 765-74.



BRIONES G, N Iñon de Iannino, M Roset, A Vigliocco, P Silva, R Ugalde.. Brucella

abortus cyclic

ß-1,2-glucan

mutants

have

reduced

virulence in mice and are defective in intracellular replication in HeLa cells. Infect Immun 69, 2001. Pp. 4528-4535. 

CAMACHO G., Hugo Felipe y TAMBO Maldonado, N.

Estudio de

prevalencia serológica de Brucella spp. en ordeñadores de hatos lecheros del municipio de San Miguel de Sema-Boyacá en el año 2003 .Salud Pública, salud ocupacional, enfermedades zoonótica, ecología de la enfermedad, enfermedades reproductivas. Universidad Cooperativa de Colombia. Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). Bogotá .2003 

CAMACHO,G.H . Estudio de prevalencia serológica de brucella spp. En ordeñadores de hatos lecheros del municipio de san Miguel de semaBoyacá. Trabajo de investigación , universidad cooperativa de Colombia. 2003



CAMACHO. Garzon. Hugo Felipe, Ninfa Tambo Maldonado; Estudio de prevalencia serológica de Brucella spp. en ordeñadores de hatos lecheros del municipio de San Miguel de Sema-Boyacá en el año 2003.



CANNING P, J Roth, L Tabatabai, B Deyoe. Isolation of components of Brucella

abortus responsible

for

inhibition

function

bovine

neutrophils. J Infect Dis 1521985,pp. 913-921. 

CONSEJO MUNICIPAL DE MIRAFLORES. Plan de Desarrollo 2008 – 2011. Acuerdo N° 010 del 5 de Junio de 2008. Tomado el dia 12 de Mayo de 2011. En: www.alcaldia.mirafloresboyaca.gov



CORBEIL L, K BLAU, T Inzana, K Nielsen, R Jacobson, R Corbeil, A Winter. Killing of Brucella abortus by bovine serum. Infect Immun 56, 1988. Pp. 3251-3261.



CORBEL M. Brucellosis: an overview. Emerg Infect Dis 3, 1997. Pp. 213221.



DETULLEO L, T KIRCHHAUSEN. The clathrin endocytic pathway in viral infection. EMBO J 17, 1998. Pp. 4585–4593.



DONNELLY J, J ULMER, J SHIVER, M Liu. DNA vaccines. Annu Rev Immunol 15, 1997. Pp. 617-48.



DONNELLY J, M

Liu, J Ulmer. Antigen presentation and DNA

vaccines. Amer J Resp Crit Care Med 162, 190-193. 2000 

EISENSCHENK F, J Houle, E Hoffmann. Mechanism of serum resistance among Brucella abortus isolates. Vet Microbiol 68, 1999. Pp. 235-44.



FERNÁNDEZ D, R Benson, C Baldwin. Lack of a role for natural killer cells in early control of Brucella abortus 2308 infections in mice Infect Immun63, 1995. Pp. 4029-4033.



FERNÁNDEZ-Prada C, M NIKOLICH, R Vemulapalli, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig, T Hadfield, D Hoover. Deletion of wboA enhances activation

the

lectin

pathway

complement

in Brucella

abortus and Brucella melitensis. Infect Immun 69, 2001. Pp. 4407-4416. 

FIORI P, S MASTRANDREA,

P RAPPELLI, P Cappuccinelli. Brucella

abortus infection acquired in microbiology laboratories. J Clin Microbiol P. 38. 2006. 

FLOREZ, R. Epidemiología de la brucelosis bovina en México. 2do. Simposio Internacional de Brucelosis Villahermosa, tabasco. México. 1 Noviembre 2003.PP. 13 – 14.



FROLOV I, T Hoffman, B Pragai, S Dryga, HV Huang, S Schlesinger, CM Rice. Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications.Proc Natl Acad Sci USA 93, 1996. Pp. 11371-11377.



GARCIA,

Brucelosis animal y humana en las Américas. Medicina

Veterinaria. 2002. Pp. 345 

GARZON, Hugo; GARZÓN, Ninfa; TAMBO Maldonado; Estudio de prevalencia serológica de Brucella spp. en ordeñadores de hatos lecheros del municipio de San Miguel de Sema-Boyacá. 2003. P. 35



GIAMBARTOLOMEI G, M Delpino, M Cahanovich, J Wallach, P Balde, C Velikovsky, C Fossati. Diminished production of T helper 1 cytoquines correlates with T cell unresponsiveness to Brucella cytoplasmic proteins in chronic human brucellosis. J Infect Dis 186, 2002. Pp. 252-259.



GOLDING B, D SCOTT, O Scharf, L Huang, M Zaitseva, C Lapham, N Eller,

Golding.

Immunity

and

protection

against Brucella

abortus. Microbes Infect 3, 2001. Pp. 43-48.. 

GONZALEZ, I.; Navarro, M. Prevalencia de la brucelosis en el personal de los mataderos en el departamento de Caldas. Trabajo de tesis de la Facultad de Medicina veterinaria. 1980. 84 p.



GUZMÁN I, E ANDREWS, A González, R Rivers, A Cabrera, A Oñate. Una vacuna ADN para la brucelosis bovina. Resúmenes del XIII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, 2004. pp. 30.



HELENIUS A, B MOREIN, E Fries, K Simons, P Robinson, V Schirrmacher, C Terhorst, J Strominger. Human (HLA-A and HLA-B) and murine (H-2K and H-2D) histocompatibility antigens are cell surface receptors for Semliki Forest virus. Proc Nat Acad Sci USA 75, 1978. Pp. 3846- 3850.



HERNANDEZ.

R;FERNANDEZ,

;BAUTISTA,

Diseños

experimentales de investigación. Metodologia de la Investigacion, 2° Edic. Editorial Mc Graw Hill. Inter Americana. Mexico. 1994. 187 – 206 pp.



ICA. Grupo de Control y Erradicación de Riesgos Zoosanitarios. Boletín divulgativo. 2002. pág.22.



KO J, G SPLITTER. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin Microbiol Rev 16 2003. pp, 65-78.



KURAR E, G Splitter. Nucleic acid vaccination of Brucella abortus ribosomal L7/L12 gene elicits immune response. Vaccine 15, 1997. Pp. 1851-1857.



LOPETEGUI P. Erradicación de brucellosis bovina en Chile. Experiencia en el uso de la vacuna cepa RB51. En: Luna- Martínez E, F SuárezGuemes (eds). III Foro Nacional de brucelosis, Acapulco. Anonymous. México.1998 Pp 159-179.



MANCILLA, I Lopez-Goni, I Moriyonrch. med. vet., Journal of Bacteriology. vol.38, 2006. pp. 8



MANDELL G, J Bennet, R Dolin. Principles and practice of infectious diseases. 4th ed. Vol 2. Churchill Livingstone. Philadelphia, USA, 1995. Pp. 2053-2057.



MCDONEL J. 1990. Brucella vaccines. In, A. Mizrahi, ed. Advances in Biotechnological Processes, Vol 13.BACTERIAL VACCINES. Pp. 105-122. Wiley-Liss Publishers, New York, NY.1990



MUÑOZ-MONTESINO C, E Andrews, R Rivers, A González-Smith, G Moraga-Cid, H Folch, S Céspedes, A Oñate. Intraspleen delivery of a DNA vaccine coding for superoxide dismutase (SOD) of Brucella abortus induces SOD-specific CD4+ and CD8+ T cells. Infect Immun 72, 2004. Pp. 20812087.



MURPHY E, G Robertson, M Parent, S Hagius, R Roop II, P Elzer, C Baldwin. Major histocompatibility complex class I and II expression on macrophages containing a virulent strain of Brucella abortus measured using

green

fluorescent

protein-expressing brucellae and

flow

cytometry.FEMS Immunol Med Microbiol 33, 2002. Pp. 191-200. 

NICOLETTI P, ; Minas.A short history of brucellosis.vet.microbiol, 2002. P. 1-4



OLIVEIRA S, G Splitter. Immunization of mice with recombinant L7/L12 ribosomal

protein

confers

protection

against Brucella

abortus infection.Vaccine 14, 1996. Pp. 959-962. 

OLIVEIRA S, J Harms, M Banai, G Splitter. Recombinant Brucella abortus proteins that induce proliferation and gamma-interferon secretion by CD4+

cells

from

Brucellavaccinated

mice

and

delayed-type

hypersensitivity in sensitized guinea pigs. Cell Immunol 1996. Pp.172, 262268. 

OLIVEIRA S, Y Zhu, G Splitter. Recombinant L7/L12 ribosomal protein and gamma-irradiated Brucella abortus induce a T-helper 1 subset response from murine CD4+ T cells. Immunology 83, 1994 . pp. 659-664.



OLIVEIRA S,N Soeurt, G Splitter . Molecular and cellular interactions between Brucella abortus antigens and host

immune

responses. Vet

Microbiol 90, 2002. Pp. 417-424. 



OLSEN & STOFFREGEN, Responses of adult cattle to vaccination with a reduced dose of Brucella abortus strain RB51. Res Vet Sci 69, 2005. 135140.



OÑATE A, H Folch. Proteína de 18.5 kDa: un antígeno interesante en Brucella. Arch Med Vet 27, 1995. Pp. 93-102.



OÑATE A, R Vemulapalli, E Andrews, G Schurig, S Boyle, H Folch. Vaccination with live Escherichia coli expressing Brucella abortus Cu/Zn superoxide dismutase protects mice against virulent B. abortus. Infect Immun 671999. Pp. , 986-988.



OÑATE A,G DONOSO, G MORAGA-Cid, H Folch, S Céspedes, E Andrews. A RNA Vaccine Based on Recombinant Semliki Forest Virus Particles Expressing Cu/Zn Superoxide Dismutase Protein of Brucella abortus Induces Protective immunity in BALB/c Mice. Infect Immun 73, 2005. Pp. 3294-3300.



PAPPAS. G, Akritidis, N, Bosilkovski, M, Tsianos, E, Brucellosis, N Engl J Med. Pag. 88 .



PARRADO, A. Incidencia de brucelosis en personas que laboran aplicando la vacuna de brucelosis bovina en el Departamento de Casanare. Villavicencio. Trabajo de grado Epidemiología General. Universidad de los llanos. Facultad de Ciencias de la Salud. 2004. 180 P.



PASQUALI P, R Adone, L Gasbarre, C Pistoia, F Ciuchini. Mouse cytokine profiles associated with Brucella abortus RB51 vaccination or B. abortus 2308 infection. Infect Immun 69, 2001. Pp. 6541-6544.



PLAN DE DESARROLLO 2008 – 2011.Alcaldia Municipal Miraflores. Tomado el día 02 de Abril de 2011



RAMÍREZ M, J Sigal. Macrophages and Dendritic Cells use the cytosolic pathway to rapidly Cross-Present antigen from live, vaccinia-infected cells. J Immunol 169, 6733-6742.2002



ROCHA. Jornada de actualización sobre la Brucelosis Bovina. 2003



ROOP II R,T Fletcher, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Identification of an immunoreactive Brucella abortus HtrA stress response protein homolog. Infect Immun 62, 1994. Pp.1000-1007.



SATKAUSKAS S, M Bureau, A Mahfoudi, L Mir. Slow accumulation of plasmid in muscle cells: supporting evidence for a mechanism of DNA uptake by receptormediated endocytosis. Mol Ther 4, 2001. Pp 317-323.



SCHARF O, I Agranovich, K Lee, N Eller, L Levy, J Inman, D Scott, B Golding.

Ontogeny of Th1 memory responses against a Brucella

abortusconjugate. Infect Immun 69, 2001. Pp. 5417-5422. 

SCHURIG G,N SRIRANGANATHAN, M Corbel. Brucellosis vaccines: past, present and future. Vet Microbiol 90, 2002. Pp. 479- 496.



SCHURIG G,R ROOP II, T Bagchi, S Boyle, D Buhrman, N Sriranganathan. Biological properties of RB51: a stable rough strain of Brucella abortus.Vet Microbiol 28, 1991. Pp. 171-188.



SIMULAÇÃO DE IMPACTO ECONÔMICO DA BRUCELOSE BOVINA. em rebanhos produtores de leite das regiões Centro Oeste Sudeste e Sul do Brasil” São Paulo: São Paulo, 2006. p. 452 .



SINGH I, A HELENIUS. Role of ribosomes in Semliki Forest virus nucleocapsid uncoating. J Virol 66, 1992. Pp. 7049-7058.



SMERDOU C, P LILJESTRÖM. Two-helper RNA system for production of recombinant Semliki Forest virus particles. J Virol 73, 1999. Pp. 1092-1098.



SMITH H, R Fritzgeorge. The chemical basis of the virulence of Brucella abortus. V. The basis of intracellular survival and growth in bovine phagocytosis. Brit J Exp Path 45, 1964. Pp. 174-186.



STEVENS M, S Olsen, G Pugh. Lymphocyte proliferation in response to Brucella abortus 2308 or RB51 antigens in mice infected with strain 2308, RB51, or 19. Infect Immun 62, 1994. Pp. 4659-4663.



TABATABAI L, S Hennager. Cattle serologically positive for Brucella abortus have antibodies to B. abortus Cu-Zn superoxide dismutase. Clin Diagn Lab Immunol 1, 1994. Pp.506- 510.



TANG D, M Devit, S Johnston. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 3561992,pp. 152-4.



VASSELON T, P Detmers. Toll receptors: a central element in innate immune responses. Infect Immun 70, 2002..pp. 1033-1041.



VEMULAPALLI R, Y He, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Brucella abortus RB51: enhancing vaccine efficacy and developing multivalent vaccines. Vet Microbiol 90,2002.pp. 521-532.



VEMULAPALLI R, Y He, S Cravero, N Sriranganathan, S Boyle, G Schurig. Overexpression of protective antigen as a novel approach to enhance vaccine efficacy of Brucella abortus strain RB51. Infect Immun 68, 2000. Pp. 3286-3289.



WHO. The Development of New/Improved Brucellosis Vaccines: Report of WHO Meeting with the participation of the Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO) and the Office International des Epizooties (OIE). World Health Organization. Geneva, Switzerland 11-12 December 1997



WILKINSON P. Leukocyte locomotion and chemotaxis: effects of bacteria and viruses. Rev Infect Dis 2, 1980.pp. 293-318.



YAGUPSKY P. Detection of Brucellae in blood cultures. J Clin Microbiol 37, 3437-3442.1999



YOUNG E, J BORCHERT, F KREUTZER, D Musher. Phagocytosis and killing of Brucella by human polymorphonuclear leukocytes. J Infect Dis 151, 1985..pp. 682-690.



ZHAN Y, A KELSO, C Cheers. Differential activation of Brucella-reactive CD4+

cells

by Brucella infection

immunization

with

antigenis

extracts. Infect Immun 63, 1995. Pp. 969-975. 

ANEXOS IMĂ GENES TOMA DE MUESTRAS

Toma de muestras 2011

Toma de muestras 2011 90

Toma de muestras 2011

2 .IMAGENES MATERIALES DE LABORATORIO

Fuente: Sáenz 2011. Centrifuga

Fuente: Sáenz 2011. Homogenizador de muestras

Fuente: Sáenz 2011. Materiales para diagnóstico

Fuente: Sáenz 2011. Micropipeta

stico

Fuente: Sáenz 2011. Lámpara para diagnóstico 91

3.IMÁGENES DIAGNÓSTICO DE PRUEBAS

Toma de muestra 2011

Homogenización de muestra 2011

Caja de lectura, mezcla de la muestra con la cantidad de antígeno 2011

.Caja de lectura junto con la muestra 2011

Homogenización de la muestra junto con el antígeno 2011

.Desecho

de mezcladores 2011

Vista en la l谩mpara para diagn贸stico 2011

Agitaci贸n por 4 minutos para observar diagn贸stico 2011

Fuente Saenz 2011..Prueba positiva para Brucella abortus 2011

Fuente Saenz 2011Prueba positiva para Brucella abortus 2011

Tabla 13 .Formato de datos y resultado del muestreo

No. ANIMAL

Nombre Animal CHIKI AQUELA HOSCA CENTAVITO PRIMAVERA MULA GUACHERNA LENTEJA CLARA TETAS PARDA PANTERA NEGRA

PROPIETARIO

VEREDA

CHEPITA

JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ JULIO PAEZ DR VACA DR VACA DR VACA DR VACA DR VACA DR VACA DR VACA HERNAN GOMEZ

SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO ESTANCIA Y TABLON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

BETA PALOMA NANA TORONJA PIRINOLA CHAPETA CENIZA CARETA No.2 CARETA No.3 FLORICIENTA BRINQUITOS REINA PIRINOLA

HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ

ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

No.47 OSA No.47 LIBIA No. 34 No.38 F1606 CHAPETA

FINCA

MUÑECA GIRNALDA GAITANA CHILINDRINA MOIKA SHAKIRA 516

62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 LEO

PITUFA CHICHOLINA N.N. CARETA No.4 SIMENTAL AMARILLA CARETA No.4 SINFOROSA LA MONA CORAZON REINA RATONA NORMANDA TOPA L.L.065 J. 54 AVISPA GIRA ABUELA PARDA T. PARDA CON CACHOS NORMANDA NEGRA BANGUARDIA CHAROLA TOPA PRINCESA CHAPETA CON CACHOS CEBU 33 CACHONA SIMENTAL BARRIGAS

HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ

ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO

HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ HERNAN GOMEZ EFRAIN LESMES EFRAIN LESMES EFRAIN LESMES EFRAIN LESMES EFRAIN LESMES EFRAIN LESMES EFRAIN LESMES CARLOS JULIO FRANCO CARLOS JULIO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO

ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON AYATA AYATA AYATA AYATA AYATA AYATA AYATA CENTRO MIRA CENTRO MIRA PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO HUMBERTO FRANCO LEONARDO CUADROS

PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

78 LEO 79 LEO 80 LEO 81 LEO 82 LEO 83 LEO 84 LEO 85 LEO 86 LEO 87 LEO 88 ALF 89 ALF 90 DUE 91 DUE 92 DUE 93 DUE 94 DUE 95 SEG 96 MIS 97 MIS 98 MIS 99 MIS 100 MIS 101 MIS 102 JAI 103 JAI 104 JAI 105 JAI 106 JAI 107 JAI 108 JAI 109 JAI 110 JAI 111 JAI

PINZAS TOPA LEO CASCARA CARA DE BONITA 23 NEGRA HOSTEIN GRANDE HOSTEIN MEDIANA PARQUEMADA COLMENA JULIA PEPA CANELA GIRL 34 VARCINOS 39 CORAZON NORMANDA ESCACHADA NORMANDA CARETA VACA BLANCA NORMANDA MESIAS NEGRA NORMANDA LESMES PALOMA LLANERA LA NEGRA COJA CORAZONES LA MECHA AMARILLA CACHONA OREJA MOCHA LA PIRINOLA

LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS

PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

LEONARDO CUADROS

PUEBLO Y CAJON

NEGATIVO

LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS ALFONSO MUÑOZ ALFONSO MUÑOZ LUIS DUEÑAS LUIS DUEÑAS LUIS DUEÑAS LUIS DUEÑAS LUIS DUEÑAS ANTONIO SEGURA MISAEL CALDERON

PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL MATA REDONDA AB

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

MISAEL CALDERON

MATA REDONDA AB

NEGATIVO

MISAEL CALDERON MISAEL CALDERON

MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB

NEGATIVO NEGATIVO

MISAEL CALDERON MISAEL CALDERON

MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB

NEGATIVO NEGATIVO

JAIRO CARO JAIRO CARO JAIRO CARO JAIRO CARO JAIRO CARO JAIRO CARO JAIRO CARO

MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

JAIRO CARO JAIRO CARO JAIRO CARO

MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB MATA REDONDA AB

POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO

112 SS 113 SS 114 SS 115 SS 116 SS 117 SS 118 SS 119 SS 120 SS 121 SS 122 SS 123 SS 124 CRI 125 CRI 126 CRI 127 CRI 128 CRI 129 SEG 130 SEG 131 SEG 132 SEG 133 SEG 134 SEG 135 SEG 136 SEG 137 SEG 138 SEG 139 SEG 140 PUE 141 PUE 142 PUE 143 PUE 144 PUE 145 PUE 146 PUE 147 PUE 148 PUE 149 PUE 150 LEO 151 LEO 152 LEO

LA CAFÉ ROJA SORPRESA SALCHICHA PALOMA LAS PECAS WILLIAM LOLA ARRAYANA PERLA LUCERA MARIPOSA ESTRELLA FRONTINA FLOR CENICIENTA LA PARDA R5 SUSUKI LA LISITA LA CACHONA MELINA JULIANA LA HOSTEIN NORMANDA LA COLORADA BONY 819 815 CARESTIA

JAIRO CARO SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA SIBEL SEGURA CRISANTO CALDERON CRISANTO CALDERON CRISANTO CALDERON CRISANTO CALDERON CRISANTO CALDERON LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA LUIS SEGURA GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES GUSTAVO PUENTES LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS 97

SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO SUNA ABAJO HATO HATO HATO HATO HATO GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL GUAMAL VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO

POSITIBVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

153 LEO 154 LEO 155 LEO 156 LEO 157 LEO 158 LEO 159 LEO 160 LEO 161 LEO 162 LEO 163 LEO 164 LEO 165 PER 166 PER 167 PER 168 PER 169 PER 170 PER 171 PER 172 PER 173 PER 174 PER 175 PER 176 PER 177 PER 178 PER 179 PER 180 PER 181 PER 182 PER 183 PER 184 PER 185 PER 186 PER 187 PER 188 PER

TOPIS MELUZA LA REINA LA CHINA SUIZA CAMILA REINITA CARETA BALUZA VALENTINA NEGRA LA COMPADRE VALENTINA AMARILLA SIMENTAL UNTOPREDA COLORADA REGRADA NORMANDA CARETA CACHUNA TETA DAÑADA SANDOVAL VARADA TONINA CARETA CACHESPUNTADA LOLI DESMADRADA BLANCA CONCACHOS CACHI ENROSCADA PARDA 6 TETAS HOSTEIN LA MARIPOSA LA CHATA NORMANDA 36 CEBU PALOMA LA FLACA

LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS

VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA

LEONARDO CUADROS LEONARDO CUADROS

VEREDA DEL HATO VEREDA DEL HATO

NEGATIVO NEGATIVO

LEONARDO CUADROS SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA

VEREDA DEL HATO SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA

POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA

SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

SALOMON PERILLA

SUNA ARRIBA

NEGATIVO

SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA

SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA

NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

189 PER 190 PER 191 PER 192 PER 193 PER 194 PER 195 PER 196 PER 197 PER 198 PER 199 PER 200 PER 201 PER 202 PER 203 PER 204 MED 205 MED 206 MED 207 ESE 208 ESE 209 ESE 210 ESE 211 ESE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

IRIS VARGAS CEBU RESURADA CACHI CHIQUITA NORMANDA 42 SARCA CACHONA 20 BOTELLAS NORMANDA 1 BARCINA CACHONA LA JIMENEZ LOS ANTOJOS CACHONA COCOLA CAREJA 425 NATALIA LA NENE 08 HOLTEIN LA PLATA PRINCESA MUÑECA BICILETA JULIANA LA NORMANDA LA PORRI ROJA PAR LENTA BARCINA CANELA JULIANA SORPRESA SARDA CADRONA PALOMA PALIANA NEGRA HOLTEIN MUÑECA ROSITA CACHITOS JAMAICA SORBA LUNITA

SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA

SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA

SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA

NEGATIVO NEGATIVO

SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA SUNA ARRIBA AYATA AYATA AYATA PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA SALOMON PERILLA MANUEL MEDINA MANUEL MEDINA MANUEL MEDINA ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO 99

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 No.8 No.9 No.10 No.11 No.12 No.13 No.14 No.15 No.16 No.17 No.18 No.19 No.20 No.21 No.22

PANELA CHABELA PINTADA PRINCESA ROSA MIEL BALUMOSA YESITA ILUSION PASTEL CACHONA II SUSPIRO PRIMAVERA PASTUCHA LUISA COTUDA MANCHAS MORA CANDY CELESTE

PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO PABLO CRISTANCHO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS CARLOS VARGAS 100

RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON ESTANCIA Y TABLON

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

No.23 C 34 C 35 C 36 C 37 C 38 C 39 C 40 C 41 C 42 C 43 C 44 C 45 C 46 C 47 C 48 C 49 C 50 C 51 C 52 C 53 C 54 C 55 CIENEGARA CARETA CANLY AVILA NUTRIA OSITA VEGA CHARITA MINCHA JULIETA No. C 1 No. C 2 No. C 3 No. C 4 No. C 5 No. C 6 No. C 7 No. C 8

CARLOS VARGAS CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO ESEQUIEL BUITRAGO CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ 101

ESTANCIA Y TABLON TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON PUEBLO Y CAJON TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

No. C 9 No. C 10 No. C 11 No. C 12 No. C 13 No. C 14 No. C 15 No. C 16 No. C 17 No. C 18 No. C 19 No. C 20 No. C 21 No. C 22 No. C 23 No. C 24 No. C 25 No. C 26 No. C 27 No. C 28 No. C 29 No. C 30 No. C 31 No. C 32 No. C 33 1 FER 2 FER 3 FER 4 FER 5 FER 6 FER 7 FER 8 FER 9 FER 10 FER 11 FER 12 FER

CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ CAROLINA RAMIREZ FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO FERNANDO GALINDO

102

TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA TUNJITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA RUSITA

NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

Tabla 9. ANEXO DESCRIPTIVO DE RESULTADOS

Descriptivos

POSITIVOS

NEGATIVOS

Media Intervalo de Límite inferior confianza para Límite superior la media al 95% Media recortada al 5% Mediana Varianza Desv. típ. Mínimo Máximo Rango Amplitud intercuartil Asimetría Curtosis Media Intervalo de Límite inferior confianza para Límite superior la media al 95% Media recortada al 5% Mediana Varianza Desv. típ. Mínimo Máximo Rango Amplitud intercuartil Asimetría Curtosis

103

Estadísti co 2,09 ,87

Error típ. ,547

3,31 2,05 2,00 3,291 1,814 0 5 5 4,00 ,205 -1,463 29,09 16,73

,661 1,279 5,549

41,45 29,27 24,00 338,691 18,404 5 50 45 36,00 -,021 -1,982

,661 1,279

104