Prevalencia de brucella abortus en hembras bovinas by Medicina Veterinaria JDC

PREVALENCIA DE BRUCELLA ABORTUS EN HEMBRAS BOVINAS MAYORES DE 24 MESES DE EDAD MEDIANTE LA TÉCNICA ROSA DE BENGALA EN EL MUNICIPIO DE CAMPOHERMOSO

PEDRO ANDRES MONROY MONTAÑEZ

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011 1

PREVALENCIA DE BRUCELLA ABORTUS EN HEMBRAS BOVINAS MAYORES DE 24 MESES DE EDAD MEDIANTE LA TÉCNICA ROSA DE BENGALA EN EL MUNICIPIO DE CAMPOHERMOSO

PEDRO ANDRES MONROY MONTAÑEZ

Trabajo de Grado presentado como requisito para Optar al Titulo de MEDICO VETERINARIO

DIRECTOR: MAURICIO BOYACA QUINTANA MVZ. Esp.

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011 2

NOTA DE ACEPTACIÓN

________________________________ ________________________________ ________________________________ ________________________________ ________________________________

DIRECTOR:

_____________________________________ DR. MAURICIO BOYACA Q

JURADO:

______________________________________ DR. GIOVANNI MORENO F

JURADO:

______________________________________ DR. CARLOS EDUARDO DIAZ

AGRADECIMIENTOS

La realización de este estudio fue posible gracias a la colaboración de personas que de alguna u otra manera formaron parte de este, en especial a:

Dr. Mauricio Boyaca Q, Médico Veterinario; Director.

Dr. Giovanni Moreno F, Médico Veterinario; Jurado.

Dr. Carlos Eduardo Díaz, Médico Veterinario y zootecnista; Jurado.

Laboratorio MICROZOO, en donde se realizaron las pruebas.

Oscar Peña, guía y asistente para la toma de muestras de campo.

TABLA DE CONTENIDO Pág. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………..

JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………...

DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA………………………………………………….

OBJETIVOS…………………………………………………………………………..

1. MARCO DE REFERENCIA……………………………………………………...

1.1 ESTADO DEL ARTE……………………………………………………………

1.2 MARCO TEÓRICO……………………………………………………………...

1.2.1 Historia de la brucelosis………………………………………………………

1.2.1 Etiología………………………………………………………………………..

1.2.2 Estructura y composición química de Brucella Abortus…………………..

1.2.3 Fuente de infección…………………………………………………………...

1.2.4 Transmisión……………………………………………………………………

1.2.5 Patogenia………………………………………………………………………

1.2.6 Inmunidad frente a Brucella………………………………………………….

1.2.6.1 Inmunidad natural…………………………………………………………..

1.2.6.2 Inmunidad adaptativa……………………………………………………….

1.2.7 Signos clínicos………………………………………………………………...

1.2.8 Diagnostico…………………………………………………………………….

1.2.8.1 Métodos directos……………………………………………………………

1.2.8.2 Métodos indirectos………………………………………………………….

1.2.8.2.1 Técnica de aglutinación con rosa de bengala (RB) para la detección de anticuerpos contra Brucella Abortus en suero..............................

1.2.9 Vacunas contra Brucella Abortus……………………………………………

1.2.10 Distribución…………………………………………………………………...

1.3 MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO………………………………………

1.4 MARCO LEGAL…………………………………………………………………

2. METODOLOGIA…………………………………………………………………..

2.1 TIPO DE ESTUDIO……………………………………………………………..

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………………………..

2.3 MATERIALES Y MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN. PROCESO Y PROCEDIMIENTOS APLICADOS………………………………………………….

2.3.1 Materiales………………………………………………………………………

2.3.2 Procesos y procedimientos aplicados………………………………………

2.4 UNIVERSO, POBLACIÓN Y MUESTRAS EXPERIMENTALES……………

2.5 FUENTES Y TÉCNICA DE RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN…….

2.6 DEFINICIÓN Y OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES Y LOS INDICADORES……………………………………………………………………….

2.7 TRATAMIENTO Y PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN…………..

3. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS…………………………………

3.1 ANÁLISIS DESCRIPTIVO...........................................................................

3.2 ANÁLISIS ESTADISTICO………………………………………………………

3.2.1 Prueba de normalidad………………………………………………………..

4. CONCLUSIONES…………………………………………………………………

5. IMPACTO………………………………………………………………………….

6. RECOMENDACIONES…………………………………………………………..

7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………

8. ANEXOS…………………………………………………………………………...

LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Tamaño de la muestra……………………………………………………..

Tabla 2. Total de muestras tomadas por vereda y resultado…………………... 45 Tabla 3. Prevalencia de Brucella Abortus por veredas en el municipio de Campohermoso……………………………………………………………………...... 48 Tabla 4. Relación de animales con o sin vacunación, positivos y negativos a Brucelosis……………………………………………………………………………… 49 Tabla 5. Relación de animales positivos o negativos a Brucelosis con relación a parámetro reproductivo……………………………………………………………. 49 Tabla 6. Relación de animales positivos o negativos a Brucelosis con o sin registro individual……………………………………………………………….......... 50 Tabla 7.Relación de animales positivos y negativos a Brucelosis con presencia de abortos…………………………………………………………………. 50 Tabla 8. Relación de animales positivos o negativos con el nacimiento en la finca……………………………………………………………………………………..

Tabla 9. Descripción de Brucella Abortus por predios en las veredas del municipio de Campohermoso………………………………………………………. 52 Tabla 10. Porcentaje de predios infectados por Vereda………………………….

Tabla 11. Prueba Shapiro-Wilk……………………………………………………...

Tabla 12. Prueba de Kolmogorov-Smirnov (K-S) no paramétrica para una muestra……………………………………………………………………………….... 54

LISTA DE GRÁFICAS Pág.

Gráfica 1. Prevalencia de Brucella Abortus en cada vereda del municipio de Campohermoso………………………………………………………………….........

Gráfica 2. Porcentaje de hembras positivas y negativas en el municipio de Campohermoso………………………………………………………………….........

Grafica 3. Análisis de prevalencia de Brucella Abortus por predios en las 22 veredas del Municipio de Campohermoso…………………………………………

LISTA DE FIGURAS Pág.

Figura 1. Esquema simplificado de la membrana externa de la pared celular de Brucella…………………………………………………………………………….

Figura 2. Mapa político del municipio de Campohermoso………………………

Figura 3. Materiales para análisis de la muestra…………………………………

Figura 4. Montaje de la muestra en la placa……..……………………………….

Figura 5. Adición de la solución antigénica a la muestra………………..………

Figura 6. Homogenización del suero con el antígeno…………………………...

Figura 7. Lectura de resultados…………………………………………………….

Figura 8. Interpretación de resultados, muestra No 5 positiva………………….

ANEXOS Pág.

ANEXO 1. Formato encuesta-historia prevalencia Brucella Campohermoso……………………………………………………………................

GLOSARIO

Anticuerpo: Proteínas séricas especializadas, producidas por los linfocitos B en respuesta a un inmenso numero de antígenos diferentes a los que el animal puede estar expuesto. Antígeno: Cualquier sustancia capaz, bajo condiciones apropiadas, de inducir una respuesta inmunitaria especifica y de reaccionar con los productos de dicha respuesta. Bacilo: Cualquier bacteria con forma de barra o vara. Bacteria: Son microorganismos unicelulares que carecen de núcleo verdadero y orgánulos. Cepa: Es una variante fenotípica de una especie o conjunto de especies bacterianas que comparten, al menos, una característica. Citoplasma: Material coloide translucido, viscoso, el constituyente esencial de la célula viva. Control de enfermedad: Restricción o reducción de la prevalencia de la enfermedad individual. Incluye una serie de estrategias que van desde la limitación de su aparición hasta su erradicación, aunque suele hablarse de "control o erradicación" como una opción a definir en términos de estrategia de lucha contra un mal. Cuarentena: Restricciones establecidas para entradas y salidas de un lugar en el que aparece un caso de enfermedad contagiosa. ELISA: (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas). Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo. Endémica: Enfermedad o agente etiológico que esta presente o que habitualmente prevalece en una población o zona geográfica en todo momento. Erradicación: Eliminar de raíz una especie de microorganismo infeccioso y, por consiguiente, una enfermedad. Especificidad: Es la proporción de verdaderos negativos detectados por un método diagnostico 11

Fómites: Cualquier objeto inanimado contaminado con el agente infeccioso y que puede vehiculizarlo. Hemocultivo: Es un cultivo microbiológico de la sangre empleado para detectar infecciones que se trasmiten a través de torrente sanguíneo bacteriemia o septicemias. Incidencia: La incidencia es el número de casos nuevos que surgen en una población a lo largo de un período de tiempo. Inmunidad: Estado del animal (natural o adquirido) contra una enfermedad particular y que disminuye notoriamente la susceptibilidad a los efectos invasivos o patogénicos de microorganismos o parásitos, así como también al efecto tóxico de sustancias agresoras de esos agentes. Inmunofluorescencia: Es una técnica inmunohistoquímica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos o antígenos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. In vitro: Se refiere a una técnica para realizar un determinado experimento en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo. Lipopolisacárido: Constituyen el antígeno O y la endotoxina de las bacterias Gram-negativas. Están localizados en la membrana externa de la envoltura celular bacteriana y juegan un papel muy importante en la patogénesis de las infecciones bacterianas, así como en la interacción con el hospedero y su sistema de defensa. Opsonización: Es el proceso por el cual se marca a un patógeno para su ingestión y destrucción por un fagocito. Plásmido: Elemento genético de auto replicación, extracromosómico de una célula. Polimorfonucleares: Los neutrófilos, basófilos y eosinófilos corresponden a leucocitos que poseen un núcleo polimorfo y numerosos gránulos en su citoplasma. Prevalencia: Proporción de individuos de un grupo o una población que presentan una característica o evento determinado en un momento o en un período determinado. Riesgo: Es toda circunstancia o situación que aumenta las probabilidades de contraer una enfermedad. 12

Sensibilidad: Es la capacidad de una prueba diagnostica para detectar una enfermedad o la fracción de verdaderos positivos. Serología: Estudia las reacciones antígeno-anticuerpo in vitro. Tasa: Es una expresión de la frecuencia con que ocurre un hecho en una población determinada. Vacuna: Es un preparado de antígenos que una vez dentro del organismo provoca la producción de anticuerpos y con ello una respuesta de defensa ante microorganismos patógenos. Vacuolas: Espacio o cavidad en el citoplasma de una célula. Zoonosis: Enfermedad de los animales transmisible al hombre.

RESUMEN

En los últimos diez años Colombia ha venido realizando acciones para la prevención, control y erradicación de la brucelosis, con el fin de solucionar una de las limitantes para la sanidad animal y comercio internacional de productos y subproductos de origen bovino. Por tal razón, en el municipio de Campohermoso se decide llevar a cabo un estudio con el fin de establecer la prevalencia de Brucella Abortus en hembras bovinas mayores de dos años mediante la prueba de aglutinación en placa de Rosa de Bengala. La prueba diagnóstica se realizo en el laboratorio médico veterinario autorizado por el ICA, MICROZOO, ubicado en Tunja. En el periodo comprendido entre diciembre de 2010 y enero de 2011 se muestrearon 385 bovinos hembras en 341 fincas ubicadas en las 22 veredas del municipio, encontrándose una positividad de 4,72% en animales y 4,1% en predios, es decir que fueron positivos 17 animales de 14 fincas del municipio, del total de bovinos muestreados el 63,64% no estaban vacunados contra brucelosis, mientras que el 58,82% de las hembras positivas fueron vacunadas; el 94,11% de hembras positivas no presentaron aborto, en cambio el 6,5% de hembras negativas presentaron alguna vez aborto. Las veredas de mayor positividad fueron San Agustin con 22,22% de casos, seguida de Cedros y Vista Hermosa con 17,64% y 11,11%, respectivamente. Los reportes de seropositividad a brucelosis en el país se mantienen sobre el 3,8%, la prevalencia encontrada en el municipio de Campohermoso puede ser aun más baja, mediante la articulación y realización de avances importantes y promisorios en el control y erradicación de la enfermedad en esta región ganadera del país.

Palabras clave: Brucelosis, Colombia, Campohermoso, erradicación, prevalencia, seropositividad.

ABSTRACT

In the last ten years Colombia has been realizing activities to prevention, control and eradication of brucellosis, with in order to solve one of the limit to animal health and international trade in products and subproducts of bovine origin. For such reason, in the Campohermoso municipality decides to carry a study to establish the prevalence of Brucella abortus in bovine females over two years by the agglutination test Rose Bengal. The diagnostic test was realized in the laboratory veterinarian authorized by the ICA, MICROZOO, located in Tunja. Between december 2010 and january 2011 385 female cattle were sampled in 341 farms located in 22 settlements of municipality, found a positivity in animals of 4.72% and 4.1% in farms, 17 animals were positive in 14 farms of the municipality, the total animals sampled the 63.64% were not vaccinated against brucelosis, while 58.82% of positive females were vaccinated, the 94.11% positive female not had abortion, while 6,5% female negative showed ever abortion. Sidewalks were higher positivity San Agustin with 22.22% of cases, followed by Cedros and Vista Hermosa with 17.64% and 11.11% respectively. Reports of brucellosis seropositivity in the country is maintained on 3.8%, the prevalence found in the municipality of Campohermoso may be even lower, through the articulation and implementation of important and promising advancesin the control and eradication of disease in this livestock region of the country.

Keywords: Brucellosis, Colombia, Campohermoso, eradication, prevalence, seropositivity.

INTRODUCCIÓN

La brucelosis una enfermedad bacteriana causada por miembros del género Brucella, es una zoonosis importante y una causa significativa de pérdidas reproductivas en los animales. La brucelosis sigue siendo una carga sanitaria, económica y social de gran importancia, asociada a la pobreza, que afecta en forma irregular a dueños de hato, operarios de mataderos y a otras subpoblaciones de riesgo.

La brucelosis, también llamada aborto contagioso ó enfermedad de Bang, es una enfermedad infecciosa del ganado bovino caracterizada por aborto en el último tercio de la gestación, infertilidad y retención de placenta.

Es producida por la bacteria Brucella Abortus, microorganismo que puede ser eliminado en la leche, en las heces, descargas vaginales, orina, fetos abortados, placentas y terneros aparentemente sanos de vacas infectadas. Se transmite la enfermedad principalmente por el consumo de pastos o de aguas contaminadas por placentas, líquidos placentarios u otras secreciones de vacas infectadas, contacto de animales sanos con secreciones y excreciones de animales brucelósicos, a través de las mucosas o heridas en la piel, manipulación de fetos abortados, placentas, líquidos fetales y accidentes vacunales (Rodríguez, 2005).

El diagnostico definitivo es posible con exámenes de laboratorio; en forma directa con intento de aislamiento bacteriológico o con pruebas serológicas que confirmen la presencia de anticuerpos en suero sanguíneo o leche (ICA, 2010).

Si bien se avanza en la certificación de fincas libres de brucelosis bovina, la falta de sistemas de trazabilidad en las ganaderías hace que la identificación de animales presuntamente afectados no sea identificados y por ende la eliminación de estas enfermedades de los países en desarrollo es más difícil y costosa. Además, las acciones de saneamiento no alcanzan a pequeñas fincas en donde es más probable el contagio al hombre y donde pueden recalar animales descartados por presunta infección (PANAFTOSA-OPS/OMS, 2008).

Entidades nacionales e internacionales resaltan la importancia de actualizar el análisis de situación y metodología de control de estas enfermedades zoonoticas, consideradas desatendidas. Por tal razón, es necesario identificar mecanismos concretos con el fin de reforzar las tareas en saneamiento de establecimientos 14

garantizando la protección de la población más expuesta, además, evitando que recirculen animales positivos, el consumo de lácteos no pasteurizados y la exposición a fuentes de infección de trabajadores de establecimientos ganaderos y frigorífico. Una de las grandes medidas que se deben tener en cuenta, es que los productores tomen conciencia de la importancia de verificar el estado sanitario de sus animales y, particularmente de animales que provienen de subastas y ferias en donde el estado sanitario de los animales en incierto, conociendo el estatus sanitario es posible evitar la reubicación de animales infectados, principal fuente de infección. Esto debe ser objeto de campañas de educación y promoción sanitaria a nivel local recomendadas por los comités ganaderos, municipios, ministerio de agricultura y desarrollo rural, autoridades encargadas de salud pública y condicionalmente los servicios veterinarios.

El objetivo del presente estudio es tener el conocimiento de la prevalencia de Brucella Abortus en el municipio de Campohermoso, con el fin de que se unan esfuerzos y recursos de los municipios y del estado destinados a la inversión en salud animal y de esta forma incidir en salud pública. En la actualidad la realización de trabajos que estudien simultáneamente la exposición y la enfermedad en una población bien definida en un momento determinado proporcionan datos esenciales para los administradores sanitarios así como para los epidemiólogos y los clínicos, de esta manera se podrán identificar los grupos de población más vulnerables y distribuir los recursos necesarios tratando de solucionar la problemática existente, además, es el primer paso en la investigación de lo determinantes de la enfermedad y la identificación de los factores de riesgo.

JUSTIFICACIÓN

La brucelosis por ser una enfermedad infectocontagiosa de los bovinos y otras especies animales, se constituye en una seria limitante para la sanidad animal y el comercio internacional; además del grave riesgo que se presenta para el hombre por ser una zoonosis.

La brucelosis se puede transmitir a los seres humanos causando graves perjuicios a la salud, lo que implica costos y prolongado tratamiento sintomático pero no definitivo.

Para los ganaderos del municipio de Campohermoso, lograr tener la certificación de hatos libres de Brucella las hace más productivas y competitivas frente a las demás fincas de la región de Lengupa y del país, conjuntamente, se garantiza la calidad e inocuidad de los productos cárnicos y lácteos, lo que resulta en la obtención de mejores ingresos económicos y mayor versatilidad en el mercado.

Con la realización de este estudio se podrán evaluar las tasas de reproducción y producción que son: días abiertos, natalidad anual, intervalo entre partos, numero de servicios por preñez o concepción, numero de preñez al primer servicio, pérdidas prenatales o abortos, vida útil o productiva de vientres, producción de leche lactancia, terneros vivos al destete, descarte anual de vientres. Los parámetros anteriormente mencionados se ven afectados principalmente por la presencia de abortos, nacimiento de animales débiles, pérdida de lactancias, enfermedades de tipo reproductivo, pérdidas económicas por la eliminación de animales de alto valor genético y productivo, entre otras. De otro lado los ganaderos adquieren la oportunidad de obtener beneficios económicos ofrecidos por el gobierno como bonificaciones en el precio de la leche, aumento en la venta de crías, disminución en gastos de asistencia técnica y medicamentos, la posibilidad de vender o exportar carne y genética.

En el municipio de Campohermoso no se están implementando las buenas practicas ganaderas (BPG) las cuales proponen una alternativa de mejoramiento conforme a las condiciones de los ganaderos. Uno de los requisitos para la certificación de fincas en buenas practicas ganaderas es obtener el certificado de fincas libres de brúcela, entre otras.

DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA

La brucelosis bovina es una enfermedad infecto-contagiosa conocida también como aborto infeccioso, cuyo patógeno principal para el bovino es Brucella Abortus. En Colombia, la brucelosis Bovina es una enfermedad de notificación obligatoria y pertenece al grupo de las enfermedades de la lista B de la Organización Mundial de Salud Animal OIE. Las pérdidas ec onómicas en bovinos no han sido calculadas en toda su extensión, sin embargo, para América Latina las perdidas económicas anuales por la presencia de brucelosis han sido cuantificadas en 600 millones de dólares anuales y para Colombia en mas de 68.000 millones de pesos anuales (Rivera, et al. 2003; ICA, 2005).

El municipio de Campohermoso basa su economía en la explotación ganadera semiextensiva, en donde los modelos de producción evidencian la presencia de abortos y signos clínicos que hacen presumir la presencia de esta enfermedad la cual puede disminuir las tasas de reproducción y producción, y por lo tanto influir negativamente generando grandes pérdidas económicas, llevando a los propietarios de finca del municipio al fracaso en sus actividades pecuarias.

La presencia de la bacteria en las fincas del municipio genera una gran barrera para el desarrollo de programas que permitan proteger la sanidad pecuaria, los cuales están siendo implementados por entidades relacionadas con la producción pecuaria, al mismo tiempo, restringe el comercio de animales y productos, de los cuales se origina el sustento diario de gran parte de la comunidad en general.

En el municipio se vienen realizando ciclos de vacunación los cuales no han sido cumplidos a cabalidad por parte de los ganaderos, de esta manera surge la posibilidad de la presencia de la enfermedad, aparte de esto, se suma el desconocimiento de los ganaderos y personas que trabajan a diario en este tipo de explotaciones, lo cual hacen que sea más difícil, aún, la prevención y control de la enfermedad.

Conocer la prevalencia de Brucella Abortus para el municipio de Campohermoso es de gran importancia, ya que tiene repercusiones directas en la salud pública del municipio, siendo esta una enfermedad zoonótica que puede trasmitirse por contacto directo con placenta, fetos abortados, orina, sangre, e indirectamente por consumo de leche, queso y derivados lácteos cuando estos no son procesados adecuadamente. 17

Surge la necesidad de tener un conocimiento epidemiológico de la enfermedad, que permita emprender acciones dirigidas a implementar programas de detección de fincas problema, nivel de prevalencia en hatos, focos de infección y magnitud de su diseminación. Por tal razón, un elemento fundamental para la comprensión del problema es saber cual es la prevalencia de Brucella Abortus en el municipio de Campohermoso, de manera que, esta información sea conocida por los ganaderos para que tengan la posibilidad de adoptar programas encaminados a tener sus fincas libres de brucelosis.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL  Establecer la prevalencia de Brucella Abortus en hembras bovinas mayores de dos años en el municipio de Campohermoso.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Conocer la prevalencia Campohermoso.

predial

brucelosis

del

municipio

 Determinar la proporción de hembras positivas teniendo en cuenta el método de reproducción, ya sea monta directa o inseminación artificial.  Relacionar la información del registro individual de los animales con la presencia de la enfermedad.  Establecer cuales son las veredas con mayor prevalencia a B. Abortus.

1. MARCO DE REFERENCIA

1.1 ESTADO DEL ARTE

La Brucelosis Bovina es una enfermedad infecciosa limitante del desarrollo ganadero. Se encuentra ubicada en la lista B de la OIE donde se enumeran enfermedades transmisibles que se consideran importantes desde el punto de vista socioeconómico y/o sanitario a nivel nacional y cuyas repercusiones en el comercio internacional de animales y productos de origen animal son considerables (OIE, 2003).

El Instituto Colombiano Agropecuario ICA, con el gremio ganadero representado por el Fondo Nacional del Ganado, FEDEGAN, adquirieron el reto con el sector pecuario del país, para iniciar en forma ambiciosa, a partir del año 2002, la prevención, el control y la erradicación de la brucelosis bovina de Colombia. En Colombia existen antecedentes de la enfermedad en 25 de los 32 departamentos del país, entre los que aparecen con más registros de diagnósticos positivos áreas de Arauca, Bolívar, Boyacá, Córdoba, Cundinamarca, Magdalena, Nariño y Sucre (ICA, 2010).

Para el diagnostico de la enfermedad las pruebas que utiliza el ICA son: Cultivo bacteriológico, tipificación y PCR para la identificación de especie como pruebas directas y pruebas indirectas: Prueba de Aglutinación Rosa de Bengala (RB), prueba de Fijación del Complemento (FC), Técnica Inmunoenzimatica Indirecta (ELISA-i) para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus en suero de bovinos, prueba de Elisa Competitiva frente a s-LPS de Brucella abortus, prueba de Elisa Indirecta para la detección de anticuerpos Anti Brucella abortus en leche bovina y prueba de Fluorescencia Polarizada para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus en suero de bovinos.

En el año 2010 se logró la certificación de la segunda zona libre de brucelosis en el país, correspondiente al Cañón de Anaime en el municipio de Cajamarca – Tolima, la primera corresponde a la provincia de García Rovira y el municipio de Santa Bárbara en Santander; igualmente se avanzó en los muestreos de San Andrés y Providencia y la Zona Norte de Boyacá. Los resultados de la primera zona fueron completamente negativos, programando su certificación como libre de brucelosis para el primer trimestre del año 2011, mientras que en la zona norte de Boyacá se presentaron resultados positivos que están por confirmarse y 20

dependiendo de los mismos podría obtener una nueva zona libre en el país (ICA, 2010).

En el departamento de Boyacá en los dos últimos años diversos autores realizaron estudios de prevalencia con el fin de tener datos de la incidencia de la enfermedad en diferentes municipios del departamento, especialmente en la provincia del Lengupa, la cual esta conformada por 6 municipios. En los meses de febreromarzo Cubides evaluó la presencia de brucelosis en hembras mayores de 24 meses edad en el municipio de Berbeo utilizando la técnica Rosa de Bengala, tamaño de muestra de (n=166) hembras, encontrando una prevalencia del 2% (Cubides, 2011). Igualmente, durante meses de enero-abril de 2011 en el municipio de San Eduardo se realizó un estudio muestreando (n=311) hembras bovinas mayores de 24 meses de edad, utilizando la técnica Rosa de Bengala se obtuvo una prevalencia de 42/311 individuos seropositivos equivalentes al 13,5% y 269/311 individuos negativos equivalentes al 86,5% del total de hembras muestreadas (Goyeneche, 2011). El municipio de Miraflores fue escogido por Zaens para la realización de un estudio de iguales características a los anteriores, tomando una poblacion a muestrear de (n=345) animales, encontrando una prevalencia del 7% (Saenz, 2011).

El municipio de Zetaquira, al igual que Páez los estudios de prevalencia se están llevando a cabo en la actualidad en espera de los resultados.

1.2 MARCO TEÓRICO

1.2.1 Historia de la brucelosis

El curso de la Brucelosis en la historia de la humanidad ha sido tratado por varios autores, quedando muy bien definido. Bräwer y Lehnent entre 1878 a 1880 determinaron el carácter infeccioso de los abortos en bovinos. Bruce en 1887 señaló que la Fiebre de Malta del hombre la producía una pequeña bacteria, cuando logra aislar por primera vez el agente etiológico al cual llamó Micrococcus mellitensis (Rodríguez, 2005).

Bang y Stribolt en 1896 lograron comprobar que el aborto infeccioso en las vacas, lo causaba una bacteria que denominaron Bacillus infectiosi. En 1897 se produce un importantísimo avance en el diagnóstico serológico de la enfermedad una vez que Wright y Smith refieren las aglutinaciones específicas en sueros sanguíneos de los enfermos. Zammit en 1905 informa que las cabras transmiten la enfermedad al hombre surge el concepto de zoonosis a partir del consumo de la leche infectada. En 1914, Traum pone al descubierto la etiología del aborto epizoótico del cerdo. Evans en 1918 comprueba el íntimo parentesco entre el Micrococcus melitensis y el Bacillus abortus, estos resultados junto con los de Meyer y Shaw en 1920 permitió agrupar a estos microorganismos en un solo género bacteriano Brucella y denominarlos Brucella melitensis y Brucella abortus.

En 1930, el nombre de la enfermedad fue cambiado de aborto infeccioso de los bóvidos a la enfermedad de Bang. Las preocupaciones crecían sobre la relación entre la enfermedad en animales y los seres humanos. Un comité de la Asociación Medica Veterinaria de América recomendó una vacuna que fue desarrollada a partir de una cepa de baja virulencia llamada B. Abortus cepa 19. Esta vacuna se ha utilizado por décadas como el principal agente inmunizante para el control de la brucelosis bovina. Se ha estudiado en una variedad de dosis y de métodos de administración.

En 1934, un programa cooperativo de Erradicación de Brucelosis en Estados Unidos fue lanzado a nivel nacional como parte de un programa de emergencia para la reducción de la enfermedad en bovinos con previo análisis de sangre, el sacrificio de ganados seropositivos, e indemnizaciones federales. Sin embargo se presentaron muchos problemas incluyendo la estandarización de procedimientos para las pruebas. En 1941, la cepa 19 fue introducida y utilizada en más estados y todo el ganado vacunado era correctamente identificado. En 1952, la prueba de 22

anillo en leche fue introducida en el programa, siendo el principal método de vigilancia en ganados lecheros con posible brucelosis. Sin embargo surgieron muchas dudas acerca del programa, dando como resultado una comisión especial, la cual recomendó muchos cambios en el programa. En 1953, Buddle y Boyes en Australia y Nueva Zelanda identificaron a B. ovis como causa de epididimitis en ovejas. Más adelante, Carmichael aisló B. canis de fetos caninos abortados (Nicoletti, 2002).

En Colombia, en 1924 se enviaron muestras de sueros bovinas provenientes del departamento de Cundinamarca a Estados Unidos y se obtuvo un diagnóstico positivo de la enfermedad. En 1928 se realizaron los primeros diagnósticos serológicos de brucelosis en el laboratorio de enfermedades infecciosas de la Escuela de Medicina Veterinaria en Bogotá, coincidiendo con el primer aislamiento del germen en nuestro país en el instituto Samper Martínez a partir de un feto bovino. Los primeros diagnósticos de brucelosis humana en Colombia fueron realizados por Cleves en 1935 en la facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional en 59 muestras obtenidas de operarios de mataderos y explotaciones pecuarias (Guerrero, 1964).

1.2.1 Etiología

El género Brucella está constituido por bacilos gram negativos pequeños, inmóviles y aerobios estrictos, de crecimiento lento que no poseen cápsulas ni forman esporas. A diferencia de muchas otras bacterias, su genoma está constituido por dos cromosomas circulares y carece de plásmidos. Tienen un metabolismo oxidativo, basado en la utilización de nitratos como aceptores de electrones. Son catalasa y oxidasa positivos, no atacan la gelatina ni modifican la leche y en general no fermentan los azúcares (Cloeckaert, et al. 2001).

El género Brucella incluye seis especies diferentes: Brucella melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae y B. maris. De ellas, las cuatro primeras pueden infectar al hombre. En base al aspecto de las colonias obtenidas en medio sólido, las diferentes especies de Brucella se clasifican habitualmente como lisas (S) o rugosas (R). Dentro de las primeras se encuentran B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. neotomae y dentro de las segundas B. ovis y B. canis. El aspecto que adquieren las colonias se debe a la expresión del lipopolisacárido LPS en la superficie bacteriana, LPS-S en las lisas y LPS-R en las rugosas, aunque durante su crecimiento en los medios de cultivo pueden experimentar mutaciones que 23

afectan la expresión del LPS. Las cepas de Brucella en fase lisa son las más virulentas y su ultraestructura es semejante a la de algunas enterobacterias (Yersinia enterocolítica, Salmonella Iandau, Pseudomona maltophilia, Escherichia coli), aunque presenta ciertas diferencias en las características de su membrana externa (ME) (Cloeckaert, et al. 2001; Sierra y Miguel, 2004).

1.2.2 Estructura y composición química de brucella abortus

Estructura externa: La membrana externa (ME) de Brucella es rica en fosfatidilcolina a diferencia de la perteneciente a las enterobacterias relacionadas con ella, que es rica en fosfatidiletanolamina. Su componente más abundante y mejor estudiado es el LPS, que se conoce también con el nombre de endotoxina. En él se distinguen tres regiones: el lípido A, inserto en la hoja externa de la membrana, un oligosacárido intermedio, llamado núcleo, y el polisacárido O (PSO), también conocido como cadena O, ausente o presente con pocos residuos en el LPS-R.

El lípido A es un glicolípido que contiene glucosamina y diaminoglucosa. En sus grupos amino e hidroxilos presenta sustituciones por ácidos grasos de variada longitud de cadena. El núcleo contiene glucosa, manosa y ácido 3, deoxi-D-mano2 octulosónico (KDO) y no contiene ni heptosas ni fosfatos. La quinovosamina está presente en el núcleo del LPS-S pero no en el del LPS-R. El PSO es la porción más distal del LPS. Es un homopolímero lineal compuesto por n-residuos de Nformil perosamina (4,6 dideoxi-4-formamido-α-Dmanopiranosilo). La unión entre estos residuos puede ser de dos tipos: α 1-2 o α 1-3, lo que permite diferenciar dos configuraciones alternativas, la A y la M, de mucha importancia en la determinación de las biovariedades, y que se establecen a partir de la alternancia de las uniones entre residuos en el PSO.

Las Brucellas contienen otro polisacárido denominado hapteno nativo (HN), que es químicamente idéntico a la cadena O, pero no está unido al núcleo. Se ha descripto un tercer polisacárido conocido como poli B, que se obtiene a partir de la cepa mutante en fase rugosa B. melitensis 115, por tratamiento con ácido tricloroacético 0,2 M y que para algunos autores sería químicamente equivalente al HN (Cloeckaert, et al. 2002).

Las proteínas de membrana externa (PME u OMPs) se asocian estrechamente con los LPS. Dentro de éstas se encuentran las denominadas proteínas mayores, que se clasifican en tres grupos de acuerdo a sus pesos moleculares: grupo 1 (8924

94 kDa), grupo 2 (36-38 kDa) y grupo 3 (25-27 y 31-34 kDa) (Salhi, et al. 2003) y se encuentran expuestas en la membrana externa, pero son menos accesibles en las cepas lisas que en las rugosas, debido al impedimento estérico ocasionado por las cadenas O del LPS de las primeras. Mediante el empleo de anticuerpos monoclonales se han identificado otras proteínas de membrana menos abundantes que se denominan proteínas menores, siendo algunas de ellas lipoproteínas (Cloeckaert, et al. 2001).

Figura 1. Esquema simplificado de la membrana externa de la pared celular de Brucella.

Fuente: Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, 2005.

El LPS-S de las formas lisas está constituido por el lípido A, el núcleo y el polisacárido O (PSO). El LPS-R de las formas rugosas carece de cadena O, o está reducida a muy pocos residuos. P: proteínas (Cloeckaert, et al. 2001).

Estructura interna: Las proteínas citoplasmáticas de las bacterias del género Brucella son específicas de ese género y la mayoría son compartidas por todas las especies. Algunas de estas proteínas son de interés diagnóstico, como por ejemplo la glicoproteína A2 termo resistente, una proteína de 17 kDa, involucrada en la síntesis de riboflavina, que aparece en la fase activa de la infección (Goldbaum, et al. 1999) y la proteína periplásmica BP26 (Seco-Mediavilla, et al. 2003). Todas estas proteínas forman parte de un antígeno denominado CP, empleado en pruebas de ELISA.

1.2.3 Fuente de infección

La fuente primaria de infección está representada por las hembras grávidas que, al abortar o parir, expulsan grandes cantidades de Brucellas con el feto, el líquido amniótico y las membranas fetales. También pueden difundir la enfermedad las hembras que, poco después de abortar, eliminan Brucellas con la secreción vaginal, y vacas que al parecer sanas, segregan leche que contienen Brucellas. En menor grado pueden contribuir a la contaminación del campo las materias fecales de terneros que se alimentan de leche contaminada, ya que no todas las Brucellas se destruyen en el tracto digestivo. Los toros sin infección no la contraen por cubrir a vacas infectadas, pero si la tienen, pueden infectar a éstas, aunque muy raras veces. En las demás especies, ocurre en forma similar. Las secundarias más importantes desde el punto de vista práctico lo constituyen las membranas fetales, el líquido amniótico y el feto infectado, pues contienen cantidades enormes de Brucella y pueden infectar fuertemente la cama y el suelo de los establos, el pienso y hasta en algunas circunstancias de mala higiene y cuidado, el agua de bebida. A la infección de los establos puede contribuir también la leche, pues, aproximadamente la mitad de las vacas infectadas, después de abortar o parir, eliminan Brucella con la leche durante semanas, meses y años; sobre todo en aquellas salas de ordeño donde la higiene es muy deficiente y que al ordeñar, se dejen caer al piso los primeros chorros de leche (despunte). Algunos planteamientos hechos sugieren que puede eliminarse la Brucella por la orina, pero no puede fijarse de antemano si tal orina contribuye a la difusión de la infección y hasta qué punto (Lucero, et al. 2008).

1.2.4 Transmisión

La vía de penetración más importante es el tracto gastrointestinal por ingestión de pastos, forrajes y aguas contaminadas. Las vacas tienen además la costumbre de lamer membranas fetales, fetos y terneros recién nacidos, que contienen todos ellos gran número de Brucella y constituyen una fuente de infección muy importante. El instinto de las vacas de lamer los órganos genitales de otras vacas contribuye también a la transmisión de la infección, sin embargo algunos autores consideran que el contagio por vía cutánea tiene por lo menos, la misma importancia, por ejemplo: se pueden producir infecciones mediante las camas infectadas, cuando haya lesiones en las tetillas o en los extremos de los miembros o en el espacio interdigital que faciliten la penetración del agente patógeno en capas profundas de la piel, al ordeñar, quizás puedan introducir Brucella en la piel de los pezones las manos humedecidas con leche infectada. La vía vaginal fue utilizada por Bang y otros para reproducir experimentalmente la infección. Según los experimentos realizados, al parecer se necesitan un gran número de gérmenes 26

(sin precisar cifras) para infectar una vaca por esta vía. Por otra parte, no hay dudas de que la vía intrauterina que se emplea en la inseminación artificial es muy importante en la transmisión de la infección. En ambientes cerrados, es probable que la infección se transmita por aerosoles.

La vía aerógena de penetración ha sido demostrada experimentalmente. La infección artificial se consigue a través de la conjuntiva tras la inoculación de Brucella en ese sitio (Rodríguez, 2005). La infección parece aumentar a medida que se acerca la madurez sexual, y es grande asimismo en los animales que la han alcanzado y no han padecido antes la infección. La sangre de los terneros recién nacidos de vacas infectadas no contiene anticuerpos, aunque estos son ingeridos en el calostro. Los anticuerpos se demuestran en la sangre después de seis meses.

Se ha determinado que aproximadamente el 65 % de las vacas infectadas abortan; de éstas, el 65% abortan solo una vez, y el 23%, dos veces. Un porcentaje mucho más pequeño abortan más de dos veces. Cuando el aborto no se presenta y la preñez llega a su término, a menudo la cría está débil y el animal recién nacido sufre neumonía y enteritis, lo cual retrasa seriamente su desarrollo. Se estima que del 40 al 50% de las vacas afectadas tienen obstaculizadas su capacidad reproductora, como resultado de la enfermedad (Fernández, et al. 2006).

1.2.5 Patogenia

Las especies de Brucella son patógenas intracelulares facultativas, propiedad que las mantiene protegidas de la acción de los antibióticos, y de los mecanismos efectores dependientes de anticuerpos; esto justifica la naturaleza crónica de la infección ya que son capaces de adherirse, penetrar y multiplicarse en una gran variedad de células eucariotas tanto fagocíticas como no fagocíticas. Cuando estas bacterias ingresan al organismo pueden ser fagocitadas por los polimorfonucleares (PMN) y macrófagos como parte de la inmunidad innata. Si no son eliminadas llegan por vía linfática a los ganglios regionales correspondient es pudiendo desde allí invadir el torrente sanguíneo, donde son fagocitadas por los PMN y macrófagos circulantes y transportadas, de esta manera, a los diversos órganos donde pueden sobrevivir y multiplicarse dentro de las vacuolas de los fagocitos circulantes y tisulares. Los mecanismos de ingreso de la bacteria a estas células no están suficientemente aclarados aunque se presume que el LPS y las proteínas de la membrana externa podrían participar en los mismos, 27

mediante receptores tipo manosa o integrinas, respectivamente. La supervivencia de Brucella dentro de las células se ha asociado con la síntesis de enzimas antioxidantes (Teixeira-Gomes, et al. 2000) y a la producción de GMP (guanosina 5´monofosfato) y adenina, que inhiben la fusión fagosoma-lisosoma, la desgranulación, la activación del sistema mieloperoxidas a haluro y la producción del TNF-α. Las células de la placenta son ricas en receptores de manosa y en un factor de crecimiento conocido como eritritol, presente en tejidos placentarios animales, lo que explica la avidez de Brucella por los mismos (Aréstegui, et al. 2001).

La especial afinidad que estas bacterias tienen por el endometrio grávido y por la placenta fetal de bovinos hace que estas bacterias también proliferen extensamente en trofoblastos de la placenta que rodean al feto, lo que condiciona que la principal manifestación clínica de la infección aguda en los animales sea el aborto durante el último tercio de la gestación, o el nacimiento de animales prematuros poco viables (Ficht, 2003).

1.2.6 Inmunidad frente a brucella

1.2.6.1 Inmunidad natural

En estados tempranos de la infección por Brucella, el rol de la respuesta innata es reducir el número inicial de bacterias promoviendo una respuesta Th1 en el huésped (Ko y Splitter, 2003).

Macrófagos: Los macrófagos juegan un rol central en la respuesta inmune frente a Brucella, ya que actúan como células fagocíticas profesionales y como células presentadoras de antígenos. Procesan antígenos en sus compartimentos intracelulares y los presentan en el contexto del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) a linfocitos T, promoviendo de esta manera la respuesta inmune adaptativa (Forestier, et al. 2000). En este sentido, se ha encontrado que el LPS de Brucella interfiere con la vía de presentación de antígenos por MHC clase II (Murphy, et al. 2002). Las funciones bactericidas de los macrófagos frente a Brucella se encuentran centradas en la actividad de las especies reactivas de oxígeno (Oliveira, Soeurt y Splitter, 2002) y las especies reactivas de nitrógeno, las cuales son inducidas por IFN-γ y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Ko y Splitter, 2003).

Células Natural Killer: Las células NK forman parte de la primera línea de defensa contra Brucella y una vez que son activadas pueden eliminar células infectadas. B. abortus puede activar la actividad lítica de las células NK, estimulando la producción de interleuquina 12 (IL-12) por parte de las células presentadoras de antígenos. IL-12 además estimula a las células NK a secretar IFN-γ (Golding, et al. 2001).

Neutrófilos: Una vez que el patógeno es fagocitado, se desarrolla una serie de mecanismos destructivos en el neutrófilo, con el fin de eliminar la bacteria, mediante el aumento del consumo de oxígeno que lleva a la aparición de radical superóxido, peróxido de hidrógeno y otros radicales derivados del oxígeno, junto con la activación de la enzima mieloperoxidasa y la fusión del lisosoma con los fagosomas que contienen la bacteria, liberándose hidrolasa ácida, glicosidasa, proteasa y lipasa. Sin embargo, la bacteria ingerida puede sobrevivir al mecanismo destructivo de los fagocitos, gracias a moléculas de bajo peso molecular que inhiben el sistema antibacteriano mieloperoxidasa-peróxido de hidrógeno-haluro (Canning, et al. 1985). Por ello, aunque los neutrófilos son las primeras células relacionadas con la eliminación de patógenos extraños, ellos son considerados de baja eficiencia contra Brucella, ya que esta bacteria puede crecer y sobrevivir en su interior y además es diseminada a través de estos leucocitos a órganos y diferentes localizaciones, desarrollándose una infección persistente.

Complemento: Uno de los primeros eventos que ocurren después de la entrada de la Brucella al organismo es la activación del complemento, la lisis de Brucella estaría mediada principalmente por la vía clásica del complemento, la cual es dependiente de anticuerpos (Fernández-prada, et al. 2001).

1.2.6.2 Inmunidad adaptativa

La exposición prolongada de un animal a Brucella cambiaría la naturaleza de la respuesta inmune, desde una inmunidad mediada por células hacia una respuesta humoral (caracterizada por la producción de IgM e IgG1), respuesta que se relaciona con una disminución en la actividad de las células T ayudadoras tipo 1, con una baja en la producción de INF-γ, favoreciéndose de esta forma un incremento de la actividad de las células T ayudadoras de tipo 2, disminuyendo la respuesta inmune celular, lo que favorecería de esta forma el establecimiento de la enfermedad crónica (Oñate, et al. 2000). Las funciones de la respuesta inmune adaptativa en la brucelosis se basan principalmente en tres mecanismos. Primero, la producción de IFN-γ por células T CD4+, CD8+, y células T γδ, que activa la función bactericida en macrófagos. Segundo, la citotoxicidad de células T CD8+ y 29

células T γδ que eliminan macrófagos infectados. Y tercero, isotipos de anticuerpos Th1, tales como IgG2a que opsonizan al patógeno para facilitar su fagocitosis (Ko y Splitter, 2003).

Linfocitos T CD4+ y CD8+: Después de la activación de los macrófagos, las células T inmaduras (Th0) se diferencian de células efectoras y de memoria, que están programadas para secretar distintos patrones de citoquinas (Golding, et al. 2001). La generación de células Th1 de memoria sólo puede realizarse si la respuesta inicial al estímulo se asocia a la producción de IL-12 e IFN-γ (Scharf, et al. 2001). El rol principal de la secreción de IFN-γ por las células Th1 en la inmunidad contra Brucella es activar la función bactericida de los macrófagos y linfocitos T CD8+ citotóxicos, así como la estimulación de la secreción de IgG2a (Scharf, et al. 2001; Ko y Splitter, 2003). En términos numéricos, la población celular predominante es la de linfocitos T CD4+ productores de IFN-γ (Ko y Splitter, 2003), responsables de la activación de macrófagos y la atracción de células inflamatorias efectoras, de ahí su importancia en promover la respuesta celular adquirida contra Brucella (Bae, et al. 2002; Wyckoff, 2002). Además, el IFN-γ inhibe la acción de IL-4 sobre las células T (Scharf, et al. 2001). Las células citotóxicas T CD8+ pueden actuar como células efectoras y eliminar macrófagos infectados con Brucella directamente (Oliveira, Soeurt y Splitter, 2002; Wyckoff, 2002). Las células blanco son reconocidas por las células citotóxicas en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad de clase I (MHC I) y son eliminadas por la acción de perforinas y granzimas (Golding, et al. 2001). Linfocitos T γδ: Las células T γδ representan una pequeña población de linfocitos, con un patrón único de reconocimiento de antígenos (Dieli, et al. 2003). En humanos, las células T γδ controlan el aumento en el número de microorganismos ya que secretan TNF-α e IFN-γ, después de ser activadas por antígenos no peptídicos, en su mayoría fosfoantígenos, los cuales no son presentados en el contexto del MHC (Giambartolomei, et al. 2002; Baldwin, et al. 2002; Ko y Splitter, 2003). En bovinos menores de un año, la población celular predominante es la de células T γδ y no la de células T αβ, lo que sugiere que el rol de este tipo celular es más significativo en la infección del ganado con brucelosis (Ko y Splitter, 2003). De todas maneras, en bovinos, la producción de IFN-γ por estas células es menor que la producida por las células CD4+ (Baldwin, et al. 2002). Linfocitos B: Las células B son estimuladas directamente por las células T a través de la interacción de moléculas coestimulatorias como CD40 y su ligando 30

CD40L presente en la célula T, lo cual, junto a las citoquinas liberadas, son importantes en promover el cambio de isotipo de IgM a IgG (Golding, et al. 2001). La opsonización acoplada al aumento de muerte de Brucella intracelular podría ser considerada como el principal rol de los anticuerpos contra la infección con Brucella (Ko y Splitter, 2003).

Citoquinas: Las citoquinas son moléculas clave en el control de la brucelosis, ya que permiten dirigir las respuestas hacia una respuesta inmune celular o humoral. B. abortus estimularía a las células presentadoras de antígenos para que secreten IL-12, la que induce a los linfocitos Th0 a diferenciarse en linfocitos Th1, secretores de IFN-γ (Oliveira, Soeurt y Splitter, 2002; Ko y Splitter. 2003). La interleuquina 18 (IL-18) citoquina sintetizada por macrófagos activados, también estimula la producción de IFN-γ, por lo que actúa sinérgicamente con IL-12 sobre las células T en la estimulación de la respuesta mediada por células contra Brucella (Pasquali, et al. 2002).

La IL-10, producida por linfocitos CD4+ Th2, macrófagos activados y algunas poblaciones de células B, inhibe la respuesta Th1, ya que disminuye la capacidad de presentar antígenos de los macrófagos e inhibe la secreción de IFN-γ, por lo tanto, aumenta la susceptibilidad a la infección por Brucella (Giambartolomei, et al. 2002).

1.2.7 Signos clínicos

El signo primario de brucelosis es el aborto. Los abortos ocurren generalmente después del quinto mes de gestación. Retención de placenta y metritis son secuelas frecuentes al aborto. Vacas infectadas con Brucella también puede dar a luz terneros débiles que mueren poco después (Youngquist y Threjfall, 2007).

En los machos la infección puede producir: Inflamación o atrofia de los testículos, infertilidad o disminución de la libido, inflamación de las vesículas seminales, en ocasiones puede producir artritis.

En los seres humanos la brucelosis se manifiesta con: Dolor de cabeza, fiebre intermitente, sudoración profusa, dolor en las articulaciones, inflamación de testículos, impotencia sexual, esterilidad y aborto (ICA, 2010).

1.2.8 Diagnóstico

Solamente con los exámenes de laboratorio es posible confirmar el diagnóstico de brucelosis; en forma directa con intento de aislamiento bacteriológico o con pruebas serológicas que confirmen la presencia de anticuerpos en suero sanguíneo o leche.

1.2.8.1 Métodos directos

Se basan en evidenciar la presencia de la bacteria o de sus componentes en los tejidos de los animales o del hombre. El diagnóstico definitivo requiere el aislamiento de la bacteria, frecuentemente a partir de hemocultivos. La técnica más utilizada para realizarlos es la de Ruiz Castañeda, que consiste en la inoculación de sangre en frascos herméticamente cerrados que contienen, simultáneamente, un medio líquido (caldo triptosa) y un medio sólido (agar triptosa). Los cultivos deben mantenerse en incubación un tiempo no menor a 30 días debido a que las bacterias del género Brucella son de crecimiento lento. En los últimos años se han desarrollado sistemas de hemocultivo automáticos o semiautomáticos entre los que se destaca el Bactec, que permite detectar más del 95% de los cultivos positivos antes del séptimo día de incubación. A medida que progresa la enfermedad disminuye la probabilidad de positividad de los hemocultivos, por lo que se hace necesario el aislamiento a partir de ganglios linfáticos, hígado o bazo. Para estudiar la presencia de antígenos de Brucella en distintos tejidos pueden emplearse los métodos de ELISA, inmunofluorescencia directa, hemaglutinación reversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En particular, se ha diseñado una técnica de PCR ampliamente utilizada en la búsqueda de Brucella en alimentos, pero que registra muchos casos de falsos positivos debido a la presencia de la bacteria Ochrobactrum anthropi, muy relacionada genéticamente con Brucella. Recientemente se ha descrito otra técnica denominada PCR-ELISA que se emplea en el diagnóstico de brucelosis humana (Morata, et al. 2003).

1.2.8.2 Métodos indirectos

Las dificultades propias de la implementación del aislamiento de Brucella a partir de los distintos tejidos hacen que los métodos indirectos sean el recurso diagnóstico más utilizado.

Existen numerosas pruebas que están destinadas a detectar no sólo el mayor número de individuos infectados sino al mismo tiempo diferenciar entre infectados y vacunados, así como detectar las reacciones cruzadas. La mayoría de las pruebas de laboratorio utilizan como antígenos suspensiones de Brucella en fase S o R, según la cepa bacteriana. Las cepas recomendadas por los organismos internacionales en la elaboración de los mismos son B. abortus 1119-3 ó 99S. Estos antígenos permiten detectar anticuerpos anti B. abortus, B. suis y B. mellitensis, mientras que para anticuerpos anti B. canis y B. ovis se necesitan antígenos específicos de especie (Morata, et al. 2003).

Dentro de las pruebas serológicas utilizadas en el diagnóstico se encuentran: -

Aglutinación lenta en tubo de Wright (SAT) Prueba de aglutinación con y sin 2-mercaptuetanol (2-ME) Reacción de Huddleson Antígeno Tamponado en Placa (BPA) Prueba de Coombs Fijación de complemento Inmunofluorescencia indirecta ELISA indirecto (ELISA-I) ELISA competitivo (ELISA-C) Polarización de fluorescencia (FPA) Prueba de inmunodifusión en agar (IDAG)

1.2.8.2.1 Técnica de aglutinación con rosa de bengala (RB) para la detección de anticuerpos contra Brucella Abortus en suero

Antígeno: Constituido por células completas inactivadas de Brucella abortus cepa 1119-3 o 99, acidificado a pH 3.6 ±0.05, coloreado con Rosa de Bengala, y con concentración celular aproximada del 8%. Debe ser almacenado entre 4°C a 5°C y no se debe congelar en ningún momento.

Suero control positivo: Es obtenido por comparación con el suero de referencia secundaria (procedente de un animal infectado) y la aglutinación producida debe ser la mínima reacción positiva visible claramente. El suero control positivo se distribuye en alícuotas de pequeño volumen (100µl a 200µl) y se almacena en congelación. En el momento de la prueba, una alícuota es descongelada y equilibrada a temperatura ambiente (18°C a 25°C). Esta alícuota debe mantenerse en refrigeración hasta terminar el contenido. 33

Suero control negativo: Es obtenido por comparación con el suero negativo de referencia secundaria (procedente de hato libre de brucelosis) y presenta reacción negativa en todas las pruebas serológicas de alta sensibilidad. El suero control negativo se distribuye en alícuotas de pequeño volumen (100µl a 200µl) y se almacena en congelación. En el momento de la prueba, una alícuota es descongelada y equilibrada a temperatura ambiente (18°C a 25°C). Esta alícuota debe mantenerse en refrigeración hasta terminar el contenido. Debe utilizarse un producto registrado ante el ICA y un lote aprobado por el mismo, el proveedor debe anexar el certificado de control de calidad oficial efectuado al lote del producto. En las pruebas in vitro, los antígenos particulados, en este caso células completas de Brucella Abortus, interactúan con los anticuerpos para generar una aglutinación visible produciendo una reacción de tipo secundario que depende de las proporciones óptimas de los reactantes. La aglutinación inespecífica de las cepas lisas de Brucella, se reduce a pH 3,6, manteniéndose la actividad de los anticuerpos específicos tipo IgG1, razón por la cual se debe emplear en esta prueba el antígeno bacteriano teñido con el colorante Rosa de Bengala (RB), tamponado a Ph 3.6. Es indispensable que antígeno y sueros (anticuerpos) se encuentren a temperatura ambiente (18°C a 25°C) para su reacción confiable en el momento de realizarse (ICA, 2005).

1.2.9 Vacunas contra Brucella Abortus

La prevención de la diseminación de la brucelosis se basa en la administración de vacunas adecuadas contra la infección por B. Abortus. Con este objetivo se han utilizado clásicamente cepas bacterianas atenuadas y componentes antigénicos propios de la Brucella. La habilidad de un antígeno específico para inducir en forma preferencial una respuesta Th1 es un aspecto importante a considerar en el desarrollo de vacunas contra Brucella Abortus (Stevens, et al. 2000).

Brucella abortus S19: La cepa 19 de Brucella Abortus es una cepa lisa que posee la cadena O del LPS, por ello, en animales inmunizados con esta cepa se pueden observar anticuerpos específicos contra este antígeno del tipo IgG1, IgG2b e IgM (Vemulapalli, et al. 2000). El defecto genético que permite la atenuación de esta cepa aún no ha sido definido, pero hace que pierda un mecanismo de virulencia esencial. Su efectividad en el ganado bovino depende de variables como la edad de vacunación, dosis, ruta de administración y de la prevalencia de la brucelosis en el rebaño vacunado (Schurig, et al. 2002). Los anticuerpos inducidos por la vacunación con esta cepa interfieren con el 34

diagnóstico tradicional de bovinos infectados con cepas silvestres de B. abortus, por lo que tiene un uso limitado en la vacunación del ganado; esta cepa puede también inducir aborto en hembras preñadas y es patógena para la especie humana (Olsen, 2000).

Brucella Abortus 45/20: La cepa 45/20 es una cepa rugosa, fue desarrollada por 20 pasajes repetidos de Brucella Abortus 45 en cobayos. A pesar de que no induce anticuerpos contra la cadena O del LPS e induce una protección significativa contra la infección por Brucella Abortus, no es muy utilizada porque es inestable y puede revertir a su forma virulenta in vivo. La cepa 45/20 también ha sido utilizada en forma inactiva, pero adicionada junto a un adyuvante oleoso, la que ha demostrado una relativa efectividad, pero provoca una reacción inflamatoria local en el sitio de la inyección (Schurig, et al. 2002).

Brucella Abortus RB51: Brucella Abortus RB51 es una cepa rugosa, resistente a rifampicina, que ha sido derivada de la cepa virulenta Brucella Abortus 2308 (Schurig, et al. 2002). Esta cepa es utilizada desde 1996 contra la brucelosis bovina en Estados Unidos y en otros países, como Chile. Es administrada en dosis que fluctúan entre 1x1010 y 4x1010 UFC por mililitro (Unidades Formadoras de Colonias) en bovinos no menores de 4 meses de edad. La protección que proporciona la vacunación con esta cepa se debe a la activación de linfocitos T (Vemulapalli, et al. 2000; Olsen, 2000). La vacunación induce altos niveles de IFNγ, lo cual es fundamental en las etapas primarias de la infección (Pasquali, et al. 2001). La inoculación intraperitoneal de B. abortus RB51 en ratones resulta en una colonización del bazo que desaparece luego de cuatro semanas postinmunización. La vacunación del ganado permite la diferenciación entre bovinos vacunados y aquellos infectados con cepas silvestres debido a que no induce anticuerpos contra la cadena O del lipopolisacárido (Pasquali, et al. 2001). Sin embargo, se ha determinado que puede causar placentitis, endometritis e infección fetal, en vaquillas adultas que han sido vacunadas durante la preñez (Van Metre, et al. 1999; Olsen, 2000). Basándose en reportes sobre la efectividad de la proteína SOD Cu/Zn de B. abortus expresada en E. coli DH5α en proteger a ratones vacunados del desafío con la cepa patogénica de B. abortus 2308, Schurig desarrollo una nueva cepa de B. abortus RB51, que sobreexpresa la proteína SOD Cu/Zn de Brucella (B. abortus RB51-SOD) (Vemulapalli, et al.2000). La inmunidad protectora proporcionada por la cepa B. abortus RB51-SOD contra Brucella es superior a la de B. abortus RB51, cepa parental, sin alterar las características de atenuación de la vacuna (Vemulapalli, et al. 2000).

1.2.10 Distribución

La incidencia y prevalencia de la brucelosis tienen importantes variaciones geográficas. Las zonas de mayor prevalencia corresponden a la región del Mediterráneo, Asia occidental, algunas partes de África y América (Estados Unidos, México, Brasil, Perú, Colombia y Argentina). B. melitensis es la especie más difundida seguida de B. abortus y B. suis. En Argentina una de las principales especies responsable de la brucelosis en el hombre es B. suis, aunque la verdadera situación epidemiológica de la brucelosis en cerdos, portadores de esta especie, es desconocida (Samartino, 2002).

1.3 MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

El municipio de Campohermoso tiene una extensión de 301 kilómetros cuadrados, está localizado en los 5º 02’ de latitud norte y los 73º 06’ de longitud oeste en la vertiente oriental de la Cordillera Oriental en el departamento de Boyacá. Limita por el norte con el municipio de Miraflores, por el occidente con el municipio de Macanal, por el oriente con el municipio de Páez y por el sur con los municipios de Santa María, San Luís de Gaceno y Páez.

Figura 2. Mapa político del municipio de Campohermoso

Fuente: Esquema de ordenamiento territorial, 1999.

Presenta una altura que varía entre los 1.150 m.s.n.m para el casco urbano, los 650 m. s.n.m. hacia el nivel del río Lengupá y los 2.000 m.s.n.m hacia la serranía de San Antonio en límites con el municipio de Miraflores. La temperatura oscila entre 13°C, en las áreas más altas y 30°C, en las zonas más bajas del municipio, a partir del análisis realizado sobre la región, la humedad relativa media se mantiene en general por encima del 70% llegando hasta el 97%, siendo la media de 85%. 37

Está dividido en 22 veredas: Agualarga, Cañadas, Castañal, Centro, Choma Colombia, , Encenillo, Guamal, Hoya Grande, Huerta Vieja, Limón, Los Cedros, Macanalito, Palmichal, Puerto Triunfo, Rodeo, Sabanetas, San Agustin, San José, Teguas, Toldo, Vistahermosa.

El área total del municipio es de 30.164 hectáreas, el área del sector agrícola es de 919,64 hectáreas que equivalen al 3,05 % del área total. El área de pastos es 15.412,41 hectáreas (el 51,10 % del área total del municipio); en estanques piscícolas se encuentra un espejo de agua 4,89 Hectáreas (0,02% del área total). El área otros (13.827.1 hectáreas) se encuentra conformada por vertientes hídricas, vivienda, zonas improductivas y bosque equivale al 45,83 % del área total del 100% del municipio.

El municipio de Campohermoso es netamente agropecuario; las actividades generales son: El 70% de la población se dedica al sector pecuario en la cría y ceba de ganado bovino; el 30% de la población restante se basa en el sector agrícola. Los cultivos predominantes son: maíz asociado con fríjol, seguido yuca, caña de azúcar y plátano con gran impulso en el cultivo de lulo (Esquema de ordenamiento territorial, 1999).

En el año 2008 FEDEGAN registro 20345 cabezas de ganado bovino distribuidos en los siguientes grupos etarios: terneras menores de un año, 2189; hembras entre 1 y 2 años, 1941; hembras entre 2 y 3 años, 3016; hembras mayores de 3 años, 6239; terneros menores de un año, 1847; machos entre 1 y 2 años, 2043; machos entre 2 y 3 años, 2224; machos mayores de 3 años, 1021.

1.4 MARCO LEGAL

ACUERDO 00009 de 2003 (ICA)

Por el cual se establecen las actividades específicas y requisitos para la autorización de laboratorios que realicen pruebas de rosa de Bengala y Elisa indirecta para el diagnóstico serológico de brucelosis bovina.

ACUERDO 00010 de 2003 (ICA)

Por el cual se establecen las actividades específicas y requisitos para la autorización de médicos veterinarios como organismos de inspección en el programa de brucelosis bovina.

RESOLUCION 02059 de 2003 (ICA)

Por la cual se adoptan medidas sanitarias para la brucelosis bovina en Colombia y establece un programa orientado en primer término a prevenir y controlar la enfermedad con perspectivas a su erradicación en las especies bovina y bufalina y secundariamente en las demás especies susceptibles como son la porcina, caprina, ovina y equina, en el territorio nacional; estableciendo dos ciclos de vacunación anual obligatoria contra la brucelosis bovina en el territorio nacional de toda hembra bovina y bufalina entre los 3 y 7 meses de edad con vacunas registradas y aprobadas por el ICA (Cepa 19 y Cepa RB51)

RESOLUCION 840 de 2011 (ICA)

Por medio de la cual se establecen medidas sanitarias para la prevención, el control y la erradicación de la brucelosis en las especies bovina, bufalina, caprina, ovina y porcina en Colombia

2. METODOLOGIA

2.1 TIPO DE ESTUDIO

Los estudios de este tipo se clasifican como estudio epidemiológico descriptivo de corte transversal, ya que se evaluó una población determinada en un tiempo determinado sin manipulación de las variables.

Estudios descriptivos de corte transversal (prevalencia) Los estudios descriptivos son diseños, que ubican en una perspectiva de primera aproximación al conocimiento de un determinado problema, se realizan por simple observación. Únicamente permiten, por lo tanto, constatar una situación dada. Consiguen sin embargo alcanzar dos tipos de objetivos. Por un lado, ofrecen información sobre la situación del problema de salud de interés, con la mayor precisión posible. De esta forma, identifican proporciones de individuos afectados y/o relacionan la distribución de algunas características o exposiciones con la del problema en estudio. Por otro lado, con una fuente inestimable de hipótesis, aún cuando su capacidad de verificación sea al menos discutible (Cerda, 1995).

Los estudios transversales tienen ventajas como son:  Este tipo de estudios dan una descripción de la magnitud y el alcance del problema. Lo que conocemos como la "fotografía", la situación en un momento dado.  Proporcionan información basal para estudios de seguimiento posteriores, ya que permiten eliminar del seguimiento a los casos ya existentes, los casos prevalentes.  Son útiles en evaluación de intervenciones sobre la población. Una combinación secuencial de estudios transversales permitiría evaluar el impacto sobre la prevalencia, si se espera una reducción en la incidencia o una mejoría en el pronóstico (Pita, 2001).

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

La edad mínima requerida para tomar la muestra debe ser 24 meses, el tamaño de la muestra se determino por medio del programa estadístico para análisis de datos Win episcope 2.0. En el año 2008 cifras de la base de datos de FABEGAN, 40

en el municipio de Campohermoso habían 20345 cabezas de ganado bovino, de las cuales 9176 eran hembras mayores de 24 meses. Para obtener el tamaño de la muestra se ha calculado en base a los siguientes datos: población objetivo 9176 animales, prevalencia esperada del 50%, nivel de confianza del 95% y un error del 5%; con los anteriores datos la muestra representativa es de 385 animales (Tabla 1). Tabla 1. Tamaño de la muestra.

Fuente: (El autor)

En el departamento de Boyacá, en particular en la región del Lengupa, no existe estudio alguno concerniente a seroprevalencia en años anteriores, las cuales, proporcionen la información sobre el porcentaje aproximado de bovinos infectados. En consecuencia la inexistencia de antecedentes epidemiológicos de la zona, obliga a tomar como referencia el 50% de prevalencia esperada, es decir se espera que máximo la mitad de la población este infectada.

La elección de las fincas y selección de los animales se realiza de forma aleatoria simple, de esta forma todas las fincas y animales tienen probabilidad de formar parte del estudio.

2.3 MATERIALES Y MÉTODOS PROCEDIMIENTOS APLICADOS

INVESTIGACIÓN.

PROCESO

2.3.1 Materiales

Material Aguja vacutainer Tubos tapa roja Termo (icopor) Gel refrigerante Alcohol antiséptico y algodón Lazos (manila) Guantes de examen

Cantidad 385 385 1 2

Material Centrifuga Viales (eppendorf) Micropipeta Puntas desechables

Cantidad 1 385 1 385

Kit rosa de bengala

1 400

Placa de aglutinación Agitador vortex

1 1

2.3.2 Procesos y procedimientos aplicados

Para obtención de la muestra se inmovilizó el animal con lazos, en brete o embudo, posteriormente, se realizo limpieza con alcohol y algodón en la zona ventral de la cola a nivel de las segunda y cuarta vertebra coccígea, se hizo punción de la vena coccígea con sistema vacutainer, por cada animal se utilizo una aguja y un tubo (tapón rojo) diferente, la camisa se reutilizo. Se obtuvieron 67ml de sangre aproximadamente. Una vez tomada la muestra se dejo a temperatura ambiente a la sombra hasta la retracción del coagulo. El tubo ya identificado se ubico en gradillas y en termos de poliuretano (icopor) con hielo suficiente para mantener la refrigeración. Para la obtención del suero sanguíneo, las muestras fueron centrifugadas a 1500 rpm durante 10 minutos, una vez separado el suero se recolecto a un tubo tipo eppendorf manteniendo la identificación de la muestra. Los viales fueron llevados a temperatura entre 4-8°C en refrigerador.

Los sueros controles, sueros diagnósticos y el antígeno se estabilizaron a temperatura ambiente del laboratorio antes de iniciar la prueba de aglutinación (Rosa de Bengala). Se colocaron 30µl de los sueros control positivo y negativo en los sitios de la placa de aglutinación de vidrio previamente definidos e identificados para ello, y 30 µl de sueros problema en lugares sucesivos también identificados. Luego se añadió 30µl de antígeno sobre los 30 µl de suero. Se mezclo homogéneamente durante 4 minutos, inmediatamente se interpreto el resultado 42

de cada suero anotando el resultado, positivo o negativo. Al momento de interpretar el resultado de la prueba la muestra positiva presento aglutinación fina con borde y fondo transparente o formación de grumos definidos; el negativo no evidencio aglutinación alguna, coloración rosado uniforme sin grumo y sin borde.

2.4 UNIVERSO, POBLACIÓN Y MUESTRAS EXPERIMENTALES

En la base de datos de FEDEGAN del año 2008 se registraron 1238 predios distribuidos en las 22 veredas del municipio, y donde se encuentran 20345 cabezas de ganado bovino, de las cuales 9176 son hembras bovinas mayores de 24 meses, siendo esta la población objeto de la investigación.

2.5 FUENTES Y TÉCNICA DE RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN

La información se obtuvo de la realización de una encuesta a los propietarios de los predios y/o animales, la cual recolectaba los datos de cada animal muestreado con el fin de obtener la información necesaria para el análisis de los resultados (Anexo 1).

2.6 DEFINICIÓN Y OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES Y LOS INDICADORES

VARIABLE Registro de animal individual

TIPO Cualitativa

Vacunado

Cualitativa

Aborto

Cualitativa

Nacidos en la finca

Cualitativa

DEFINICIÓN Historial a partir del nacimiento Administración de vacuna Interrupción de la preñez Sitio o lugar de nacimiento

INDICADOR Si, NO SI, NO SI, NO SI, NO

2.7 TRATAMIENTO Y PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN

La información obtenida de la encuesta realizada se organizo por vereda teniendo en cuenta para cada muestra lo siguiente: identificación de la muestra, edad, vacunado, aborto, registro de animal individual, nacidos en la finca, total predios muestreados. El análisis estadístico se efectuó mediante el programa SPSS 10.0, además, se aplicaron las pruebas de normalidad Shapiro-Wilk y KolmogorovSmirnov.

3. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La principal fuente económica del municipio de Campohermoso es la ganadería, encontrándose alrededor de 20345 bovinos, los cuales no tienen datos individuales ni poblacionales de la presencia de enfermedades de tipo infeccioso, por lo tanto es el primer estudio que se realiza de enfermedades de este tipo tomando un total de 385 muestras. El resultado obtenido fue una seropositividad de 4.72% en animales (Gráfica 2) y 4,1% en predios (Tabla No 9).

Tabla 2. Total de muestras tomadas por vereda y resultado.

MUESTREO ALEATORIO Total Vereda muestras Agualarga 11 Cañadas 14 Castañal 32 Cedros 17 Centro 22 Choma 7 Colombia 20 Encenillo 28 Guamal 17 Hoya Grande 14 Huerta Vieja 15 Limon 10 Macanalito 15 Palmichal 16 Puerto Triunfo 11 Rodeo 15 Sabanetas 16 San Agustin 9 San Jose 7 Teguas 49 Toldo 31 Vista Hermosa 9 TOTAL 385

ROSA DE BENGALA Positivo

Negativo

0 0 0 3 2 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 2 0 2 2 1 17

11 14 32 14 20 0 19 0 16 0 14 0 14 0 10 0 0 7 0 47 29 8 368

3.1 ANÁLISIS DESCRIPTIVO

En la (Gráfica 1) se puede visualizar que las únicas veredas que mostraron hembras positivas fueron Cedros con 3 casos, Centro, San Agustin, Teguas y Toldo presentaron 2 hembras positivas y las veredas de Colombia, Guamal, Huerta Vieja, Macanalito, Puerto Triunfo y Vista Hermosa presentaron únicamente un caso. Es decir que de las 385 hembras mayores de 2 años que se tomaron para el estudio, existen 17 hembras seropositivas a B. Abortus.

Gráfica 1. Prevalencia de Brucella Abortus en cada vereda del municipio de Campohermoso.

Fuente: (El autor)

Se observó que 17 hembras mayores de dos años fueron seropositivas a Brucella Abortus, esto equivale al 4,72% de la población muestreada; es decir que la prevalencia de hembras mayores a dos años es de 0,0472 (Gráfica 2). Se han realizado estudios de seropositividad a B. Abortus en 3 de los seis municipios que conforman la provincia del Lengupa. Cubides (2011) evaluó la presencia de brucelosis en hembras mayores de 24 meses edad en el municipio de Berbeo utilizando la técnica Rosa de Bengala, tamaño de muestra de (n=166) hembras, encontrando una prevalencia del 2%; igualmente, durante meses de enero-abril de 2011 en el municipio de San Eduardo se realizó un estudio muestreando (n=311) hembras bovinas mayores de 24 meses de edad, utilizando la técnica Rosa de Bengala se obtuvo una prevalencia de 42/311 individuos seropositivos equivalentes al 13,5% y 269/311 individuos negativos equivalentes al 86,5% del total de hembras muestreadas (Goyeneche, 2011). Por ultimo, Zaens (2011) 46

realizó un estudio de características similares a los anteriores en el municipio de Miraflores encontrando una prevalencia del 7%. Divantoque, et al. (2009) realizaron un estudio descriptivo del programa “ Hatos Libres de Brucelosis” en conjunto con FEDEGAN Tunja, muestrearon 1910 animales en 41 fincas ubicas en las provincias de Centro, Tundama y Sugamuxi, en las cuales el 98.8% de los bovinos eran hembras y el 1.2% machos, encontrando en éstos una positividad ante la prueba Rosa de Bengala del 2,9%, ante la prueba Elisa Indirecta un 0,8% y ante la prueba Elisa Competitiva un 2,8% de positividad, con una prevalencia de 0,73% en la población analizada.

Gráfica 2. Porcentaje de hembras positivas y negativas en el municipio de Campohermoso.

Fuente: (El autor)

Se puede observar que Cedros, San Agustín y Vista Hermosa son las veredas que presentaron los valores más altos de prevalencia, siendo la vereda de San Agustín la que mayor prevalencia alcanzo con un valor de p= 0,222, que equivale al 22,22% de hembras infectadas, es decir que 2 de cada 10 hembras mayores de 2 años en la vereda de San Agustín presentaran seropositividad a la enfermedad. Por otra parte tenemos que las veredas de Agualarga, Cañadas, Castañal, Choma, Encenillo, Hoya Grande, Limón, Palmichal, Rodeo, Sabanetas y San José, no presentaron casos, es decir que el 50% de las veredas del municipio de Campohermoso no presentan Brucella Abortus (Tabla 3).

Tabla 3. Prevalencia de Brucella Abortus por veredas en el municipio de Campohermoso.

Vereda

Positivo

Negativo

Prevalencia

AGUALARGA CAÑADAS CASTAÑAL CEDROS CENTRO CHOMA COLOMBIA ENCENILLO GUAMAL HOYA GRANDE HUERTA VIEJA LIMON MACANALITO PALMICHAL PUERTO TRIUNFO RODEO SABANETAS SAN AGUSTIN SAN JOSE TEGUAS TOLDO VISTA HERMOSA TOTAL

0 0 0 3 2 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 2 0 2 2 1 17

11 14 32 14 20 7 19 28 16 14 14 10 14 16 10 15 16 7 7 47 29 8 368

0 0 0 0,176470588 0,090909091 0 0,05 0 0,058823529 0 0,06666667 0 0,06666667 0 0,090909091 0 0 0,222222222 0 0,040816327 0,064516129 0,111111111 0,047232337

Total hembras 11 14 32 17 22 7 20 28 17 14 15 10 15 16 11 15 16 9 7 49 31 9 385

Se encontró que el 36,36% de hembras mayores de 2 años fueron vacunadas mientras que 63,64% de las hembras no están vacunadas, también se pudo evidenciar que el 33,76% de las hembras vacunadas son negativas esto se puede deber a que la vacuna genera inmunidad protegiendo al animal de la enfermedad. Por otro lado tenemos que 2,85% de hembras que no fueron vacunadas presentan seropositividad, lo que nos lleva a deducir que el 58,82% de las hembras que presentaron seropositividad fueron vacunadas, es decir que la prevalencia de Brucella Abortus no depende de que una hembra mayor de 2 años sea vacuna ya que un gran error que se comete al momento de colocar la vacuna es la edad de la ternera. La aplicación de la vacuna después de los 8 meses de edad genera anticuerpos residuales pasados los dos primeros años de vida, lo cual, hace suponer que este es el factor principal para obtener un resultado positivo (Tabla 4). El ICA en el programa nacional de control y de erradicación de la brucelosis 48

bovina ha establecido la vacunación obligatoria de las terneras entre 3 y 8 meses de edad, con las vacunas cepa 19 o cepa RB51, en dos ciclos de vacunación anual. La cobertura nacional para 2008 alcanzó cifras del 99% (FEDEGAN, 2008; Orjuela, et al. 2007).

Tabla 4. Relación de animales con o sin vacunación, positivos y negativos a Brucelosis.

Vacunada No vacunada TOTAL

POSITIVA 10 7 17

NEGATIVA TOTAL 130 140 238 245 368 385

Se encontró que el 100% de hembras positivas se utiliza como método de reproducción la monta natural. Igualmente, en el total de hembras muestreadas no utilizan otro método de reproducción diferente que el uso de toro reproductor (Tabla 5).

Tabla 5. Relación de animales positivos o negativos a Brucelosis con relación a parámetro reproductivo.

Monta Natural Inseminación artificial TOTAL

POSITIVA 17 0 17

NEGATIVA 368 0 368

TOTAL 385 0 385

Se encontró que el 93,2% de la población muestreada no tienen registros individuales, mientras que el 6,8% poseen registro. Los propietarios del 76,4% de animales que fueron positivos a Brucella Abortus no tienen registros individuales en el cual se sustente el historial de cada animal, es decir, no conocen datos exactos de la sanidad y producción de sus animales (Tabla No 6).

Tabla 6. Relación de animales positivos o negativos a Brucelosis con o sin registro individual.

REGISTRO NO REGISTRO TOTAL

POSITIVA 4 13 17

NEGATIVA TOTAL 22 26 346 359 368 385

Se evidencia que el 94,11% de las hembras mayores a dos años que fueron positivas no presentan abortos, podemos entonces afirmar que la presencia de Brucella Abortus no es un indicativo para que las hembras bovinas del municipio de Campohermoso presenten aborto. No obstante es preocupante que 6,25% de hembras negativas mayores de 2 años presenten abortos en las veredas del municipio de Campohermoso (Tabla 7). El aborto, es una enfermedad inespecífica; es un signo clínico de numerosas enfermedades que afectan ya sea al feto, a la placenta, al aparato reproductor de la madre, o causante de enfermedad sistémica en la madre.

Tabla 7. Relación de animales positivos y negativos a Brucelosis con presencia de abortos.

Aborto No aborto TOTAL

POSITIVA 1 16 17

NEGATIVA TOTAL 23 24 345 361 368 385

Se muestrearon 341 de 1237 predios en las 22 veredas que conforman el municipio de Campohermoso es decir que se tomaron para el estudio el 27,5% del total de los predios de donde se obtuvo que el 4,1% de los predios muestreados están afectados (Gráfica 3). En el departamento de Córdoba, Tique, González y Mattar (2009) realizaron un estudio de seroprevalencia empleando las técnicas de Rosa Bengala (n=29.628) y ELISA indirecta (n=341), encontrando una prevalencia del 3,71% en animales y de 12,7% (635/4922) en predios.

Gráfica 3. Análisis de prevalencia de Brucella Abortus por predios en las 22 veredas del Municipio de Campohermoso.

Fuente: (El autor)

El 41,17% de hembras mayores a 2 años que presentaron Brucella Abortus no nacieron en las finca a la cual pertenecen en la actualidad, mientras que 72,01% son hembras negativas y fueron nacidas en las fincas, es importante que las hembras sean criadas desde el vientre en la finca a la cual van a pertenecer para la implementación de estrategias de selección y sanidad desde el nacimiento hasta la etapa de reproducción y producción (Tabla 8).

Tabla 8. Relación de animales positivos o negativos a nacimiento en la finca

Nacida finca No nacida finca TOTAL

Brucelosis con el

POSITIVA NEGATIVA TOTAL 10 265 275 7 103 110 17 368 385

Tenemos que de los 341 predios muestreados el 4,1% de los predios presentan hembras seropositivas, es decir que en las veredas del municipio de Campohermoso se encontrara una hembra mayor de dos años infectada con Brucella Abortus cada 72,76 predios (Tabla 9).

Tabla 9. Descripción de Brucella Abortus por predios en las veredas del municipio de Campohermoso.

Vereda AGUALARGA CAÑADAS CASTAÑAL CEDROS CENTRO CHOMA COLOMBIA ENCENILLO GUAMAL HOYA GRANDE HUERTA VIEJA LIMON MACANALITO PALMICHAL PUERTO TRIUNFO RODEO SABANETAS SAN AGUSTIN SAN JOSE TEGUAS TOLDO VISTAHERMOSA TOTAL

Total predios 33 49 76 40 80 29 56 82 45 88 54 24 74 74 53 43 42 36 36 87 99 37 1237

Predios muestreados 11 12 29 11 27 8 19 24 16 13 15 9 15 15 12 12 14 7 6 30 28 8 341

Predios afectados 0 0 0 2 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 2 2 1 14

N° Anim afectados 0 0 0 3 2 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 2 0 2 2 1 17

La vereda de Cedros presenta el 18,18% de predios infectados, seguida de las veredas de San Agustín y Vista Hermosa con el 14,28% y 12,5% respectivamente, y la vereda que menos predios tiene infectados es Centro que tiene solo el 3,7% de los predios.

Por otro lado tenemos que en los predios infectados con hembras que presentan Brucella Abortus presentaran una hembra infectada cada 0,823 predios, es decir que la relación es predio infectado por hembra infectada (Tabla 10).

Tabla 10. Porcentaje de predios infectados por Vereda.

Vereda CEDROS CENTRO COLOMBIA GUAMAL HUERTA VIEJA MACANALITO PUERTO TRIUNFO SAN AGUSTIN TEGUAS TOLDO VISTA HERMOSA TOTAL

Predios muestreados 11 27 19 16 15 15 12 7 30 28 8 188

Predios afectados 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 14

% Predios infectados 18,18181818 3,703703704 5,263157895 6,25 6,666666667 6,666666667 8,333333333 14,28571429 6,666666667 7,142857143 12,5 7,446808511

3.2 ANALISIS ESTADISTICO

3.2.1 Prueba de normalidad Se aplico la prueba de normalidad de Shapiro – Wilk con una confianza de 95% y se obtuvo que W calculado (W cal = 0,790 y 0,819) es menor que W de tabla (W tab =0,911). Esto quiere decir que las hembras positivas y negativas de las veredas del municipio de Campohermoso no provienen de una población con distribución normal (Tabla 11). Tabla 11: Prueba Shapiro-Wilk. Veredas Campohermoso POSITIVOS NEGATIVOS

Shapiro-Wilk Estadístico ,790 ,819

Gl 22 22

Sig. ,000 ,001

a. Corrección de la significación de Lilliefors gl: grados de libertad Sig: nivel de significancia

Como los valores son menores a 1,480 con 1-£ de 0,975, decimos que los datos de hembras positivas y negativas por vereda del municipio de Campohermoso provienen de una muestra normal, es decir se puede generalizar para toda la población lo observado en la muestra (Tabla 12).

Tabla 12. Prueba de Kolmogorov-Smirnov (K-S) no paramétrica para una muestra.

POSITIVOS 22

NEGATIVOS 22

Media

,77

16,73

Desviación típica

,922

9,682

Absoluta

,299

,257

Positiva Negativa Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintót. (bilateral)

,299 -,201 1,402 ,039

,257 -,158 1,206 ,109

N Parámetros normales(a,b) Diferencias más extremas

a: La distribución de contraste es la Normal. b: Se han calculado a partir de los datos.

4. CONCLUSIONES

La prevalencia de brucella abortus encontrada en el municipio de Campohermoso fue de 4,72%, este indicativo no esta lejos de la seropositividad que reporta y mantiene el ICA que es de 3,8% para el hato nacional.

De un total de 1237 predios ganaderos 341 fueron muestreados, la prevalencia predial a brucelosis es de 4,1%, esta cifra es menor a la seropositividad encontrada en los bovinos muestreados, situación que puede ser explica por el programa de control y de erradicación que se esta implementando en el país. Los datos obtenidos en la encuesta más del 40% de las hembras afectadas provenían de otras fincas, la movilización de animales entre fincas condiciona el comportamiento de la brucelosis en la población bovina del municipio. Al mismo tiempo, la inexistencia de registros individuales, considerando que cada registro individual que se lleva bajo una rutina puede repercutir directamente sobre los promedios y apreciaciones, porque el dato de vacunación no fue suministrado con seguridad y precisión al momento de realizar la encuesta a cada animal.

Los ganaderos del municipio de Campohermoso no utilizan e incluso no tienen conocimiento del uso de inseminación artificial como otra opción reproductiva para utilizar en sus ganaderías, encontrándose que fueron sometidas a monta natural la totalidad de hembras muestreadas.

Las veredas de mayor prevalencia fue San Agustin con un 22.22% de prevalencia, seguida de Cedros con 17,64% y Vista Hermosa 11.11% siendo estos valores mayor 4.5 veces que el promedio nacional, a más de lo anterior, el 50% de las veredas del municipio no presentaron un solo caso de brucella.

La prueba de normalidad aplicada Shapiro–Wilk indica que las muestras tomadas no provienen de una población con distribución normal, al contrario, la prueba Kolmogorov-Smirnov no paramétrica dice que los datos de hembras positivas y negativas por vereda provienen de una muestra normal divulgando que, los resultados del estudio se pueden generalizar para toda la población del municipio de Campohermoso, es decir, que es posible establecer la prevalencia total de brucelosis del municipio. La prueba Rosa de Bengala ha sido evaluada por diversos autores y ha demostrado elevada sensibilidad (94,5%) y una especificidad relativamente baja 55

(52,2%), se considera la realizaci贸n de una prueba confirmatoria a todas las muestras para evitar falsos negativos.

5. IMPACTO

La ganadería es uno de los factores más importantes de la economía y el sustento de la mayoría de los habitantes del municipio y las enfermedades animales zoonóticas continúan siendo un serio obstáculo para la salud pública, el progreso económico y social, particularmente la brucelosis es una de estas enfermedades en la cual no se aplican o se toman a tiempo las medidas necesarias para la prevención sanitaria con el fin de mitigar los riesgos cuando s e esta expuesto a la enfermedad. El desconocimiento de la enfermedad, como puede llegar la enfermedad, como se transmite a la ganadería y al hombre, genera un problema de salud pública y ocupacional. Tener conocimiento y conciencia de tomar las medidas necesarias para prevenir la infección sería el primer paso en la erradicación de la enfermedad, pues mientras existan reservorios (animales infectados) del microorganismo existirá la enfermedad. Para el campo económico el costo-beneficio se basa principalmente en tres aspectos: el diagnóstico correcto, la vacunación y la eliminación de los animales positivos con un único destino: sacrificio. Los ganaderos del municipio tienen la iniciativa de ingresar sus fincas al programa “Hatos Libres de Brucelosis” pero no tienen la información suficiente del programa, el cual debería estar en conocimiento de todos los ganaderos del país.

6. RECOMENDACIONES

Surge la necesidad de continuar con el estudio, realizando la prueba de Elisa Competitiva para confirmar la presencia o no de anticuerpos postvacúnales ya que mas de la mitad de los sueros positivos a Rosa de Bengala tienen el historial que los animales fueron vacunados con cepa 19, además, realizar un chequeo serológico a machos mayores de 8 meses. En caso de confirmarse los sueros verdaderos positivos ser comunicado al ganadero de la situación s anitaria de su explotación para que sigua las acciones descritas por el ICA en la Resolución 001192 del 2008. Con eventual control y posible erradicación de la zoonosis, es prudente dar a conocer los resultados a las entidades interesadas para que realicen las actividades necesarias y correspondientes en esta problemática que directa o indirectamente afecta a la población del país. Una forma de realizar vigilancia sostenida seria la implementación de un chequeo serológico en el municipio y caserío en donde se comercializan bovinos principalmente los días de mercado, en los cuales es significativo el número de animales que llegan y a la vez procedentes de diferente predios. Para la realización de dicha propuesta, el procedimiento y diagnostico debe ser realizado por personal autorizado por el ICA, si es viable la propuesta los resultados positivos a la prueba tamiz Rosa de Bengala deben ser confirmados con ELISA Indirecta. Un factor fundamental en un eventual proceso de este tipo es el económico, pero si el municipio, comité de ganaderos del municipio, ICA, FABEGAN, y los ganaderos están dispuestos a entrar al programa de fincas libres de brucelosis bovina debemos realizar un esfuerzo el cual se vera recompensado con las bonificaciones en el sector lácteo, igualmente aumento del valor de los animales, facilidad de movilización de los mismos, entre otros.

Es realmente preocupante que los ganaderos del municipio no lleven un registro individual a sus animales, con el fin de tener un historial que pueda evaluar la trazabilidad de cada individuo, además, es de gran ayuda para evaluar índices reproductivos y productivos, que lote de vacuna fue aplicada, entre otras importantes funciones que cumple en una explotación ganadera. Al momento de realizar los ciclos de vacunación contra la fiebre aftosa y brucella, implementar a través de vacunadores campañas de la importancia de inmunizar el 100% de grupos etarios con su respectiva vacuna. Además, que los ganaderos tengan conocimiento de la enfermedad, prevención, control y erradicación entrando al programa “Hatos Libres de Brucelosis”. 58

El atraso que la comunidad presenta ante la posibilidad de implementar biotecnología en sus ganaderías debe ser revisado por las entidades encargadas e interesadas que pretenden que el sector pecuario del municipio compita con otras regiones del país en las cuales las prácticas de biotecnología llevan décadas en funcionamiento.

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8. ANEXO

Figura No3: Materiales para anรกlisis de la muestra (Autor, 2011).

Figura No 4: Montaje de la muestra en la placa (Autor, 2011).

Figura No 5: Adición de la solución antigénica a la muestra (Autor, 2011).

Figura No 6: Homogenización del suero con el antígeno (Autor, 2011).

Figura No 7: Lectura de resultados (Autor, 2011).

Figura No 8: Interpretaci贸n de resultados, muestra No 5 positiva (Autor, 2011).

FORMATO ENCUESTA-HISTORIA PREVALENCIA BRUCELLA CAMPOHERMOSO Propietario:……………………………………………………………ID:…………………. Nombre o número:……………………………………........vereda:……………………... Edad:…………………………….Raza:…………………..Propósito:…………………… Vacunado:

Ultima vacunación:……………………N° partos:………...

Días abiertos:………… Intervalo partos:………..Numero de servicios:……………… Aborto:

SI NO

N° Abortos:………………… Ultimo aborto:…………………….

Periodo gestación:………………………………...Tuvo retención de placenta: SI NO Nacidos en la finca: SI NO

MN (Monta natural): SI NO

Usa IA: SI NO

Toro propio: SI NO Alquilado: SI NO Si es alquilado para cuantas fincas lo prestan……………………….. Usan MN en vacas que han abortado: SI NO Han realizado algún tipo de examen serológico o similares: SI NO Tiene registro a cada animal: SI NO Acuden al veterinario: SI NO

Si es no quien:………………………………………...

Que hacen los fetos abortados…………………………………………………………… Sabe que es la brucelosis:………………………………………………………………… Vacuna todos los ciclos: SI NO

Porque vacuna…………………………………..

Venden la leche: SI NO Consume leche cruda: SI NO Procesan la leche: SI NO Que productos fabrican:………………………... ……Si hay abortos infirman: SI NO A quien……………………………………….......Inyectan con aguja individual: SI NO Tiene vacas que repiten celo: SI NO Han abortado animales de otra Spp: SI NO Cuales animales vacuna contra brucella:………………………………………………..