Articulo

FOS-SDS-PAGE: Un nuevo método para detectar Veneno Diarreico en mariscos Cienc. Tecnol. Mar, 30 (1): 141-148, 2007

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FOS-SDS/PAGE: UN NUEVO MÉTODO PARA DETECTAR VENENO DIARREICO EN MARISCOS AÚN EN PRESENCIA DE OTRAS FICOTOXINAS* FOS-SDS/PAGE: A NEW METHOD TO DETECT DIARRHEIC POISON IN SHELLFISH CONTAMINATED WITH OTHER PHYCOTOXINS NELLY DÍAZ1 ANDREA SFEIR2 KARINA MANSILLA3 MIRIAM SEGUEL2 JOSÉ CÓRDOVA1 1

Fundación Ciencia para la Vida Santiago, Chile.

2 Laboratorio CERAM, Universidad Austral de Chile, Casilla 1327, Puerto Montt,

E-mail: mseguel@uach.cl, asfeir@uach.cl, 3 karinamansillaalbornoz@hotmail.com Recepción: 13 de junio de 2001 - Versión corregida aceptada: 17 de enero de 2007.

RESUMEN El ácido okadaico y la dinophysis toxina-1 son toxinas encontradas en el veneno diarreico de mariscos (VDM) que se encuentra en mariscos contaminados de la XI región. También los mariscos de la misma área geográfica tienen veneno paralizante de mariscos (VPM), condición bi-tóxica que hace incierta la determinación de VDM mediante el bioensayo, a pesar de la aplicación del método Yasumoto modificado. Se analizó individualmente la actividad fosfatasa endógena presente en el hepatopáncreas de mariscos tóxicos con VDM/VPM mediante geles de acrilamida en condiciones no denaturantes y se observó que la actividad de estas moléculas están inhibidas. Este método fue llamado fosfatasa-sodium dodecyl sulfato-geles de poliacrimalmida (FOS-SDS/PAGE), permite evaluar si la activadad de la fosfatasa endógena del marisco esta inhibida o no, aún en presencia de toxinas VPM presente en altas concentraciones en el marisco. Finalmente la implementación y entrenamiento del nuevo método es económica, rápida y segura.

Palabras claves: Veneno diarreico, ficotoxina, método DSP, actividad patrón de la fosfatasa en moluscos.

ABSTRACT Okadaic acid and dinophysis toxin 1 belong to the diarreic shellfish poison (DSP) and are found in toxic shellfish from the XI region. Also, shellfish from the same geographic area has paralytic shellfish poison (PSP). This bi-toxic shellfish condition makes almost impossible to detect DSP by the mouse bioassay, despite of the application of modified Yasumoto´s method. Hepatopan*Proyecto CONA-C8F 02-06.

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creas phosphatase activity from toxic shellfish with DSP/PSP were individually analyzed by acrylamide gels under non denaturing condition to detect whether their activities were or not inhibited by DSP. This method was named phosphatase-sodium dodecyl sulphate-poliacrylamide gel electrophoresis (FOS-SDS-PAGE), allows to evaluate if the endogenous shellfish phosphatase is inhibited or not, even in presence of the PSP at high concentrations in the shellfish. Also, the electrophoretic pattern the phosphates activity was determined for each shellfish species studied. This new method FOS-SDS/PAGE allows detecting DSP toxins even in the presence of high concentration of PSP toxins in the same shellfish. Finally, the implementation and training of this new method is economic, fast and safe.

Key works: Diarreic shellfish poison (DSP), phycotoxin,, DSP detection method, pattern shellfish phosphatase activity.

INTRODUCCIÓN En 1979 Yasumoto y col. describen el síndrome conocido como Veneno Diarreico de los Mariscos (VDM) observado en personas que se alimentaron con mariscos contaminados con éstas toxinas. Y en 1980 identifican que Dinophysis fortii fue el organismo productor primario del VDM encontrado en esos mariscos (Yasumoto, et al., 1980). Desde entonces, el VDM ha sido reportado en diversas partes del mundo (Maestrini, 1998). En Chile se encontró otra especie tóxica asociada al VDM, el Dinophysis acuta (Lembeye y col. 1991) y cuyas proliferaciones se han detectado en los estuarios y fiordos de la X y XI Región. Para Chile también se han descrito otras especies del género Dinophysis, pero sólo 6 han sido aisladas: D. acuta, D. acuminata, D. argus, D. caudata, D. operculata y D. ovum (Muñoz et al., 1992). Se considera que la incidencia de VDM en Chile está disminuida porque los signos clínicos que produce en el humano son similares a los producidos por bacterias enteropatogénicas, pero no existe un estudio que lo confirme.

El VDM es un complejo tóxico formado por ácido okadaico (OA) y sus isoformas estructurales entre las cuales la dinophysis toxina 1 (DTX1) posee similar toxicidad que el OA. Pero además estas toxinas poseen otras dos propiedades: son potentes promotores tumorales e inhiben la actividad fosfatasa de la PP1, PP2A, PP2B pero no de la PP2C, (Yasumoto et al., 1985; Takai et

al., 1987, and Fujiki et al., 1988 & Cohen, P. 1989).

Los efectos nocivos descritos arriba para el VDM han estimulado el desarrollo de metodologías para su detección como el bioensayo de ratón (Jap. Min. Hlth. Welf., 1981), efecto en el apetito de ratas (Terao et al., 1993), deshidratación del intestino del ratón recién nacido (Hamano et al., 1986), el efecto citopático de células en cultivo (Amzil et al., 1992), su efecto sobre la actividad de la PP2A (Shikari et al., 1985), ELISA (Uda et al., 1989); RIA (Levine et al., 1988), HPLC (Lee et al., 1987) y la cromatografía líquida con espectrometría de masas (LC-MS) (Pleasance et al., 1990). Sin embargo estos ensayos requieren de varios pasos de purificación, además de entrenamiento especial y estándares de toxinas que son costosos y no siempre están disponibles. Por lo tanto se requiere de un método rápido, económico y sensible, con el menor número de pasos de purificación y que no se vea afectado por la presencia de otras ficotoxinas como es el caso de VPM en mariscos de la XI región (Lembeye, 1991) o por la presencia de otros compuestos en el marisco como ácidos grasos (Tagaki et al., 1984; Kogawa et al., 1988).

En 2003, Córdova y col, reportaron que mediante el método FOS/SDS-PAGE (visualización de actividad de la fosfatasa endógena, mediante geles de acrilamida bajo condiciones no denaturantes, seguido de una reacción coloreada específica, el hepatopáncreas del marisco, que es la

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Los geles se obtuvieron siguiendo el protocolo descrito por Laemmli, 1970. Una vez preparado el gel, el tejido de hepatopáncreas se resuspendió en una solución fría salina de fosfato (PBS: KCl 3 mM; KH2PO4 monobásico 15 mM; Na2HPO4 x 7 H2O 8mM; pH 7,2) y se mantuvieron en hielo durante todo el proceso.

Posteriormente, las muestras de moluscos se centrifugaron a 14.000 rpm por 2 minutos (Microcentrífuga Modelo 5415, Eppendorf, Alemania) y se determinó la concentración de proteínas solubles totales mediante el método de Bradford, 1976.

de acuerdo a las indicaciones del productor en una placa con pocillos Inmulón 3. El pocillo que correspondió al blanco se colocó 5 µl de solución PBS y en los pocillos restantes se colocó 5 ml de la muestra respectiva (suspensión de la muestra de tejido). A cada uno de los pocillos se le agregó 25 µl de reactivo A y 200 ml de reactivo B, luego la placa se incubó en una estufa (modelo ULE 4400-800, Memmert, Alemania) a 37 ºC por 15 minutos y a continuación se leyó la placa en un lector de ELISA (modelo El x 800 Universal Microplate Reader, BIO-TEK instrumento, INC) A630 nm. Una vez obtenido los datos de la lectura se realizó una regresión lineal para saber qué volumen de muestra contenía la concentración de proteína deseada. Una vez conocida la cantidad se colocó en cada tubo el Buffer de Muestra en condiciones no denaturantes (0,0625 M Tris-HCl pH 6,8; 10% glicerol, 2,3% dodecil sulfato de sodio (SDS), azul de bromofenol al 0.00125% (p/v) y que corresponde a la mitad del total de la muestra, esta mezcla se homogeneizó por un minuto. Las muestras obtenidas se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% de 10 bolsillos y 1,0 mm de espesor. Los geles se ubicaron en una cámara electroforética (Mini Protean 3 Cell, BIO-RAD, USA) con amortiguador de corrida (Tris 0,025 M HCl pH 8,8; 0,192 M glicina; 0,0035 M SDS) y se agitó suavemente para eliminar las burbujas que pudieran interferir en la corrida. Finalmente se colocó en el primer carril 10 µl de estándar de proteínas (Marcador preteñido de proteína, rango entre 20 y 120 kDa, Winkler Ltda.) y 75 µg de proteína total en los bolsillos correspondientes. La cámara se conectó a una fuente poder (Fuente Poder Modelo 4001, Life Technology) y la electroforesis se realizó a 60 voltios los primeros 30 minutos hasta que el azul de bromofenol atravesó el gel concentrador y a 80 voltios hasta que el colorante terminó de migrar a través del gel separador.

Determinación de la concentración de las proteínas solubles totales de mariscos

Tinción para detectar actividad fosfatasa de moluscos (VDM).

Para determinar la concentración de las proteínas se utilizó un Kit comercial BIO-RAD

Obtenido el gel de la electroforesis, se prosiguió con el método descrito por Córdo-

región anatómica que se utiliza para detectar y cuantificar el VDM), se puede demostrar que la actividad de la proteína fosfatasa de los mariscos naturalmente contaminados con VDM son específicamente disminuidas o inhibidas.

También se demostró que cada especie de marisco tiene su propio patrón electroforético de actividad fosfatasa, que una de las fosfatasas actúa como el aceptor del VDM (no implica que no hayan otros aceptores de VDM) y que el marisco es capaz de sensar la inactivación de la actividad fosfatasa y compensarla expresando mas la fosfatasa resistente a VDM.

MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de mariscos Los mariscos fueron recolectados por un buzo autónomo a una profundidad que varió entre los 0 y 20 metros. A bordo del buque fueron seleccionados por especie, rotulados y congelados con concha para su posterior análisis en el laboratorio.

Electroforesis en geles de archilamida

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va et al., 2001. Brevemente, el gel se incubó con agua con suave agitación por dos veces de 10 minutos cada una, luego el gel se traspasó a una placa Petri con 15 µl de solución de fosfatasa alcalina (Tampón Fal; Tris 100 mM HCl pH 9,5; 5mM MgCl2; 100mM NaCl) y se deja agitando hasta el otro día con la finalidad de que quede totalmente limpio de detergentes. El tampón FAL se cambió por 15 ml de tampón fresco y a continuación se agregó 40 µl de BCIP (5-Bromo 4- Cloro 3-indolil fosfato, sal disódica, Sigma; disuelto en dimetilformamida al 100%) y 80 µl de NBT (dimetilformaldehído al 100% más azul nitro tetrazolium 3,9 x 10–4 M, Sigma). Esta mezcla se homogeneizó por unos minutos y se incubó a oscuridad hasta que las bandas se visualizaron y que correspondieron a la actividad fosfatásica endógena del marisco. Posteriormente el revelado se detuvo con agua destilada, se procedió a digitalizar y secar al vacío.

Fig. 1:

Fig. 1:

Detección de toxinas empleando el bioensayo de ratón Muestras de mariscos colectadas de las mismas áreas geográficas fueron preparadas para evaluar la presencia de toxinas mediante el bioensayo de ratón. Para detectar el veneno diarreico se empleó el método modificado de Yasumoto modificado (Yasumoto, 1984; Jap. Min. Hlth. Welf., 1981) pero no se cuantificó.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La actividad de la proteína fosfatasa de diferentes especies de mariscos: “almeja” (Venus antiqua), “chorito” (Mytilus chilensis), “culengue” (Gari solida) y “cholgas” (Aulacomya atter) se vieron significativamente inhibidas en varias estaciones muestreadas es-

Detección de VDM en mariscos. “Almejas” aisladas de la estación No 51 el mes de noviembre, fueron individualmente analizadas mediante FOS-SDS/PAGE. Se puede observar la inactivación de la fosfatasa de menor peso molecular (flecha, carril No 4) con respecto de la actividad normal (flecha, carril No 1 y 6). También se puede observar la inactivación parcial (carriles No 2, 3, 5, 7 y 8). Todos los carriles contienen igual cantidad de proteína total aislada desde el hepatopáncreas del marisco.

Detection of DSP in shellfish. “Clams” isolated from station No. 51 on November, were individually analyzed by FOS-SDS/PAGE. The small phosphatase activity is inactivated (lane No. 4) as compare to normal activity (arrow, Lanes No. 1 and 6). Also, partial inhibition is observed (Lanes No. 2, 3, 5, 7 and 8). All lanes contain the same amount of total protein isolated from shellfish hepatopancreas.

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Tabla I. Comparación de resultados obtenidos de FOS-SDS/PAGE y el bioensayo del ratón. En la estación 44, ejemplar No 1, se detecta simultáneamente VDM (FOS-SDS/PAGE) y VPM (tiempo corto de muerte del ratón, flecha).

Table I. Compared results obtained with FOS-SDS/PAGE and the mouse bioassay. In station N° 44, the sample No. 1 was detected simultaneously by DSP (FOS-SDS/PAGE and PSP (short time of mouse death, arrow).

FOS/DSD-PAGE BIOENSAYO RATÓN ESTACIÓN

RECURSO

Nº

VDM

EJEMPLAR Est. 51

Almeja

1

–

2º parte

Est. 44

Almeja

2

+/–

3

+/–

4

+

5

+/–

6

–

7

+/–

8

+/–

1

+

2

+

3

+/–

4

+/–

2º parte

Est. 52

Almeja

5

+

6

+/–

7

+/–

8

+

1

+

2º parte

Est. 66

Almeja

2

+

3

+

4

+

5

–

6

–

7

–

8

+

1

–

2

+

3

+/–

4

+/–

5

+/–

6

+

7

+

2º parte

VDM

VPM

Tiempo

Tiempo

detección

detección

–

–

no detectado

no detectado

–

+

no detectado

181 seg

–

–

no detectado

no detectado

φ

+ 65 seg

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pecialmente en el mes de noviembre (Fig. 1), esto se puede deber a que la mayoría de éstos organismos mantuvieron retenida la toxina desde el primer muestreo que fue el mes de julio, no obstante esta inhibición puede ser detectada con pequeñas cantidades de proteína (25 µg) contenidas en un extracto acuoso de tejido digestivo. Por otro lado, también hubieron mariscos que tuvieron una baja toxicidad o ausencia completa de veneno (Fig. 1), esto se puede ver atribuido a la posibilidad que las toxinas no fueron retenidas en el tejido del marisco, o bien las células fueron evacuadas rápidamente por las heces y por último puede que exista un bajo número de moléculas de proteína fosfatasa que actúen como aceptores de VDM. Se encontraron diferencias significativas al comparar el método empleado (FOS/SDSPAGE) con el ensayo biológico de ratón y su respectivo tiempo de detención (Tabla I), lo cual indica que en varias estaciones se encontró presencia de VDM que a diferencia del ensayo biológico de ratón éste veneno no fue detectado pero sí lo fue con VPM, en tal caso se puede atribuir a que el ratón murió por la presencia simultánea de las dos toxinas.

En definitiva, éste método puede detectar bajas cantidades de ácido okadaico evidenciado por la reducción de la actividad de una de las fosfatasas endógenas del marisco. Además cabe destacar que en el ensayo biológico de ratón requiere de a lo menos 100 a 150 g de carne lo que a diferencia de este ensayo que requiere solamente una muestra individual, no obstante, el método empleado FOS/SDSPAGE es más preciso y tiene un alto grado de sensibilidad, por ende, requiere sólo un pequeño volumen de tejido (> 0,008 g) para detectar presencia de estos venenos. Por otro lado, el bioensayo se requiere de un stock de ratones para los análisis además de tiempo para ser detectado, a diferencia de FOS/SDS-PAGE que tiene la ventaja de analizar mariscos en forma individual y determinar si el organismo está contaminado o no con ácido okadaico (VDM).

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