Revista chilena de anatomía versión impresa ISSN 0716-9868 Rev. chil. anat. v.17 n.2 Temuco http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98681999000200014 INTOXICACION CON ION COBRE EN RATAS PREÑADAS Y SU EFECTO EN LA FORMACION DE CENTROS PRIMARIOS DE OSIFICACION EN FETOS COPPER ION INTOXICATION IN PREGNANT RATS AND THEIRS EFFECTS ON THE PRIMARY OSSIFICATION CENTER IN FETUS *
Olga Acuña H. Guido Silva T. ** David Lemus A. ** Marcela Fuenzalida B. *** Domingo Román S. *** Lidia Rivera Y. *** Héctor Varela V. * Facultad Ciencias de la Salud. Universidad de Antofagasta, Chile. ** Programa de Morfología ICBM. Facultad de Medicina, Universidad de Chile. *** Facultad de Ciencias Básicas, Universidad de Antofagasta, Chile. Financiamiento: Dirección de Investigación Universidad de Antofagasta, Chile. *
RESUMEN: La actividad socioeconómica de la II Región de Chile es la minería del cobre, generándose subproductos que son eliminados al medio. Se ha informado en centros industrializados, que los metales pesados se transfieren de las madres a los fetos, vía placenta. Se propone conocer la bioacumulación de cobre en órganos y fluidos en ratas gestantes y su efecto en la formación de centros primarios de osificación (CPO). Hembras de tres meses Sprague Dowley, se ciclan y se cruzan en estro. Al octavo día de gestación, se inyectan i.p. con 1 ml de CuSO4 en concentraciones 1024, 512, 256,128 y 64 ppm y suero fisiológico, el grupo control. A los 18 días, se sacrifican y se evalúan los fetos, procesándose por técnicas de tinción, diafanización e histológica. Secciones de 5 µm se tiñen con Azul de Alcian /Azul de Toluidina. Se recupera sangre materna, hígado fetal y fetos; placenta, membranas amniocoriónicas y líquido amniótico, para determinar los niveles de cobre por espectrofotometría de absorción atómica. Los datos fueron analizados por ANOVA, Comparación múltiple (LSD), Tests de Fisher bilateral y Kruskal Wallis. Los resultados indican niveles elevados y estadísticamente significativos de cobre en el hígado fetal entre grupos tratados y controles (p<0.01). No existe diferencia del químico, en la sangre materna, membranas amniocoriónica, líquido amniótico y placenta, entre grupos tratados y controles. Una diferencia
significativa en la formación de los CPO en vértebras cervicales y dorsales, se encontró con el tratamiento de 256 ppm, en comparación con el control (p<0.05). No se observaron anomalías externas. Se infiere que ión cobre se transfiere a los fetos vía placenta, bioacumulándose en el hígado e induciendo alteraciones o retardo en la formación de CPO, especialmente a nivel de vértebras cervicales y dorsales; observándose microscópicamente en dichas zonas, ausencia de tejido cartilaginoso característico. PALABRAS CLAVE: 1. Fetos; 2. Cobre; 3. Osificación. INTRODUCCION El cobre es un elemento químico que se encuentra ampliamente distribuido en el medio ambiente y en los organismos como un elemento esencial, con capacidad para combinarse y originar compuestos orgánicos e inorgánicos necesarios para algunos procesos vitales. Se conoce desde hace varias décadas que el cobre es un elemento requerido por los seres vivos para un desarrollo normal. Se ha informado que el déficit de cobre en los organismos afecta un amplio rango de funciones. Sin embargo, escasos antecedentes se tienen de las alteraciones producidas por un exceso del mismo. Experimentalmente, se ha informado que en embriones de pollo, el cobre tiene un efecto teratogénico (GILANI & ALIBHAI, 1990; ACUÑA et al., 1997) y en mamíferos puede atravesar la barrera placentaria (Mc ARDLE, & ERLICH, 1991). Los efectos observados en los fetos de rata tratados con sales de cobre, indican que éstos presentan un moderado retardo del crecimiento y un reducido número de centros de osificación en diferentes huesos (HADDAD et al., 1991). Trabajos en fémur de pollo en cultivo, demuestran que el cobre causa cambios atróficos del tejido óseo, en presencia o ausencia de zinc (KAJI et al., 1990, 1991). En trabajos anteriores, demostramos en un estudio secuencial durante la gestación, que la sangre de ratas preñadas que recibieron un tratamiento de sales de sulfato de cobre, presentaban niveles de cobre similares a los controles. Además, determinamos que el cobre tiende a acumularse en el riñón, entre los días 12 al 16 de gestación, alcanzando niveles semejantes a los controles al final de este proceso de gestación y la placenta transfiere el cobre a los fetos, los cuales, pese a los elevados niveles de cobre presentes, no presentan anormalidades, al menos visibles externamente (SILVA et al., 1994, 1995). El propósito de este trabajo, es conocer la bioacumulación de cobre en órganos y fluidos en ratas gestantes y su efecto en el proceso de formación de centros primarios de osificación en los fetos.
MATERIAL Y METODO Se seleccionaron ratas hembras adultas jóvenes (Spragüe Dowley) de 3 meses de edad, las que se mantuvieron en un régimen de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad, controlada automáticamente. Durante todo el experimento los animales recibieron alimento de laboratorio y agua potable ad libitum. Las hembras fueron cicladas diariamente determinándose el día de estro, para ser cruzadas con machos reproductores. Al día siguiente, se evaluó microscópicamente la presencia de espermatozoides obtenidos de la vagina; la obtención de un test positivo, se consideró como día uno de gestación. Las ratas se separaron en 6 grupos experimentales, recibiendo al octavo día de preñez, 1 ml de sulfato de cobre estéril (CuSO4 Merck calidad analítica) preparada en agua desionizada. El tratamiento se aplicó en el día 8 de gestación, vía intraperitoneal en concentraciones de: 1024(n=4), 512(n=4), 256(n=4), 128(n=4), 64(n=4) ppm de cobre y suero fisiológico al grupo control (n=5). En el día 18 de gestación, se sacrificaron las hembras y se recuperaron: hígado fetal, placenta, membranas amniocoriónicas, sangre materna y líquido amniótico. Se registró el peso de los fetos y se realizaron observaciones macroscópicas, para evaluar posibles anomalías externas. Del total de crías por grupo, se tomó una muestra al azar de10 fetos, que fueron procesados por técnica de tinción y diafanización, para la determinación de centros primarios de osificación. Paralelamente, fetos de grupos tratados y controles, fueron sometidos a técnica histológica teñidos con Alcian Blue/Azul de Toluidina. Los niveles de cobre fueron determinados en órganos y fluidos de cada uno de los animales que conformaron los grupos experimentales, por medio de espectrofotometría de absorción atómica con llama, empleando una lámpara de cátodo hueco convencional Photron, teniendo presente la sugerencia del Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente, para el caso de tejidos biológicos. La determinación se efectúo por adición múltiple de estándar y en las calibraciones y controles de calidad analíticos, se utilizaron referencias estándares DORM-1, DOLT 1. Los resultados fueron analizados por test de análisis de varianza (Anova), test exacto de Fisher Bilateral, test Kruskal Wallis y test de Comparación Múltiple (Test no paramétricos arrojaron las mismas conclusiones) y se presentan resumidos como promedios, para cada uno de los tratamientos. RESULTADOS Placenta: Los niveles de cobre determinados en la placenta indican que en este órgano, el cobre no se bioacumula, presentando valores promedios que oscilan en un rango entre 3.81 y 2.41 µg/g de cobre, para la mayoría de los
grupos tratados. Estos niveles son significativamente menores (p<0.01) comparados con el grupo control y el tratado con 64 ppm, los que alcanzaron valores promedios de 10.12 y 7.50 µg/g de cobre, respectivamente. Fig.1. Hígado fetal: Elevados niveles de cobre se presentan en este órgano, valores promedios entre 22,07 y 18,64 µg/g de cobre en los grupos tratados, a diferencia del control que al-canza un valor promedio de 9.85 µg/g de cobre. Aunque el test de Anova y Kruskal Wallis detectan diferencias (p>0.25), el test de Comparaciones Múltiples detecta diferencias significativas, sólo entre los grupos 512 y control. Fig. 2.
Fig. 1. Valores promedios de la concentración de cobre en placenta expresados en µg/g e intervalos de confianza, según test LSD.
Fig. 2. Valores promedios de la concentración de cobre en hígado fetal expresados en µg/g e intervalos de confianza
Membranas amniocoriónicas: En las envolturas anexas al embrión, el mayor valor promedio del químico bioacumulado fue de 10.28 µg/g de cobre, para el grupo tratado con 512 ppm, no encontrándose diferencia significativa entre este grupo y el grupo control. Fig. 3.
Fig.3 Valores promedios de la concentración de cobre en membranas amniocoriónica expresados en µg/g e intervalos de confianza, según test LSD. Líquido amniótico: Los valores promedios de cobre en los grupos tratados, oscilaron entre 0.56 y 0.69 µg/ml, encontrándose que no existe una diferencia estadísticamente significativa con el grupo control (p>0.25). Fig. 4.
Fig. 4. Valores promedios de la concentración de cobre en líquido amniótico expresados en µg/ml e intervalos de confianza, según test LSD.
Sangre materna: La comparación de grupos tratados y controles indica que no existen diferencias significativas entre grupos tratados y control, en los niveles de cobre bioacumulado en la sangre materna (p>0.25). Fig. 5.
Fig.5 Valores promedios de la concentración de cobre en sangre materna expresados en mg/ml e intervalos de confianza, según test LSD. Peso: Diferencias menores, significativas (p<0.05), se encontraron entre el peso de los fetos provenientes de madres tratadas con soluciones de 64 y 128 ppm de cobre controles en comparación con los hijos de madres controles. Se recuperaron fetos de mayor peso cuando el tratamiento correspondió a 256 ppm de cobre, dato estadísticamente significativo. El valor promedio del peso de los fetos controles fue de 1.56 g. Fig. 6.
Fig. 6. Valores promedios de los pesos de los fetos expresados en gramos e intervalos de confianza, según test LSD.
Centros de osificación: La aplicación de la técnica de tinción y diafanización, muestra la formación de los centros de osificación con una coloración característica en los fetos controles. Fig. 7.
Fig.7 Visión de un feto control de 18 días de gestación. En los fetos tratados con diferentes dosis de cobre, se observó retardo generalizado de la formación de los centros primarios de osificación. Fig. 8. A nivel de vértebras, se observó además del retardo, una ausencia de coloración en algunas de estas estructuras.
Fig. 8. Feto tratado con 1024 ppm de cobre, observándose retardo en la formación de los centros primarios de osificación (flechas).
De acuerdo al test exacto de Fisher bilateral, se detectó una diferencia significativa (p<0.05) en la formación de los centros primarios de osificación en vértebras cervicales y dorsales con el tratamiento de 256 ppm, en comparación con el grupo control, no siendo evidente (0.05<p<0.1) esta situación para el resto de las vértebras con los diferentes tratamientos aplicados. Tabla I. Tabla I. Número de fetos que presentan normalidad en la formación de los centros de osificación en las vértebras cervicales, dorsales y lumbares, sobre una muestra n=10. (*p <0.05) Tratamiento Control 64ppm 128 ppm 256 ppm 512 ppm 1024 ppm
Vértebras cervicales 10 10 10 5 7 8
Vértebras dorsales 10 7 10 *5 9 9
Vértebras lumbares 10 6 6 *9 6 8
Estudio histológico: El análisis histológico de los fetos provenientes de madres tratadas con diferentes concentraciones de CuSO4, mostró alteraciones a nivel de la formación del tejido cartilaginoso de los miembros y, especialmente, en las vértebras, observándose en estas estructuras zonas con ausencia total o parcial de condrocitos y con alteración de la matriz extracelular característica del tejido cartilaginoso, siendo ésta reemplazada por tejido mesenquimático. Fig. 9.
Fig. 9. Microfotografía de sección sagital de feto tratado con 256 ppm de cobre. Se observa a nivel de las vértebras ausencia de tejido cartilaginoso (flechas).
Fig.10. Microfotografía de feto control. Se observa a nivel de las vértebras la presencia de condrocitos y matriz extracelular característica. DISCUSION El desarrollo de la II Región de Chile, está dado básicamente por la actividad minera del cobre, reconociéndose que los elementos químicos y productos de desecho que resultan de los procesos de purificación, son eliminados al medio ambiente (LAGOS,1990). En las últimas décadas, ha habido preocupación por conocer y demostrar los efectos de estos elementos químicos, sobre la salud y calidad de vida de las poblaciones más próximas a los centros industrializados. En este estudio, utilizando un modelo de rata preñada, informamos sobre los niveles bioacumulados de cobre y los efectos en la formación de centros primarios de osificación de los fetos, al aplicar tratamientos con diferentes concentraciones de éste químico. El hecho que en la sangre materna no existen diferencias significativas en los valores promedios de cobre, entre los grupos tratados y los controles, estaría indicando que la sangre sólo sería un medio de transporte para el ión. Estos datos confirman resultados anteriores, en los que no se observaron diferencias significativas de los niveles de cobre en sangre, a través el proceso de gestación, entre animales tratados y controles (SILVA et al.,1995). Por otra parte, la acumulación de cobre en el hígado fetal de animales tratados, alcanzaron valores de más del doble de la concentración, comparado con los controles. Este hecho, se ve apoyado por el trabajo de MASARU et al. (1993), quienes informan elevadas concentraciones de este ión en el hígado de ratas sometidas a una ingesta diaria de acetato de cobre, proponiendo que este órgano juega un rol importante en la excreción del mismo, al ser tomado
y ex-cretado a través de la bilis, creando un mecanismo de detoxificación. RecientementeABURTO et al. (1999 a), informan que el tratamiento con elevadas cantidades de cobre (1500-2000 ppm) en ratas, induce daños hepáticos a nivel celular, señalándose severos cambios en la histología del hígado. Los mismos autores, (ABURTO et al., 1999b), correlacionan la severidad de las lesiones histológicas producidas por cobre administrado en la dieta y el contenido de éste en el hígado. Estos investigadores concluyen que es probable una tolerancia al cobre y que la lipoperoxidación no tenga, posiblemente, un rol en este modelo de toxicidad de cobre empleado, debido a que no se determinó un aumento de malondialdehído. La bioacumulación de cobre determinada en hígado fetal, apoya la idea que este ión atraviesa la placenta, como ha sido demostrado por McARDLE et al. op cit, aunque en este trabajo se muestra que el tóxico no se deposita en la placenta, ya que los valores promedios determinados fueron significativamente menores en los animales tratados, en relación al grupo control (p<0.01). Como tampoco es evidente que este ión se bioacumula en el líquido amniótico, ni en las membranas amniocoriónica. El hecho que el cobre no se bioacumula en los tejidos, podría explicarse por la existencia de un mecanismo adecuado a nivel celular, que permite establecer un balance entre la acumulación y eflujo de cobre, esta última situación podría estar dada por la ausencia de metalotioneínas, como ha sido recientemente informado porTAPIA et al. (1998). En relación al peso, se observó que con las menores concentraciones aplicadas, 64 y 128 ppm de cobre, se indujo la formación de fetos de menor peso, obteniéndose fetos de mayor peso cuando la concentración fue de 256 ppm, situación que no podemos explicar, ya que este aumento de peso de los fetos no es proporcional al tratamiento con mayores concentraciones de soluciones de cobre aplicadas a sus madres. La observación macroscópica externa no evidencia efectos teratogénicos, aunque con la aplicación de tratamientos de cobre en otros modelos biológicos, se describen variadas malformaciones en embriones de aves (ACUÑA et al. op. cit.), así como también en embriones de Xenopus laevis (LUO et al., 1993). La transferencia de cobre de la madre a los fetos, estaría probablemente asociada a las alteraciones en el retardo de la formación de los centros primarios de osificación presentados en forma generalizada y evidenciados microscópicamente, los que corresponderían con los cambios informados por KAJI et al. (op cit), en sus estudios con cobre, sobre la osificación de fémur de pollo en cultivo. El estudio histológico de los fetos tratados mostró cambios degenerativos en las zonas correspondientes a las vértebras, con la ausencia de tejido cartilaginoso y centros primarios de osificación. Estos resultados fueron independientes del tratamiento, es decir, un daño histológico similar se presenta en las vértebras, con las diferentes concentraciones de cobre utilizadas.
Además, nosotros determinamos que no se forman los centros primarios de osificación, o éstos se encuentran en una fase muy temprana de formación, en relación a los controles, especialmente a nivel de las vértebras cervicales, y dorsales, observaciones que se relacionan fuertemente con lo informado por HADDAD et al. (op cit), que indican que el tratamiento con acetato de cobre en agua de bebida, antes y durante la preñez, reduce el número de centros de osificación en fetos de 21,5 días y recién nacidos, en vértebras, esternón y falanges de las extremidades superiores e inferiores. La presencia de estas alteraciones observadas, indistintamente con las diferentes concentraciones de cobre, sugieren que éstas no sean sólo producto de la presencia de este elemento químico, ya que existe información que el cobre puede interactuar con otros iones: cadmio, zinc (KAJI et al.) provocando cambios degenerativos, en el tejido óseo de embriones de pollo en cultivo; o con otros químicos, como arseniato o dicromato, aumentando la incidencia de reabsorciones y malformaciones en los fetos de rata, de acuerdo a lo informado por MASON et al., 1989. Más aún, se ha indicado que una dieta de hierro y cobre en exceso en ratas preñadas, pueden alterar el metabolismo de cada metal, siendo estos cambios dependientes de la edad y del órgano de las crías (CROWE & MORGAN, 1996). En resumen, este trabajo estaría demostrando que el ión cobre produce trastornos a nivel de los centros primarios de osificación en las crías. No observamos otras alteraciones a nivel histológico en los fetos cuyas madres son expuestas a diferentes concentraciones de este químico. Los cambios observados en los centros primarios de osificación, en relación a los controles, posiblemente se deba a que el exceso de ión cobre interfiere en la reacción de catálisis de la enzima lisiloxidasa (proteína rica en Cu) en su unión a derivados de lisina y/o a posibles interacciones con otros químicos. SUMMARY: The social and economic activity in the 2nd Region of Chile is copper mining, generating subproducts which are eliminated in the environment. It has been reported that in industrialized centers, there is a transference of heavy metals from the mother to the fetus by placental transfer. It's proposed to know the bioaccumulation of copper in organs and fluids of pregnant rats and its effects on the primary ossification centers (POC). Three month female albine rats (Sprague Dowley), are cycled and mated in estrous. On the 8th gestation day, they are injected intraperitoneally with 1 ml of CuSO4 in concentrations 1024, 512, 256, 128, 64 ppm and physiological serum. After 18 days, the female are sacrificed and the fetus evaluated and processing with alizarin red stainig skeleton and histologic technique, 5 mm tissue sections are stained with alcian blue and/or toluidine blue. Maternal blood is obtained, as well as, fetal liver, and fetus, placenta, amniochorion membrane, and amniotic fluid for determining copper levels by means spectrophotometry of atomic absorption. In addition, fetus are checked for external visible malformation. The statistical study was carried out through
variance analysis ANOVA, multiple comparison test (LSD), bilateral Fisher test, Kruskal Wallis test. The results show a high and statistically significant levels of copper in fetal liver of the intoxicated groups and control (p<0.01). There are no differences of the chemical in maternal blood, amniotic fluid, amniochorion membrane and placenta between intoxicated and control groups. A significant difference in POC formation in cervical and dorsal vertebras was found with the treatment of 256 ppm compared to the control group (p<0.05). It wasn't observed external abnormalities. It is inferred that copper ion is it's placental transferred to the fetus via placenta bioaccumulating in the liver inducing alterations in the POC formation , specially in cervical and dorsal vertebra level, which microscopically shows absence of characteristic hyaline cartilage tissue. KEY WORDS: 1. Fetus; 2. Copper; 3. Ossification.
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Recibido Aceptado: 13-12-1999
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