LUISDAVIDGÓMEZ-MÉNDEZ ADRIANADELPILARPULIDO-VILLAMARÍN RUBIELACASTAÑEDA-SALAZAR JUANCARLOSULLOA-RUBIANO ADRIANAMATIZ-VILLAMIL FIDSONJUARISMYVESGA-PÉREZ
Reservadostodoslosderechos
©PontificiaUniversidadJaveriana ©LuisDavidGómez-Méndez,Adrianadel PilarPulido-Villamarín,RubielaCastañedaSalazar,JuanCarlosUlloa-Rubiano,Adriana Matiz-VillamilyFidsonJuarismyVesga-Pérez, autores.
Correccióndeestilo: SamuelCurrea
Diseñodepauta ConTEXt ydiagramación: AndrésConradoMontoyaAcosta Diseñodecubierta: AndrésConradoMontoyaAcosta Impresión: DGPEditoresS.A.S.
Facultad de Ciencias
Primeraedición:agostode2022 ISBN:(impreso)978-958-781-702-7 ISBN:(digital)978-958-781-703-4 DOI: https://doi.org/10.11144/ Javeriana.9789587817034
Númerodeejemplares:300 ImpresoyhechoenColombia PrintedandmadeinColombia
EditorialPontificiaUniversidadJaveriana Carrera7.ªn.º37-25,oficina1301 Bogotá,EdificioLutaima Teléfono:3208320,ext.4205 www.javeriana.edu.co/editorial editorialpuj@javeriana.edu.co
PontificiaUniversidadJaveriana|Vigilada Mineducación.Reconocimientocomo Universidad:Decreto1270del30demayo de1964.Reconocimientocomopersonería jurídica:Resolución73del12dediciembrede 1933delMinisteriodeGobierno.
PontificiaUniversidadJaveriana.BibliotecaAlfonsoBorreroCabal,S.J. Catalogaciónenlapublicación
Gómez-Méndez,LuisDavid,autor
Microbiología:manualdelaboratorio/LuisDavidGómez-Méndez[yotroscinco].–Primeraedición.–Bogotá:EditorialPontificiaUniversidadJaveriana,2022.
142páginas;ilustraciones;17×24cm. Incluyereferenciasbibliográficas. ISBN:978-958-781-702-7(impreso) ISBN:978-958-781-703-4(electrónico)
1.Microbiología-Manualesdelaboratorio2.Laboratorios-Medidasdeseguridad3.Disciplinasdelas cienciasbilógicas-Manualesdelaboratorio4.Bioseguridad5.Laboratoriosdemicrobiología-Normas I.PulidoVillamarín,AdrianadelPilar,autoraII.CastañedaSalazar,Rubiela,autora,III.UlloaRubiano, JuanCarlos,autorIV.MatizVillamil,Adriana,autoraV.VesgaPérez,FidsonJuarismy,autorVI.Pontificia UniversidadJaveriana.
CDD579.078edición23 inp08/03/2022
Introducción .............................................. 13
Bioseguridadenellaboratoriodemicrobiología ................. 15
Materialdelaboratorioempleadoenmicrobiología .............. 21 Esterilización,desinfecciónymantenimiento decondicionesasépticas .................................... 29 Microscopía ............................................... 35
Métodosdesiembraycaracterizaciónmorfológica dehongosfilamentosos .................................... 103
Caracterizaciónmorfológicadehongos(levaduras) ............. 109
Recuentodemicroorganismosviablesenplaca ................ 113
Recuentodevirusinfecciososenplaca 121
Reconocimientodenematodosapartirdemuestrasdesuelo. Observaciónmacroscópicadealgunosnematodosparásitos demamíferos 127
Referencias .............................................. 133 Anexos .................................................. 137
1 Elementosdeprotecciónpersonalutilizadosen laboratoriosdemicrobiología .......................... 17 2 Recipientespararesiduos ............................. 18 3 Ejemplodematerialvolumétrico ....................... 22 4 Micropipeta ......................................... 22 5 Ejemplodematerialnovolumétrico ..................... 23 6 Otroselementosdeusorutinarioenloslaboratorios demicrobiología ..................................... 23 7 Autoclaveparalaesterilizaciónporcalorhúmedo ......... 31 8 Hornoparalaesterilizaciónporcalorseco ............... 31 9 EmbudoBüchnerempleadoparalafiltraciónpor membrana(microfiltración) ........................... 32 10 Microscopiodeluz(campoclaro)ysuspartes ............ 35 11 Estereomicroscopioysuspartes ........................ 36 12 CambioenlaANamedidaqueseemplean diferentesobjetivos .................................. 38 13
Mediodecultivosintéticocomercialenpresentación de500g(polvo) ...................................... 46 14 Característicasmacroscópicasdelascoloniasbacterianas .. 54 15 Tomademuestraapartirdeplacadentalyposterior siembraporaislamiento,empleandoescobillónyasa ...... 58 16 Siembraporaislamientoconlatécnicaenformade z ...... 59 17 Coloniasaisladasconlatécnicadezigzag ................ 59 18 Siembraporaislamientoapartirdemuestralíquida ....... 61
Siembraporaislamientodeunacoloniabacterianaen mediosólido ........................................ 62 20
Siembramasivaconescobillónoasaapartir decultivolíquido .................................... 63 21
Siembraporpuncióncentralenmediosemisólido ......... 65 22
Siembraporpunciónyespiralenmediosólidoinclinado 66 23 Pruebadeambiente .................................. 70 24 Tosersobreelagar .................................... 71 25 Aislamientoapartirdemuestradepiel .................. 72 26 ColoracióndeGram .................................. 75 27
PasosparalaelaboracióndelacoloracióndeGram 78 28 ColoracionesdeGramobservadasalmicroscopio ......... 80 29
PasosparalacoloracióndeShaeffer-Fulton (verdedemalaquita) .................................. 86 30 ColoracióndeShaeffer-Fulton(verdedemalaquita) ........ 87 31
CrecimientoadiferentesvaloresdepH 93 32 CrecimientoadiferentesconcentracionesdeNaCl ......... 93 33 Crecimientoadiferentestemperaturas ................... 94 34 Aerobiosisyjarradeanaerobiosis ....................... 94 35
empleadaparaelconteodediferentestiposdecélulas
blancosyrojos
posteriorrecuentoalmicroscopio
47
Preparacióndemuestradevirus(fagos)ybacterias paraladeterminacióndeUFPmediantelatécnicade doblecapadeagar .................................. 125 48 Nematodoyalgunasdesusestructurasmorfológicas ...... 128 49 MontajedelembudodeBaermann ..................... 132
1 Materialempleadoenmicrobiología .................... 25
2 Conceptosdelimpieza,antisepsia, desinfecciónyesterilización ........................... 34
3 Ejemplosdealgunastincionesdeacuerdoconla estructurabacteriana ................................. 83
4 Condicionesdecrecimientoendiferentesambientes ...... 95
5 Descripciónmacroymicroscópicadehongosfilamentosos 107
EstemanualhasidoelaboradoporprofesoresdelDepartamentodeMicrobiologíadelaFacultaddeCienciasdelaPontificiaUniversidadJaveriana (PUJ),SedeCentral.Sedirige,especialmente,aestudiantesdepregradode lascienciasbiológicas,biomédicasyafinesquetomancursosprácticosen microbiologíageneral.
Aquíencontrarán,atravésdedieciséisprácticas,losprocedimientosbásicosparaelmanejodelmicroscopio,equipoimprescindibleenmicrobiología;lasprincipalestécnicasdeaislamientodebacteriasyhongoslevaduriformesyfilamentososapartirdediferentesfuentes;elcrecimientoylacaracterizaciónmacroscópicadebacteriasydehongosendiferentesmedios decultivo,ylamorfologíadebacteriasyhongoslevaduriformesyfilamentososatravésdetécnicasdetinciónymanejodediferentestécnicasderecuentoparabacterias,levaduras,conidiosoesporasfúngicas,microalgas ybacteriófagos.Todoseharásegúnlasbuenasprácticasdelaboratorio.
Sedefinecomo bioseguridad alconjuntodemedidasynormaspreventivasdestinadasaprotegerlasaluddelostrabajadoresydelacomunidad engeneral.Estasmedidasseencaminanaprevenirlosdiferentesriesgos quepuedanejercerunimpactonocivo,siempreteniendoencuentalos tresprincipiosdelabioseguridad: universalidad, barrerasdeprotección y medidasdeeliminación.Losriesgosmencionadospuedenserbiológicos (comobacterias,hongos,protozoosovirus),físicos(comotemperaturas, radiacionesionizantese,incluso,obstáculosenlamovilidad)yquímicos (comoácidos,colorantes,etc.).
EnloslaboratoriosdelaPUJ,labioseguridadinvolucraaestudiantes,docentesydemástrabajadores.Porello,losestudiantesdebencumplircon lasnormasestablecidas,ylosdocentes,velarporsucumplimiento.Asimismo,sedebenofrecerlascondicionesadecuadasparaqueestasnormasse cumplanpuntualmente.
Parauntrabajoóptimoenellaboratoriodemicrobiología,elestudiante debeprepararlaprácticayconsultarlametodologíaquedebeseguir,lo queleayudaráaplaneareltrabajoyamanejareficientementeeltiempo.
Enloslaboratoriosdedocencia,setrabajaconmicroorganismosnopatógenosopatógenosclasificadosdentrodelosgruposderiesgo1o2(1).Por lotanto,sedebentenerpresenteslasnormasdelaFacultaddeCiencias —entreellas,los 12hábitosbioseguros (2)—ylassiguientesreglas:
Bioseguridadenellaboratoriodemicrobiología
• Usarbatablancaantifluido,tapabocasygorro(cofia)(figura1).
• Colocarropa,maletasymorralesenellugardispuestoparaello,idealmenteencasilleros.
• Mantenerelsitiodetrabajoordenadoyusarsolamenteelmaterial necesario.
• Lavarselasmanosantesdeiniciaryalfinalizarlapráctica.
• Tenercuidadoconelusodelmechero:reconocerlaposicióndecierre (perpendicularaltubodelgas)ydeapertura(paraleloaltubodelgas), asícomomanejarcorrectamenteelregistroqueseencuentraenla parteinferiorolateraldecadamechero.
• Usaradecuadamentepipetas,micropipetasypipeteadores,deacuerdoconlasinstruccionesimpartidasparasuusocorrecto.
• Descartarlasláminasusadasoelmaterialdevidriorotoenlosguardianes(figura2a).
• AbrirlascajasdePetri,lostubosdeensayouotroselementosquecontenganmediosdecultivosólidosolíquidosduranteelmenortiempo posibleycercadelmechero,paraevitarcontaminaciones.
• Seguirlametodologíaadecuadaparalacorrectamanipulacióndelos implementosdelaboratorio.
• Transportarloscultivosymaterialesfrágilesdentrodebandejas.Nuncacorrermientrassetransportaestematerial.
• Encasodederrameorupturadeunrecipientedecultivo,cubrircon unatoalladepapelyaplicarhipocloritodesodioal2%(v/v).
• Llevarlabatablancaalacasadentrodeunabolsaylavarlaporseparado(trasdesinfectarlaconunlíquidoblanqueador).
Microbiología
Figura 1. Elementosdeprotecciónpersonalutilizadosen laboratoriosdemicrobiología:a)tapabocas;b)gorro(cofia); c)guantesdenitrilo;d)batablanca;e)gafasdeseguridad.
Fuente: fotografíasdelosautores
Ustednodebe:
• Hacermanipulacionesmano-boca.
• Comer,beber,fumaromasticarchicledentrodelasinstalacionesdel laboratorio.
• Usarjoyaso piercings.
• Tenersueltoelcabellolargoniusarzapatosdescubiertosnidematerialesporosos(comotelaotipo crocs);seprefierequeseandecuero.
• Usarlasuñaspintadasdecualquiercolor,pueselesmalteesinflamable.Igualmente,siesesmalteoscuro,impidedetectarsignosdeintoxicaciónreflejadosenelcambiodecolordelasuñas.
Todomaterialquesedesechedebecolocarseenelrecipienteadecuado(figura2),siguiendolasnormasinternacionalesrelacionadasconelmanejo deresiduos:
• Canecaverde(conbolsa):materialnocontaminado,comopapely otrosreutilizables.
• Canecaroja(conbolsa):materialbiológicocontaminado.
• Canecarojagrande(sinbolsa):láminasportaobjetosymaterialdevidrioroto.
• Guardián:materialcortopunzante,comoagujas.
Figura 2. Recipientespararesiduos:a)canecarojagrandesinbolsa; b)canecarojaconbolsa;c)canecaverdeconbolsa;d)guardián.
Fuente: fotografíasdelosautores
Microbiología
Conbaseenlaintroducción,averiguaryprofundizarenlossiguientesaspectos:
• Principiosdelabioseguridad.
• Tríadadelabioseguridad.
• Ejemplosderiesgobiológico,físicoyquímico.
Bioseguridadenellaboratoriodemicrobiología
Este manual práctico ha sido diseñado para usted, estudiante de ciencias biológicas, biomédicas o afines, que se encuentra realizando algún curso de microbiología y que requiere conceptos básicos e instrucciones detalladas para realizar procedimientos fundamentales en el laboratorio. Apoyándose en estas instrucciones, las imágenes y los videos, a través de la experimentación práctica, logrará adquirir las destrezas necesarias en la manipulación, fundamentación y comprensión del cómo, por qué y para qué se realizan los procedimientos de laboratorio aquí descritos. Seis profesores del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ), quienes cuentan con más de quince años de experiencia docente e investigativa universitaria, dan vida a este manual, que le será muy útil en la compresión y el manejo de los microorganismos más estudiados en los laboratorios de microbiología básica.