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Implicación de Vibrio spp. metabólicamente activo en el tracto digestivo de Litopenaeus vannamei en su desarrollo postlarval
PATOLOGÍA
- FEBRERO 2021
Implicación de Vibrio spp. metabólicamente activo en el tracto digestivo de Litopenaeus vannamei en su desarrollo postlarval
Autores: Estefanía Garibay - Valdez1,4 Luis Rafael Martínez-Córdova2 Marco A. López - Torres2 F. Javier Almendariz - Tapia3 Marcel Martínez-Porchas1 Kadiya Calderón2,4
Publicado en www.nature.com El cultivo de camarón juega un papel importante en la economía mundial. En el hemisferio occidental, México es el sexto productor de camarón y, específicamente, el 37% de esta producción es provisto por el Estado de Sonora, donde el camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei, es una de las especies más exportadas alrededor del mundo para consumo humano debido a sus proteínas y nutrientes1,2. En la última década, la alta demanda del mercado de la acuicultura, el rápido crecimiento de la producción de camarón y las prácticas de cultivo intensivo, han hecho que el camarón sea susceptible a enfermedades y mortalidad, causando el deterioro de cultivos y pérdidas económicas irreparables para la industria de la acuicultura2–4 .
Uno de los principales factores que amenaza la producción de camarón está relacionado con los factores bióticos, que comprenden las infecciones virales y bacterianas, y factores abióticos que en su mayoría están vinculados a prácticas de cultivo intensivo, desencadenando la acumulación de especies carbonáceas, nitrogenadas y de fósforo en estanques de cultivo1,3. Las enfermedades del camarón causadas por bacterias oportunistas, como bacterias y virus, son los principales problemas que pueden provocar pérdidas considerables en la industria camaronera. Las principales enfermedades del camarón son causadas por patógenos bacterianos principalmente de especies de Vibrio como V. harveyi, V. alginolyticus, V. campbellii y V. parahaemolyticus, causando necrosis, crecimiento lento, anorexia y mortalidad durante el desarrollo postlarvario5. En este sentido, las cepas de V. parahaemolyticus constituyen el agente etiológico de la enfermedad bacteriana más relevante registrada en el camarón hasta la fecha, perturbando gravemente la industria camaronera conteniendo un plásmido de virulencia único con genes codificados para endotoxinas delta (pir A y pir B), similar a la toxina relacionada con insectos Photorhabdus (Pir), y causando mortalidad en los organismos infectados2,6 . Sin embargo, especies no patógenas como V. alginolyticus y V. gazogenes inhiben el crecimiento de otros Vibrio patogénicos. Por ejemplo, V. alginolyticus ha mostrado actividad antagonista y V. gazogenes tiene potencial como probiótico para el control de infecciones de Vibrio luego de aplicaciones orales en el camarón blanco del Pacifico L. vannamei7. En otros invertebrados como los copépodos, se ha establecido que son capaces de discriminar entre diferentes especies de Vibrio, presentando diferentes respuestas inmunitarias transcripcionales que pueden favorecer la adquisición de bacterias simbiontes del ambiente como el Vibrio no patógeno8. En este sentido, Wendling y Wegner9 mencionaron que la ostra del Pacífico (Crassostrea gigas) presenta una rápida respuesta evolutiva y un mecanismo genético de resistencia frente a factores de virulencia de Vibrio. Además, la expresión de los factores de virulencia de Vibrio depende de la microbiota residente del huésped; por lo tanto, una enfermedad causada por Vibrio estalla de forma sinérgica con el microbioma, que puede incluir otros Vibrio no virulentos. Las investigaciones sobre la enfermedad de Vibrio deben centrarse en las interacciones bióticas entre el ambiente, el huésped y las fracciones patógenas y no patógenas de las comunidades microbianas10. Por ejemplo, los patógenos de Vibrio pueden interactuar con comunidades simbióticas y la microbiota del huésped para invadir el intestino del huésped manipulando su biomecánica para redefinir las comunidades intestinales. En general, comprender los procesos ecológicos implicados en las enfermedades es complicado debido a la alta diversidad de las poblaciones de Vibrio, y porque las interacciones bióticas dentro y entre las comunidades microbianas modifican la expresión de la enfermedad en diferentes niveles10-12 . De la misma forma, las comunidades microbianas podrían brindar protección al huésped contra infecciones patógenas porque algunos microorganismos producen
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complejos antimicrobianos13,14. Además, la microbiota intestinal del camarón se ha vuelto más relevante debido a nuestro conocimiento sobre sus interacciones biológicas. El proceso de colonización microbiana en el intestino puede ser impulsado por poblaciones que establecen las condiciones óptimas para la formación de colonias, donde otros microbios se adhieren al tejido intestinal y crean fuertes interacciones con el consorcio microbiano formado mientras desplazan patógenos o microbios indeseables que podrían afectar al huésped y la función intestinal eficiente3,13-16 . Por lo tanto, estudiar aspectos relacionados al comportamiento de la microbiota intestinal puede contribuir a la comprensión de estas complejas comunidades. Además, la microbiota varía durante el desarrollo de la mayoría de los animales, según sus necesidades y otros factores subyacentes; por lo tanto, esta respuesta también se la espera en el camarón, pero aún se desconoce qué cambios o cómo ocurren estos cambios. La información sobre la dinámica de Vibrio en el intestino del camarón contribuiría a comprender esta compleja relación entre Vibrio y camarones peneidos.
A pesar de los esfuerzos para mejorar la producción de camarón, solo hay unos pocos estudios basados en ecología microbiana que vinculan la aparición de grupos microbianos patógenos relevantes y las actividades metabólicas de estos grupos, causando disbiosis en el camarón blanco, que está relacionada con su desarrollo ontogenético. En este estudio, se evaluaron la población total y la población metabólicamente activa de Vibrio sp. en un sistema a escala en laboratorio con una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR) y qPCR transcripción inversa (RT-qPCR), dirigidos a la secuencia del gen ARNr 16S. El vínculo entre la presencia/abundancia de las poblaciones objetivo y la composición bacteriana durante el desarrollo ontogenético postlarvario y su correlación con los parámetros ambientales y los nutrientes se investigaron mediante análisis multivariables [análisis de componentes principales (PCA)] en los intestinos y en el agua de cultivo.
Resultados
Se evaluaron análisis de biometría y respuesta productiva de L. vannamei, registrándose diferencias significativas asociadas a etapas de desarrollo; por ejemplo, entre el control (día 0), 20 a 40 días de desarrollo y 60 a 80 días de desarrollo (Tabla 1). Además, la respuesta productiva del camarón fue la esperada, con un mayor rendimiento de crecimiento entre los días 1 y 40 y una fase estacionaria alcanzada en los días 60–80. La tasa de crecimiento específico (SGR) se estimó para explicar la tasa de aumento de la población de L. vannamei de un día de muestreo a otro, con cada intervalo perteneciente a una etapa de desarrollo. Hubo diferencias significativas en la SGR entre todos los estadios postlarvarios. Desde la primera etapa, la SGR fue de 5.60% día-1, seguido de la segunda etapa con 4.24% día-1. En las etapas III y IV, la SGR del camarón disminuyó a 1.36% y 0.33% día–1 respectivamente, con una SGR global de 2.88% día–1 para todo el bioensayo (Tabla 1). No se encontraron diferencias significativas entre las etapas de desarrollo con respecto a la temperatura (24.8–25.4 °C), la salinidad (35.36–36.25%), DO (6.4–6.9 mgL–1) y el pH (8.1–8.4), demostrando que todo el experimento estuvo bien controlado a escala de laboratorio (Tabla 2). En cuanto a la calidad del agua, se registraron diferencias significativas para algunos parámetros (Tabla 3). Se observaron altas concentraciones de NH3–NH4 a los 20 días de desarrollo (5.34 mgL–1), mientras que se registraron valores bajos a los 40 y 60 días (0.93 y 1.2 mgL–1, respectivamente), y se registraron valores estadísticamente similares pero menores en los días 0 y 80 (0.39 mgL–1). Las concentraciones de nitrito (NO2 – N) y nitrato (NO3 – N) fueron más altas el día 60 (0.27 mgL–1 y 10.2 mgL–1, respectivamente), seguido del día 40 (0.11 mgL–1 y 6.50 mgL–1 , respectivamente), en comparación con el resto de los días muestreados (0, 20 y 80 días). Las concentraciones más altas de fosfato se registraron en los días 20, 40 y 60, todos con valores oscilando entre 1.6 y 1.98 mgL–1 .
Con respecto a los análisis de qPCR y RTqPCR, todas las abundancias promedio se expresaron como una escala logarítmica del número de copias de ADNr 16S o ARNr 16S de bacterias totales y Vibrio spp., cuantificadas por gramo de muestra (agua o intestino, respectivamente), correspondiendo a 0, 20, 40, 60 y 80 días de desarrollo (Fig. 1A, B). Las pruebas de Kruskal-Wallis y Conover-Iman mostraron que las diferencias entre las cuantificaciones de cada grupo objetivo, basadas en el ADN o el ARN, siempre fueron significativas, siendo
Tabla 1. Data biométrica durante el desarrollo del camarón y tasas de crecimiento específico (SGR) de Litopenaeus vannamei durante el período experimental. BL corresponde a la longitud biométrica. El BL y el peso inicial se refieren al primer día de cada etapa, y el BL y el peso final se refieren al día final de cada etapa. Los valores mostrados son promedios ± desviación estándar SD. LSD, diferencia mínima significativa (prueba de Student, p < 0.05). *Diferencias significativas entre las etapas I, II y III, correspondientes a 0-20, 20-40 y 40-60 días de desarrollo del camarón, respectivamente (p < 0.05). Las letras diferentes indican diferencias significativas entre las etapas de desarrollo con un nivel de confianza del 95%.
Fase de Desarrollo Días de Desarrollo BL Inicial (cm) BL Final (cm) Peso inicial (g) Peso final (g) SGR (%día-1)
Control0 I II III IV 1–20 21–40 41–60 61–80 3.2 ± 0.1(d) –0
.3 ± 0.1(d) 4.40 ± 0.71(c) 6.57 ± 0.800 .75 ± 0.34(c) 6.57 ± 0.80(b) 8.59 ± 1.002 .32 ± 0.83(b) 8.59 ± 1.00(a) 9.37 ± 1.115 .41 ± 1.87(a) 9.37 ± 1.11(a) 9.68 ± 0.937 .15 ± 2.5(a) ––2.32 ± 0.835 .60(a) 5.41 ± 1.874 .24(b) 7.15 ± 2.5 1.36(c) 7.59 ± 2.090 .33(d)
Global SGR 2.88
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las poblaciones metabólicamente activas al menos cuatro órdenes de magnitud más altas, especialmente para las bacterias totales (Figura 1). También se observaron diferencias significativas entre los diferentes orígenes de las muestras, donde los valores de las muestras de agua fueron a menudo más altos que los valores de las muestras de intestino para ambos grupos objetivo y solo ocasionalmente para la etapa de desarrollo del camarón.
Los resultados de las abundancias relativas promedio de Vibrio spp., en comparación con el total de bacterias mostró una diferencia significativa basada en el grupo del medio estudiado, como el de intestino o agua, y se observaron diferencias significativas para ambos grupos al comparar la ocurrencia (copias de ADNr 16S) y los especímenes metabólicamente activos (copias de ARNr 16S) (Fig.1). La aparición de copias de ADNr 16S de Vibrio en agua osciló entre el 0.7 y el 7.4% (figura 1C). Simultáneamente, la abundancia relativa de la comunidad Vibrio metabólicamente activa osciló entre 0.4 a 7.6% (figura 1D). Adicionalmente, al inicio del bioensayo (W0), la comunidad de Vibrio presentó mayor actividad metabólica en comparación con la abundancia relativa total (ADNr 16S). En W80, la abundancia relativa de Vibrio fue mayor que la abundancia metabólicamente activa, que está relacionada con el total de bacterias (Fig. 1C, D). Mientras tanto, la abundancia relativa de toda la comunidad de Vibrio en el intestino de los camarones fue mayor (5.83 a 10.63%) que la encontrada en muestras de agua (0.47.6%). Además, la abundancia relativa de Vibrio metabólicamente activo (ARNr 16S) entre las bacterias totales fue casi mayor en el agua que en el intestino de los camarones durante todo el bioensayo.
Para analizar el sistema biológico relacionado con la abundancia total y la expresión metabólicamente activa de bacterias totales y comunidades de Vibrio spp., se realizó PCA basado en distancias euclidianas (Fig. 2), donde el primer eje explicó el 51.2% de variabilidad total en todo el sistema biológico. El segundo eje también mostró el 30.5% de la variabilidad, es decir, se explicó el 81.7% de la variabilidad total del sistema estudiado, considerando los cuatro sets de data biótica derivada de las cuantificaciones por qPCR/RT-qPCR en agua y muestras de intestino. Todo el sistema fue impulsado primero por la presencia de bacterias totales (ADNr 16S de bacterias), que teóricamente incluye todos los taxones bacterianos que prosperan en el sistema (incluyendo la población de Vibrio), seguido de la presencia de la comunidad de Vibrio (ADNr 16S de Vibrio). Además, se formaron clusters diferentes, dependiendo del tejido evaluado [agua (azul) o intestino (verde)]. Aquí, se formó un grupo aislado, correspondiente a los intestinos de organismos postlarvarios de la granja (ID0), y otro grupo vecino también se formó, correspondiente a muestras de la primera etapa de desarrollo postlarvario, correspondiente a 20 días de ensayo (ID20), lo que se correlacionó fuertemente con el desempeño metabólicamente activo de las bacterias totales (ARNr 16S de bacterias). Curiosamente, la abundancia metabólica activa de bacterias totales (ARNr 16S) se correlacionó negativamente con la abundancia metabólica activa de la población de Vibrio (ARNr 16S de Vibrio), que fue, al mismo tiempo, el parámetro biótico que manejó el ambiente acuático estudiado. Además, los clústeres derivados de las muestras de intestino de D40, D60 y D80 formaron un solo grupo, sugiriendo un patrón de microbiota similar durante el desarrollo tardío postlarvario (juvenil-adulto) en comparación con las etapas tempranas de D0 y D20 (postlarvas).
Además, para evaluar todo el sistema, considerando los cuatro conjuntos de parámetros bióticos y la influencia de los parámetros abióticos en un ambiente acuoso, se realizó otro PCA (Fig. 3). Como resultado, se explicó el 70.5% de la variabilidad total del sistema biológico, resultando del 43.2% en el primer eje y el 27.3% del segundo eje. Se formaron claramente diferentes clústeres, dependiendo de la etapa de desarrollo del camarón blanco. Los resultados revelaron que, para el medio acuático, los factores abióticos como la acumulación de nutrientes (P–PO4), son actores clave
Tabla 2. Parámetros fisicoquímicos del agua monitoreados durante el bioensayo. *Diferencias significativas (p < 0.05).
Tabla 3. Media ± SD de los parámetros de calidad del agua de nitrito (NO2–N), nitrato (NO3–N), amoníaco (NH3–NH4) y fosfato (P–PO4) durante los días de cultivo de camarón como Temperatura. Las diferentes letras en la misma columna indican diferencias significativas entre tratamientos a un nivel de confianza del 95%.
I II
Fase de Desarrollo Días de Desarrollo Tempertura (°C)
)DO (mg L )S
Salinidad (%)
)pH
Sample NH3–NH4 (mg L ) NO2–N (mg L ) NO3–N (mg L ) P–PO4 (mg L ) Temperature (°C)S
Salinidad (%)
)DO (mg L )pH
W0 0.39 ± 0.01(c) 0.01 ± 0.00(c) 0.0 ± 0(c) 0.17 ± 0.03(b) 25.2 ± 0.3 37.9 ± 0.76 .87 ± 0.05 8.3 ± 0.0 W205 .34 ± 0.16(a) 0.04 ± 0.00(c) 0.93 ± 0.49(c) 1.98 ± 0.20(a) 25.1 ± 0.6 35.4 ± 0.36 .45 ± 0.27 8.4 ± 0.1 W400 .93 ± 0.09(b) 0.11 ± 0.00(b) 6.50 ± 1.67(b) 1.66 ± 0.08(a) 24.7 ± 0.7 35.2 ± 0.16 .57 ± 0.25 8.1 ± 0.1 W601 .20 ± 0.03(b) 0.27 ± 0.05(a) 10.2 ± 1.30(a) 1.88 ± 0.30(a) 24.3 ± 1.1 35.3 ± 0.47 .07 ± 0.13 8.1 ± 0.1 W800 .39 ± 0.01(c) 0.01 ± 0.00(c) 0.0 ± 0(c) 0.17 ± 0.03(b) 24.9 ± 1.5 35.1 ± 0.07 .07 ± 0.13 8.0 ± 0.0
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Figura 1. Logaritmo del número de copias (nbc) de genes de ADNr 16S y ADNr 16S de bacterias (A) por gramo de intestino (ID) y agua (W) muestreados, y el logaritmo del número de copias (nbc) de ADNr 16S y ARNr 16S de Vibrio (B) por gramo muestreado en el intestino (ID) y agua (W). Las barras marcadas con el asterisco son significativamente diferentes según la prueba de Kruskal-Wallis (p < 0.05). Copias de las abundancias relativas promedio de Vibrio sp. ADNr 16S (C) y ARNr 16S (D), expresadas como el porcentaje de copias de ADNr 16S de bacterias, en intestino de camarón (ID) y agua (W). Las barras marcadas con el asterisco son significativamente diferentes, según la prueba de Kruskal-Wallis (p < 0.05).
Figura 2. Análisis de componentes principales (PCA) basado en distancias euclidianas que ilustran el componente de cuatro conjuntos de data biótica derivada de las cuantificaciones por qPCR/RT-qPCR en muestras de agua e intestino. El número de copias por g de muestra de genes de ARNr 16S (ADNr 16S) y ARNr 16S se utilizó para explicar la abundancia de bacterias totales y Vibrio.
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Figura 3. PCA basado en distancias euclidianas para analizar la influencia de variables abióticas, como NO2–N, NH3–NH4, NO3–N, P–PO4, oxígeno disuelto (DO), salinidad, pH y temperatura, sobre el total bacterias y Vibrio de muestras de agua, según el número de copias de genes de ARNr 16S (ADNr 16S) y ARNr 16S.
que controlan el desempeño bacteriano. Un grupo separado de muestras de W0 se correlacionó positivamente con la ocurrencia total de bacterias, donde la temperatura y la salinidad jugaron un papel importante. Las muestras control (W0) se correlacionaron negativamente con W40 y W60, que se correlacionaron fuerte y positivamente con la acumulación de nitratos y nitritos en el agua.
La abundancia total de la comunidad de Vibrio metabólicamente activo mostró tendencias similares en respuesta, donde las muestras de W80 se correlacionaron positivamente de acuerdo al conjunto de datos bióticos y de acuerdo con el rendimiento metabólicamente activo de las bacterias totales, donde el oxígeno disuelto (DO) jugó un papel importante por su correlación positiva con W80. Finalmente, las muestras de las primeras etapas de desarrollo (W20) se correlacionaron positivamente con la acumulación de amoníaco (NH3–NH4) en el agua, así como con el pH.
Discusión
Para evaluar el crecimiento del camarón blanco se realizaron análisis biométricos, demostrando diferencias significativas en función a la etapa de desarrollo del camarón, donde se formaron dos grupos. La primera etapa abarcó organismos desde el día 1 al 40, donde su crecimiento fue notorio, y la segunda etapa abarcó organismos que aún estaban en proceso de crecimiento, pero a una tasa mucho menor, sin registrar diferencias significativas entre los días 60 y 80.
El primer grupo correspondió a camarones durante la primera etapa de desarrollo postlarval, mientras que el segundo grupo correspondió a camarones en el día 60 de desarrollo, cuando los camarones se consideraron juveniles. Por lo tanto, los requerimientos nutricionales del camarón cambian según su desarrollo y comportamiento biológico. Informes previos han demostrado que el perfil enzimático intestinal difiere entre cada etapa para lograr una mejor absorción de nutrientes17 . Además, Xiong et al. 18 demostraron que la tasa de crecimiento del camarón está ligada a su microbiota ya que organismos de la misma edad y tiempo de cultivo pueden tener diferencias en su tasa de crecimiento, y presentan similitudes entre el ensamblaje de la comunidad intestinal según su crecimiento. En este estudio, hubo una tasa de crecimiento significativamente mayor durante la fase postlarval en comparación con la fase juvenil-adulta. En este trabajo, cuando el camarón alcanzó una etapa de madurez, se registraron tasas de crecimiento asintótico19 . Según los análisis qPCR y RT-qPCR, se demostró que la abundancia de la comunidad bacteriana total (ADNr 16S y ARNr 16S) en el intestino del camarón era estable desde el día 20 en adelante. Antes de eso, las muestras control (ID0) eran significativamente más bajas que en otros días de cultivo. A pesar de esto, algunos factores como enfermedades, la nutrición y el ambiente, pueden regular la microbiota intestinal. Nuestros resultados sugieren que se produce un proceso de colonización durante la fase postlarval, alcanzando estabilidad durante la fase juvenil a la adultez, reduciendo el riesgo de disbiosis20-22. Sin embargo, nuestros resultados demostraron que la presencia de bacterias metabólicamente activas disminuyó en los días de cultivo 40 y 60, y la cantidad de estas bacterias aumentó el día 80, sin diferencias significativas en los días 0 y 20.
La abundancia total de la comunidad bacteriana en las muestras de agua fue constante durante el bioensayo, excepto para el control (día 0) donde la abundancia fue significativamente mayor. Sin embargo, la abundancia de bacterias metabólicamente
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activas fue la más alta el día 80, y la abundancia fue significativamente mayor que los días 0, 20 y 60. Estudios anteriores han revelado que tanto el camarón como el agua de cultivo comparten la misma composición bacteriana, lo que significa que el camarón puede tener conjuntos bacterianos similares a los de su medio de cultivo23,24. Además, la riqueza de especies tiende a ser mayor en las muestras de agua que en la microbiota intestinal del camarón 18, probablemente porque las bacterias albergadas por el camarón están sujetas a condiciones de cuello de botella, favoreciendo a especímenes particulares.
En este estudio, al explorar la dinámica de ocurrencia de la población de Vibrio, se encontró que a lo largo del bioensayo los niveles de abundancia fueron significativamente más bajos en el intestino el primer día de cultivo (ID0). Por el contrario, la población de Vibrio metabólicamente activa no mostró diferencias significativas en el intestino del camarón durante el período de postlarvas a adulto. Sin embargo, la comunidad total de Vibrio en el agua tendió a disminuir los días 20, 40 y 60, y volvió a aumentar el día 80. En particular, el Vibrio metabólicamente activo fue significativamente más alto en agua que el Vibrio metabólicamente activo en el intestino del camarón, a pesar de la abundancia relativa de la comunidad total de Vibrio (ADNr 16S), que fue mayor en los intestinos de los camarones. Cabe destacar que nuestro estudio se realizó con camarones sanos, donde los niveles de abundancia en la comunidad total de Vibrio y la comunidad metabólicamente activa fueron similares.
Otros autores han reportado anteriormente que aumentos en la comunidad de Vibrio o las variaciones bacterianas específicas en intestinos de camarón o el agua, se consideran indicadores de enfermedad24,25. Sin embargo, su presencia podría estar asociada con su desempeño metabólicamente activo, pero esto no está determinado solo por su aparición. Gainza et al. 26 demostraron que la proporción de la población de Vibrio en la microbiota intestinal de camarón basada en la secuenciación de amplicones V2-V3, fue mayor durante la etapa de laboratorio (2.02%) que en la etapa de cosecha (0.64%), revelando que la microbiota en etapa de cosecha es más diversa que la microbiota en laboratorio. Huang et al. 27 argumentaron que la microbiota de los estanques de cultivo (agua o sedimento) difiere de la microbiota intestinal del camarón. Además, la abundancia de la comunidad en los intestinos de los camarones no está relacionada con el ambiente circundante (agua), porque la microbiota ambiental está expuesta a mayores fluctuaciones de nutrientes y otros factores influyentes.
No hubo diferencias significativas en las abundancias relativas promedio de la comunidad total de Vibrio (ADNr 16S) entre todas las poblaciones bacterianas en los intestinos de los camarones en el bioensayo relacionado con las etapas de desarrollo. Por el contrario, la abundancia relativa promedio de la copia del número de ARNr 16S de la población de Vibrio entre todas las comunidades bacterianas en los intestinos de los camarones fue inferior al 1%. Nuestro estudio demostró que a pesar de que la población total de Vibrio era mayor en intestinos de camarones sanos, esta comunidad no era metabólicamente activa. Esto indica que la actividad metabólica es el principal factor causante de enfermedad a través de la disbiosis intestinal debido a que la microbiota intestinal tiene roles esenciales en el desarrollo del huésped, actuando como una barrera natural contra los patógenos18,28 . Se sabe que las especies del género Vibrio son patógenas para el camarón; aunque las bacterias Vibrio son habitantes naturales en los intestinos del camarón y podrían controlarse en condiciones óptimas de cultivo29,30 .
Nuestros resultados demostraron qué Vibrio era altamente metabólicamente activo en el ambiente acuático en los días 0 y 20, pero no en el intestino, donde solo se detectó su presencia. Esto indica que la población de Vibrio juega un papel clave como parte de toda la estructura de la comunidad bacteriana durante los primeros días de cultivo de camarón correspondientes a las etapas postlarvarias (0-20 días). En este sentido, los organismos acuáticos tienen una estrecha relación con la microbiota presente en el medio acuático debido al intercambio de la microbiota intestinal y la microbiota que se produce en el agua, lo que significa que el camarón y su microbiota estaban trabajando juntos como un holobionte. Sin embargo, la población microbiana planctónica no es parte de este holobionte, pero comparten el mismo ambiente y el intestino del camarón está expuesto al ambiente acuático, lo que representa una importante puerta de entrada para microorganismos. Esta relación completa puede considerarse como un hologenoma31. Como muchos otros microorganismos, Vibrio se encuentra naturalmente en ambientes marinos y estuarinos, tanto como células flotantes como adheridas a superficies quitinosas; sin embargo, se conoce que no todas las cepas de Vibrio son patógenas.
En un estudio previo desarrollado por nuestro grupo de investigación32, exploramos la diversidad de composición bacteriana de la microbiota intestinal del camarón blanco y su estructura durante el desarrollo ontogenético utilizando análisis de secuenciación de próxima generación, y curiosamente se observó que la población de Vibrio no coloniza en todas las etapas de desarrollo, sino solo durante la etapa postlarval (0 y 20), en contraste con la etapa juvenil (Fig. S1). Esto podría explicarse por los altos niveles de abundancia metabólicamente activa de Vibrio en las etapas postlarvales en el medio acuático. Además, la diversidad total es el número total de especies presentadas en un nicho33; así, el comportamiento de la población de Vibrio que se presenta en el intestino del camarón se puede explicar si consideramos que la estructura de la comunidad está ensamblada por diferentes especies que conforman todo el microbioma.
Aunque, en agua a la W80, la presencia de Vibrio metabólicamente activo aumentó, presentando una actividad similar a la registrada en el día 60 (W60), sugiriendo una baja oportunidad de infección en comparación con la comunidad metabólicamente activa en los días de cultivo iniciales. Por lo tanto, en un caso en el que una infección por Vibrio pudiera desarrollarse en un cultivo de camarón a gran escala, probablemente podría estar asociada con la pérdida de cultivo debido a su alta actividad metabólica en el agua. Así, la importancia de rastrear factores abióticos, como parámetros de calidad del agua y nutrientes, es fundamental para evitar la vibriosis por su actividad metabólica. En particular, la temperatura del
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agua, la salinidad y el nivel de eutrofización pueden provocar estrés en el camarón y, eventualmente, reducir la selección de huéspedes bacterianos y la enfermedad en el camarón34,35. Los resultados de este estudio demuestran que la abundancia relativa total de Vibrio spp. en los intestinos del camarón es mayor que su actividad metabólica. Esto coincide con estudios previos, donde se evaluó la activación del sistema inmunológico innato de camarones, como Marsopenaeus japonicus y L.vannamei, en respuesta a Infecciones por V. alginolyticus y V. parahaemolyticus, lo que demuestra que pueden modular la señalización de proteínas del huésped y activan su sistema de defensa en presencia de microorganismos potencialmente patógenos, activando genes que tienen actividades relacionadas con los mecanismos de respuesta inmune, como las actividades de la profenoloxidasa y superóxido dismutasa, y la apoptosis en el tejido del hepatopáncreas36,37 así como en el epitelio intestinal38 .
Por lo tanto, podría estar ocurriendo una presión biológica selectiva ejercida por el huésped sobre la actividad metabólica de esta bacteria, mientras se estimula el sistema inmunológico del camarón al funcionar como un probiótico natural necesario para el ciclo de vida del huésped.
Conclusiones
Este estudio proporciona una visión general de las interacciones entre la microbiota intestinal del camarón blanco y su entorno, enfatizando la proporción y correlación entre el Vibrio total y el metabólicamente activo. Tanto la población total de Vibrio como la activa, indicaron que existe una colonización de esta bacteria en el intestino del camarón blanco a lo largo de su desarrollo postlarval, pero con baja actividad metabólica. Por tanto, Vibrio es parte de la microbiota intestinal del camarón, y podría estar jugando un papel dualista, involucrado en una relación simbiótica entre el organismo y la estructura de la comunidad bacteriana de la microbiota intestinal, actuando como patógeno oportunista en determinadas circunstancias.
Nuestros resultados sugieren que el resto de la microbiota probablemente podría regular la actividad de Vibrio, posiblemente estableciendo un mecanismo de coexistencia que no afecta al huésped, proporcionando las condiciones para el desarrollo de la comunidad microbiana. En contraste, la abundancia de la población de Vibrio metabólicamente activa fue mayor en el agua de cultivo, a pesar de su baja abundancia total. Finalmente, nuestros resultados demuestran que a pesar de que Vibrio puede ser un miembro común e inclusivamente dominante de la microbiota del camarón blanco, su actividad podría estar regulada por el resto de la microbiota y por el camarón.
Materiales y métodos
Muestreo de organismos y experimentos de bioensayo. Se recolectaron postlarvas de camarón (PL5) de Litopenaeus vannamei de la camaronera Parque acuícola Cruz de Piedra, Guaymas, Sonora, México (27°51′05.9″N 110°31′57.0″W). Posteriormente, las postlarvas fueron transportadas en tanques aireados con la misma agua del estanque de la granja al Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora (DICTUS), donde previamente se probó y utilizó un sistema a escala de laboratorio. El bioensayo se realizó durante 80 días con camarones sanos, cada uno con un peso de 0.5 ± 0.1 g, y las postlarvas se distribuyeron al azar en el sistema a escala de laboratorio. El sistema consistió en nueve unidades de cultivo de 80L conectadas a un sistema de recirculación (RAS), y se utilizó agua de mar esterilizada para llenar las unidades hasta un volumen operativo de 60L.
El agua de mar de entrada se filtró y pasó a través de una lámpara UV para su esterilización, y el agua de mar se distribuyó por igual a todas las unidades de cultivo, como se muestra en el material complementario (Fig. S2). Las unidades de cultivo se mantuvieron en condiciones interiores similares con aireación artificial (sílice unida por calor 2000F; tamaño de poro 140 µm), y la salinidad se mantuvo alrededor de 35‰ con la adición de agua dulce esterilizada (grado MilliQ, Millipore) para evitar la incorporación de bacterias externas y para compensar la evaporación. Finalmente, el efluente generado por el sistema fluyó a través de un biofiltro que contenía bacterias nitrificantes para controlar los compuestos nitrogenados tóxicos en el sistema de recirculación (Fig. S2). El alimento no consumido, las heces, las mudas y los organismos muertos (si los hubiera), se eliminaron diariamente. La salinidad, el oxígeno disuelto (DO), el pH y la temperatura se midieron dos veces al día (07:00 y 18:00 h) utilizando un sistema de sonda múltiple YSI 556 (YSI Incorporated). El bioensayo comenzó con PL5 el día 0. En este punto, se introdujeron al azar 40 organismos en cada unidad de cultivo y el experimento duró 80 días. A lo largo del experimento, los camarones se alimentaron dos veces al día a una tasa del 4% de su biomasa húmeda día1 utilizando bandejas de alimentación con el mismo alimento formulado que consistía en alimento comercial pelletizado de engorde con 25% de proteína cruda, 5% de lípidos y 4% fibra.
Calidad del agua y respuesta productiva. La calidad del agua se monitoreó diariamente durante todo el bioensayo y las muestras se recolectaron semanalmente de cada unidad de cultivo utilizando tubos Falcon estériles filtrando el agua a través de membranas de 0.45 μm (Millipore). Las concentraciones de nitrito (NO2 – N), nitrato (NO3 – N), amoníaco (NH3 – NH4) y fosfato (P – PO4) se midieron utilizando los kits de reactivos comerciales de Hanna HI 93707-01, HI 93728-01, HI 93700-01 y HI 93717-01, respectivamente (Hanna Instruments, Rumania). Los análisis biométricos se realizaron en las cuatro diferentes etapas de desarrollo, denominadas I, II, III y IV, correspondientes a 0-20, 20-40, 40-60 y 60-80 días de cultivo, respectivamente, calculando la respuesta productiva15 .
Recolección de muestras de intestino y agua, y extracción de ADN y ARN. Para descartar la microbiota transitoria, los camarones se dejaron en ayunas durante 6 h antes del muestreo. Una vez vacíos los intestinos, estos se extrajeron en las fechas correspondientes utilizando un kit de disección estéril, para colocarlos en tubos criogénicos estériles y se almacenaron en -80 °C hasta la extracción del ácido nucleico. Cada fecha de muestra pertenece a una unidad experimental con tres tanques de cultivo. Las muestras de intestino de los tanques de cultivo se combinaron y se consideraron como una réplica, dando tres
- FEBRERO 2021
PATOLOGÍA
réplicas por tiempo de muestreo. En los mismos puntos de muestreo, se recolectaron muestras de 1L de agua (W) de cada unidad de cultivo correspondiente a una réplica experimental y se combinaron para su filtración a través de filtros estériles de 0.22 µm de membrana de éster de celulosa mixto (Whatman, Sigma, St. Louis, EE. UU.) y colocados en tubos Falcon estériles de 50 mL para su almacenamiento a – 80 °C hasta la extracción del ácido nucleico.
El ADN y el ARN total se extrajeron y purificaron de los filtros de membrana utilizados previamente para filtrar muestras de agua de mar y de intestinos que también fueron muestreados previamente, ambos con el FastDNA Spin Kit for Soil15 y el FastRNA Pro Blue Kit (MP-Bio, Santa Ana, CA, EE. UU.) en combinación con lisis mecánica utilizando FastPrep Systems (MP-BIO, Santa Ana, CA, EE. UU.). Las muestras de ARN obtenidas se digirieron de acuerdo con el protocolo de ADN TURBO (Ambion, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.) y EDTA para detener la actividad de ADNasa y garantizar que se presentaran residuos de ADN. Finalmente, las muestras se purificaron según el protocolo RNA Cleanup del RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hamburgo, Alemania). La calidad y concentración de los ácidos nucleicos se probaron como describieron previamente Maza-Márquez et al. 39 .
Ensayos de qPCR y RT-qPCR. Los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se han implementado ampliamente para estimar el recuento total de células basado en marcadores de genes de ADN, independientemente de su nivel de actividad metabólica40,41, mientras que la qPCR de transcripción inversa (RT-qPCR) es un método útil para analizar la expresión de genes específicos. La RT-qPCR también se utiliza debido a su alta sensibilidad, precisión, especificidad y rapidez en el análisis de la expresión específica en el tiempo de genes particulares, lo que permite la detección de transcripciones de baja abundancia42 .
La abundancia absoluta de poblaciones totales y metabólicamente activas de bacterias y Vibrio en ambas muestras objetivo se midió mediante qPCR y RT-qPCR, respectivamente, utilizando un sistema StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, EE. UU.). Para la RT-qPCR, la síntesis de ADNc se realizó mediante transcripción inversa de ARN con la ayuda de SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.), siguiendo las especificaciones del fabricante en un volumen final de 20 µL y utilizando 150-200 ng de ARN total como plantilla (primers específicos descritos en la Tabla S4) (Sigma Aldrich; St. Louis, MO, EE. UU.) y dNTP (Invitrogen; Carlsbad, EE. UU.). Además, la calidad y la concentración del ADNc se midieron usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Waltham, MA, EE. UU.).
El número de copias (nbc) de los genes de ARNr 16S (ADNr 16S) y ARNr 16S (ARNr 16S) se evaluó en cada muestra utilizando ADN o ADNc extraído, respectivamente, como plantillas con un conjunto de primers previamente descritos (Tabla S4) basados en el aumento de la intensidad de fluorescencia del colorante SYBR Green durante la amplificación. Para la amplificación y detección de fragmentos específicos se utilizó el iTaq Universal SYBR Green Supermix (Biorad, EE. UU.) en un volumen final de 15 µL para cada reacción. Todas las amplificaciones cuantitativas se realizaron por triplicado. Las mezclas de reacción de qPCR contenían 1.8 µL de ADNc o ADN, 250 ng de T4 gen 32 (QBiogene, Illkirch, Francia), 1.2 µL de cada primer (10 mM), suministrado por Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.), y 1×SYBR Green Supermix. Las condiciones de amplificación y detección se describen en la Tabla S5.
Para proporcionar una cuantificación absoluta de los microorganismos objetivo, se construyeron curvas estándar con la ayuda de un plásmido estándar que contenía los insertos de los genes objetivo. Se generaron amplicones del ADN r16S a partir de cepas de cultivo de Pseudomonas putida NCB957 (cuantificación de bacterias) y Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 (cuantificación de Vibrio). Los productos de PCR se clonaron con la ayuda del vector plásmido pCR2.1-TOPO utilizando el sistema de clonación TOPO TA (Invitrogen, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.), siguiendo los protocolos del fabricante. Las curvas de calibración para la cuantificación absoluta en las muestras de ADN (ADNr 16S) se generaron utilizando diluciones seriadas de diez veces de patrones de plásmidos linealizados, y para la cuantificación absoluta en muestras de ARN (ARNr 16S), se utilizaron patrones de plásmidos no linealizados como plantillas para la transcripción in vitro de los genes objetivo en ARN39,40,43. El número de copias ng se calculó como se describió anteriormente43 . Todas las curvas de calibración tenían un coeficiente de correlación (r2) de > 0.99 en todos los ensayos, y la eficiencia de la amplificación por PCR siempre estuvo entre el 90 y el 110%. Finalmente, el número de copias de los genes objetivo se expresó por gramo de tejido muestreado, mientras que para las muestras de agua se expresó como el número de copias por ml.
Análisis estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron en R Studio (versión 3.6.0)44 utilizando los siguientes paquetes de R: maggrittr45, ade446, factoextra47, vegan48 y gplots49. Se utilizaron análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de rango múltiple (prueba de Student) con un nivel de significancia del 95% (p < 0.05). Dado que la mayoría de los conjuntos de datos no se ajustaban a la distribución normal, se realizó un método de ordenación no paramétrico basado en una prueba de comparación múltiple, como la prueba de Kruskall-Wallis, seguida de una prueba de Conover-Iman para cada ensayo biológico, comparando el desarrollo etapa o ambiente probado (intestino y agua) entre cada camarón, con un nivel de significancia del 95% (p < 0.05).
Se utilizó PCA basado en distancias euclidianas para explicar mejor el análisis de los cuatro conjuntos de datos bióticos referidos al número de copias por gramo de muestra de ADNr 16S y ARNr 16S tanto de Bacteria total como de Vibrio derivado de las cuantificaciones por qPCR/RT- qPCR en muestras de agua e intestino. Además, se realizó también un PCA para correlacionar la influencia de las variables abióticas como NO2–N, NH3–NH4, NO3–N, P– PO4, DO, salinidad, pH y temperatura, con el conjunto de datos bióticos del medio acuoso. Las diferencias en la abundancia de copias de genes y los parámetros fisicoquímicos se evaluaron utilizando ANOVA seguido de las pruebas de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey•
