15 minute read
Acción antibacterial de los aceites esenciales y su efecto sobre el crecimiento en el cultivo de camarón blanco Litopenaeus vannamei
PRODUCCIÓN
- FEBRERO 2021
Acción antibacterial de los aceites esenciales y su efecto sobre el crecimiento en el cultivo de camarón blanco Litopenaeus vannamei
Autores:
César Molina Poveda, Ph.D. Carlos Mora Pinargote, B.Sc. Investigación y Desarrollo. Skretting Ecuador
cesar.molina@skretting.com La acuicultura a nivel mundial ha sido una de las actividades productoras de mayor crecimiento. Durante 2007-2018 el promedio de tasa de crecimiento anual fue de 4.6%. Sin embargo, este aumento se estima que decrecerá a un 2.3% en los períodos de 2019-2030, debido a algunos factores como: la amplia adopción de las regulaciones ambientales, disponibilidad reducida del agua y lugares de producción, aumento de brotes de enfermedades relacionados a la práctica de producción intensiva y disminución de las ganancias de productividad de la acuicultura (FAO, 2020). Ecuador no se encuentra exento de problemas relacionados a enfermedades. La actual intensificación de los cultivos favorece las condiciones de desarrollo de enfermedades causadas por patógenos virales, bacterianos o fúngicos; que pueden afectar significativamente la productividad de la industria camaronera, causando grandes pérdidas (Flegel et al., 2008; GraciaValenzuela et al., 2011; Hettiarachchi et al., 2005). Un método de control para estas enfermedades ha sido la aplicación de antibióticos como Enrofloxacina, Florfenicol y Oxietraciclina, administrados al agua o en el alimento (Roque et al., 2001; Ultee et al., 2002; Xu et al., 2006).
Los antibióticos a pesar de ser usados ampliamente para promover el crecimiento y controlar enfermedades, no resulta ser una opción sostenible. Su uso en acuicultura bajo ninguna regulación, puede plantear problemas para la salud humana y la seguridad alimenticia. Las consecuencias mayormente reportadas son la acumulación de residuos en los productos acuícolas (peces y camarones) y la ocurrencia de bacterias resistentes a antibióticos (Li et al., 2007; Ng et al., 2009; Santos y Ramos, 2018; Zhou et al., 2009). Actualmente, en algunos países, incluido Ecuador, la aplicación de ciertos antibióticos ha sido restringida en la acuicultura (MAP, 2018).
De las consecuencias nombradas anteriormente, el incremento de la resistencia bacteriana a antibióticos ha conducido a la investigación de nuevos productos con propiedades antibacteriales. Varias alternativas como probióticos, terapia de fagos y aceites esenciales se han planteado por sus satisfactorios resultados en
- FEBRERO 2021
PRODUCCIÓN
instalaciones acuícolas y relativa seguridad (Romero et al., 2012). Los aceites esenciales parecen ser bastante prometedores. Estos compuestos son líquidos lipofílicos producidos como metabolitos secundarios, que contienen sustancias responsables del aroma de las plantas, atracción de polinizadores y resistencia a una amplia variedad de patógenos; de ahí que puedan ser considerados como posibles antibacteriales (Figura 1) (Bakkali et al., 2008; Cunha et al., 2018). Estos aceites pueden ser obtenidos a partir de flores, semillas, hojas, corteza, frutos y raíces, por varios métodos de extracción como la fermentación, enfloración o por presión; pero el método por destilación al vapor es el más usado en la elaboración de aceites esenciales para uso comercial (Burt, 2004). A pesar de tener resultados prometedores, son necesarios más estudios para conocer mejor los mecanismos de acción, mejorar la estabilidad de los compuestos en el momento de la administración, sus efectos al ambiente y la microbiota del animal tratado.
En este artículo nos enfocaremos en el uso de los aceites esenciales y proveeremos una visión general en la acuicultura, sus estudios in vitro e in vivo, y su uso como ingrediente en la industria de balanceado acuícola.
Los aceites esenciales como alternativa antibacterial en la acuicultura:
Las condiciones de cultivo de especies acuícolas como peces y camarones cuando no son adecuadas, pueden generar un estrés en los animales que favorecen las infecciones causadas por bacterias, hongos, virus y parásitos (Naylor et al., 2000; Pantoja et al., 2012; Walker y Winton, 2010). Entre estas, las bacterias del género Vibrio y Pseudomonas son los principales y más comunes agentes infecciosos (Citarasu, 2010; Hettiarachchi et al., 2005). Un indiscriminado uso de los antibióticos ha conducido al desarrollo de bacterias resistentes a los fármacos, empujando a la comunidad científica a encontrar alternativas con propiedades antibióticas. (Acar et al., 2009; Cabello, 2006; Rhodes et al., 2000). Entre estas alternativas los aceites esenciales, usados ampliamente en la industria alimenticia, farmacéutica y en la producción de productos de limpieza y perfumería (Souza et al., 2019), han mostrado poseer cualidades que promueven el crecimiento, disminuyen el estrés, incrementan la actividad antioxidante, estimulan el sistema inmune y el apetito, tienen una baja toxicidad ambiental e inhiben el desarrollo de patógenos en peces y camarones (Chakraborty y Hancz, 2011; Citarasu, 2010; da Cunha et al., 2010; Giannenas et al., 2012; MimicaDukic y Bozin, 2008; Park et al., 2011; Reverter et al., 2017; Sutili et al., 2016; Zeppenfeld et al., 2014). Estas cualidades son atribuidas a sus principios activos como alcaloides, terpenoides, taninos, saponinos y flavonoides.
La capacidad que tienen los diferentes aceites esenciales depende de la composición de estos principios activos. Usualmente la actividad antimicrobiana es derivada no solo de un único mecanismo de acción, sino de una cascada de reacciones involucradas en la fisiología de la célula bacteriana, promovida por las diferentes estructuras químicas que poseen los aceites esenciales en su composición y grupos funcionales (Burt, 2004; Nazzaro et al., 2013). Estos componentes de bajo peso molecular, hidrofóbicas y lipolíticos, pueden destruir la pared celular y membrana citoplasmática de las bacterias, modificar la estructura de la pared celular afectando la permeabilidad, bloquear la síntesis de proteínas, ATP y ADN, inhibir la secreción de enzimas e interferir con la comunicación bacteriana vía querum sensing (Bouyahya et al., 2017; Citarasu, 2010; Cunha et al., 2018; Hussain et al., 2008; Nazzaro et al., 2013; Thoroski et al., 1989; Wendakoon y Morihiko, 1995). Aceites esenciales provenientes de ajo, canela, orégano, laurel, romero, tomillo, albahaca, árbol de té, cúrcuma y vainilla han demostrado interferir el quorum sensing bacteriano a menores concentraciones que las necesarias para destruir a las bacterias.
Figura 1. Principales diferencias entre los metabolitos primarios y secundarios de una planta. (Tavares-Dias, 2018).
Antes de usar un aceite esencial in vivo, es indispensable determinar qué tan adecuado sería su uso determinando su potencial antibacteriano y citotóxico. Existen dos métodos para medir estas propiedades: un método cualitativo conocido como prueba de disco de difusión, en donde la inhibición es clasificada según el diámetro de la zona de inhibición; y, un método cuantitativo llamado prueba de concentración mínima inhibitoria (MIC), que mide su actividad en base a la concentración mínima para inhibir o matar al microorganismo. En este artículo nos enfocaremos en las pruebas MIC de diferentes aceites esenciales contra los más comunes patógenos gram-negativos, en camarones como son del género Vibrio y Pseudomonas (Tabla 1).
Existe cierta discrepancia en cuanto a la concentración mínima para que un aceite esencial sea considerado activo. Según Ríos
PRODUCCIÓN
- FEBRERO 2021
Tabla 1. Estudios in vitro de la actividad antibacterial de los aceites esenciales contra patógenos de camarones y peces del genero Vibrio y Pseudomonas.
Fuente de aceite esencial Zingiber officinale Z. officinale Z. officinale Z. officinale Z. officinale Z. officinale Curcuma. Longa C. longa C. longa Aloysia citrodora A. citrodora A. citrodora Cinnamomum. verum C. verum C. verum Bacteria desafiada Componente principal (%) MIC (µg ml-1) Referencia V. harveyi V. vulnificus 260 260 Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D
Pseudomonas 260 Laboratorio in house I+D
V. alginolyticus
Monoterpenos (32) V. parahaemolyticus Zingibereno (27) V. vulnificus Zingibereno (27)
V. harveyi V. vulnificus Pseudomonas V. harveyi V. vulnificus Pseudomonas V. harveyi V. vulnificus Pseudomonas 50 32 31 1000 1000 1000 340 340 500 > 1000 > 1000 > 1000 Snuossi et al. (2016) Debbarma et al. (2013) Debbarma et al. (2013) Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D
Allium sativum A. sativum V. harveyi V. vulnificus
A. sativum Pseudomonas
Laurus nobilis Lippia berlandieri L. berlandieri V. alginolyticus V. vulnificus V. vulnificus 1,8-cineol (56) Carvacrol (71) Carvacrol (23)
Apium. graveolens V. alginolyticus
Carvona (27) Eucalyptus camadulensis V. parahaemolyticus α-felandreno (28) E. camadulensis V. vulnificus α-felandreno (28)
Camellia. sinensis C. sinensis V. parahaemolyticus Limoneno (91) V. vulnificus Limoneno (91)
Thymus. vulgaris T. vulgaris T. vulgaris Syzygium. aromaticum Cymbopogon. nardus C. nardus V. anguillarum V. ordalii V. parahaemolyticus V. spp. V. spp. Ps. Spp. Eugenol (49) Citronelal (30) Citronelal (30) 180 180 180 Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D Laboratorio in house I+D
50 100 100 100 31 31 62 125 Snuossi et al. (2016) Paredes-Aguilar et al. (2007) Paredes-Aguilar et al. (2007) Snuossi et al. (2016) Debbarma et al. (2013) Debbarma et al. (2013) Debbarma et al. (2013) Debbarma et al. (2013)
80
Navarrete et al. (2010) 80 - 1280 Navarrete et al. (2010) 80 - 1280 Navarrete et al. (2010) 0.015 Lee et al. (2009) 0.24 - 0.48 Wei & Wee (2013) 0.24 Wei & Wee (2013)
y Recio (2005) el aceite esencial debería inhibir el crecimiento bacteriano por debajo de una concentración de 100 µg ml-1. Por otro lado, Aligiannis et al. (2001) propone una inhibición fuerte a una MIC de 500 µg ml-1 o menor. En la tabla 1 se muestra un resumen de diferentes estudios in vitro. Entre los aceites esenciales evaluados, el proveniente de Syzygium aromaticum posee los resultados más prometedores, siendo capaz de inhibir el crecimiento de Vibrio spp. a una concentración tan baja de 0.015 µg ml-1, seguidas de Cymbopogon nardus con MIC de 0.24 µg ml-1 en la inhibición de Vibrio spp. y Pseudomonas spp. Otros aceites esenciales que podrían ser efectivos agentes antibacteriales para estos patógenos acuícolas podrían provenir de plantas como Allium sativum, Eucalyptus camaldulensis, Zingiber officinale, Lippia berlandieri y Camellia sinensis, que mostraron tener MIC menores a 300 µg ml-1 .
Es de importancia conocer la composición química de cada aceite esencial estudiado. Esto nos permite conocer qué compuestos tienen una alta actividad antibacterial. Basándonos en los resultados mostrados en la Tabla 1, es posible concluir en base al componente principal que el eugenol y el 1,8 cineol son componentes altamente antibacteriales (Bouyahya et al., 2017; Hyldgaard et al., 2012).
En cuanto a los estudios in vivo de aceites esenciales, existen varios reportes indicando sus efectos promotores de crecimiento e inmunoestimulantes en peces (Acar et al., 2015; Baba et al., 2016; de Oliveira Hashimoto et al., 2016; Ngugi et al., 2017; Zheng et al., 2009). Sin embargo, estudios similares no han encontrado efectos significativos de los aceites esenciales sobre el crecimiento del camarón blanco L. vannamei (Kim et al., 2011). Una explicación para estos resultados es la diferenciación en los compuestos activos de cada aceite esencial (Baba et al., 2016).
La efectividad de los aceites esenciales depende de la manera de aplicación y las diferentes moléculas presentes en aceites esenciales aislados de una misma planta. Por ejemplo, en estudios in vitro, a
- FEBRERO 2021
pesar de que el eugenol demuestra ser un efectivo componente principal en aceites esenciales a 0.015 mg L-1 para la inhibición bacteriana, el aceite esencial de Ocimum gratissimum, el cual contiene un 90% de eugenol, no resulta ser tan efectivo como uso terapéutico para peces, aplicado en el agua a concentraciones de 5 y 10 mg L-1 (Sutili et al., 2015). Lo que podría indicar que el efecto de un aceite esencial no solo depende de su componente principal. Por otra parte, se ha observado incluso que aceites esenciales que mostraban una alta MIC pueden tener un resultado muy favorable a concentraciones más bajas que las observadas en el MIC. Esto a su vez podría demostrar que no existe una correlación entre la MIC y la concentración mínima para uso terapéutico en el agua, manifestando que los ensayos in vitro pueden no ser una buena metodología para predecir los resultados in vivo (Cunha et al., 2018). Entre los aceites esenciales que han mostrado reducir la mortalidad de peces al ser usados de manera terapéutica, son aquellos aislados a partir de Ocimum americanum (quimiotipos β-linalol y 1,8 cineol), Hesperozygis ringes, Lippia alba y Melaleuca alternifolia. Sin embargo, más estudios son necesarios sobre los diferentes quimio-tipos presentes, con el fin de garantizar la efectiva protección del animal; ya que estos puedes cambiar la composición y propiedades de los aceites esenciales (Cunha et al., 2018; Deering et al., 2017).
Existen varios métodos de aplicación de fuentes antimicrobianas en la acuicultura. Los más comunes son la inclusión directa al agua o como suplementación en la dieta (Cunha et al., 2018). El primero tiene la ventaja de beneficiar a un gran número de animales al mismo tiempo; sin embargo, posee un alto costo y requiere de grandes cantidades del compuesto. Por otro lado, la suplementación dietética de aceites esenciales tiene la gran ventaja de reducir los costos comparados con la aplicación en el agua. El suministrarlos a través del alimento requiere hacerse de manera preventiva, es decir, antes de que la enfermedad se presente (Sutili et al., 2018); asegurando que los camarones estén consumiendo activamente, ya que los animales enfermos tienden a no alimentarse, lo cual puede ser
PRODUCCIÓN
Tabla 2. Parámetros zootécnicos de L. vannamei con peso inicial 2.05 g, alimentado con dietas suplementadas con diferentes dosis de un único aceite esencial frente a otra fuente. Dosis 2 es la dosis 1 mas un incremento del 50% y la dosis 3 es dos veces la dosis 1.
Figura 2. Actividad anión superóxido de camarones L. vannamei alimentados con dietas suplementadas, con diferentes dosis de aceites esenciales, antes y después de exposición a estrés osmótico.
Figura 3. Concentración de proteína plasmática en camarones L. vannamei alimentados con dietas suplementadas, con diferentes dosis de aceites esenciales, antes y después de exposición a estrés osmótico.
Figura 4. Cantidad de células totales en camarones L. vannamei alimentados con dietas suplementadas, con diferentes dosis de aceites esenciales, antes y después de exposición a estrés osmótico.
Aceite esencial Peso final (g) Biomasa final (g /acuario) Supervivencia (%) FCA Producto A dosis 1 5.17b 47.06a 60a 4.50a Producto A dosis 2 4.88ab 35.70a 49a 4.93a
Producto A dosis 3 4.40a 47.14a 71a 5.52a
Producto B dosis 2 5.20b 38.06a 49a 4.90a
PRODUCCIÓN
- FEBRERO 2021
una limitante y por ende comprometer la ingesta del antimicrobiano. Adicionalmente, otras consideraciones son: la tecnología de procesamiento durante la incorporación del aceite esencial, que debe conservar las propiedades de los componentes; y, el posible efecto negativo sobre la palatabilidad del alimento. Superados estos retos, otros estudios como el análisis de la estabilidad del aceite esencial durante el almacenamiento bajo las condiciones correctas, son necesarias por la posible pérdida de sus efectos biológicos (Sutili et al., 2018).
Laboratorio in house, con el fin de elaborar mejores alimentos sostenibles para el cultivo de camarón, ha realizado estudios en Litopenaeus vannamei alimentados con dietas suplementadas con un aceite esencial a diferentes dosis. Esto, con el objetivo de determinar el mejor porcentaje de suplementación. Se expuso a los camarones a estrés osmótico por un incremento de 10ppt en 4 días, para observar su efecto sobre la supervivencia. Los parámetros zootécnicos evaluados mostraron una mejora del crecimiento no proporcional a una mayor dosis, de manera similar, la supervivencia no se vio incrementada a una mayor suplementación (Tabla 2). Los parámetros inmunológicos de estos camarones mostraron concordancia con los mayores resultados zootécnicos. Aquellas dosis en las que se observaba mayor biomasa final y supervivencia, resultaron ser aquellas con una mayor actividad de anión superóxido (Figura 2), concentración de proteína plasmática (Figura 3) y cantidad de hemocitos totales (Figura 4); lo que pudo beneficiar al camarón contra el estrés inducido por el incremento en la salinidad. La figura 5 muestra que las dosis 1 y 2 del producto A indujeron a una mayor producción de hemocitos granulosos y semigranulosos después de que los camarones fueron sometidos al cambio de salinidad.
Similar a otros aditivos usados en la fabricación de balanceado, el procesamiento o método de obtención puede generar resultados diferentes, a pesar de tratarse del mismo ingrediente. Laboratorio in house estudió diferentes productos conteniendo aceites esenciales, incluyendo dos presentaciones (polvo y líquido) de un mismo aceite esencial suplementado a dietas, mostró diferencias en terminos al crecimiento y respuesta inmunológica en camarones L. vannamei (Tabla 4). Luego de 21 días de alimentación, se evaluó simultáneamente la resistencia del camarón a estrés térmico a baja temperatura y protección contra infección por V. harveyi inoculado a través de la dieta. El efecto del aceite esencial líquido sobre el peso ganado y biomasa final del camarón, fue significativamente mayor en comparación a los demás tratamientos. Las mayores supervivencias fueron registradas en los tratamientos que incluían aceites esenciales del producto B en ambas presentaciones seguido por el producto A como se muestra en la Tabla 4. Sin embargo, la cantidad producida de hemocitos totales fue un 52% mayor en la presentación liquida, comparado con lo encontrado en los camarones suministrados con el mismo aceite esencial en forma de polvo; sugiriendo que bajo la forma líquida se tiene un mayor aprovechamiento de las propiedades de los principales componentes del aceite esencial empleado para la elaboración de dietas de uso preventivo.
Figura 5. Tipos de hemocitos en camarones L. vannamei alimentados con dietas suplementadas, con diferentes dosis de aceites esenciales, antes y después de exposición a estrés osmótico.
Tabla 4. Parámetros zootécnicos e inmunológicos de L. vannamei con peso inicial 4.05 g y sembrados a razón de 56/m2 fueron alimentado con dietas suplementadas con productos conteniendo diferentes aceites esenciales.
Dieta Peso ganado Supervivencia Biomasa final Hemocitos totales (g) (%) (g/acuario) (E+06 células/ml)
Control
1.19 Producto A 1.01 Producto B (Polvo) 0.97 Producto B (Líquido) 1.56 Producto C 1.30 73 87 90 93 77 38.25 44.02 45.18 52.17 41.20 2.10 5.30 5.90 9.00 5.44
Conclusión
A la fecha, los estudios realizados sugieren que los aceites esenciales son un excelente método de prevención contra infecciones bacterianas y promoción del crecimiento en la acuicultura y por lo tanto una estrategia para reducir el uso de los antibióticos convencionales. Como uso preventivo a las infecciones bacterianas, la suplementación dietética de los aceites esenciales parece ser la mejor alternativa para prevenir brotes de enfermedades que ocasionen pérdidas sustanciales. Debido a la amplia variedad de aceites esenciales con propiedades efectivas en la reducción de patógenos, es necesaria una adecuada selección, basada en la sensibilidad a los patógenos presentes en los sistemas de cultivos, en la estabilidad del aceite esencial a su incorporación al alimento y su tiempo de vida hasta su consumo•
Para más información sobre este artículo escriba a: cesar.molina@skretting.com
