Criopreservação de sémen

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REPRODUÇÃO| PEQUENOS RUMINANTES CRIOPRESERVAÇÃO DE SÉMEN A MAIORIA DAS RAÇAS AUTÓCTONES DE PEQUENOS RUMINANTES ESTÁ EM PERIGO DE EXTINÇÃO E TEM ÍNDICES REPRODUTIVOS E PRODUTIVOS QUE TÊM DE SER MELHORADOS. A CRIOPRESERVAÇÃO DO SÉMEN PERMITE A SUA UTILIZAÇÃO ASSOCIADA A OUTRAS BIOTECNOLOGIAS REPRODUTIVAS COMO A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL E A FERTILIZAÇÃO IN VITRO.

Acriopreservação de sémen é uma biotecnologia reprodutiva essencial em programas de melhoramento genético das raças autóctones de pequenos ruminantes. A maioria destas raças está em perigo de extinção e com índices reprodutivos e produtivos que têm de ser melhorados com o objetivo de melhorar a rentabilidade da sua exploração. A criopreservação de sémen é uma metodologia complexa e requer pessoal e equipamento especializados. Existem múltiplos fatores que influenciam a criopreservação de sémen, desde os protocolos de criopreservação, diluidores, espécie animal, fatores individuais e época do ano. Esta biotecnologia diminui significativamente a qualidade do sémen quando comparado com o sémen fresco e/ou refrigerado, daí ser necessário um adequado conhecimento dos múltiplos fatores que condicionam a qualidade do sémen criopreservado. Esta biotecnologia tem múltiplos requisitos com enfoque nas metodologias de recolha, avaliação morfo funcional dos ejaculados, concentração espermática, tipo de diluidores, título de diluição, protocolos de refrigeração, criopreservação e descongelação, condições higiossanitárias dos animais e instalações. O sémen criopreservado tem uma capacidade de conservação ilimitada desde que devidamente conservado em azoto líquido sem diminuição da sua capacidade fertilizante. Esta conservação ilimitada permite que o sémen possa ser utlizado em qualquer período e/ou em qualquer lugar associado a outras biotecnologias reprodutivas como a inseminação artificial (IA) e a fertilização in vitro (FIV). INTRODUÇÃO As raças autóctones portuguesas de pequenos ruminantes são um valioso património genético. Portugal possui 5 raças autóctones de caprinos e 16 raças de ovinos (Lino Neto, comunicação pessoal). A maioria delas encontra-se em perigo de extinção. Globalmente, as raças autóctones de pequenos ruminantes estão bem adaptadas às condições edafoclimáticas em que são exploradas e produzem produtos de excelente qualidade, sendo uma importante fonte de receita de numerosas populações rurais (Barbas et al, 1991; Cavaco Gonçalves et al. 2017). Globalmente são caracterizadas por terem produtividade

MARIA DA CONCEIÇÃO BAPTISTA Engenheira Zootécnica, PhD INIAV, Estação Zootécnica Nacional baptista.sao@gmail.com

JOÃO PEDRO BARBAS Engenheiro Zootécnico, PhD INIAV, Estação Zootécnica Nacional CIISA Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária jpbarbas@gmail.com

inferior quando comparadas com as suas congéneres europeias, correndo o risco de serem substituídas, parcialmente e/ ou totalmente, quando aumenta o nível de intensificação da exploração (Barbas, 1998). As raças autóctones de pequenos ruminantes apresentam baixa sazonalidade reprodutiva (Mascarenhas et al. 1995; Sousa et al. 2000), particularmente a espécie ovina. Todavia existem épocas do ano, nomeadamente no inverno e no início da primavera, em que os índices reprodutivos são inferiores sendo recomendável a utilização de biotecnologias reprodutivas (Sousa et al., 2000; Mascarenhas et al., 2011). REQUISITOS EXIGIDOS AOS MACHOS DADORES DE SÉMEN E TREINO DOS MACHOS Os machos de raças autóctones destinados a colheita de sémen são enviados pelos secretários técnicos das respetivas associações de criadores, após prévia avaliação genética, morfológica e testes sanitários. O estatuto sanitário do Polo de Investigação da Fonte Boa, localizado na Quinta da Fonte Boa, ex Estação Zootécnica Nacional é B4. Assim, os animais destinados a serem dadores de sémen têm obrigatoriamente de ter este estatuto sanitário, seguindo para as instalações de quarentena durante cerca dos 35-40 dias em que são submetidos a diferentes provas sorológicas. Preferencialmente, deverão chegar com uma idade e peso próximos da puberdade, pois facilita o treino dos machos destinados à recolha de sémen (Barbas, 1998; Barbas et al., 2004). Após a saída da quarentena são submetidos a uma avaliação andrológica e colocados num parque com instalações cobertas em que irão permanecer durante o período em que irão decorrer as recolhas de sémen. Para o treino dos machos, procede-se à sincronização do estro de uma fêmea ou em alternativa, procura-se no efetivo disponível a presença de uma fêmea em estro (Barbas, 1998). A presença de uma fêmea em estro, facilitará o trabalho do operador (que faz a recolha do sémen com vagina artificial) no treino dos machos. Esta operação requer muita paciência do operador e várias sessões regulares, preferencialmente 1-2 vezes por semana, deixando o macho saltar na fêmea inicialmente e posteriormente (variação individual) o animal começará a saltar na vagina artificial após várias sessões de treino (Marques et al., 2006; Barbas et al., 2006). Estes deverão manifestar vigor sexual e boa aptidão para o salto na presença dos tratadores. Habitualmente, a inaptidão para o salto pode ser devida a traumas físicos (artrites, feridas, lesões nos cascos) ou traumas psicológicos (condições adversas, stress, lutas, hierarquias) (Evans e Maxwell, 1990; Valente et al., 2010). RECOLHA E AVALIAÇÃO DO SÉMEN O método de recolha de sémen é o da vagina artificial que é acoplada a um cone vaginal tendo no final um tubo coletor graduado (ml) sendo envolvida por uma capa protetora de feltro (isolante térmico) para evitar o choque térmico dos ejaculados recolhidos. Após a recolha do sémen dos animais no local destinado para o efeito (que é sempre o mesmo), designadamente a sala de recolha do sémen, procede-se à avaliação macroscópica e microscópica individual dos ejaculados no Laboratório de Andrologia (Zona Limpa) (Barbas, 1998). Os tubos coletores são identificados e colocados num banho maria mantido a uma temperatura de 30 Cº. Macroscopicamente são avaliados o volume (ml), a cor dos ejaculados (branco, branco leitosa) para despiste de colorações anómalas (cinza, castanho e rosa), a viscosidade e o cheiro (urina) (Valverde et al., 2016; Evans e Maxwell, 1990). Relativamente às avaliações microscópicas, são avaliadas a mobilidade massal (0-5), a mobilidade individual (0- 100%), a concentração espermática (x109/ ml), o número de espermatozoides (spz) totais (x109 por ejaculado), a vitalidade espermática (% de spz vivos) e a % de morfoanomalias na cabeça, peça intermédia e cauda (Evans e Maxwell, 1990; Valente et al., 2010) (Tabela 1). Nas Tabelas 2 e … 3, são apresentados os valores médios dos parâmetros seminais do sémen fresco nas

TABELA 1 AVALIAÇÕES MICROSCÓPICAS DOS PARÂMETROS SEMINAIS DOS EJACULADOS

Análise microscópica

Mobilidade massal Descrição

Avaliada numa escala de 0-5 (intensidade e vigor dos movimentos de onda) depositando uma gota (10 µl) de sémen puro na platina aquecida (37 ºC) do microscópio (200 X), para observação de “movimentos de onda”

Mobilidade individual

Concentração espermática

Vitalidade espermática

Avaliação subjetiva em que se estima a % de spz móveis, com boa qualidade de movimentos, nomeadamente progressivos, retilíneos e uniformes, diluindo previamente um gota de sémen (1/100) em soro fisiológico aquecido (30 ºC) (Barbas, 1998)

Determinada num espectrofotómetro calibrado para a respetiva espécie, após uma diluição 1/400 numa solução aquosa.

Determinada (com a utilização de objetiva de imersão (1000 X) e contando no mínimo 100 spz) pela % de spz vivos (não corados) num esfregaço utilizando 2 gotas do corante vital eosina-nigrosina e 1 gota sémen diluído (1/100) (Evans e Maxwell, 1990; Valente et al., 2010).

Variável Volume Mobilidade massal Vigor Nº total de espermatozoides Mobilidade individual Espermatozoides normais Ejaculados/semana

Adaptada de Morrow (1986) Valores médios 0,8 presente 3 2x10 9

80% 90% 20

TABELA 3 EJACULADOS/PARÂMETROS SEMINAIS EM ESPÉCIE CAPRINA

Variável Volume Mobilidade massal Vigor Nº total de espermatozoides Mobilidade individual Espermatozoides normais Ejaculados/semana

Adaptada de Morrow (1986) Valores médios 1,0 presente 3 3x10 9

75% 90% 6-24

…espécies ovinas (Tabela 2) e na espécie caprina (Tabela 3) (Morrow, 1986; Valente et al., 2010). Alguns dos parâmetros seminais dos ejaculados processados podem ser determinadas de um modo objetivo através da utilização de equipamentos automáticos de grande precisão designados por CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer). Estes equipamentos, determinam adicionalmente outros parâmetros cinéticos, nomeadamente VAP, VSL, VCL, ALH, BCF, STR e LIN. Têm igualmente módulos de morfologia e de fluorescência, sendo necessário a utilização de fluorocromos para determinar a integridade do DNA, acrossoma e a atividade mitocondrial como parâmetros seminais mais relevantes (Barbas e Mascarenhas, 2009; Evans e Maxwell, 1990 ). ETAPAS DE PREPARAÇÃO E A CRIOPRESERVAÇÃO DO SÉMEN A formulação, a utilização de diluidores específicos e a utilização de excelentes protocolos de criopreservação de sémen são requisitos indispensáveis (entre outros) para a produção de sémen de criopreservado de qualidade (Barbas e Mascarenhas, 2009). É nosso objetivo que a sua utilização, juntamente com outras biotecnologias reprodutivas, permita a obtenção de bons índices reprodutivos e contribua para o melhoramento genético das raças autóctones de pequenos ruminantes.

DILUIDORES DE CRIOPRESERVAÇÃO No nosso laboratório temos procurado formular os diluidores que melhor se adaptem à criopreservação de sémen de pequenos ruminantes (Barbas e Mascarenhas, 2009; Valente et al., 2010). Os diluidores que utilizamos no nosso laboratório têm como componentes principais o tris ou citrato de sódio (tampão/pH e osmolaridade), a glucose e/ou frutose (energia), a gema de ovo (devido à sua composição em fosfolípidos é adequada na proteção da integridade da membrana plasmática), o glicerol (crioprotetor interno) e antibióticos (inibição do desenvolvimento microbiano) (Barbas e Mascarenhas, 2009). O controlo do pH é igualmente importante. Por vezes temos utilizado crioprotetores externos como a trealose (Valente et al., 2010). Os diluidores e os protocolos de criopreservação de sémen de ovino e caprino são muito diferentes. Uma das principais diferenças têm a ver com a percentagem de gema de ovo na composição do diluidor, bem como a utilização de duas centrifugações do ejaculado de bode após adição de uma solução salina isotónica (solução de fosfato de Ringer) para remoção do plasma seminal, que antecedem a utilização do diluidor de criopreservação (Marques et al., 2006; Barbas et al., 2006). SELEÇÃO DE EJACULADOS PARA CRIOPRESERVAÇÃO Unicamente os ejaculados com mobilidade individual e viabilidade ≥ 50% são selecionados para a criopreservação (Barbas et al., 2013). Os ejaculados de ovinos e caprinos destinados à criopreservação são diluídos de forma a terem concentrações espermáticas de 1,2 * 109 e 800 milhões de spz totais por ml. São utilizadas palhinhas “Cassou Straws” de 0,25 ml (Barbas et al., 2013). Assim, o número de spz totais e o número de doses produzidas por ejaculado são determinados pela concentração espermática e pelo volume (Barbas et al., 2013; Romão et al., 2013). Previamente ao enchimento das palhinhas, todos os ejaculados destinados à criopreservação, e após a sua prévia diluição com o diluidor de criopreservação, são novamente visualizados para controle de qualidade. Se alguma anomalia ocorreu, os ejaculados são imediatamente rejeitados (Barbas et al., 2013). REFRIGERAÇÃO As palhinhas destinadas à criopreservação são devidamente identificadas com o número o local de recolha de sémen, número de SIA do animal, cores da palhinha e do alcoolpolivinílico (pvc) utilizado na selagem, e pela numeração do visutubo. Após o enchimento das palhinhas, estas são seladas com pvc e depositadas numa proveta contida num copo de vidro (1 litro) com água a 28 ºC. Este é colocado numa bancada refrigeradora regulada para uma temperatura de 4 ºC. As palhinhas de sémen são submetidas a uma descida gradual da temperatura de cerca de 0,2 ºC /minuto até aos 4 ºC utilizando um tempo de equilíbrio de 3,5 horas (Valente et al., 2010). CRIOPRESERVAÇÃO Posteriormente as palhinhas são dispostas horizontalmente numa “floating freezing rack” (cuja temperatura está situada entre os -110 e os -120 Cº) cerca de 4 cm acima do nível de azoto líquido. O procedimento da criopreservação do sémen em vapores de azoto líquido tem uma duração de 20 minutos (Barbas et al., 2013). Seguidamente, são submergidas em azoto líquido e posteriormente armazenadas em visotubos durante cerca de 24-48 horas até posterior descongelação para avaliação da qualidade dos ejaculados criopreservados (Barbas e Mascarenhas, 2009). FATORES QUE INFLUENCIAM A QUALIDADE DO SÉMEN CONGELADO Existem vários fatores que condicionam a qualidade do sémen criopreservado. O principal objetivo é a obtenção de sémen criopreservado com capacidade fertilizante. A sua utilização “in vitro”, através da fertilização homóloga ou heteróloga, é um bom indicador da capacidade fertilizante …

…do sémen. Mas o teste decisivo da determinação da sua capacidade fertilizante é a sua utilização “in vivo” através da inseminação artificial (IA). A obtenção de uma boa fertilidade é o principal indicador da capacidade fertilizante do sémen criopreservado (Barbas et al., 2013; Romão et al., 2013). Os principais fatores que influenciam a qualidade do sémen são os seguintes (Barbas e Mascarenhas, 2009; Barbas et al., 2013; Romão et al., 2013): - espécie, raça, fatores individuais; - época do ano, método de recolha do sémen e frequência de ejaculação; - temperaturas de avaliação e processamento do sémen; - metodologias de avaliação quantitativa e qualitativa dos ejaculados; - composição dos diluidores, concentração e tipo de crio-protetores e antioxidantes; - metodologias de criopreservação do sémen: 1 ou 2 etapas (momento da adição e concentração em glicerol ou outro crioprotetor interno) de adição da fração glicerolada do diluidor; - equipamentos, curvas (velocidades de arrefecimento do sémen) de refrigeração e congelação (temperaturas e duração); - protocolos de descongelação do sémen criopreservado.

EFEITOS DA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÉMEN A qualidade do sémen criopreservado e a sua capacidade fertilizante são significativamente inferiores comparativamente ao sémen fresco e ou refrigerado. A criopreservação é uma biotecnologia complexa e dispendiosa que requer equipamento e pessoal especializado. É uma metodologia traumática para os ejaculados recolhidos cujos efeitos dependem de múltiplos fatores, salientandose a qualidade dos ejaculados, a espécie animal, fatores individuais, diluidores de criopreservação e os protocolos de criopreservação aplicados (Barbas et al., 2013; Barbas et al., 2017). Os principais efeitos traumáticos da criopreservação a nível das células espermáticas são as crio-lesões espermáticas, em consequência de vários fatores físicos e osmóticos, como a formação de cristais de gelo (intracelulares), modificações da estrutura e composição fosfolipídica das membranas plasmáticas e organelos intracelulares, os quais têm efeitos determinantes na motilidade espermática, integridade do acrossoma e DNA, e capacidade fertilizante in vitro e in vivo (Barbas et al., 2000; Barbas e Mascarenhas, 2009; Horta et al., 2010). Torna-se assim necessário minorar os efeitos traumáticos, nomeadamente a formação de cristais de gelo, a diminuição das lesões das membranas plasmáticas e organelos intracelulares e no aumento da sobrevivência à congelação e descongelação através de estratégias para aumentar a crioresistência dos spz (Sousa et al., 2001; Barbas et al., 2013; Barbas et al., 2017). PROPOSTAS PARA MELHORAR A CRIOPRESERVAÇÃO DO SÉMEN Sendo a criopreservação uma metodologia traumática para as células espermáticas é essencial continuar os estudos sobre os múltiplos fatores que a influenciam, com o objetivo de melhorar a qualidade do sémen criopreservado (estratégias para melhorar a crioresistência) (Barbas et al., 2017), designadamente as suas características morfofuncionais e capacidade fertilizante in vitro e in vivo (Barbas e Mascarenhas, 2009; Romão et al. 2013). As principais etapas a explorar para melhorar a qualidade dos criopreservados são: - a seleção dos machos após a sua avaliação andrológica, o seu libido e a qualidade dos ejaculados frescos e crio-preservados, avaliados pelo CASA; - o estudo e a formulação de novos diluidores contendo antioxidantes e aditivos, que melhorem a qualidade do sémen criopreservado (Barbas et al. 2013; (Barbas et al. 2017); - a testagem e refinamento de protocolos de criopreservação e descongelação do sémen (Horta et al., 2014; Barbas et al., 2013); - a testagem dos machos “in vitro” através de fertilização homóloga e heteróloga; - a utilização do sémen criopreservado “in vivo” através da inseminação artificial (IA) recolhendo a informação reprodutiva, com enfoque na fertilidade dos efectivos utilizados na experimentação (Barbas e Mascarenhas, 2009; Romão et al., 2013). DESCONGELAÇÃO DE SÉMEN A qualidade do sémen descongelado é influenciada por múltiplos fatores, nomeadamente a espécie, a variabilidade individual, a metodologia de recolha do sémen, a qualidade dos ejaculados, a concentração espermática por dose, a composição do diluidor e os protocolos de refrigeração (tempo de equilíbrio, temperaturas e duração do processo) e criopreservação (velocidades de arrefecimento, duração, e temperaturas) (Barbas e Mascarenhas, 2009; Horta et al., 2014) . A descongelação do sémen é realizada durante as primeiras 48 horas após a criopreservação em água à temperatura de 38 ºC durante 1 minuto. Habitualmente é descongelada 1 palhinha por ejaculado/ animal/sessão de criopreservação. Posteriormente, o seu conteúdo (0,25 ml) é depositado num tubo de ensaio (em banho maria a 38 ºC) contendo 1 ml de soro fisiológico (diluição de 1:4), iniciandose as observações 5 minutos mais tarde. Habitualmente avalia-se a mobilidade individual, vitalidade e morfo-anomalias espermáticas. Unicamente os ejaculados com MI e % de Spz vivos ≥ 35 %, e com <25% de morfo-anomalias espermáticas (sémen descongelado) são selecionados e conservados em contentores de azoto líquido (Valente et al., 2010; Barbas et al., 2013). O sémen crio-preservado tem múltiplas utilizações, designadamente para o Banco Português de Germoplasma Animal (BPGA), em investigação e desenvolvimento experimental (avaliação da capacidade fertilizante) e em programas de melhoramento genético de raças autóctones de pequenos ruminantes (Barbas et al. 2017). Alguns autores (Barbas e Mascarenhas, 2009; Barbas et al., 2013), após observação de diferenças individuais na qualidade do sémen e sua congelabilidade, sugeriram ajustamentos individuais dos diluidores e/ou dos protocolos de criopreservação de sémen em pequenos ruminantes. Ungerfeld et al., (2017) verificaram nas espécies selvagens e/ ou nas espécies recentemente domesticadas que existia uma maior variabilidade individual na congelabilidade do sémen, comparativamente a outras espécies há muito domesticadas.

CONCLUSÕES E PERSPETIVAS • A tolerância dos ejaculados para a criopreservação é fortemente condicionada por múltiplos fatores, salientando a espécie, raça, qualidade dos ejaculados, variabilidade genética individual, época do ano, composição dos diluidores e os protocolos de criopreservação utilizados (Barbas et al., 2009). • A congelação é uma biotecnologia que diminui a qualidade do sémen acrescido do facto de haver uma percentagem importante de animais cujo sémen não é apto para a congelação (Barbas et al., 2017). • Podem verificar-se variações na qualidade do sémen congelado em função da espécie, raça, indivíduos e época do ano em que é recolhido o sémen. • Há que continuar o desenvolvimento de estudos para melhorar a crio-resistência do sémen e o aumento da sua capacidade fertilizante (Barbas et al., 2017). • Habitualmente, os ejaculados com maior mobilidade individual sugerem uma maior fertilidade. Todavia, estes resultados carecem ser confirmados em programas de inseminação artificial (Barbas et al., 2013) . • A utilização da inseminação artificial (IA) permite a utilização de sémen de reprodutores de alto valor genético para características desejáveis, como o aumento da produtividade e a qualidade dos produtos tais como a carne, leite, lã e/ou pelo (Barbas et al., 2016; Cavaco-Gonçalves et al., 2017).

As referências Bibliográficas serão disponibilizadas através dos emails dos autores. Agradecimentos: Trabalho realizado no âmbito do Projecto ALT-Biotech.