AKTUALNOŚCI Z NARODOWEGO CENTRUM PROMIENIOWANIA SYNCHROTRONOWEGO SOLARIS

AKTUALNOŚCI Z NARODOWEGO CENTRUM PROMIENIOWANIA SYNCHROTRONOWEGO SOLARIS

Pierwsza publikacja naukowa z badań na mikroskopie cryo-em

Możemy już pochwalić się pierwszą publikacją powstałą na podstawie badań prowadzonych za pomocą kriomikroskopu elektronowego, który znajduje się w Centrum SOLARIS. Praca autorstwa Ewy Drab i Kaori Sugihary Cooperative Function of LL-37 and HNP1

Protects Mammalian Cell Membranes from Lysis prezentuje, nowe wśród peptydów antybakteryjnych, zjawisko przekierowania niszczącego działania wobec błon patogenu na działanie ochronne, jeśli dotyczy ono błon komórkowych gospodarza. Kluczem okazuje się sparowanie dwóch peptydów, które umożliwia rozróżnienie pomiędzy patogenem agospodarzem. Znana z synergistycznego przeciwbakteryjnego działania para peptydów LL-37 oraz HNP1, silnie niszczących błony komórkowe bakterii, zostaje przekierowana na funkcję chroniącą komórki gospodarza przed lizą w zależności od tego, czy celem ich działania są komórki gospodarza, czy komórki patogenu.

LL-37 to amfipatyczny ludzki peptyd uwalniany z katelicydyny, którego obecność wykazano wkomórkach nabłonka jąder, skóry, przewodu pokarmowego idróg oddechowych, a także w monocytach, neutrofilach, limfocytach T, komórkach NK ikomórkach B. Wykazano, że posiada on własności przeciwdrobnoustrojowe, przeciwwirusowe iprzeciwnowotworowe, a także pełni funkcje immunomodulacyjne, czyli przeciwzapalne, prozapalne, chemotaktyczne i cytotoksyczne, a także sprzyja migracji komórek. HNP1 jest ludzkim peptydem zrodziny defensyn, składającym się z 30 aminokwasów i przyjmującym strukturę trójniciowego arkusza β. Jest uwalniany z komórek pod wpływem bodźców lub, w niektórych przypadkach, z neutrofili i monocytów, wykazując działanie przeciwdrobnoustrojowe, neutralizując toksyny bakteryjne i modulując

Wnętrze mikroskopu Glacios

adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. W2000 roku Nagaoka wykazał ewidentnie bezpośredni efekt synergistyczny peptydów LL-37/HNP1 przeciwko Escherichia coli i Staphylococcus aureus. Wiadomym jest, że LL-37 w wysokich stężeniach wykazuje właściwości cytotoksyczne, niszcząc błony komórkowe, nie wiadomo natomiast, w jaki sposób komórki gospodarza chronią się przed atakiem. W celu

zbadania kooperatywności peptydów LL-37/HNP1 na komórki gospodarza, przeanalizowano odpowiedź komórek ssaków (MDCK – Madin-Darby Canine Kidney i HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells) i modeli błon komórkowych na działanie LL-37, HNP1 oraz ich mieszaniny.

Analizę aktywności peptydów na błonach ssaków przeprowadzono z użyciem metod FRAP (Fuorescence Recovery After Photobleaching), QCM-D (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation), EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy) oraz zwykorzystaniem pomiaru przewodnictwa elektrycznego na poziomie pojedynczego kanału, a także kilku metod spektroskopowych i mikroskopii elektronowej. Badania, przeprowadzone na syntetycznych błonach komórkowych, dały podobne wyniki do przeżyciowego testu toksyczności na poziomie komórkowym przeprowadzonego za pomocą barwnika wrażliwego na wapń. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano antagonistyczne oddziaływanie peptydów wstosunku do komórek MDCK iHUVEC, w których cytotoksyczność LL-37 była tłumiona przez HNP1. Z obecnych i poprzednich analiz wynika więc, że współdziałanie pary peptydów LL-37/HNP1 może ulegać zmianie z destrukcyjnej na ochronną w zależności od tego, jaki typ komórek jest celem ich ataku. Mikroskopia elektronowa Cryo, dostępna w NCPS Solaris, pozwoliła zwizualizować, że LL-37 niszczy pęcherzyki reprezentujące błony plazmatyczne Eukaryota, zbudowane zlipidów POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine), rozkładając je na małe fragmenty. HNP1 powoduje protruzję błony komórkowej, natomiast mieszanina obu peptydów hamuje powyższe efekty.

Peptyd HNP1 samodzielnie nie indukuje zauważalnej cytotoksyczności w warunkach eksperymentu in vitro, natomiast hamuje destrukcyjny wpływ LL-37, jeśli stosowany jest wmieszaninie LL-37/HNP1. Prezentowane wyniki opisują potencjalne możliwości „podwójnej współpracy” peptydów LL-37 i HNP1, która może być wykorzystana przez układ immunologiczny ipomocna wprzyszłości w rozwoju efektywnych i bezpiecznych czynników przeciwdrobnoustrojowych.

Badania zostały opublikowane w„Biophysical Journal”(Impact Factor = 3.665), a z pełną wersją pracy można zapoznać się pod adresem https://doi.org/10.1016 /j.bpj.2020.10.031. Zwraca uwagę nowe zjawisko pojawienia się nanodysków pod wpływem peptydów antybakteryjnych, co zostało uwidocznione na przyznanej tej pracy okładce czasopisma. Z uwagi na znaczący wpływ opublikowanego odkrycia na pole badań peptydów antybakteryjnych artykuł został opatrzony ilustrowanym komentarzem edytorów (Tyler S. Johnson and Charles M. Deber, Protection or Destruction: The LL-37/ HNP1 Cooperativity Switch) w tym samym wydaniu czasopisma (DOI:https:// doi.org/10.1016/j.bpj.2020.10.046).

Realizacja badań na kriomikroskopie była możliwa dzięki współpracy dr. Sebastiana Glatta, dr. Michała Rawskiego i dr inż. Pauliny Indyki. Pierwszy nabór wniosków badawczych na kriomikroskop został otwarty we wrześniu 2019 roku.

Oprac. Sylwia Orzechowska

Narodowe Centrum Promieniowania Synchrotronowego SOLARIS

KRIOMIKROSKOP GLACIOS CZĘŚCIĄ INFRASTRUKTURY BADAWCZEJ SOLARIS

13 stycznia 2021 w obecności przedstawicieli Centrum SOLARIS oraz firmy LABSOFT odbyło się oficjalne podpisanie protokołu przekazania kriomikroskopu Glacios. Uzupełni on ofertę badawczą Krajowego Centrum Kriomikroskopii Elektronowej. Tym samym NCPS SOLARIS staje się jedynym w Polsce, który dysponuje dwoma komplementarnymi kriomikroskopami o najwyższych parametrach technicznych. Jest to też jedyne w kraju urządzenie badawcze tego typu, które dysponuje detektorem najnowszej generacji Falcon 4. Warto przypomnieć, że zakup mikroskopu możliwy był dzięki dofinansowaniu unijnemu w ramach konkursu organizowanego przez Ośrodek Przetwarzania Informacji. Użytkowanie drugiego obok Titan Krios G3i kriomikroskopu elektronowego skierowane będzie zarówno na potrzeby eksperymentów naukowych, jak i do firm zainteresowanych wykorzystaniem techniki Cryo-EM w swoich badaniach (około 40 procent czasu badawczego).

Starania o zakup mikroskopu podjęliśmy z uwagi na zainteresowanie ze strony firm, które pytały o możliwość przeprowadzenia pomiarów przy wykorzystaniu techniki kriomikroskopii elektronowej – mówi Michał Młynarczyk, zastępca dyrektora ds. administracji i finansów wSOLARIS. – Zależy nam, aby umożliwić polskim firmom dostęp do tej atrakcyjnej nowej technologii, która rozwija się bardzo szybko i staje się obecnie najważniejszą stosowaną w biologii strukturalnej. Wyniki

Kriomikroskop Glacios uzupełni ofertę badawczą SOLARIS

uzyskiwane w trakcie pomiarów ułatwiają zrozumienie mechanizmów komórkowych chorób człowieka, projektowanie nowych leków oraz ulepszanie już istniejących. Technika ta jest również z powodzeniem stosowana w nanotechnologii i innych dziedzinach nauki i przemysłu – uzupełnia Sebastian Glatt, szef grupy badawczej Maxa Plancka w Małopolskim Centrum Biotechnologii, główny partner SOLARIS w realizacji tego projektu.

Cenny nabytek przeszedł już pierwsze testy, które okazały się bardzo zadowalające. Kolejnym etapem będą badania testowe zaprzyjaźnionych użytkowników. Oficjalne otwarcie naboru aplikacji oczas badawczy zarówno podmiotów komercyjnych, jak i niekomercyjnych przewidywane jest na trzeci kwartał 2021 roku. Badania na tym kriomikroskopie będą płatne. Szczegółowy kalendarz dostępnego czasu badawczego oraz cennik już wkrótce zostanie zamieszczony na stronie internetowej Centrum SOLARIS.

Oprac. Katarzyna Bester-Ostrowska