ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN TRONG CHẾ PHẨM DƯỢC LIỆU CHỨA THỔ PHỤC LINH BẰNG HPLC by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN BẰNG HPLC

vectorstock.com/2358396

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN TRONG CHẾ PHẨM DƯỢC LIỆU CHỨA THỔ PHỤC LINH BẰNG HPLC WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

ƠN

OF FI C

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

IA L

BỘ Y TẾ

HOÀNG THỊ THUỲ LINH

ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN TRONG CHẾ

QU Y

PHẨM DƯỢC LIỆU CHỨA THỔ PHỤC

KÈ M

LINH BẰNG HPLC

DẠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

OF FI C

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

IA L

BỘ Y TẾ

HOÀNG THỊ THUỲ LINH

ƠN

Mã sinh viên: 1601434

ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN TRONG CHẾ PHẨM DƯỢC LIỆU CHỨA THỔ PHỤC

QU Y

LINH BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

1. TS. Trần Nguyên Hà 2. ThS. Nguyễn Thị Thanh Nhài Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

DẠ

KÈ M

Người hướng dẫn:

HÀ NỘI - 2021

IA L

LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội, dưới sự hướng dẫn, tận tình chỉ bảo của TS.

OF FI C

Trần Nguyên Hà và ThS. Nguyễn Thị Thanh Nhài.

Lời đầu tiên, tôi xin được phép gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến những người đã hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này: TS. Trần Nguyên Hà, ThS. Nguyễn Thị Thanh Nhài, PGS. TS. Phạm Thị Thanh Hà, ThS. Vũ Ngân Bình và ThS. Nguyễn Hoàng Lê. Các thầy, cô luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, luôn nhiệt tình giải đáp mọi thắc mắc, luôn khích lệ tinh thần,

ƠN

động viên tôi mỗi khi gặp khó khăn, cũng như gợi ý những hướng giải quyết những vấn đề tôi gặp phải.

Tiếp theo, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô của bộ môn Hóa phân tích

và Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, người thân và gia đình đã luôn

QU Y

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, xin kính chúc các thầy cô luôn có một sức khỏe dồi dào, luôn

DẠ

KÈ M

hạnh phúc và thành công trong tương lai.

Hà Nội, ngày 07 tháng 06 năm 2021 Sinh viên

Hoàng Thị Thuỳ Linh

IA L

MỤC LỤC

OF FI C

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................... 3

ƠN

1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................... 3 1.1.1. Thực vật học ........................................................................................ 3 1.1.2. Astilbin và các thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh ............... 4

1.1.3. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh ..... 8 1.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC ...................................................... 11 1.2.1. Khái niệm .......................................................................................... 11

QU Y

1.2.2. Cấu tạo hệ thống HPLC .................................................................... 12 1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký .................................... 12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 13

KÈ M

2.1.1. Mẫu thử ............................................................................................. 13 2.1.2. Hoá chất ............................................................................................ 13 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................... 14

2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 14 2.2.1. Khảo sát qui trình xử lý mẫu ............................................................. 14

DẠ

2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích AST trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................... 14 2.2.3.Thẩm định phương pháp .................................................................... 15

2.3. Áp dụng phương pháp ........................................................................... 20 2.4. Xử lý kết quả ........................................................................................... 20

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............. 21

IA L

3.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ............................................................... 21 3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết ............................................................... 21 3.1.2. Khảo sát thời gian chiết..................................................................... 23

OF FI C

3.1.3. Khảo sát số lần chiết ........................................................................ 23 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................... 25 3.3. Thẩm định phương pháp ....................................................................... 28 3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................... 28 3.3.2. Độ đặc hiệu ....................................................................................... 28 3.3.3. Xây dựng đường chuẩn ..................................................................... 29

ƠN

3.3.4. Độ lặp lại của phương pháp .............................................................. 30 3.3.5. Độ đúng của phương pháp ................................................................ 31 3.3.6. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ........................................... 32

3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm viên nang cứng có chứa thổ phục linh trên thị trường ....................................................................... 32 3.5. Bàn luận .................................................................................................. 33

QU Y

3.5.1. Về quy trình xử lý mẫu ..................................................................... 33 3.5.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp .......................................... 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 35 Kết luận .......................................................................................................... 35 Kiến nghị ........................................................................................................ 35

KÈ M

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DẠ

PHỤ LỤC

IA L

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tiếng Việt

AST

Astilbin

HPLC

High Performance liquid chromatography

OF FI C

Ký hiệu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD

Limit of Detection

LOQ

Limit of Quantitation

MeOH

Methanol

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

TPL

Smilax Glabra

Thổ phục linh

Ultraviolet

UV-VIS

Ultraviolet – Visible

Giới hạn định lượng

ƠN

Methanol

QU Y KÈ M Y DẠ

Giới hạn phát hiện

Tử ngoại Tử ngoại – khả kiến

IA L

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh ....... 8 Bảng 2.1. Quy trình pha các mẫu thử thêm chuẩn .............................................. 19

OF FI C

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hàm lượng AST với các phương pháp chiết khác

nhau ..................................................................................................................... 22 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết ......................................................... 23 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát số lần chiết .............................................................. 24 Bảng 3.4. Chương trình gradient chạy sắc ký ..................................................... 27 Bảng 3.5. Kết quả độ phù hợp hệ thống .............................................................. 28

ƠN

Bảng 3.6. Kết quả đường chuẩn……………………………………………… 29 Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại của phương pháp ................................................... 31 Bảng 3.8. Kết quả độ đúng của AST................................................................... 32

Bảng 3.9. Hàm lượng AST của một số chế phẩm chứa Thổ phục linh trên thị

DẠ

KÈ M

QU Y

trường .................................................................................................................. 33

IA L

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây thổ phục linh .................................................................................. 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của AST .................................................................. 4

OF FI C

Hình 1.3. Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và dung môi ............ 5 Hỉnh 1.4. Dihydroflavonol được tách từ rễ TPL ................................................... 7 Hình 1.5. Một số các flavonoid khác được tách từ rễ TPL ................................... 7 Hình 1.6. Lignan glycoside được tách từ rễ TPL .................................................. 8 Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc hệ thống HPLC ........................................................... 12 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu ................................................................... 25

ƠN

Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát theo điều kiện sắc ký của Dược điển Việt Nam V26 Hình 3.3. Sắc ký đồ được chọn với pha động MeOH 60% : H20 = 38 : 62 ....... 27 Hình 3.4. Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc ở bước sóng 291 nm ...................... 28

DẠ

KÈ M

QU Y

Hình 3.5. Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ AST ................ 30

IA L

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay bên cạnh các loại thuốc tổng hợp hóa học thì việc sử dụng các

OF FI C

loại cây cỏ, thảo mộc để điều chế thuốc chữa bệnh, thực phẩm chăm sóc sức

khỏe cũng được phát triển rộng rãi và ngày càng được ưa chuộng. Không nằm ngoài xu hướng chung của thế giới, nguồn dược liệu thực vật Việt Nam ngày càng được khẳng định có giá trị to lớn trong việc chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe. Nhiều loại thuốc được sản xuất từ dược liệu Việt Nam như Berberin, Palmatin… Đối với các nhà khoa học, các nhà quản lý, yêu cầu về việc kiểm soát thành

ƠN

phần cũng như hoạt tính sinh học của các dược liệu càng được đề cao nhằm mục đích sử dụng chúng một cách hợp lý, khoa học và hiệu quả. Trong số các bài thuốc dân gian đã và đang được quan tâm nghiên cứu đầy đủ về hoạt chất và

hoạt tính sinh học, trong đó phải kể đến là cây Thổ phục linh. Thổ phục linh (Smilax glabra) vốn là một loại cây mọc hoang ở các vùng miền núi ở nước ta. Từ rất lâu, trong Y học cổ truyền Việt Nam, Thổ phục linh

QU Y

được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh về gân cốt, trị giun sán, ung nhọt, giải độc, chống viêm …[1]. Theo Y học cổ truyền Trung Quốc thì rễ của Thổ phục linh (TPL) có tác dụng giải độc, làm giảm mất nước, có thể được sử dụng để điều trị bệnh trùng xoắn, viêm da, bệnh giang mai, bệnh brucella, cấp tính do vi khuẩn kiết lỵ…[1].

KÈ M

Y học hiện đại cũng chỉ ra trong rễ Thổ phục linh có chứa astilbin (AST),

đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn hoạt động của acid uric trong máu, tăng sản hoạt dịch, giảm viêm, ngăn chặn xâm nhập tế bào vào màng hoạt dịch, từ đó làm giảm quá trình ăn mòn sụn khớp [18, 21]. Hơn nữa, trong các loài

TPL, chỉ có chi Smilax chứa AST có tác dụng dược lý và là chất chỉ điểm của

DẠ

loài này [3]. Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về thành phần hoá học [4], hoạt tính sinh học [3, 4] cũng như phương pháp định tính, định lượng trong dược liệu TPL [2, 4]. Trong DĐVN V, AST đã được lựa chọn làm chất đánh dấu trong cả chỉ tiêu định tính và định lượng cho dược liệu TPL [2]. Nhưng 1

chưa có nghiên cứu nào xây dựng phương pháp định lượng AST trong dược

IA L

phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ từ TPL và các dược liệu khác. Trong khi đó,

các thành phần của TPL cũng như các dược liệu khác thường khá phức tạp, không thể ứng dụng trực tiếp phương pháp định lượng AST trong dược liệu của

OF FI C

Dược điển Việt Nam vào các sản phẩm này. Các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa TPL trên thị trường chủ yếu là dạng viên nang cứng, một số ít là dạng cao lỏng, nước uống, viên hoàn.

Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng Astilbin trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng HPLC” nhằm mục tiêu như sau: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AST trong chế phẩm

DẠ

KÈ M

QU Y

ƠN

chứa Thổ phục linh bằng HPLC góp phần kiểm tra chất lượng sản phẩm.

IA L

CHƯƠNG 1. TỔNG QU AN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Thực vật học

OF FI C

Thực vật học Thổ phục linh thuộc: - Họ Khúc Khắc (Smilacaceae)

ƠN

- Chi Khúc khắc (Smilax)

Hình 1.1: Cây thổ phục linh Thổ phục linh có tên khoa học là Smilax glabra hay còn gọi là Khúc

QU Y

Khắc, Kim cang, khau đâu, cẩu ngổ lực (Tày), mọi hoi dòi (Dao), D’rang lò (Châu Mạ), tơ pớt (K’Ho), Lái (K’Dong), Smilax gabre, squine (Pháp). TPL thuộc chi Khúc Khắc (Smilax) là chi của khoảng hơn 200 loài dây leo hay thân thảo trong thực vật có hoa, nhiều loài trong số đó là các cây thân gỗ hay có gai.

KÈ M

Các loài trong chi Smilax mọc thành dạng cây bụi, tạo ra bụi rậm dày đặc khó xuyên qua. Chúng thuộc họ Smilacaceae. Tên gọi là Sarsaparilla là tên chung cho nhiều loài thuộc họ Khúc Khắc (Smilacaceae). Có rất nhiều loài của họ Smilacaceae mang chung một tên là Sarsaparilla

như loài offiinalis, aristolochiaefolia, glabra, febrifuga, ornata, regelii, japicanga

mọc ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới nhưng giống nhau về hình dáng, về tính

DẠ

năng và thành phần hoá học cũng như sử dụng. Họ Khúc Khắc bao gồm khoảng 350 loài, được phân bố tại những vùng khí hậu ôn hoà, nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam Mỹ, Jamaica, Caribbean, Mexica, Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt 3

Nam,… Trong đó Smilax glabra ( Roxb) phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Đài

IA L

Loan, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, TPL phẩn bố rải rác khắp các tỉnh ở miền núi cũng như trung du và một vài đảo lớn. TPL là loại cây leo, sống lâu năm, trườn dài 4-5 m (có thể tới 10 m), phân nhiều cành. Cành

OF FI C

nhỏ, mềm, không gai, lá mọc so le, hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 5-11 cm,

rộng 1-5 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên sáng bóng, mặt dưới bệnh như phấn trắng, lá khô có màu hạt dẻ rất đặc sắc, gân chính 3, cuống lá dài 1 cm mang tua cuốn mảnh và dài do lá kèm biến đổi. Cụm hoa mọc ở kẽ lá, cuống rất ngắn và gần như không cuống, mang 1 tán đơn gồm nhiều hoa màu vàng nhạt, cuống hoa mảnh như sợi chỉ, dài 1 cm hoặc hơn. Hoa đực và hoa cái riêng rẽ, hoa đực có lá

ƠN

đài hình tim dày, cánh hoa bầu hơi khum, nhị không cuống, bao phấn thuôn, hoa cái giống hoa đực. Sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm. Tuy nhiên chỉ những cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa, quả. Quả

mọng, hình cầu, đường kính 6-7 mm gần như 3 cánh, chứa 3 hạt, khi chín màu đen [1].

1.1.2. Astilbin và các thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh

QU Y

Astilbin

- AST là một flavanonol, một dạng của flavonoid có dạng đồng phân 2R – trans, dạng neoisoastilbin là đồng phân (2S – cis) và isoastilbin là dạng đồng phân (2R-cis). AST được tìm thấy trong nhiều họ như Hypericaceae, Smilacaceae, ….như hình 1.2.

KÈ M

- CTPT: C21H22O11 - Trọng lượng phân tử: 450 g/mol

DẠ

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của AST 4

- Tên IUPAC: (2R,3R) – 2 - (3”,4”- dihydroxyphenyl) - 5,7 – dihydroxy –

IA L

3 - [(2S,3R,4R,5R,6S) - 3,4,5 – trihydroxy – 6 – methyloxan – 1 - yl] oxy - 2,3 dihydrochromen – 4 - ol.

- Tên thường gọi: Astilbin; Taxifolin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside.

OF FI C

- Dạng đồng phân này của AST được phân lập từ rễ của cây thổ phục linh

(Smilax glabra Roxb). AST được xem là hoạt chất chính trong rễ Thổ phục linh. AST được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc, nó có tác dụng trừ sâu, kháng khuẩn và làm lành vết thương. Những nghiên cứu mới đây đã chỉ ra AST có tác dụng chống ung thư [19], tác dụng bảo vệ gan [32], chống oxy hoá [17] và kháng khuẩn [20].

DẠ

KÈ M

QU Y

ƠN

- Độ ổn định của AST:

Hình 1.3. Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và dung môi [29] Sự phân huỷ của AST phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và môi trường cùng với

sự đồng phân hoá của AST thành 3 đồng phân lập thể của nó. Quá trình phân 5

huỷ tuân theo mô hình động học bậc nhất và tốc độ phân huỷ có k tăng lên trong

IA L

khi thời gian bán rã giảm khi pH và nhiệt độ tăng lên. Tính ổn định của AST

liên quan đến sự thay thế vòng B. Ngoài ra, độ ổn định của AST khác nhau tuỳ thuộc vào dung môi và tuân thủ theo thứ tự 50% ethanol > ethanol > methanol >

OF FI C

50% methanol > nước [29]. Độ ổn định của AST được mô tả trực tiếp như hình 1.3. Nhận xét:

- AST là hợp chất có vòng thơm benzen nên khả năng hấp thụ UV-VIS mạnh. Do đó, có thể phát hiện AST bằng detector UV-VIS.

- AST có độ ổn định phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và môi trường chiết xuất.

ƠN

Do đó, khi lựa chọn điều kiện chiết xuất, điều kiện định lượng cần lựa chọn dung môi, nhiệt độ, pH thích hợp để không ảnh hưởng đến kết quả. Thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh

Trong dịch chiết nước của rễ TPL, polysaccharid chiếm hàm lượng rất lớn đến 32% trọng lượng mẫu khô, điều này giải thích vì sao rễ Thổ phục linh đã từng sử dụng thay lương thực khi nạn đói xuất hiện ở Trung Quốc. Rất nhiều các

QU Y

cấu tử có hoạt tính sinh học trong rễ Thổ phục linh quyết định dược tính đã được phân lập. Trong đó, lớp chất các flavonoid được xem là các cấu tử hoạt tính chính, ngoài ra là các hợp chất phenylpropanoid glycoside, lignan glycoside, các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó bao gồm là các resveratrol, các acid hữu cơ và một số các hợp chất khác. Tổng cộng có khoảng 40 hợp chất

KÈ M

đã được phân lập từ rễ TPL. Các flavonoid [45, 46]: Lớp hoạt chất chính trong rễ thổ phục linh là các

flavonoid, trong đó có 12 flavonoid đã được tách ra thuộc về 5 hợp chất là dihydroflavonol, dihydroflavone, flavonol, isoflavon và flavanol. Trong các

flavonoid được phân lập thì dihydroflavonol có hàm lượng chính bao gồm

DẠ

khoảng

cấu

tử

là

astilbin

(3-O-alpha-L-rhamnoside-5,7,3’,4’-

tetrahydroxydihydroflavonol)(1) hay (taxifolin-3-O-alpha-L-rhamnoside) và các dạng đồng phân lập thể của nó là neoastilbin(2), isoastilbin(3), neoisoastilbin(4), taxifolin(5),

taxifolin-3”-O-beta-D-glucopyranoside(6), 6

engeletin(7),

stereoisomeride isoengeletin(8), smitilbin(9) và đồng phân lập thể của nó là

flavone

là

quercetin(11),

naringenin(12),

isoflavon

IA L

neosmitilbin(10) được mô tả trong hình 1.4. Những flavonoid khác là các

7,6”-dihydroxy-3”-

methoxyisoflavon(13) và flavanol(-)-epicatechin(14) được trình bày trong hình

ƠN

OF FI C

1.5.

DẠ

KÈ M

QU Y

Hỉnh 1.4. Dihydroflavonol được tách từ rễ TPL

Hình 1.5. Một số các flavonoid khác được tách từ rễ TPL

Lignan glycoside: lignan glycoside là chất mới (+) – syringaresinol 4-O-

IA L

β-D-glucopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside đã được tách ra với 12 cấu tử

ƠN

OF FI C

trên bởi Yuan(2003) [47].

Hình 1.6. Lignan glycoside được tách từ rễ TPL

Các hợp chất phenylpropanoid glycoside [12] là lớp chất thứ hai có 7 cấu tử trong đó 5 cấu tử mới là smiglaside A-E.

Các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó [45]: lớp chất này

QU Y

bao gồm 9 cấu tử gồm các resveratrol.

Các acid hữu cơ bao gồm các butan diacid, palmitic acid, và 2,2dimethylsuccinic acid.

Các chất sterol gồm các β-sterol và stigmasterol. Cuối cùng là các hợp chất khác như các fructoside, các hợp chất dị tố, các acid amine, protein, …

KÈ M

1.1.3. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh Phương pháp

[TLTK]

chiết

DẠ

STT

1 [2]

Điều kiện phân tích

- Dung môi

HPLC

chiết: MeOH

- Pha động: MeOH:

60%.

CH3COOH 1% (39:61).

- Điều kiện

- Pha tĩnh: Cột kích thước

chiết: đun hồi

(25 cm x 4,6 mm; 5 µm) 8

Kết quả phân tích Dược liệu phải chứa không dưới 0,45% AST tính theo dược liệu khô kiệt.

lưu trong 1h.

- Bước sóng phát hiện 291

IA L

nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.

- Định lượng đồng

OF FI C

HPLC

Ethanol 50 %,

- Cột sắc ký SunFire C18

- Nhiệt độ

(25 cm x 4,6 mm; 5 µm);

chiết 70ºC,

detector UV tại bước sóng

chiết 2 lần

320 nm; tốc độ dòng 1,0

- Tỷ lệ dung

ml/phút; thể tích bơm mẫu

môi/ dược liệu 10µl. 5/1,15/ lần,

ƠN

2 [5]

thời AST và emodin

- Dung môi

- Pha động: gradient ACN: từ 20: 80 đến 95:5.

QU Y

30 phút/lần.

thời gian chiết HCOOH 0,2% thay đổi tỉ lệ

trong bài thuốc GK1 (gồm nhiều loại dược liệu) với hàm lượng được xác định lần lượt là 3,30 ± 0,02 mg/g và 0,55 ± 0,02 mg/g tính theo khối lượng khô tuyệt đối. - Hiệu suất chiết AST là 94,86 ± 4,44 % và emodin là 62,61 ± 2,70 %.

HPLC

- Dung môi

chiết: Ethanol

KÈ M

85%. - Phương pháp

3 [3]

chiết: ngâm trong thiết bị

DẠ

chiết thuỷ tinh ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.

- Cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 mm x 150 mm, 5

Hàm lượng AST

μm) và cột bảo vệ C18 của

trong mẫu thổ phục

hãng Agilent.

linh Việt Nam tại các

- Pha động Methanol : nước tỉnh là khá cao từ 0,8 (0,3% acid acetic), chạy

- 1,1% so với trọng

gradient.

lượng mẫu củ khô

- Thời gian chạy 40 phút;

(trừ vùng Sơn La

Tốc độ dòng 0,5 ml/phút;

0,74%).

Bước sóng lựa chọn phân tích 191 nm; - Lượng mẫu bơm 5 μl; 9

- Nhiệt độ cột 25ºC.

IA L

- LOD là 0,5 μg/ml, LOQ là 1,5 μg/ml.

- Thời gian lưu của

chiết: MeOH.

- Cột C18 (4,6 mm x 250

AST ở khoảng 19

- Điều kiện

mm, 5 μm); tốc độ dòng 1,0

phút.

chiết: chiết

ml/phút; bước sóng phân

- Thẩm định phương

siêu âm 3 lần,

tích 291 nm.

pháp cho độ chính

mỗi lần 8ml

- Pha động: acid acetic 0,1% xác cao (98,3 ± 4,6%

dung môi.

- acetonitril (70:30, v/v).

HPLC

OF FI C

HPLC

ƠN

4 [24]

- Dung môi

đến 102,5 ± 1,0%) và độ đúng có RSD  1,37%. - Định lượng được 10 mẫu dược liệu được

- Pha động: acid Phosphoric thu nhặt ở những vùng khác nhau của

gradient.

tỉnh Guangxi.

KÈ M

QU Y

5 [39]

0,2%, acetonitril, chạy

DẠ

6 [25]

- Pha tĩnh: cột C18 (5 µm;

- Đường chuẩn có hệ

4,6 mm × 150 mm); bước

số R2 = 0,9999.

sóng phát hiện 290 nm.

- RSD trung bình của độ thu hồi là 1,09%.

HPLC

- Khoảng tuyến tính

- Cột ODS-A (5 μm, 4,6

của AST là 0,018 –

mm x 250 mm); tốc độ

0,288 mg/ml.

dòng 0,8 ml/phút; bước

- Độ thu hồi trung

sóng phát hiện 306 nm.

bình từ 99,6%-

- Pha động: acetonitril và

102,1% với RSD =

acid phosphoric 0,05% chạy 1,9%. gradient.

Nhận xét:

IA L

- Qua các nghiên cứu trong nước và trên thế giới, nhóm nghiên cứu nhận thấy AST được xác định hàm lượng trong dược liệu Thổ phục linh mà chưa có trong các chế phẩm.

OF FI C

- Để chiết AST, dung môi được sử dụng chủ yếu là Methanol và Ethanol

với các phương pháp chiết khác nhau như hồi lưu, siêu âm, chiết nóng, chiết ở nhiệt độ phòng, …Trong đó, chiết siêu âm với dung môi Methanol cho kết quả có độ chính xác khá cao, thao tác đơn giản và nhanh.

- Phương pháp phân tích được sử dụng chủ yếu là HPLC với hệ pha động và bước sóng phát hiện khác nhau. Pha tĩnh được sử dụng chủ yếu là cột C18

ƠN

của các hãng khác nhau. - Khoảng tuyến tính ở mỗi hệ dung môi trong các nghiên cứu khác nhau 18 – 288 μg/ml [25].

nhiều. Hệ pha động Acetonitril và acid phosphoric có khoảng tuyến tính dài từ 1.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 1.2.1. Khái niệm

QU Y

Sắc ký lỏng là một phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của các chất khác nhau nên

KÈ M

khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Trong HPLC, tùy thuộc vào kỹ thuật sắc ký người ta chia thành: - Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC).

- Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: Pha thường (Normal phase: NP-HPLC), Pha

DẠ

ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC). - Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC). - Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC).

1.2.2. Cấu tạo hệ thống HPLC

IA L

Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Hình 1.7) gồm các bộ phận sau: - Pha tĩnh: Cột sắc ký đặt trong buồng cột. - Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột.

OF FI C

- Pha động: Dung môi đưa mẫu đi qua cột.

- Detector (DAD): Phát hiện chất phân tích trong mẫu.

QU Y

ƠN

- Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu.

Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc hệ thống HPLC

1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

KÈ M

- Thời gian lưu giữ - Hệ số phân bố và hệ số dung lượng - Độ chọn lọc

- Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký

DẠ

- Khả năng phân giải

IA L

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu

OF FI C

2.1.1. Mẫu thử

Chế phẩm nghiên cứu là 6 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe (T1 đến T6) của Nanocare, Khương thảo đan, Goutcare, Viên gout Tâm Bình, Vương thảo kiện cốt với một số lô khác nhau. Các mẫu được mua ngẫu nhiên trên thị trường. Trong đó T1 được sử dụng để làm nền mẫu khảo sát xây dựng phương pháp định lượng.

ƠN

- Viên gout Nanocare: Sản xuất tại phân xưởng SX TPCN BKST2269 của Công ty CP Khoa học Kỹ thuật Bách Khoa; số lô sản xuất: 090419; hạn dùng: 080422 và số lô sản xuất: 201217; hạn dùng: 211220.

- Khương thảo đan: Sản xuất tại Công ty Cổ phần Công nghệ cao Thái Minh; Số lô sản xuất: 150820; số đăng kí: 3131/2019/ĐKSP; hạn dùng: 090823. - Vương thảo kiên cốt: Sản xuất tại Xưởng sản xuất Công ty CP Y dược

QU Y

ELIPHA; Số lô sản xuất: 022021; Số đăng kí: 6668/2020/ĐKSP; Hạn dùng: 36 tháng từ ngày sản xuất.

- Viên gout Tâm Bình: Sản xuất tại Công ty Dược phẩm Tâm Bình; số lô và ngày sản xuất: 06042020.

- Gudcare: Sản xuất tại Công ty TNHH sản xuất DP công nghệ cao

KÈ M

Nanofrance; Số lô sản xuất: 010120; số đăng kí: 66/2020/ĐKSP; hạn dùng: 18/01/2023.

2.1.2. Hoá chất

- Chuẩn đối chiếu: AST mua từ Biopurify Phytochemicals ( Trung Quốc)

(98,00%, Lot. No. PRF9022741).

DẠ

- Dược liệu chuẩn mua tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (SKS:

CV 0116035.01), dược liệu mua ngẫu nhiên ở cửa hàng bán dược liệu. - Methanol (Merk) dùng cho HPLC. - Nước cất hai lần. 13

dùng cho HPLC. 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 Series (Mỹ).

IA L

- Acid acetic, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn hoá chất tinh khiết phân tích

xử lý số liệu Agilent ChemStation. - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức).

OF FI C

- Cột sắc ký Sunfire C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), sử dụng phần mềm

- Phễu lọc Buchner, màng lọc cellulose 0,45 µm.

- Cân phân tích A&D, Model GR-200, Nhật Bản, d = 0,1 mg. - Tủ sấy, tủ hốt.

ƠN

- Máy ly tâm lạnh. - Micro pipet 10-100 µl ABMATE pro, 100-1000 µl Nichipet EX. - Pipet chính xác 5 ml, 10 ml.

- Bộ chiết Soxhlet 100 ml.

- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, vial, chày và cối. 2.2. Phương pháp nghiên cứu

QU Y

Phương pháp thực hiện được khảo sát và xây dựng phù hợp với từng nội dung và theo hướng dẫn của AOAC 2013. 2.2.1. Khảo sát qui trình xử lý mẫu Tiến hành khảo sát phương pháp chiết, thời gian chiết, số lần chiết. Dựa vào diện tích pic của chất phân tích trên thiết bị sắc ký HPLC để lựa chọn quy

KÈ M

trình xử lý mẫu cho hoạt chất AST trong chế phẩm tối ưu sau khi chiết. 2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích AST trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) a) Lựa chọn pha tĩnh

Pha tĩnh được sử dụng là cột Sunfire C18 (250 mm x 4,6 mm; 5µm).

DẠ

b) Khảo sát pha động Tiến hành khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động. Dựa vào khả năng tách các

chất, mức độ ổn định của đường nền, thời gian lưu và hình dáng pic của chất

phân tích để chọn pha động. Các pha động được khảo sát là hỗn hợp của MeOH

IA L

60% và các dung dịch sau: - Acid acetic băng 1%. - Nước cất 2 lần. Các dung dịch trên được chuẩn bị như sau:

OF FI C

- Acid phosphoric 0,1%.

- Dung dịch acid acetic băng 1%: Hút chính xác 10,0 ml acid acetic 100% vào bình định mức 1000 ml. Thêm nước cất 2 lần từ từ, định mức cho vừa đủ thể tích. Lắc đều.

- Dung dịch acid phosphoric 0,1%: Hút chính xác 600 µl acid phosphoric

ƠN

85% vào bình định mức 100,0 ml. Thêm nước cất 2 lần từ từ, định mức vừa đủ thể tích. Lắc đều.

- Methanol 60%: Lấy chính xác 600 ml dung dịch MeOH 100% cho tích. Lắc đều. - Nước cất 2 lần.

HPLC vào bình định mức 1000,0 ml. Thêm nước cất 2 lần định mức vừa đủ thể

QU Y

Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm trước khi sử dụng.

2.2.3.Thẩm định phương pháp

Dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn

KÈ M

định lượng (LOQ) theo hướng dẫn của AOAC 2013. a) Độ phù hợp của hệ thống - Độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ

thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.

- Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên

DẠ

tiếp mẫu chuẩn AST có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic đáp ứng qua các lần sắc ký. - Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic và thời gian lưu giữa các lần tiêm của

cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD không lớn hơn 2%. 15

- Tiến hành:

IA L

+ Mẫu chuẩn gốc: Cân chính xác 5 mg AST cho vào bình định mức 5,0

ml, hoà tan và định mức bằng dung dịch MeOH 60%, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1000 ppm (µg/ml).

OF FI C

+ Mẫu chuẩn làm việc: Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào

bình định mức 100 ml, định mức vừa đủ bằng MeOH 60%. Mẫu có nồng độ 10 ppm. + Tiêm 6 lần mẫu chuẩn làm việc.

- Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn 100% có thời gian lưu (≤ 2,0%) và diện tích pic (≤ 2,0 %) của AST đều

ƠN

nằm trong khoảng cho phép thì hệ thống sắc ký là ổn định để định lượng AST. b) Độ đặc hiệu

- Độ đặc hiệu của phương pháp: là khả năng đánh giá một cách rõ ràng

chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất và các chất cản trở khác.

- Yêu cầu: Thời gian lưu AST của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và

QU Y

dung dịch thử thêm chuẩn phải tương đương nhau. Pic trong mẫu thử và thử thêm chuẩn phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu. Dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của AST trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn - Tiến hành: Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng MeOH 60%, mẫu

KÈ M

chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lưu, diện tích của các pic thu được. - Chuẩn bị các mẫu như sau: + Mẫu trắng: dung dịch pha mẫu MeOH 60%.

+ Mẫu chuẩn: mẫu chuẩn AST nồng độ 10 ppm.

DẠ

+ Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,1250 g chế phẩm T1 vào bình định

mức 10,0 ml, định mức vừa đủ bằng dung môi MeOH 60%. Xử lý mẫu như mục 3.1 thu được mẫu thử T1.

+ Mẫu thử thêm chuẩn: chuẩn bị thêm một mẫu thử T1 như trên, thêm 70

IA L

µl chuẩn AST nồng độ 1000 ppm, trộn đều thu được mẫu thử thêm chuẩn. c) Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

- Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

OF FI C

đo được và nồng độ các chất phân tích.

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích. - Thực hiện:

+ Mẫu chuẩn AST gốc: dung dịch chuẩn Astilbin trong MeOH 60% nồng độ 1000 ppm.

ƠN

+ Mẫu chuẩn AST pha loãng: lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn AST 1000 ppm pha vào bình định mức 10,0 ml. Thêm dung dịch MeOH 60% đến vạch để được dung dịch có nồng độ 100 ppm.

+ Từ dung dịch chuẩn gốc AST tiến hành pha loãng bằng MeOH 60% để được các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt 1 ppm; 2 ppm; 5 ppm; 10 ppm; 15 ppm; 20 ppm.

QU Y

+ Dùng micropipet hút chính xác lần lượt 10 µl; 20 µl; 50 µl; 100 µl; 150 µl; 200 µl dung dịch chuẩn AST 100 ppm rồi thêm chính xác lượng dung môi MeOH 60% cho đủ 1000 µl.

+ Viết phương trình thể hiện mối tương quan của diện tích pic theo nồng độ của mỗi chất và đánh giá đường chuẩn dựa vào hệ số tương quan r.

KÈ M

d) Độ chính xác của phương pháp - Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ

nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định.

+ Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một

DẠ

quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ mẫu thử, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng.

+ Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của

IA L

phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác, đổi kiểm nghiệm viên và phân tích trên hệ sắc ký lỏng khác. + Thực hiện: chuẩn tương đối. 𝑅𝑆𝐷 (%) =

OF FI C

Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên mẫu thử T1 và tính toán độ lệch 𝑆𝐷 × 100 𝑥⃐

∑𝑁 (𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2 𝑆𝐷 = √ 𝑖=1 𝑁−1

ƠN

Trong đó: xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i. 𝑥̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm.

- Yêu cầu:

+ Độ lặp lại: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng AST không quá 2%.

QU Y

+ Độ chính xác trung gian: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày và 12 lần thử trong hai ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng AST không quá 3%. e) Độ đúng

- Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các

KÈ M

giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

- Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so

với giá trị lý thuyết.

- Tiến hành: thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng hoạt chất một

DẠ

lượng chính xác chất chuẩn sao cho nồng độ AST trong mẫu thử ở các khoảng 5 ppm, 10 ppm và 15 ppm. Mỗi mức nồng độ làm 03 mẫu. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Tính tỷ lệ lượng AST thu hồi lại được so với lượng thêm vào. - Độ thu hồi được tính theo công thức: 18

𝐶𝑡𝑐 − 𝐶𝑛 × 100 % 𝐶𝑥

R: độ thu hồi (%).

IA L

𝑅(%) =

𝐶𝑡𝑐 : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (ppm).

OF FI C

Cn: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (ppm). 𝐶𝑥 : nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppm).

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi (85 - 110%) ở mỗi mức nồng độ và giá trị RSD (%) của tỷ lệ thu hồi phải ≤ 6,0 % ở mỗi mức nồng độ. - Chuẩn bị các dung dịch thẩm định như sau:

+ Chuẩn bị 9 mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,1250 g bột thuốc mẫu T1

ƠN

đã nghiền vào bình định mức 10,0 ml.

+ Chuẩn bị 9 mẫu thử thêm chuẩn ở các mức nồng độ 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm: Thêm chính xác vào các mẫu thử đã cân ở trên x µl dung dịch chuẩn gốc

AST 1000 ppm. Thêm dung môi MeOH 60% vào lắc đều và định mức vừa đủ. Làm tương tự các bước siêu âm, lắc xoáy và ly tâm như chuẩn bị dung dịch thử ở phần 3.1. Hút dịch sau khi ly tâm vào xylanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 µl vào

ppm.

QU Y

lọ đựng mẫu, thu được 9 dung dịch thử ở các mức nồng độ 5 ppm, 10 ppm, 15 Bảng 2.1 dưới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên. Bảng 2.1. Quy trình pha các mẫu thử thêm chuẩn Mức nồng độ V chuẩn gốc astilbin Bình định mức (ppm) (x µl) (ml) 1 5 20 10,0 2 5 20 10,0 3 5 20 10,0 4 10 70 10,0 5 10 70 10,0 6 10 70 10,0 7 15 120 10,0 8 15 120 10,0 9 15 120 10,0 f) Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

DẠ

KÈ M

STT

Pha loãng dần mẫu chuẩn bằng dung môi pha mẫu. Tiến hành phân tích

các dung dịch pha loãng trên. Trên sắc ký đồ thu được, xác định đáp ứng pic 19

(chiều cao) tương ứng với mỗi mức nồng độ. Xác định giá trị LOD của phương

IA L

pháp dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu. Trong đó LOD là giá trị nồng độ mà ở

đó có đáp ứng pic Astilbin gấp khoảng 3 lần giá trị nhiễu đường nền. Sau khi xác định giá trị LOD, tính giá trị LOQ thông qua công thức:

OF FI C

LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt) 2.3. Áp dụng phương pháp

Áp dụng phương pháp trên tiến hành phân tích astilbin trong các mẫu chế phẩm chứa Thổ phục linh còn lại có dạng bào chế tương tự mẫu chế phẩm đã được khảo sát. 2.4. Xử lý kết quả

ƠN

- Một số đặc trưng thống kê: các đặc trưng thống kế được tính dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel.

+ Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE

+ Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV + Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):

100 × SD X

- Tương quan hồi quy tuyến tính:

QU Y

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y=aX + b. Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT;

DẠ

KÈ M

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL

IA L

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết

OF FI C

Từ chuyên luận của Dược điển Việt Nam V: lấy 0,8 g nguyên liệu Thổ phục linh được chiết hồi lưu (HL) trong 100 ml MeOH 60%. Tuy nhiên, nhận

thấy các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa Thổ phục linh trên thị trường thường là dạng cao khô, viên nang cứng nên có thể chiết AST đơn giản hơn so với Dược điển. Do vậy, tiến hành khảo sát phương pháp chiết siêu âm (SA) và HL đối với cả 2 đối tượng:

ƠN

- Nguyên liệu Thổ phục linh: dược liệu chuẩn mua tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (VKN) và mẫu mua ngoài thị trường (TT). - Thực phẩm bảo vệ sức khỏe T1: phương pháp siêu âm (SA) và HL với tỉ

lệ khối lượng dược liệu/dung môi tương tự như Dược điển. Quy trình xử lý mẫu được áp dụng như sau: + Với các mẫu dược liệu cho phương pháp chiết SA: cân chính xác

QU Y

khoảng 0,0250 g bột dược liệu chuẩn (VKN) và dược liệu trên thị trường (TT) đã được nghiền mịn vào từng bình định mức 10,0 ml, thêm MeOH 60% định mức vừa đủ 10 ml, lắc đều, siêu âm 10 phút. Lắc đều rồi lấy 1 lượng dịch đem ly tâm. Hút dịch sau khi ly tâm vào xylanh, lọc qua màng 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, được dung dịch VKN-SA và TT-SA nồng độ 2,5 mg/ml (khối lượng dược

KÈ M

liệu/dung môi).

+ Với mẫu chế phẩm cho phương pháp SA: cân chính xác khoảng 0,1250

g bột chế phẩm đã nghiền mịn (tương đương 0,0250 g thổ phục linh) vào bình định mức 10,0 ml. Làm tương tự với quy trình chiết trên được dung dịch T1-SA

nồng độ 12,5 mg/ml (khối lượng chế phẩm/dung môi).

DẠ

+ Với mẫu dược liệu cho chiết HL: cân chính xác khoảng 0,8000 g bột

dược liệu chuẩn và bột dược liệu trên thị trường đã nghiền mịn vào từng bình nón nút mài, thêm chính xác 100 ml MeOH 60%, đậy nút cân. Đun hồi lưu trong 1h, để nguội, đậy nút, cân lại. Bổ sung khối lượng mất đi bằng MeOH 60%, lắc 21

đều, ly tâm. Hút chính xác 312 µl dịch này và 688 µl MeOH 60% vào dụng cụ

IA L

pha mẫu, trộn đều, lọc qua màng 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, được dung dịch VKN-HL và TT-HL nồng độ 2,5 mg/ml (khối lượng dược liệu/dung môi).

+ Với mẫu chế phẩm cho chiết HL: cân chính xác khoảng 2,000 g bột chế

OF FI C

phẩm đã nghiền mịn (tương đương 0,4 g thổ phục linh) vào một bình nón nút

mài, thêm chính xác 50 ml MeOH 60%, đậy nút cân. Làm tương tự các bước như trên, được dung dịch T1-HL nồng độ 12,5 mg/ml (khối lượng chế phẩm/ dung môi).

Sau khi chiết, tiến hành sắc ký với 6 mẫu dung dịch, mỗi mẫu 1 lần thu được kết quả như bảng 3.1 và phụ lục 6.

ƠN

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hàm lượng AST với các phương pháp chiết khác nhau

(mg) 25,60

VKN-HL

813,0

TT-SA

26,40

TT-HL

407,0

T1-SA T1-HL

dung môi (ml) Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%, kl/kl)

1079,4

1,421

100

814,9

1,091

284,3

0,3910

172,8

0,2621

127,4

99,5

0,0335

2002

40,1

0,0185

QU Y

VKN-SA

Thể tích

Khối lượng

Các kết quả sắc ký cho thấy hàm lượng AST trong chế phẩm khi được

KÈ M

chiết bằng SA cao hơn so với mẫu được chiết HL. Kết quả cũng tương tự như vậy khi chiết một số mẫu dược liệu bằng siêu âm. Nghiên cứu của Qing-Feng Zhang và cs. (2013) đã khảo sát thấy AST có thể bị phân hủy từ nhiệt độ 45oC và ở 55oC, t1/2 chỉ khoảng 2,5 giờ [29]. Với phương pháp chiết HL với MeOH,

nhiệt độ chiết HL ở khoảng 70oC, do đó nguyên nhân chiết HL thấp hơn có thể

DẠ

do AST không bền với nhiệt. Vì vậy lựa chọn phương pháp chiết SA trong chế phẩm cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.2. Khảo sát thời gian chiết

IA L

Do độ ổn định của AST bị ảnh hưởng bởi pH, nhiệt độ và môi trường nên

cần khảo sát thời gian chiết để tránh chiết quá lâu, nhiệt độ tăng lên làm astilbin bị phân huỷ.

OF FI C

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2500 g bột chế phẩm T1 đã nghiền

mịn vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi MeOH 60% vừa đủ, lắc đều. Siêu âm liên tục. Lấy dịch lọc ở các mốc thời gian lần lượt 5 phút, 10 phút, 20 phút và 30 phút. Lọc dịch chiết qua màng lọc cellulose 0,45 µm lọ đựng mẫu. Tiến hành sắc ký được kết quả như bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết

(mg)

5 phút 125,7

20 phút 30 phút

Hàm lượng

(mAU.s)

(%, kl/kl)

197,1

0,0297

213,4

0,0318

217,5

0,0324

215,4

0,0321

10 phút

Diện tích pic

ƠN

Khối lượng

Thời gian chiết

QU Y

Khi siêu âm mẫu 10 phút, hàm lượng AST tăng lên 7,1% so với khi siêu âm 5 phút, khi siêu âm đến 20 phút thì hàm lượng AST hầu như không tăng lên hoặc tăng lên rất ít. Siêu âm đến 30 phút thì hàm lượng AST bắt đầu có xu hướng giảm. Mặc dù quá trình chiết không gia nhiệt, nhưng khi thời gian chiết > 20 phút, nhiệt độ dung dịch bắt đầu bị tăng lên đáng kể, và tới 30 phút, nhiệt độ

KÈ M

tăng lên lớn hơn 50°C. Do đó, hàm lượng AST giảm khi tăng thời gian chiết SA cũng có thể do nhiệt độ. Để tiết kiệm thời gian chiết mẫu trong quá trình làm thực nghiệm và tránh chiết lâu AST bị phân huỷ do nhiệt, thời gian chiết siêu âm được lựa chọn là 10 phút.

3.1.3. Khảo sát số lần chiết

DẠ

Khảo sát 3 lần chiết mẫu chế phẩm với thể tích dung môi lần lượt là 5 ml,

3 ml, 2 ml. Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1250 g bột chế phẩm T1 vào bình

định mức 5ml, định mức vừa đủ bằng MeOH 60%, đậy kín và lắc đều. Siêu âm 23

10 phút, lấy dịch đem ly tâm. Hút một lượng dịch bằng xylanh lọc qua màng lọc

IA L

0,45 µm vào lọ đựng mẫu thu được dịch T1-1 chiết lần 1. Gạn phần dịch còn lại trong ống nghiệm, thu phần cắn, rửa sạch nhiều lần bằng MeOH 60%. Thêm

tiếp 3 ml MeOH 60%, tiến hành siêu âm tương tự lần 1, thu được dung dịch T1-

OF FI C

2 chiết lần 2. Làm tiếp với 2 ml MeOH 60% thu được dịch T1-3 chiết lần 3. Tiến hành sắc ký các mẫu chiết, đánh giá hiệu suất và lựa chọn số lần chiết. Kết quả được tổng hợp dưới bảng 3.3 và phụ lục 7.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát số lần chiết Khối lượng Thời gian lưu (mg)

Lần 1 Lần 2

Diện tích pic

Hàm lượng

( phút)

(mAU.s)

(%, kl/kl)

20,191

197,1

0,0296

126,1

(-) (-)

Lần 3

(-)

(-): không phát hiện pic của AST

ƠN

Lần chiết

Kết quả cho thấy, sau lần chiết 1 siêu âm 10 phút thì hầu như Astilbin đã được chiết hết và đạt hàm lượng là 0,0296%. Tiến hành chiết lần 2 và lần 3 thì

QU Y

không thấy xuất hiện pic của astilbin trên sắc ký đồ nữa. Do đó, lựa chọn chiết 1 lần siêu âm 10 phút là phù hợp nhất. Như vậy, quy trình xử lý mẫu được xây dựng như hình 3.1: Tháo bỏ lớp vỏ nang cứng của 20 viên chế phẩm, trộn đều và nghiện mịn phần bột, sau đó cân chính xác khoảng 0,1250 g bột trên (tương ứng với khoảng

KÈ M

0,0250 g dược liệu thổ phục linh) vào bình định mức 10,0 ml. Thêm dung môi MeOH 60% vừa đủ định mức, lắc đều rồi đem siêu âm 10 phút. Sau 10 phút lấy bình ra khỏi bể siêu âm. Lấy một lượng dịch đem ly tâm. Hút dịch sau khi ly tâm bằng xylanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, thu được dung

DẠ

dịch thử dùng để định lượng astilbin trong chế phẩm.

Nghiền bột của 20 viên chế phẩm

OF FI C

Cân chính xác khoảng 0,125 g bột chế phẩm đã nghiền

IA L

Tháo lớp vỏ nang cứng của chế phẩm

Định mức vừa đủ 10ml bằng MeOH 60%

Lắc xoáy đều bằng máy

ƠN

Siêu âm 10 phút

Ly tâm lạnh 5 phút

Lấy dịch bằng xylanh, lọc qua màng 0,45 µm

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu

QU Y

3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

Theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V về định lượng astilbin trong dược liệu Thổ phục linh, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện đấy trên chế phẩm T1 như sau:

KÈ M

- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm; 5μm). - Bước sóng phát hiện 291nm. - Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20μl. - Hệ pha động MeOH 60% : acid acetic băng 1% ( 39:61).

DẠ

Sắc ký đồ thể hiện trong hình 3.2

IA L OF FI C ƠN

Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát theo điều kiện sắc ký của Dược điển Việt Nam V

a) Chuẩn AST; b) Mẫu thử T1

QU Y

Kết quả nhận thấy pic AST không tách được khỏi các chất khác trong chế phẩm. Tiến hành khảo sát thêm trên 2 hệ pha động khác: 1) MeOH 60% : H3PO4 0,1%; 2) MeOH 60% : H2O với các tỉ lệ khác nhau. Qua quá trình khảo sát thu được ở hệ pha động MeOH 60% : H2O (38:62), pic AST tách tốt, dung môi thông dụng, dễ thực hiện trong quá trình thực nghiệm (Hình 3.3). Tuy nhiên, các

KÈ M

thành phần khác trong chế phẩm lưu giữ tốt trên cột nên thời gian phân tích tương đối dài. Vì vậy, để đẩy hết phần tạp còn lại trong mẫu nhanh hơn, căn cứ vào thời gian lưu của các tạp trên sắc ký đồ, kết hợp chạy gradient để đẩy hết

DẠ

phần tạp còn lại trong mẫu, chương trình gradient như bảng 3.4.

IA L OF FI C

ƠN

Hình 3.3. Sắc ký đồ được chọn với pha động MeOH 60% : H20 = 38 : 62 Từ kết quả thực nghiệm trên, xây dựng phương pháp phân tích AST trong - Điều kiện sắc ký

chế phẩm có chứa thổ phục linh như sau:

+ Pha tĩnh: Cột Sunfire C18 (4,6 x 250 mm; 5 µm). + Pha động: Hỗn hợp MeOH 60% : H2O = 38:62 (v/v).

QU Y

+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

+ Bước sóng phát hiện: 291 nm. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl + Chương trình gradient:

Bảng 3.4. Chương trình gradient chạy sắc ký

DẠ

KÈ M

Thời gian (phút)

Tỷ lệ MeOH 60%

Tỷ lệ H2O (%)

(%)

23,1

32,1

Stop time

3.3.1. Độ phù hợp hệ thống

IA L

3.3. Thẩm định phương pháp Chuẩn bị dung dịch chuẩn AST 10ppm như mục 2.2.3. Sau đó tiến hành

sắc ký mẫu này 06 lần theo phương pháp đã xây dựng. Ghi lại các sắc ký đồ,

OF FI C

thời gian lưu và diện tích pic như bảng 3.5 và phụ lục 1.

ƠN

Bảng 3.5. Kết quả độ phù hợp hệ thống Thời gian lưu Diện tích pic STT (phút) (mAU.s) 20,58 392,2 1 20,48 397,4 2 20,34 400,6 3 20,63 388,9 4 20,26 384,2 5 20,51 382,6 6 0,70 1,83 RSD (%) Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số phân tích

thống với chất AST. 3.3.2. Độ đặc hiệu

đều dưới 2%. Như vậy, phương pháp đã đạt tiêu chuẩn về độ ổn định hệ

QU Y

Chuẩn bị các mẫu như trong mục 2.2.3. Sau đó tiến hành sắc ký theo

DẠ

KÈ M

phương pháp ở mục 3.2. Kết quả được thể hiện dưới hình 3.4.

Hình 3.4. Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc ở bước sóng 291 nm a) Mẫu trắng; b) Mẫu chuẩn; c) Mẫu thử; d) Mẫu thử thêm chuẩn 28

Nhận xét:

IA L

- Trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu (mẫu trắng - hình 2a) không có pic tại thời gian lưu của chất phân tích AST.

- Trên sắc ký đồ chuẩn AST (mẫu chuẩn - hình 2b) ở bước sóng 291nm

OF FI C

xuất hiện pic ở 19,90 phút.

- Trên sắc ký đồ mẫu thử (mẫu thử - hình 2c) có pic tại thời gian lưu tướng ứng với thời gian lưu của AST trong dung dịch chuẩn.

- Trên sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn (mẫu thử thêm chuẩn - hình 2d) có pic chất tương ứng với thời gian lưu của pic AST trong dung dịch chuẩn. - Pic tương ứng AST trong mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn được tiến

ƠN

hành chồng phổ với pic AST chuẩn, cho hệ số chồng phổ > 0,99. Độ tinh khiết của các pic AST trong mẫu thử và thử thêm chuẩn cũng đạt > 0,999. Như vậy phương pháp có độ đặc hiệu đối với AST.

Kết luận: Phương pháp đã xây dựng có độ chọn lọc với AST. Pic AST có thời gian lưu khoảng 19,90 phút. 3.3.3. Xây dựng đường chuẩn

QU Y

Chuẩn bị các mẫu chuẩn như trong mục 2.2.3. Sau đó tiến hành sắc ký theo phương pháp đã xây dựng ở mục 3.2. Kết quả được thể hiện dưới bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả đường chuẩn

Mẫu Nồng độ

1,076

2,152

5,380

10,76

16,14

21,52

19,0

41,6

118,8

284,8

444,0

648,0

KÈ M

(ppm)

Diện tích pic (mAU.s)

y=30,513x – 30,663

hồi quy

r = 0,997

DẠ

Phương trình

IA L OF FI C ƠN

Hình 3.5. Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ AST

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, đã có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AST. Sự tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 1,076 ppm đến 21,52 ppm; hệ số tương quan r = 0,997. Kết luận: phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu.

QU Y

3.3.4. Độ lặp lại của phương pháp

Chuẩn bị các mẫu thử như trong mục 2.2.3 theo quy định như trong mục 3.1. Sau đó tiến hành sắc ký theo phương pháp ở mục 3.2. Kết quả được thể hiện dưới

DẠ

KÈ M

bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại của phương pháp % HL astilbin

astilbin (ppm)

(kl/kl)

mthử (mg)

128,0

4,512

128,9

4,459

IA L

Nồng độ mẫu thử

STT

127,9

4,453

0,0348

126,4

4,472

0,0354

125,8

4,528

0,0360

127,4

4,551

0,0357

0,0346

0,0353%

RSD1 (%) 127,5

126,1

128,6

1,50%

4,639

0,0364

4,574

0,0363

4,649

0,0362

126,1

4,610

0,0366

126,4

4,577

0,0362

128,7

4,525

0,0352

QU Y

ƠN

TB1 (n = 6)

0,0352

OF FI C

Ngày

TB2 (n = 6)

0,0362%

RSD2 (%)

1,37% 0,0357%

RSD (%)

1,83%

KÈ M

TB (n=12)

Nhận xét: Độ lặp lại trong ngày của hàm lượng AST đạt yêu cầu, thể hiện

bởi RSD < 2% và độ lặp lại khác ngày của hàm lượng AST đạt yêu cầu, thể hiện bởi RSD<3%.

Kết luận: Phương pháp đạt về độ chính xác.

DẠ

3.3.5. Độ đúng của phương pháp Chuẩn bị các mẫu như mục 2.2.3 theo quy định như trong mục 3.1. Sau

đó tiến hành sắc ký theo phương pháp ở mục 3.2. Kết quả được thể hiện dưới bảng 3.8 và phụ lục 4. 31

Bảng 3.8. Kết quả độ đúng của AST Lượng

mthử

trong mẫu

chuẩn AST

chuẩn

(mg)

thêm chuẩn

thêm vào

AST tìm

(μg/ml)

lại (μg/ml) 2,229

103,61

2,327

108,12

2,094

97,29

7,738

102,73

8,075

107,21

IA L

Lượng

Độ thu hồi

(%)

128,5

6,871

2,152

128,9

6,983

2,152

126,1

6,648

2,152

127,9

12,36

7,532

128,9

12,73

7,532

129,3

12,91

7,532

8,241

109,41

129,0

17,97

12,91

13,31

103,04

126,6

18,30

12,91

13,73

106,33

129,0

18,61

13,95

108,04

ƠN

12,91

Trung

bình (%)

OF FI C

STT

Lượng AST

103,01

106,45

105,80

Nhận xét: Tỷ lệ tìm lại trung bình của các mức nồng độ lần lượt là 103,01% - 106,45% đạt yêu cầu về tỷ lệ thu hồi (80-110%).

QU Y

Kết luận: Phương pháp đạt về độ đúng. 3.3.6. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng So sánh đáp ứng của mẫu chuẩn AST ở nồng độ 0,083 ppm với nhiễu được kết quả S/N=3,5. Như vậy nồng độ 0,083 ppm được chấp nhận là LOD.

KÈ M

LOQ là 0,25 ppm. Sắc ký đồ được thể hiện ở phụ lục 5. Như vậy, phương pháp đã xây dựng được thẩm định đầy đủ theo AOAC

2013, phù hợp định lượng AST trong chế phẩm chứa Thổ phục linh. 3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm viên nang cứng có chứa thổ phục linh trên thị trường

Áp dụng quy trình trên để định lượng AST trong một số chế phẩm có

DẠ

chứa Thổ phục linh bán trên thị trường. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9. Hàm lượng AST của một số chế phẩm chứa Thổ phục linh Khối lượng Hàm lượng AST trong

IA L

trên thị trường

Hàm lượng

dung dịch định lượng

AST/viên

(mg)

(ppm)

(mg/viên)

100

4,639

100

4,212

330

KPH (*)

650

KPH (*)

100

KPH (*)

100

KPH (*)

ƠN

(*)

OF FI C

TPL/viên

0,1819 0,1630

< 0,01 (**) < 0,02 (**)

< 0,003 (**) < 0,003 (**)

KPH - Không phát hiện (< LOD 0,083 ppm trong dung dịch định

lượng)

Ngưỡng hàm lượng tính từ lượng cân và KLTB viên

(**)

Kết luận: Phương pháp đã được ứng dụng phân tích AST trên 5 mẫu chế phẩm chứa Thổ phục linh. Tuy nhiên, một số chế phẩm chứa Thổ phục linh

QU Y

không thấy xuất hiện pic của AST trên sắc ký đồ. Do vậy cần tiếp tục phân tích AST trên một số lượng mẫu chế phẩm lớn hơn. 3.5. Bàn luận

3.5.1. Về quy trình xử lý mẫu

KÈ M

- AST là một hợp chất hữu cơ có vòng benzen nên có khả năng hấp thu tốt tia UV-VIS vì vậy có thể phát hiện AST bằng detector UV – VIS. Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và môi trường nên khi thực hiện các quy trình xử lý mẫu cần lưu ý để vấn đề này. - Về phương pháp chiết AST, trong Dược điển Việt Nam V đã có quy

trình chiết HL trong vòng 1h với dung môi MeOH 60% [2]. Chúng tôi đã làm lại

DẠ

quy trình này trên mẫu thử. Nhận thấy các chế phẩm có chứa Thổ phục linh trên thị trường thường có dạng viên nang cứng, cao khô, cao lỏng,….nên khả năng chiết AST có thể sẽ dễ dàng hơn. Chúng tôi đã tiến hành chiết AST bằng phương pháp SA trên mẫu thử và các mẫu dược liệu thì được kết quả hàm lượng 33

AST trong chiết HL có xu hướng thấp hơn chiết SA. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn

IA L

phương pháp chiết SA để không ảnh hưởng đến độ ổn định của AST.

- Về thời gian chiết: trong quá trình khảo sát xử lý mẫu, khi siêu âm lâu,

bể siêu âm có thể nóng lên, làm tăng nhiệt độ mẫu khiến tăng tốc độ phân hủy

OF FI C

của AST. Thể hiện sự giảm diện tích sau mỗi lần tiêm. Vì vậy cần lựa chọn thời gian chiết phù hợp và chú ý thay nước bể siêu âm nếu sử dụng kéo dài.

- Quy trình chiết SA áp dụng chiết trong chế phẩm có chứa Thổ phục linh nhanh và thao tác đơn giản, ngoài ra cũng khắc phục được sự phân huỷ của AST do nhiệt độ, pH và môi trường trong quá trình chiết. 3.5.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp

ƠN

- Định lượng AST trong dược liệu Thổ phục linh đã có hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam V, tuy nhiên trong chế phẩm ngoài Thổ phục linh còn chứa nhiều loại dược liệu khác nhau áp dụng phương pháp theo dược điển thì pic

AST không tách được ra khỏi các pic còn lại trong mẫu. - Khi khảo sát trên các hệ dung môi khác thì nhận thấy với hệ pha động MeOH 60% : H2O = 38 : 62 thu được pic đẹp, tách tốt, thời gian lưu vừa phải và

QU Y

đặc biệt dung môi H2O dễ thực hiện, thuận tiện trong quá trình thực nghiệm. - Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2013 đều đáp ứng các yêu cầu.

- Ứng dụng phương pháp định lượng trên một số chế phẩm có dạng bào chế tương tự T1 trên thị trường. Tuy nhiên, một số chế phẩm chứa Thổ phục

KÈ M

linh không thấy xuất hiện pic của AST, mặc dù một số chế phẩm có lượng cao khô trong viên tương ứng với Thổ phục linh khá cao. Do số lượng mẫu được áp dụng còn hạn chế, chưa thể có nhận định về chất lượng sản phẩm, nhưng đây có thể là gợi ý để hợp tác với các nhà sản xuất trong việc kiểm tra nguyên liệu đầu

vào sản xuất theo tiêu chuẩn DĐVN V, đồng thời kiểm soát quy trình sản xuất

DẠ

tránh làm phân hủy hoạt chất.

IA L

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

OF FI C

Nghiên cứu này đã đạt được mục tiêu đề ra: Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu phương pháp phân tích AST trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Phương pháp xử lý mẫu bằng chiết siêu âm với MeOH 60% cho tỷ lệ thu hồi tốt, mẫu sau chiết tách tốt, định lượng được AST trong khoảng thời gian phân tích vừa phải, độ nhạy tốt, độ lặp lại và tính đúng bảo đảm khi thẩm định

ƠN

theo hướng dẫn của AOAC [8]. - Điều kiện sắc ký

+ Pha tĩnh: Cột Sunfire C18 (4,6 x 250 mm; 5 µm).

+ Pha động: Hỗn hợp MeOH 60% : H2O = 38 : 62 (v/v). + Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

+ Bước sóng phát hiện: 291 nm.

QU Y

+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. + Chương trình chạy gradient như bảng 3.4. - Phương pháp đã được minh chứng tính khả thi trong xác định hàm lượng AST trong các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứ Thổ phục linh đang bán trên thị trường.

KÈ M

Kiến nghị

Khi tiến hành ứng dụng phương pháp định lượng AST trong chế phẩm có

chứa Thổ phục linh, đã khảo sát trên vài chế phẩm có dạng bào chế tương tự ngoài thị trường thì chỉ có một số mẫu có xuất hiện pic của AST, còn lại thì

không. Do vậy cần tiếp tục phân tích AST trên một số lượng mẫu chế phẩm lớn

DẠ

hơn và cân nhắc đến hoạt chất khác làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm chứa Thổ phục linh.

IA L

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Cương, Nguyễn Thượng

OF FI C

Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn(2003), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tập II trang 883-886.

2. Bộ Y Tế ( 2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, Tập II, tr 1344-1345.

ƠN

3. Mai Hương (2013), “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh (SMILAX GLABRA ROXB.) của Việt Nam”, Luận văn thạc sĩ chuyên ngành sinh học thực nghiệm, Viện sinh thái và tài

nguyên sinh vật.

4. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Quyết Tiến, Trần Thị Thanh Hằng, Phạm Hữu Điện (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học củ Thổ phục linh

QU Y

Smilax glabra Roxb. Trồng tại Thái Nguyên“, Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP Hà Nội Tập 55(6), tr.62-70.

5. Lê Ngọc Tân, Đỗ Mạnh Dũng, Phạm Văn Hiển, Nguyễn Trọng Điệp, Đăng Trường Giang, Vũ Bình Dương (2019), “Định lượng đồng thời astilbin và emodin trong bài thuốc GK1 bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Dược học, số

KÈ M

518 – trang 16-21.

6. Nguyễn Quốc Vượng, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Thị Thu, Diệp Thị Lan

Phương, Phạm Văn Cường, Châu Văn Minh (2013), “Khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ cây thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) và bán tổng hợp

alphitonin bằng phương pháp đồng phân hóa taxifolin”, Tạp chí Hóa học, T

DẠ

51(2AB), 208-213. 7. Nguyễn Ngọc Xuân, Đào Văn Phan, Nguyễn Duy Thuần (2000),

“Bước đầu nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của thổ phục linh (Smilax Glabra Roxb.) trên chuột nhắt”. Tạp chí Dược học, số 4, 12-16 và số 11, 18-21.

Tiếng Anh

IA L

8. AOAC International (2013), “Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals”, AOAC Official Methods of Analysis, pp. 3-32.

9. Cai Y, Chen T, Xu Q (2003), “Astilbin suppresses collagen-induced

OF FI C

arthritis via the dysfunction of lymphocytes”, Inflammation Research, 52, 334340.

10. Cai Y, Chen T, Xu Q (2003), “Astilbin suppresses delayed-type hypersensitivity by inhibiting lymphocyte migration”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 55, 691-696.

11. Chen T, Li J, Cao J, Xu Q, Komatsu K, Namba T.(1999), “A new

ƠN

flavanone isolated from Rhizoma Smilacis glabrae and the structural requirements of its derivatives for preventing immunological hepatocyte

damage”, Planta Medica, 65, 56-59.

12. Chen T, Li, JX, Xu Q. (2000), “Phenylpropanoid glycosides from Smilax glabra”, Phytochemistry, 53, 1051-1055. 13. CHEN You-jun, ZHAO Rui-zhi, Zhao Ying, Lu Chuan-jian,

QU Y

“Simultameous determination of chlorogenic acid, peoniflorin, isofraxidin, ferulaic acid and astilbin in Yinxieling liquid extract by HPLC-PDA”, Chinese Traditional Patent Medicine 2010 Issue 9. 14. Cintra P, Bueno FC, Bueno OC, Malaspina O, Petacci F, Fernandes

KÈ M

JB (2005), “Astilbin toxicity to leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera :Formicidae)”, Sociobiology, 45,347-353. 15. Closa D, Torres M, Hotter G, Bioque G, Leon OS, Gelpi E,

RoselloCatafau J. (1997), “Prostanoids and free radicals in Cl4C-induced hepatotoxicity in rats: Effect of astilbin”, Prostaglandins Leukotrienes and

DẠ

Essential Fatty Acids, 56, 331-334. 16. Du HZ, He XC, Nong H, Dong LS, Chen HB, Cal J, Li M, “UPLC

and HPLC analysis on contents of astilbin and engeletin in dong medicine “sunlgaems” of Guizhou origin by QAMS”, China Journal of Chinese Materia Medica, 01 Aug 2015, 40(15):3115-3120.

17. Fei MJ, Wu XF, Xu Q (2005), “Astilbin inhibits contact A”, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 116, 1350-1356.

IA L

hypersensitivity through negative cytokine regulation distinct from cyclosporin

18. Feng, H.; He, Y.; La, L.; Hou, C.; Song, L.; Yang, Q.; Wu, F.; Liu,

OF FI C

W.; Hou, L.; Li, Y.; et al. “The flavonoid-enriched extract from the root of

Smilax china L. inhibits inflammatory responses via the TLR-4-mediated signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 2020, 256, 112785.

19. Fukunaga T, Miura T, Furuta K, Kato A. (1997), “Hypoglycemic effect of the rhizomes of Smilax glabra in normal and diabetic mice”, Biological & pharmaceutical bulletin, 20, 44-46.

ƠN

20. Haraguchi H, Ohmi I, Fukuda A, Tamura Y, Mizutani K, Tanaka O, Chou WH. (1997), “Inhibition of aldose reductase and sorbitol accumulation by astilbin and taxifolin dihydroflavonols in Engelhardtia chrysolepis”, Bioscience

Biotechnology and Biochemistry, 61, 651-654.

21. Huang, L.; Deng, J.; Chen, G.; Zhou, M.; Liang, J.; Yan, B.; Shu, J.; Liang, Y.; Huang, H. “The anti-hyperuricemic effect of four astilbin

QU Y

stereoisomers in Smilax glabra on hyperuricemic mice.” J. Ethnopharmacol. 2019, 238, 111777.

22. Jiang JY, Xu Q (2003), “Immunomodulatory activity of the aqueous extract from rhizome of Smilax glabra in the later phase of adjuvant- induced arthritis in rats”, Journal of Ethnopharmacology, 85, 53-59.

KÈ M

23. Jiang JY, Wu FH, Lu JF, Lu ZH, Xu Q (1997), “Anti-inflammatory

activity of the aqueous extract from RSG”, Pharmacological Research, 36, 309314.

24. Le Viet Duc, Vu Binh Duong, Trinh Nam Trung, Pham Thi Thanh

Huong,

DẠ

“Quantitative study for determination of astilbin in Smilax Glabra by high

performance liquid chromatography”, Journal of military pharmaco – medicine No7-2015. 25. LI, Lei; ZHANG, Hong-gui; QIAO, Yan-jiang,”HPLC determination

of astilbin and resveratrol in Smilax grabra Roxb”,Chinese Journal of

IA L

Pharmaceutical Analysis, Volume 27, Number 5, 1 May 2007, pp. 654-656(3).

26. Moulari B, Pellequer Y, Lboutounne H, Girard C, Chaumont JP,

Millet J, Muyard F (2006), “Isolation and in vitro antibacterial activity of

OF FI C

astilbin, the bioactive flavanone from the leaves of Harungana madagascariensis Lam. ex Poir. (Hypericaceae)”, Journal of Ethnopharmacology, 106, 272- 278.

27. N. Q. Chien und G. Adam (1979),“Ueber die Inhaltsstoffe von Smilax glabra (Roxb.)”, Pharmazie, 34(12), 841-843.

28. PetacciF, Freitas SS, Brunetti IL, Khalil NM (2010), „„Inhibition of peroxidase activity and scavenging of reactive oxygen species by astilbin

ƠN

isolated from Dimophandra mollis (Fabaceae, Caesalpinoideac)“, Biological research, 43, 63-74.

29. Qing-Feng Zhang, Ying-Juan Fu, Zhan-Wang Huang, Xin-Cheng Temperature,

and

Shangguang, Yu-Xian Guo. “Aqueous Stability of Astilbin: Effects of pH, Solvent”,

Journal

Agricultural

and

Food

Chemistry 2013 61 (49), 12085-12091.

QU Y

30. Sa F, Gao JL, Fung KP, Zheng Y, Lee SMY, Wang YT. (2008), “Anti- proliferative and pro-apoptotic effect of Smilax glabra Roxb. extract on hepatoma cell lines”. Chemico-biological interaction, 171, 1-14. 31. Shuo Xu, Ming-Ying Shag, Guang-Xue Liu, Feng Xu, Xuan Wang, Cheng-Chao Shou and Shao-Qing Cai (2013), „„ Chemical constituents from the

KÈ M

Rhizomes of Smilax glabra and Their Antinucrobial Activity“, Molecules, 18, 5265-5287.

32. Tewtrakul S, tharat A, Rattanasuwan P (2006), “Anti-HIV-1 protease-

and HIV-1 integrase activities of Thai medicinal plants known as Hua-Khao-

Yen”, Journal of Ethnopharmacology, 105, 312-315.

DẠ

33. Thabrew MI, Mitry RR, Morsy MA, Hughes RD. (2005), “Cytotoxic

effects of a decoction of Nigellasativa, Hemidesmus indicus and Smilax glabra on human hepatoma HepG2 cells”, Life sciences, 77, 1319-1330. 34. Tran Van Loc, Tran Van Chien, Tran Duc Quan, Pham Thi Ly, Trinh

Thi Thuy, Tran Van Sung (2007), “ Isolation of dihydrokaempferol 3-O-α-l-

IA L

rhamnopyranoside and astibin from the Similax glabra roots and their

transformation into auronols”, Vietnamese Academy of Science and Technology, 45(3A), 138-141.

OF FI C

35. Zang Qing-Feng, Zhang Zhongrong, Cheung Hon-yeung (2008), “Literature Review of Rhizoma Smilax glabra” Hong Kong Pharmaceutical Journal, 15(2), 68 – 71.

36. Zang Qing-Feng, Zhang Zhongrong, Cheung Hon-yeung (2009), “Antioxydant activity of Rhizoma Smilacis glabrae Extracts and its key constituent-astilbin”, Food Chemistry, 115, 297-303.

ƠN

37. Vijayalakshimi A and at all (2011), “Antioxydant anticonvulsant activity of asstilbin, a flavonoid glycoside from Rhizome of Smilax China Linn. J”, Pharmacy Research, 4(3), 561-563.

38. Wang J, Zhao Y, Xu Q (2004), “Astilbin prevents concanavalin Ainduced liver injury by reducing TNF-alpha production and T lymphocyte adhesion”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 56, 495-502.

astilbin

from

QU Y

39. Xiangpei Zhao, Licheng Guo, Hongli Teng, “HPLC analysis of the

rhizome

the

traditional

zhuang

medicine

“Gaeulanghauh”(2016), Biotechnology and Medical Science, pp.410-413. 40. Xiao-dan Wang, Min-xin Meng, Ling-bo Gao, Ting Liu, Qiang Xu, Su Zeng (2009), “Permeation of astilbin and taxifolin in CaCo-2 cell and their

KÈ M

effects on the P-gp”, Internationnal Journal of Pharmaceutics, 378, 1-8. 41. Xinyu Zhao, Ruyi Chen, Yueyue Shi, Xiaoxi Zhang, Chongmei Tian

and Daozong Xia, “Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Six Flavonoids from Smilax Glabra Roxb”, Molecules,2020 Nov 13;25(22):5295.

42. Xu Q, Wang R, Xu L, Jiang J (1993), “Effects of RSG on cellular and

DẠ

humoral immuneresponses” Chin J Immunol, 9, 39-42. 43. Xu Q, Wu FG, Cao JS, Chen T, Jiang JY, Saiki I, Koda A. (1999),

“Astilbin selectively induces dysfunction of liver-infiltrating cells - novel protection from liver damage”, European Journal of Pharmacology, 377, 93-

100.

interleukin-2-dependent

phytohemagglutinin-activated

Pharmacological Research, 44, 135-139.

IA L

44. Yan R, Xu Q (2001), “ Astilbin selectively facilitates the apoptosis of Jurkat

cells”,

OF FI C

45. Yi YJ, Cao ZZ, Yang DL, Cao Y, Wu YP, Zhao SX. (1998), “Studies

on the chemical constituents of Smilax glabra”, Acta Pharmaceutica Sinica, 33, `873-875.

46. Yi YJ, Cao ZZ, Yang WH, Hong WQ, Cao Y, Leng ZK. (1995), “Chemical studies of Smilax glabra (III). Isolation and indentification of smiglanin from smilax glaba”, Acta Pharmaceutica Sinica, 30, 718-720.

ƠN

47. Yuan JZ, Li W, Koike KZ, Chen YJ, and Nikaido T. (2003), “Phenolic glycosides from rhizomes of smilax glabra”, Heterocycles, 60, 1633-

DẠ

KÈ M

QU Y

1637.

IA L

PHỤ LỤC

OF FI C

Phụ lục 1: Sắc ký đồ độ phù hợp hệ thống …................................................. PL-2 Phụ lục 2: Chổng phổ mẫu thử với pic trong sắc ký đồ chuẩn ...................... PL-8 Phụ lục 3: Độ tinh khiết của thử..................................................................... PL-9 Phụ lục 4. Sắc ký đồ độ đúng ở các mức nồng độ ....................................... PL-10 Phụ lục 5. Sắc ký đồ của LOD và LOQ ....................................................... PL-19 Phụ lục 6. Sắc ký khảo sát phương pháp chiết ............................................. PL-20

ƠN

Phụ lục 7. Sắc ký độ khảo sát số lần chiết ................................................... PL-22

DẠ

KÈ M

QU Y

Phụ lục 8. Bài báo khoa học ......................................................................... PL-23

PL-1

Phụ lục 1: Sắc ký đồ độ phù hợp hệ thống

DẠ

KÈ M

QU Y

ƠN

OF FI C

IA L

Lần 1

PL-2

DẠ

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

Lần 2

PL-3

DẠ

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

Lần 3

PL-4

DẠ

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

Lần 4

PL-5

DẠ

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

Lần 5

PL-6

DẠ

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

Lần 6

PL-7

ƠN

OF FI C

IA L

Phụ luc 2: Chổng phổ mẫu thử với pic trong sắc ký đồ chuẩn

DẠ

KÈ M

QU Y

Chồng phổ AST

PL-8

QU Y

ƠN

OF FI C

IA L

Phụ lục 3: Độ tinh khiết của thử

DẠ

KÈ M

Độ tinh khiết của thử T1

PL-9

DẠ

KÈ M

QU Y

ƠN

OF FI C

IA L

Phụ lục 4. Sắc ký đồ độ đúng ở các mức nồng độ

5ppm – 1

PL-10

DẠ

5ppm - 2

PL-11

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

5ppm – 3

PL-12

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

10ppm - 1

PL-13

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

10ppm – 2

PL-14

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

10ppm - 3

PL-15

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

15ppm – 1

PL-16

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

15ppm – 2

PL-17

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

DẠ

15ppm - 3

PL-18

KÈ M QU Y ƠN

OF FI C

IA L

ƠN

OF FI C

IA L

Phụ lục 5. Sắc ký đồ của LOD và LOQ

LOQ

DẠ

KÈ M

QU Y

LOD

PL-19

VKN – SA

DẠ

KÈ M

QU Y

VKN - HL

ƠN

OF FI C

IA L

Phụ lục 6. Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết

TT – SA

TT - HL PL-20

DẠ

KÈ M QU Y ƠN

T1 - HL

PL-21

T1 - SA

OF FI C

IA L

OF FI C

IA L

Phụ lục 7. Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết

QU Y

ƠN

Chiết lần 1

DẠ

KÈ M

Chiết lần 2

Chiết lần 3 PL-22

DẠ

KÈ M

QU Y

ƠN

OF FI C

IA L

Phụ lục 8. Bài báo khoa học

PL-23

IA L

Determination of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra using high-performance liquid chromatography Tran Nguyen Ha1, Hoang Thi Thuy Linh1, Vu Ngan Binh1,

Nguyen Thi Thanh Nhai2, Phi Van Toan3, Pham Thi Thanh Ha11 2

Hanoi University of Pharmacy, Hanoi, Vietnam

OF FI C

Hai Duong Central College of Pharmacy, Hai Dương, Vietnam 3

Hanoi University of Science and Technology, Hanoi, Vietnam

(Received: 03/05/2021; Accepted: 07/06/2021) Abstract

Smilax glabra rhizoma has been used in traditional medicine remedies for the treatment

ƠN

of joint pain and inflammation, and recently, has been presented in dietary supplements for supporting arthritis and gout treatment. In the 5th Vietnamese Pharmacopoeia, astilbin was chosen as a chemical marker for the quality control of Smilax glabra as herbal medicine. A

high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the qualitative and quantitative determination of of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra. Ultrasonic extraction with methanol 60% was used for astilbin extraction from herbal products. HPLC analysis was performed with a C18 column and a mobile phase consisting of

QU Y

methanol and water in gradient mode, with UV detection at 291 nm. The method was validated according to AOAC International’s requirements with high specificity and precision.

Keywords: Astilbin, Smilax glabra, dietary supplement, high performance liquid

KÈ M

chromatography, HPLC.

1. INTRODUCTION

Smilax glabra rhizoma (Smilax glabra Roxb.) is a plant that grows wildly in the

mountainous areas in Vietnam. For a long time, in Chinese and Vietnam Traditional Medicines, Smilax glabra rhizoma has been used in many remedies to treat diseases of

tendons, parasitic worms, ulcer, detoxification, anti-inflammatory, treatment of leptospirosis,

DẠ

dermatitis, syphilis, brucellosis, acute bacterial dysentery [i]. Modern medicine also shows that Smilax glabra rhizoma’s root contains astilbin (AST), which plays an important role in reducing uric acid in the blood by inhibiting the activity of the enzyme xanthine oxidase and 1Corresponding

author: Tel 0904882288

Email: thanhha.pham@gmail.com

PL-24

increasing the expression of metabolites uric acid secretion [2], and also has the effect of

IA L

reducing the inflammatory response through inhibition of inflammatory mediators [3]. In addition to the fact that Smilax glabra rhizoma presents in pharmaceuticals, it also presents in dietary supplements which are widely used without a doctor's prescription. Therefore, quantifying AST in dietary supplements to control product quality becomes necessary.

OF FI C

In Vietnam, there are some studies about chemical components [ ii-iii], biological

activity [ii-iii] qualitative and quantitative methods of Smilax glabra rhizoma [iii]. In Vietnamese Pharmacopoeia V, AST has been selected as a marker in both qualitative and quantitative criteria for Smilax glabra rhizoma as a medicinal herb [Error! Bookmark not defined.]. There are some publications of quantitative methods of AST in Smilax glabra rhizoma, which utilized high-performance liquid chromatography (HPLC) [iv, Error! Bookmark not defined.]. However, there has not been any method to determine

ƠN

AST in supplement products from Smilax glabra rhizoma. Therefore, this study aims to develop a quantitative method to determine astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma by HPLC.

2. MATERIALS AND METHODS 2.1. Materials

AST standard was purchased from Biopurify Phytochemicals (China) (98%, Lot.No. PRF9022741); Smilax glabra rhizoma standard material was obtained from National Institute

QU Y

of Drug Quality Control (Vietnam) (SKS: CV 0116035.01); 5 samples of dietary supplements (code from T1 to T5) which are preparations in the form of hard capsules containing dried medicinal herbs including Nanocare, Khuong Thao Dan, Goutcare, Vien gout Tam Binh, Vuong Thao Kien Cot. Among those samples, the T1 sample was used as the matrix sample to develop the quantitative method.

KÈ M

2.2. Equipment and chemicals An Agilent 1200 series Gradient HPLC with diode-array detection (DAD), Agilent

Chemstation software (Agilent, Us) was used for the separation, qualitative and quantitative determination of AST. Methanol (MeOH) of HPLC grade and other chemicals at analytical grade were obtained form Merck, Germany.

2.3. Methods

Method development: We conducted the extraction solvent selection, and other

DẠ

extraction parameters. Based on some references, we optimized liquid chromatography conditions such as components of mobile phases, and gradient program. Method validation: We validated the method according to the guideline of AOAC

International Appendix K [ v ] with some criteria of selectivity, system suitability, PL-25

calibration curve, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy, and

IA L

precision. To test the applicability of the method, we have quantified AST in several

commercially available dietary supplements with Smilax glabra rhizoma as one of the

3. RESULTS AND DISCUSSION

OF FI C

main ingredients.

3.1. Develop the quantitative method of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma 3.1.1. Investigation of chromatographic conditions

We investigated the chromatographic conditions for quantifying AST in Smilax glabra rhizoma referring to Vietnamese Pharmacopoeia V, the conditions were as follow: C18 column (250 × 4.6 mm i.d.; particle size 5 μm), detection wavelength of 291 nm, a flow rate

ƠN

of 1 mL/min, injection volume of 20 μL, a mobile phase of methanol (MeOH) - 1% acetic acid in water (39 : 61, v/v). The results showed that the AST peak could not be separated from the product matrix. We, then, investigated two other mobile phase systems: a) MeOH - 0.1%

H3PO4 in water; b) MeOH - H2O with different ratios. Consequently, the mobile phase of MeOH - H2O (38 : 62, v/v) gave the best separation of AST peak, and easily implement in the experiment. However, the other compounds in the matrix had a relatively strong interaction with the column so the total analysis time last relatively long. Based on the retention time of

QU Y

interferences in the matrix, to quickly remove them, the gradient program of MeOH - H2O was as follows: 0 - 23 min (38 : 62, v/v); 23.1 - 32 min (85 : 15, v/v); 32.1 - 37 min (38 : 62, v/v).

3.1.2 Investigate extraction method of astilbin in dietary supplement containing Smilax glabra rhizome

KÈ M

T1 sample was firstly extracted follow the method in the Vietnamese Pharmacopoeia V. An amount of sample equivalent to 0.8 g Smilax glabra rhizome was weighed, then it was conducted reflux extraction in 100 mL of 60% MeOH. However, the extraction of astilbin in dietary supplements is considered easier compare

to the extraction from Smilax glabra rhizome herbal. Thus, T1 sample was extracted in 60%

MeOH with the support of ultrasonic for ten minutes (AST is soluble in this solvent). The amount of AST in the T1 sample extracted by two methods was reported in Figure

DẠ

PL-26

0.040

1.60

0.025 0.020

0.019

0.015

1.20 1.00 0.80 0.60

0.010

0.40

0.005

0.20

0.000

T1-HL1

0.00

T1-SA

1.091

OF FI C

0.030

IA L

1.40

Amount (%w/w)

1.421

0.034

0.035

0.391

0.262

VKN-HL

VKN-SA

TT-HL

TT-SA

Figure 1. Amount % of astilbin in T1 sample, Smilax glabra rhizoma standard

ƠN

material (VKN), and commercial product (TT) extracted by reflux extraction (HL) and ultrasonic (SA)

For the same sample extracted with two methods, the amount of AST extracted by SA

tended to be higher than that of HL method. The research of Qing-Feng Zhang’s group (2013) showed that astilbin can be decomposed by temperature from 45°C; at the temperature of 55°C, t1/2 was about 2.5 hours [vi]. Our research group verified this result by an experiment. After 30 minutes of heating the AST standard solution to 50°C, the concentration reduced

QU Y

significantly. In the HL extraction method, the temperature of methanol was about 70°C. Thus, the reason for the low efficiency of HL extraction was thermal decomposition. Therefore, the SA extraction method was selected to extract AST from dietary supplements. Our research group also compared the HL extraction method according to the Vietnamese Pharmacopoeia V and SA extraction method for raw material of Smilax glabra rhizoma. The samples were Smilax glabra rhizoma standard material (VKN sample) obtained

KÈ M

from the National Institute of Drug Quality Control (Vietnam) and the commercial one (TT sample). The results (Figure 1) showed that the amount of AST in samples extracted by the SA method was higher than that of the HL method. 3.1.3. Investigate extraction time T1 sample was extracted by the SA method with different ultrasonic times in 5, 10, 20,

30 minutes, then analyzed by HPLC-DAD. The result of ultrasonic for ten minutes increase

DẠ

7.1% compared to ultrasonic for five minutes. After ultrasonic 20 minutes, the amount of AST barely increased or increased insignificantly compared with the result of ultrasonic ten minutes. Ultrasonic 30 minutes showed a tendency to decrease AST. Although there was no heating process, after 20 minutes of ultrasonic, the temperature of the extraction solution PL-27

started to increase, and after 30 minutes of ultrasonic, the temperature of the solution was

IA L

greater than 50°C. Thus the amount of AST decreased when increasing the ultrasonic time by thermal decomposition. In conclusion, to save time and avoid decomposition of AST, the extraction time with ultrasonic was ten minutes. 3.1.4. Investigate number of extractions

OF FI C

Sample T1 was extracted three times, the solvent volumes were 5 mL, 3 mL, and 2 mL,

respectively, and each time was extracted by ultrasonic for ten minutes with 60% MeOH. The result of HPLC-DAD analysis showed that after the first extraction, most of AST was extracted, and the amount was 0.0296% (w/w). Extraction solutions of the second and the third time did not show any signal of AST in the chromatogram. Therefore, extraction one time with ten minutes of ultrasonic was the most suitable.

Finally, the extraction method was as follows: weighing an amount of sample

ƠN

equivalent to 50 mg Smilax glabra rhizoma, extracting the sample with 5 mL of 60%MeOH for ten minutes, centrifuging the solution, filtering the solution through a 0.45 μm membrane, injecting 20 μl of the extraction solution into HPLC-DAD system.

3.2. Method validation 3.2.1. Specificity

Simultaneous analysis of four samples including blank, standard, test sample, and standard addition test sample (spiked sample) obtained the results shown in Figure 2.

QU Y

In the chromatogram of standard solution, AST’s peak appeared at 19.9 min (Figure 2b), and it did not show in Figure 2a (balnk sample). In the chromatograms of test sample (Figure 2c) and spiked sample (Figure 2d), there was a peak appeared at the same retention time (tR) of AST. The corresponding AST peak in the sample and the spiked sample was performed overlaid with the standard AST peak, giving a spectral

KÈ M

superposition factor > 0.99. The purity of the AST peaks in the sample and spiked

DẠ

sample also reached > 0.999. Thus the method has specificity for AST.

PL-28

IA L OF FI C

ƠN

Figure 2. Chromatogram of blank (a), standard solution (b), test sample (c), and standard addition sample (d) 3.2.2. Systematic suitability

Analysis of six replication of 10 ppm AST standard solution were recorded the retention

time and peak area. The results showed that the relative standard deviation (RSD) of the retention time is 0.7% (< 2%), of the peak area is 1.8% (< 2%). These figures meet the requirements of AOAC 2013. 3.2.3. Calibration curve

QU Y

A series of AST standard solutions with actual concentrations of 1.077 ppm, 2.152 ppm, 5.380 ppm, 10.76 ppm; 16.14 ppm, and 21.52 ppm were prepared, then analyzed with the selected conditions. The regression equation (y = 30.513x - 30.663) showed a good correlation between the peak area and the corresponding analyte concentration with the correlation coefficient r = 0.997, which meets the requirements of AOAC 2013.

KÈ M

3.2.3. Repeatability

T1 sample was weighed six times with a mass of about 0.125 g. These samples were

extracted ten minutes with 60% MeOH, then analyzed. We conducted this experiment twice with different analysts on different days to calculate the average. On the first day, the average amount of AST was 0.0353% w/w, RSD 1.50%. On the second day, the average amount of

AST was 0.0361% w/w, RSD 1.37%. The repeatability was acceptable with RSD for the

DẠ

amount of AST was 1.83%, the average amount of AST was 0.0357% w/w. 3.2.4. Accuracy The accuracy of the method was determined by the following experiment: Adding an

amount of AST standard to T1 sample such that the amount of AST in the extraction solution has a concentration range of 5 to 20 ppm; at each concentration, performing three replications. PL-29

The concentration of AST in the samples was determined from the calibration curve. The

IA L

results were presented in Table 1. The recovery was from 103.01% - 106.45%; RSD < 8% meets AOAC 2013 regulations with a content of 0.01% (RSD < 6% at 0.1%, w/w). Table 1. Result of recovery experiments Recovery concentration

Recovery

Average

concentration (ppm)

(ppm)

(%)

2.152

2.229

103.61

103.01

1.35

2.152

2.327

2.152

2.094

7.532

7.738

106.45

1.67

7.532

8.075

7.532

8.241

12.91

13.31

103.04

105.80

2.10

12.91

13.73

106.33

12.91

13.95

108.04

OF FI C

Addition

RSD (%)

108.12 97.29

102.73 107.21 109.41

ƠN

Sample

3.2.5. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) AST standard solution was prepared at a concentration of 0.083 ppm. The ratio of AST’s signal S and noise N (S/N) was 3.5. Thus, 0.83 ppm can be accepted as the LOD, and 0.25 ppm can be the LOQ.

QU Y

So far, the developed method was validated fully according to AOAC 2013, and suitable to quantitatively determine AST in Smilax glabra rhizoma dietary supplements. 3.3. Feasibility of the method

To test the feasibility of the developed method, the above procedure was applied for the quantification of AST in several dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma on

KÈ M

the market. The results were presented in Table 2. The results showed that the AST content has been determined in 2 samples of the Smilax glabra rhizoma dietary supplements. In the remaining four samples, there was no peak corresponding to the retention time of AST. It means that other ingredients in the products do not have peaks that affect the quantification of AST. This proves the feasibility of the method when applied to real samples.

Some products containing Smilax glabra rhizoma did not show the peak of AST, although these products were assumed to have a high content in tablets. Due to the limited

DẠ

number of samples applied, it is not possible to comment on product quality, but this can be a suggestion to cooperate with manufacturers in testing input materials for production according to Vietnamese Pharmacopoeia V, and controlling the production process to avoid decomposition of active ingredients. PL-30

Table 2. Amount of AST in some Smilax glabra rhizoma dietary supplements Concentration of AST in

Amount of AST in a tablet

tablet (mg)

extraction solution (μg/mL)

(mg/tablet)

100

4,639

0.1819

100

4,212

0.1630

330

ND (*)

650

ND (*)

100

ND (*)

100

ND (*)

OF FI C

(*)

IA L

Mass of a

Sample

ND (*) ND (*) ND (*)

ND - Not detected (< LOD 0.08 μg/mL in extraction solution)

4. CONCLUSION

The study has developed a method for the quantification of astilbin in dietary

ƠN

supplements containing Smilax glabra rhizoma by high-performance liquid chromatography with a UV detector at 291 nm and simple mobile phases. The method of sample treatment by ultrasonic extraction with 60% methanol gives a high recovery, acceptable separation in the

moderate analysis time, high sensitivity, repeatability, and accuracy meeting the AOAC guidelines [9]. The method has proven feasibility in determining AST content in commercial dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma.

QU Y

REFERENCES [1]. D. H. Bich, D. Q. Chung, B. X. Cương, N. Thuong Dong, D. T. Dam, P. V. Hien, V. N. Lo,

P. D. Mai, P. K. Man, D. T. Nhu, N. Tap, and T. Toan, “Medicinal plants

and animals in Vietnam,” Hanoi: Science and Technology Publisher, vol.2, pp. 883-886, 2003.

KÈ M

[2]. L. Huang, J. Deng, G. Chen, M. Zhou, J. Liang, B. Yan, J. Shu, Y. Liang, and H. Huang, “The anti-hyperuricemic effect of four astilbin stereoisomers in Smilax glabra on hyperuricemic mice,” Journal of Ethnopharmacology, vol. 238: 111777, 2019. [3]. C-L. Lu, Y-F. Zhu, M-M. Hu, D-M. Wang, X-J Xu, C-J. Lu, and W. Zhu, "Optimization of astilbin extraction from the rhizome of Smilax glabra, and evaluation of its antiinflammatory effect and probable underlying mechanism in lipi-polysaccharide-induced

RAW264.7 macrophages", Molecules, vol. 20, no. 1, pp. 625-644, 2015.

DẠ

[4]. M. Huong, “Research on biological activities and chemical compositions in the roots of Smilax glabra rhizoma (SMILAX GLABRA ROXB.) in Vietnam,” Master's Thesis in Experimental Biology, Institute of Ecology and Biological Resources, 2013.

PL-31

[5]. P. T. H. Minh, N. Q. Tien, T. T. T. Hang, and P. H. Dien, “Research on the chemical

Hanoi National University of Education, vol 55, no. 6, pp. 62-70, 2010.

IA L

composition of the Smilax glabra Roxb. grown in Thai Nguyen,” Journal of Science,

[6]. T. T. T. Van, V. V. Chien, P. T. Hang, P. V. Cuong, N. Q. Vuong, Antioxidant activity of

extracts and astilbin from the root of Smilax glabra of Vietnam, Malaysian Journal of

OF FI C

Chemistry, 17, 12-19, 2015.

[7]. Pharmacopoeia Council - Ministry of Health, Vietnam Pharmacopoeia V, Medicine Publisher, vol. II, pp. 1344-1345, 2017.

[8]. L. V. Duc, V. B. Duong, T. N. Trung, and P. T. T. Huong, “Quantitative study for determination of astilbin in Smilax glabra by high performance liquid chromatography,” Journal of Military Pharmaco-Medicine, vol. 7, pp. 8-12, 2015.

[9]. AOAC International, “Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals”,

ƠN

AOAC Official Methods of Analysis, pp. 3-32, 2013.

[10]. Qing-Feng Zhang, Ying-Juan Fu, Zhan-Wang Huang, Xin-Cheng Shangguang, Yu-Xian Guo, "Aqueous Stability of Astilbin: Effects of pH, Temperature, and Solvent", Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 61 (49), 12085-12091, 2013.

QU Y

Xây dựng phương pháp định lượng Astilbin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe

có chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Trần Nguyên Hà1, Hoàng Thị Thuỳ Linh1, Vũ Ngân Bình1,

KÈ M

Nguyễn Thị Thanh Nhài2, Phí Văn Toàn3, Phạm Thị Thanh Hà1, 2

Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam

Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, Hải Dương, Việt Nam 3

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam

Tóm tắt

Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) là một dược liệu được sử dụng trong nhiều bài

DẠ

thuốc cổ truyền về gân cốt, chống viêm, và gần đây cũng được sử dụng trong các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ hỗ trợ điều trị viêm khớp và điều trị gout. Để kiểm soát chất lượng dược liệu Thổ phục linh, astilbin là hoạt chất được lựa chọn làm chất đánh dấu trong Dược điển Việt Nam V. Phương pháp định tính và định lượng astilibin trong sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa PL-32

Thổ phục linh sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được xây dựng trong nghiên cứu này.

IA L

Astilbin trong chế phẩm được chiết siêu âm bằng methanol 60%, phương pháp định lượng HPLC sử dụng cột C18, pha động gồm methanol và nước theo chế độ gradient, phát hiện với UV tại bước sóng 291 nm. Các tiêu chí thẩm định phương pháp được thực hiện đầy đủ theo hướng dẫn của AOAC 2013 cho kết quả tin cậy.

OF FI C

Từ khóa: Astilbin, Smilax glabra, Thổ phục linh, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, sắc ký

DẠ

KÈ M

QU Y

ƠN

lỏng hiệu năng cao, HPLC.

PL-33

ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN TRONG CHẾ PHẨM DƯỢC LIỆU CHỨA THỔ PHỤC LINH BẰNG HPLC

Articles inside

trường

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết

Bảng 3.4. Chương trình gradient chạy sắc ký

Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại của phương pháp

Bảng 3.8. Kết quả độ đúng của AST Bảng 3.9. Hàm lượng AST của một số chế phẩm chứa Thổ phục linh trên thị

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát số lần chiết

Bảng 3.5. Kết quả độ phù hợp hệ thống

Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh