KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CỦA BẠCH PHỤC LINH
vectorstock.com/24597468
Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection
Kiểm tra chất lượng của Bạch phục linh theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV. Xây dựng quy trình định lượng polysaccharides dạng βglucan trong Bạch phục linh WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594
Lời Cảm Ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Dược đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô Đào Thị Cẩm Minh đã tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Phòng Kiểm Nghiệm Thực Phẩm,Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, khích lệ giúp tôi vượt qua khó khăn trong thời gian tôi thực hiện đề tài. TT Huế, tháng 4 năm 2014 Trần Thị Nhật Linh
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và do tôi thực hiện, không trùng lặp với bất kỳ luận văn nào trước đây. Người cam đoan Trần Thị Nhật Linh
MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 2 1.1. Tổng quan về Bạch phục linh ................................................................. 2 1.2. Vài nét về Polysacharide dạng β - Glucan trong Bạch phục linh........... 4 1.3. Chiết xuất và định lượng Polysacchide .................................................. 5 1.4. Vài nét về quang phổ hấp thụ UV-VIS .................................................. 5 1.5. Thẩm định phương pháp ......................................................................... 7 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 10 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 10 2.2. Phương pháp nghiên cứu: ..................................................................... 11 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................ 15 2.4. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ .................................................................... 15 2.5. Các thuật toán thống kê ........................................................................ 16 2.6. Xử lý kết quả nghiên cứu...................................................................... 16 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 18 3.1. Kiểm tra theo tiêu chuẩn DĐVN IV ..................................................... 18 3.2. Kiểm tra hàm lượng Polysaccharide dạng β –Glucan trong Bạch phục linh ............................................................................................................... 20 Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 30 4.1. Về việc thiết kế mẫu ............................................................................. 30 4.2. Về phương pháp nghiên cứu ................................................................. 31 4.3. Xây dựng quy trình định lượng â-glucan .............................................. 32 4.4. Về kết quả nghiên cứu .......................................................................... 34 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 40 PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Bảng 2x2 các tần số quan sát O ...................................................... 17 Bảng 3.1. Bảng so sánh kết quả hai đợt thu mẫu ............................................ 20 Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose ........................ 22 Bảng 3.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp ........................................ 25 Bảng 3.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................... 25 Bảng 3.5. Kết quả định lượng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh phân phối tại Thành Phố Huế................................................................................... 26
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của β - glucan ........................................................ 4 Hình 2.1. Dược liệu Bạch phục linh................................................................ 10 Hình 2.2. Hình ảnh soi bột Bạch phục linh dưới kính hiển vi ........................ 12 Hình 2.3. Máy UV-VIS (Jasco V-630) ........................................................... 16 Hình 2.4. Máy quay li tâm (EBA 21) .............................................................. 16 Hình 3.1. Hình ảnh soi bột mẫu số 20............................................................. 18 Hình 3.2. Các phản ứng định tính của mẫu 13 ................................................ 19 Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch D-glucose chuẩn-pp phenol sulfuric ... 22 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml)............................................................................................................. 22 Hình 3.5. Phổ đồ UV mẫu trắng...................................................................... 23 Hình 3.6. Phổ đồ UV mẫu dịch chiết Bạch phục linh không tạo màu ................. 23 Hình 3.7. Phổ đồ UV của dung dịch D-glucose chuẩn có tạo màu ................ 23 Hình 3.8. Phổ đồ UV của mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu ................. 23 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml)............................................................................................................. 24 Hình 4.1. Hình ảnh soi bột mẫu 6 ................................................................... 35 Hình 4.2. Các dạng sơ chế Bạch phục linh ..................................................... 36
1
ĐẶT VẤN ĐỀ Nền Y học cổ truyền của Việt Nam có một lịch sử phát triển lâu dài và phong phú. Từ xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý giá của đất nước để phòng bệnh và chữa bệnh. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từ những kinh nghiệm do nhu cầu thực tiễn, số lượng dược liệu có nguồn gốc từ thực vật và động vật được đưa vào làm thuốc ngày càng gia tăng. Trong đó, Bạch phục linh là một trong những dược liệu phổ biến, được sử dụng trong y học từ lâu. Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm dân gian, Bạch phục linh có tác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, chữa tiểu tiện khó khăn, thủy thũng, trướng mán, tiết tả…[4]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của của các hoạt chất trong dược liệu này cho thấy rằng Bạch phục linh có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, kháng viêm, kháng khối u.[21], [13], [15] Tuy nhiên, trên thị trường dược liệu này có nguy cơ không đảm bảo chất lượng do giả mạo bằng các hóa chất, chế phẩm thay thế. Theo kết quả kiểm tra của Bộ Y tế vào năm 2012, Bạch phục linh trên thị trường được làm giả khá nhiều, chủ yếu bằng calci carbonat [5], [2]. Thêm vào đó, việc kiểm tra ở các cơ sở khám chữa bệnh chỉ được thực hiện bằng cảm quan nên hiệu quả điều trị của dược liệu không được đảm bảo [1]. Nhằm giúp các nhân viên y tế, các nhà quản lý ngành y tế thành phố Huế có thêm thông tin về chất lượng thuốc đông y trên địa bàn chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế” với mục tiêu : • Kiểm tra chất lượng của Bạch phục linh theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV. • Xây dựng quy trình định lượng polysaccharides dạng β-glucan trong Bạch phục linh.
2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BẠCH PHỤC LINH 1.1.1. Vài nét về Bạch phục linh: Bạch linh tên gọi khác là Phục linh, là thể quả nấm đã phơi hay sấy khô của nấm Phục linh - Poria cocos (Schw.) Wolf, họ Nấm lỗ (Polyporaceae), mọc ký sinh trên rễ một số loài Thông. • Phục linh bì: Là lớp ngoài Phục linh tách ra, lớn, nhỏ, không đồng nhất. Mặt ngoài từ nâu đến nâu đen, mặt trong màu trắng hoặc nâu nhạt. Chất tương đối xốp, hơi có tính đàn hồi. • Phục linh khối: sau khi tách lớp ngoài, phần còn lại được thái, cắt thành phiến hay miếng, lớn nhỏ không đồng nhất, màu trắng, hồng nhạt hoặc nâu nhạt. • Xích phục linh: Là lớp thứ hai sau lớp ngoài, hơi hồng hoặc nâu nhạt. • Phục thần: Là phần nấm Phục linh ôm đoạn rễ thông bên trong. • Bạch phục linh là phần bên trong màu trắng của thể nấm. Nấm phục linh là loại nấm được trồng ở Trung Quốc và đã được sử dụng trong y học trong khoảng 2000 năm [6]. Phục linh cũng như Bạch phục linh không những được sử dụng trong các bài thuốc đông y sử dụng trên lâm sàng mà còn được sử dụng để nghiên cứu bào chế các sản phẩm thuốc chiết xuất từ dược liệu. Nhiều nhà y học trên thế giới đã bắt tay vào nghiên cứu thành phần hoạt tính, tác dụng dược lí và hiệu quả trị liệu của Bạch phục linh. - Thành phần hoá học: [6]Gồm 3 loại + Các acid có thành phần triterpen : Acid pachimic, acid tumolosic, acid eburicoic, acid pinicolic, acid 3β hydroxylanosta-7,9 , 24 trien, 21-oic
3 + Các polysaccharide dạng β-glucan và heteropolysaccharides, trong đó polysaccharide dạng β-glucan chiếm trên 90%. + Ngoài ra còn có egosterol, histidin, cholin và rất ít men proteaza. - Tác dụng dược lý: + Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm nhân dân Bạch phục linh có tác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, dùng chữa tiểu tiện khó khăn, thủy thủng, tiết tả, phục thần định tâm, an thần chữa mất ngủ.[6] + Một số nghiên cứu gần đây trên thê giới cho thấy Bạch phục linh chứa các hoạt chất có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, kháng viêm, kháng khối u.[14], [17], [23] Với những tác dụng trên, Bạch phục linh trở thành một một vị thuốc được sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc và có nhiều khả năng ứng dụng trong điều trị các bệnh khó chữa. Nhưng trong tình hình hiện nay dược liệu này đang ngày càng bị làm giả một cách tinh vi bằng một số chất như các loại tinh bột, calci carbonat… làm cho công tác điều trị bệnh trở nên khó khăn, thiếu hiệu quả. 1.1.2. Chất lượng bạch phục linh trên thị trường Bạch phục linh là dược liệu nhập hoàn toàn từ Trung Quốc. Vì vậy, đây là dược liệu khó kiểm soát chất lượng. Trước đây loại dược liệu này thường bị làm giả bằng bột sắn, gạo,…[5] nên muốn kiểm tra chất lượng chỉ cần cho vào nước dược liệu sẽ bị nở ra. Nhưng theo một cuộc khảo sát chất lượng dược liệu của một số tỉnh thành của Vụ Dược Liệu vào năm 2012 cho thấy dược liệu Bạch phục linh được làm giả chủ yếu bằng calci carbonat [2], người ta trộn một ít bột vụn dược liệu Bạch phục linh với calci carbonat rồi đem dập thành các viên dạng hình khối vuông dẹt (Bạch phục linh thường được sơ chế thành dạng này), rất khó nhận biết bằng mắt thường, dược liệu này có thể có các phản ứng đặc
4 trưng của Bạch phục linh (được quy định trong Dược Điển Việt Nam IV) vì có một lượng nhỏ dược liệu nhưng chắc chắn chất lượng không đám bảo cho hiệu quả trị bệnh. 1.2. VÀI NÉT VỀ POLYSACHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide trong Bạch phuc linh chủ yếu là dạng β –glucan – là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β –glycoside ở vị trí 1,3 và 1,6. + Công thức phân tử: (C6H10O5)n , n = 4,1x104 → 5x106 [18] + Độ hòa tan: không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm, Cadoxen, dung dịch ethylendiamin bão hòa trong cadmium oxyd.[18] + Cấu trúc phân tử :[23]
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của β - glucan 1.2.2. Tác dụng sinh học Vì polysaccharide có dạng β (1,3/1,6) –glucan cùng với độ dài mạch đặc trưng nên đây là hoạt chất có tác dụng sinh học cao[23], một số nghiên cứu trên invitro và trên động vật cho thấy chất này: + Có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch do khả năng kích thích tạo ra các tác nhân miễn dịch trong cơ thể .[23],[15] + Tác dụng kháng viêm: do khả năng ảnh hưởng lên sự có mặt của phospholipase (chất gây viêm) .[15]
5 + Tác dụng kháng khối u : gián tiếp tham gia vào quá trình tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách kích hoạt hệ thống miễn dịch làm việc có hiệu suất và hiệu quả cao để tiêu diệt các tế bào ung thư mà không gây hại cho các tế bào lành khác.[17] 1.3. CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHIDE Phương pháp chiết xuất: Trong chiết xuất polysaccharide từ dược liệu, người ta thường sử dụng phương pháp chiết nóng với các dung môi thích hợp: + Phương pháp chiết nóng: chiết dược liệu trong dung môi thích hợp ở nhiệt độ 80-100oC trong thời gian quy định, thu được dịch chiết, loại tạp. [8] Ngoài ra, để tăng cường hiệu suất chiết dược liệu, nhiều nhà nghiên cứu đã áp dụng sóng siêu âm trong chiết xuất.[22] Cơ chế tác động của sóng siêu âm trong ly trích: sử dụng sóng âm thanh có tần số và cường độ cao để truyền qua chất lỏng, giúp tăng cường sự xâm nhập của dung môi và nhiệt vào tế bào nguyên liệu do đó cải thiện tốt khả năng truyền khối. + Dung môi chiết xuất: thường sử dụng dung môi là nước dành cho các polysacchride tan, sử dụng dung dịch NaOH ở các nồng độ khác nhau (tùy vào độ dài mạch và độ phân cực) cho các polysaccharide không tan trong nước, ngoài ra còn sử dụng acid acetic, phenol...[12],[22] Phương pháp định lượng: Thường sử dụng phương pháp đo quang UV-Vis với thuốc thử phenolsulfuric, chất chuẩn là các đường đơn.[16],[7],[8] 1.4. VÀI NÉT VỀ QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến là phương pháp dựa trên khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ đi vào dung dịch của chất nghiên cứu trong
6 một dung môi nhất định. Trong công tác kiểm nghiệm phép đo phổ hấp thụ UVVIS có vai trò quan trọng trong phân tích định tính, thử tinh khiết và định lượng. 1.4.1. Độ hấp thụ Khi cho bức xạ đơn sắc đi qua một môi trường có chứa chất hấp thụ thì độ hấp thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trường hấp thụ. Mối quan hệ tuân theo định luật Lambert-Beer và được biểu diễn theo phương trình sau: A: độ hấp thụ T: độ truyền qua I0:cường độ ánh sáng đơn sắc tới I: cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi truyền qua dung dịch K: hệ số hấp thụ L: chiều dày của lớp dung dịch C: nồng độ dung dịch
A = lg1/T = lgI0/I = KCL
- Trường hợp C(mol/l) và L(cm): A = ε.L.C (ε đặc trưng cho bản chất của chất tan trong dung dịch, chỉ phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng đơn sắc) - Trường hợp C(% KL/TT) và L(cm): A = E1% 1cm.L.C (E1%1cm là hệ số hấp thụ riêng, đặc trưng cho mỗi chất. Hệ số ε hay dùng trong mô tả cấu trúc, tính chất quang phổ, còn trong phân tích kiểm nghiệm hay dùng E. ► Điều kiện áp dụng định luật Lambert-Beer: Ánh sáng đơn sắc, khoảng nồng độ tuyến tính, dung dịch phải trong suốt, chất thử phải bền trong dung dịch và dưới tác dụng ánh sáng UV-VIS. 1.4.2. Các phương pháp định lượng - Phương pháp đo phổ trực tiếp Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng. Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về bước sóng lẫn độ hấp thụ. A = E1%1cm.L.C
7 - Phương pháp đo phổ gián tiếp Ở phương pháp này cần phải có chất chuẩn để so sánh, có thể không cần phải chuẩn hóa máy. Các phương pháp gián tiếp: + Phương pháp so sánh + Phương pháp thêm chuẩn so sánh + Phương pháp đường chuẩn + Phương pháp thêm đường chuẩn + Phương pháp định lượng hỗn hợp + Kỹ thuật đo quang vi sai theo bước sóng Trong đề tài này, chúng tôi chỉ trình bày phương pháp đường chuẩn. Phương pháp đường chuẩn là phương pháp được dùng phổ biến trong phân tích quang phổ. Chuẩn bị một dãy chuẩn khoảng 5 dung dịch có các nồng độ chất chuẩn CS khác nhau. + Đo độ hấp thụ AS của dãy chuẩn và lập đồ thị của A theo C. + Đo độ hấp thụ AX của dung dịch mẫu thử và dựa vào đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu thử CX. Khi xây dựng đường chuẩn nên khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ với hấp thụ. Trường hợp dãy chuẩn không tuân theo định luật Lambert-Beer, cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với các nồng độ gần nhau hơn (khác nhau không quá 10%). Vẽ đồ thị đi qua các vị trí gần nhất với các điểm thực nghiệm hoặc dựa vào bảng chuẩn để xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính hay phi tuyến tính, tính hệ số tương quan r (r ≥ 0.995 là tốt). 1.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 1.5.1. Khái niệm Thẩm định một phương pháp phân tích là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích
8 thực tế. Các đặc điểm phân tích đặc trưng: độ đúng, độ chính xác, độ chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính. Ngoài ra có thể có những yêu cầu khác tùy theo loại phương pháp và đối tượng nghiên cứu. Thẩm định phương pháp phân tích là một quá trình nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát [19], [10]. 1.5.2. Nội dung thẩm định - Tính chọn lọc Tính chọn lọc của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thử dùng khi tách và định lượng hai hay nhiều thành phần trong một hỗn hợp của phương pháp đó. - Khoảng nồng độ tuyến tính Khoảng nồng độ tuyến tính là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được y và nồng độ đã biết x của chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định, được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính r. Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số r phải không nhỏ hơn 0,995. - Độ chính xác Độ chính xác của một phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất, được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (σ) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD%), hoặc sai số tương đối (εr%). - Độ đúng Độ đúng của một phương pháp phân tích là một mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của chất phân tích. Độ đúng có thể thay đổi từ 0100%. Đánh giá kết quả: Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trị
9 trung bình so với giá trị thực. Giá trị trung bình thu được sau khi phân tích phải sai lệch không quá 5% so với giá trị thực. - Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhấp trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận. LOQ được chấp nhận nếu đạt các điều kiện: Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng; cực đại hấp thụ của chất phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác không được lớn hơn 2%.
10
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu và địa điểm lấy mẫu - Dược liệu Bạch phục linh được bán tại các nhà thuốc Bắc trên địa bàn thành phố Huế. - Dược liệu Bạch phục linh được cấp phát tại các cơ sở khám chữa bệnh y học cổ truyền tại thành phố Huế.
Hình 2.1. Dược liệu Bạch phục linh 2.1.2. Số lượng mẫu nghiên cứu [9] Cỡ mẫu được tính dựa vào sự khác biệt giữa số đo của mẫu và tham số của quần thể theo công thức: n=
z2.p(1-p) e2
Trong đó: z là độ tin cậy 95% =1,96; p là tỷ lệ ước đoán của một nghiên cứu trước đó, p=0,15 (với tỷ lệ Bạch phục linh không đạt tiêu chuẩn là 15% [11]); e là mức chính xác mong muốn =0,08. Theo công thức, tôi tính được cỡ mẫu: n = 77
11 Do thời gian nghiên cứu ngắn và kinh phí thực hiện đề tài còn hạn hẹp nên tôi lấy cỡ mẫu nhỏ nhất là 77 mẫu để đạt được độ chính xác mong muốn. 2.1.3. Phương thức lấy mẫu Theo thông tư số 04 /2010/TT-BYT ngày 12/02/2010 về việc hướng dẫn việc lấy mẫu thuốc để xác định chất lượng thì số lượng mẫu cần lấy là 2 mẫu ở mỗi cơ sở, mỗi mẫu lấy 150g theo quy định của Dược điển Việt Nam. 77 mẫu thuốc (mã hóa theo phụ lục ) được sắp xếp theo thời gian lấy mẫu, từng phường trong thành phố Huế. Mỗi mẫu thuốc có đầy đủ thông tin về thời gian lấy mẫu và địa điểm lấy mẫu. Tiến hành thu mẫu trong 2 đợt vào tháng 9/2013 và thang 3/2014 để thuận lợi cho việc so sánh sự ảnh hưởng của điều kiện thời tiết (nhiệt độ, độ ẩm) tại hai thời điểm thu mẫu đối với chất lượng Bạch phục linh . 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1. Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh theo các tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV [2] Soi bột Màu trắng tro, có những khối sợi nấm dạng hạt không đều và những khối phân nhánh, không màu, nhỏ dung dịch cloral hydrat, sẽ tan dần. Soi kính hiển vi thấy: sợi nấm không màu hoặc màu nâu nhạt, mảnh dẻ, nhỏ, dài, hơi cong, phân nhánh, đường kính 3-8 µm, ít khi có sợi nấm đường kính tới 16 µm. Chuẩn bị dụng cụ: Chuẩn bị kính hiển vi, phiến kính, lam kính, nước cất, giấy thấm, bột dược liệu Bạch phục linh (được nghiền mịn và rây qua rây thích hợp) Chuẩn bị tiêu bản bột: - Nhỏ 2-3 giọt nước cất lên phiến kính. - Lấy ít tinh bột Bạch phục linh cần kiểm nghiệm bằng kim mũi mác lên phiến kính.
12 - Nghiền các hạt bột bằng kim mũi mác cho tới khi đều trong nước. - Đậy lam kính lên trên giọt bột cần soi sao cho không đọng bọt khí. - Thấm nước thừa trên phiến kính bằng giấy thấm. - Đặt tiêu bản lên trên mâm kính cố định. - Soi kính bằng độ phóng đại 10x rồi 40x.
Hình 2.2. Hình ảnh soi bột Bạch phục linh dưới kính hiển vi 1. 2. Sợi nấm; 3. 4. Sợi nấm hình khối Định tính - Các phản ứng đặc trưng của Bạch phục linh: A. Lấy 1,0 g bột dược liệu, thêm 5 ml aceton (TT), đun hồi lưu trên cách thủy 5 phút, thỉnh thoảng lắc, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thuỷ đến cạn. Hoà tan cặn trong 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm 1 giọt acid sulfuric (TT), xuất hiện màu đỏ nhạt, sau chuyển thành màu xanh. B. Nhỏ 1 giọt dung dịch iod- iodid (TT) lên bột dược liệu sẽ có màu đỏ thẫm. - Các phản ứng định tính phát hiện tạp chất : + Phản ứng phát hiện tinh bột: thêm dung dịch iod vào bột dược liệu đem thử, xuất hiện màu xanh lam hay xanh tím. Soi dưới kính hiển vi để xác định các dạng tinh bột thường gặp ( tinh bột sắn, tinh bột gạo…)
13 + Phản ứng định tính phát hiện calci carbonat: A.
Thêm 5ml dung dịch acid acetic loãng (TT) vào 0,1g bột dược
liệu đem thử, có sủi bọt khí carbon dioxyd. Khí thoát ra được dẫn vào dung dịch calci hydroxyd(TT) sẽ xuất hiện kết tủa trắng, tủa tan trong acid hydrocloric 7 M (TT) quá thừa. B.
Để yên dung dịch trên cho đến khi sủi bọt hết, thêm 2-3 giọt
dung dịch amoni oxalat 4% (TT), phải xuất hiện tủa trắng, tủa này không tan dung dịch acid acetic 6 M, tan trong dung dịch acid hydrocloric loãng(TT) + Kiểm tra độ ẩm, tỷ lê vụn nát: •Độ ẩm : Không quá 12,0 % ( Phụ lục 9.6, 1g, 105 oC, 5 giờ). Sử dụng phương pháp sấy trong tủ sấy có áp suất thường : - Cân bì chén cân có nắp mài đã sấy ở nhiệt độ 105oC trong vòng 30 phút. - Cân ngay vào bì 1g dược liệu (sai số không quá ± 10%). - Tiến hành làm khô trong điều kiện nhiệt độ 105oC trong tủ sấy có áp suất thường trong thời gian 5 giờ. - Cho chén cân vào bình hút ẩm đến khi nguội rồi cân. - Độ ẩm (X%) của dược liệu tính theo công thức: X% = (P – A)/P . 100 Trong đó: P là số gam mẫu dược liệu trước khi sấy A là số gam mẫu dược liệu sau khi sấy •Tỷ lệ vụn nát: Tỷ lệ qua rây có kích thước mắt rây 3,150 mm: không quá 5% Cân 150g dược liệu đã được loại tạp chất. Rây qua rây 3,150mm. Cân toàn bộ dược liệu lọt qua rây. Xác định tỷ lệ vụn nát (x%) của dược liệu theo công thức: x% = a/p.100
14 Trong đó: a là khối lượng dược liệu cân ban đầu p là khối lượng dược liệu lọt qua rây 2.2.2. Định lượng polysacchride dạng β-glucan trong Bạch phục linh: 2.2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng β-glucan trong Bạch phục linh bằng quang phổ hấp thụ UV-VIS: - Quy trình xử lý mẫu: xây dựng quy trình chiết mẫu, khử tạp chất. - Tiến hành phản ứng tạo màu: lựa chọn thuốc thử, khảo sát nồng độ thuốc thử, thời gian phản ứng, điều kiện phản ứng. - Xác định cực đại hấp thụ của dung dịch phân tích. - Xây dựng phương trình hồi quy: lựa chọn khoảng nồng độ tuyến tính, có mật độ quang nằm trong khoảng 0,2-0,8. Từ những khảo sát trên, xây dựng hoàn chỉnh quy trình. 2.2.2.2 Thẩm định phương pháp Phương pháp tiến hành gồm các tiêu chí: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn định lượng. Cân chính xác m (g) chất chuẩn D-glucose, pha thành các dung dịch có nồng độ thích hợp (trong dung môi nước) và tiến hành thẩm định: ► Tính chọn lọc: Chuẩn bị 4 mẫu dung dịch, mỗi mẫu làm song song 2 lần: - Mẫu 1: nước cất, tạo màu. - Mẫu 2: dung dịch D-glucose chuẩn, tạo màu. - Mẫu 3: dịch chiết Bạch phục linh . - Mẫu 4: dịch chiết Bạch phục linh, tạo màu. So sánh phổ đồ các mẫu phân tích. ► Khoảng nồng độ tuyến tính:
15 Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng nước cất thành các dung dịch C1→C5, tạo màu, đo độ hấp thụ dãy dung dịch tại λmax . Thiết lập mối tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ quang trong khoảng nồng độ khảo sát, thể hiện bằng đường hồi qui tuyến tính và hệ số tương quan r. ► Giới hạn định lượng: Chuẩn bị dãy các dung dịch có nồng độ thấp dần. Mỗi nồng độ tiến hành làm 6 lần song song. Tạo màu và tiến hành đo quang. Tính RSD% nồng độ tìm lại. ► Độ chính xác: Chuẩn bị các 6 mẫu chất thử. Tạo màu và tiến hành quét phổ, đo quang. Tính RSD% nồng độ tìm lại. ► Độ đúng: Cho vào dung dịch mẫu thử một lượng chất chuẩn là nhất định, tiến hành phân tích hàm lượng polysaccharide trong 6 mẫu dung dịch chất thử có thêm chuẩn . Tạo màu và đo quang. Tính RSD % nồng độ tìm lại. 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Các mẫu nghiên cứu được thu thập, mã hóa, mô tả và tiến hành kiểm tra tại Khoa Dược – Trường Đại Học Y Dược Huế - Thời gian nghiên cứu : từ tháng 9/2013 đến tháng 5/2014 2.4. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 2.4.1. Hóa chất: - Chất chuẩn D-glucose (Merck-Đức) - H2SO4 đậm đặc, phenol (Trung Quốc) 2.4.2. Thiết bị: - Máy UV-VIS - Cân phân tích (Mettler Toledo AB 204-S)
16 - Máy quay li tâm (EBA 21) - Các dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
Hình 2.3. Máy UV-VIS (Jasco V-630)
Hình 2.4. Máy quay li tâm (EBA 21) 2.5. CÁC THUẬT TOÁN THỐNG KÊ - Giá trị trung bình: - Độ lệch chuẩn: - Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = SD/ x .100 2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Excel.
17 - Đối với biến định tính, so sánh tỉ lệ bằng test χ2 (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05) và test t (với xác suất 95%) Công thức tính χ2: [4] Các tần số quan sát được trình bày theo bảng tiếp liên 2x2 như sau: Bảng 2.1. Bảng 2x2 các tần số quan sát O Số mẫu đạt
Số mẫu không đạt
Tổng
Nhóm I
a
b
a+b
Nhóm II
c
d
c+d
Tổng
a+c
b+d
T=a+b+c+d
Trong đề tài, do có trị số quan sát ở một ô bất kỳ nhỏ (<50) nên sử dụng công thức tính χ2 hiệu chỉnh của Yates:
Trong đó: - a, b, c, d là các giá trị quan sát được trình bày theo bảng 2x2 - Nt = a + b + c + d Công thức tính t : [4] với
Trong đó: - m1,m2 là giá trị trung bình của mẫu thứ nhất và mẫu thứ hai - S1, s2 là độ lệch chuẩn của mẫu thứ nhất và mẫu thứ hai - n1, n2 là cỡ mẫu của mẫu thứ nhất và thứ hai
18
Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KIỂM TRA THEO TIÊU CHUẨN DĐVN IV 3.1.1. Soi bột: Kết quả soi bột: trong 77 mẫu đem soi có 73 mẫu đạt tiêu chuẩn về soi bột Bạch phục linh của Dược Điển Việt Nam IV [4]
Hình 3.1. Hình ảnh soi bột mẫu số 20 Có 4 mẫu là mẫu 6,16, 51,55 khi soi bột có đặc điểm khác với các mô tả trong Dược Điển. Kết luận: có 4 mẫu trên tổng số 77 mẫu khảo sát không đạt tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam về soi bột. 3.1.2. Định tính Phản ứng định tính đặc trưng của dược liệu Bạch phục linh: Kết quả: trong 77 mẫu đem thử có 61 mẫu đạt tiêu chuẩn về định tính theo Dược Điển Việt Nam.
19
A
B
Hình 3.2. Các phản ứng định tính của mẫu 13 Có 6 mẫu trong tổng số 75 mẫu đem khảo sát không đạt tiêu chuẩn về định tính, đó là mẫu số 6, 10, 33, 36, 52,64. Phản ứng phát hiện các tạp chất: Kết quả: Trong 77 mẫu khảo sát có 2 mẫu dược liệu có chứa calci carbonat là mẫu 10,16. Có 2 mẫu có phản ứng của tinh bột là mẫu 6 và mẫu 51. 3.1.3 Kiểm tra độ ẩm, tỷ lệ vụn nát: Kiểm tra độ ẩm của dược liệu: Kết quả: trong 77 mẫu đem thử có 12 mẫu không đạt tiêu chuẩn về độ ẩm theo Dược Điển Việt Nam là các mẫu: 1, 6, 7, 8, 12, 19, 20, 37, 38, 39, 41, 54, 74. Kiểm tra tỷ lệ vụn nát của dược liệu: Kết quả: không có dược liệu nào trong 77 mẫu dược liệu đem khảo sát có tỷ lệ vụn nát không đạt tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam. Kết quả chung: - Sau khi khảo sát chất lượng của 77 mẫu dược liệu Bạch phục linh theo tiêu chuẩn của Dược Điển Việt nam IV, kết quả có 21/77 mẫu không đạt tiêu chuẩn, tỷ lệ là 27,27%. - So sánh tỷ lệ đạt tiêu chuẩn giữa các mẫu được thu vào tháng 9/2013 với các mẫu được thu vào tháng 3/2014:
20 Bảng 3.1. Bảng so sánh kết quả hai đợt thu mẫu Thời gian
Số mẫu
Số mẫu
Tổng
Tỷ lệ đạt
thu mẫu
đạt
không đạt
9/2013
25
13
38
65,79%
3/2014
30
9
39
76,92%
Tổng
55
22
77
χ2=0,687< 3,841 cho thấy không có sự khác biệt giữa tỷ lệ mẫu đạt với hai thời điểm thu mẫu. 3.2. KIỂM TRA HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE DẠNG β – GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 3.2.1. Xây dựng phương pháp: 3.2.1.1. Xử lý mẫu, chiết xuất dược liệu: - Sau khi thu mẫu, mẫu được kiểm tra chất lượng bằng các tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV, nếu kết quả kiểm tra mẫu là đạt mới tiến hành bước định lượng. Vậy tiến hành định lượng trên 56 mẫu dược liệu Bạch phục linh. - Dược liệu Bạch phục linh được xay nhỏ thành bột và bảo quản nơi khô ráo. - Chiết 5 g dược liệu nhiều lần bằng NaOH 0,5N trên bếp cách thủy điều nhiệt ở 800C đến khi dịch chiết âm tính với thuốc thử phenol-sulfuric [12]. - Kết tủa hoàn toàn polysaccharid bằng ethanol 960. - Siêu ly tâm để thu được tủa. - Rửa tủa nhiều lần bằng ethanol 800 và nước. - Cô quay trong chân không thu được cao polysaccharid toàn phần [6]. - Tiến hành khảo sát nồng độ pha loãng của cao dựa trên các điều kiện đo và số liệu đo. Tỷ lệ pha loãng cao phù hợp là n=5000
21 3.2.1.2. Phương pháp định lượng Chúng tôi lựa chọn phương pháp định lượng β-glucan bằng quang phổ UV-VIS vì phương pháp này thích hợp để định lượng mẫu mà hàm lượng chất phân tích thấp, cho kết quả chính xác, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của Khoa. Sau khi tham khảo tài liệu và khảo sát sơ bộ, chúng tôi tiến hành thực hiện phân tích định lượng bằng phương pháp Dubois - đo mật độ quang dựa trên phản ứng tạo màu với phenol- acid sulphuric, dùng D-Glucose làm chất chuẩn [23]. Khảo sát điều kiện đo: Sau khi tiến hành thực nghiệm tại Khoa Dược, chúng tôi thực hiện ở điều kiện đo như sau: Chất tạo màu: dung dịch phenol 5% Tỷ lệ các chất: cho 1ml dung dịch chất phân tích (đã pha loãng), 1ml phenol 5%, 5ml H2SO4 đậm đặc. Thực hiện phản ứng: cho vào cốc nước sôi 2 phút, làm lạnh và ổn định ở nhiệt độ phòng 45 phút. 3.2.1.3. Xây dựng đường chuẩn Sau khi khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, chúng tôi tiến hành thiết lập dãy nồng độ chuẩn như sau: Cân chính xác 0,1000g D-glucose chuẩn hòa tan và định mức bằng nước cất thành 100ml, được dung dịch D-glucose 1mg/ml (1000µg/ml). Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành các dung dịch có nồng độ 30; 45; 60; 75; 90; 105µg/ml. Mỗi mẫu lấy 1ml, thêm 1ml dung dịch phenol 5% và 5ml dung dich H2SO4 đậm đặc, lắc đều. Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
22 Tiến hành quét phổ dung dịch ở nồng độ 55µg/ml từ bước sóng 600nm đến 400nm, thu được phổ đồ hấp thụ trong hình :
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch D-glucose chuẩn-pp phenol sulfuric Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose PP phenol-sulfuric Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ (A) 1 30 0,2546 2 45 0,3776 3 60 0,4986 4 75 0,6246 5 90 0,7396 6 105 0,8646 Phương trình hồi qui: y= 0,0081x + 0,012 R=0,9999 STT
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml)
23 Vậy :
- Đã xác định được cực đại hấp thụ của chất cần phân tích là ở 490nm. -
Đã xây dựng được phương trình hồi qui trong khoảng nồng độ: 30-
105µg/ml đối với phương pháp định lượng. 3.2.2. Thẩm định phương pháp 3.2.2.1. Tính chọn lọc: Tiến hành phản ứng và quét phổ 4 mẫu dung dịch sau: - Mẫu 1: NaOH 0,5N, tạo màu. - Mẫu 2: dịch chiết từ Bạch phục linh. - Mẫu 3: dung dịch D-glucose chuẩn, tạo màu. - Mẫu 4: dịch chiết từ Bạch phục linh, tạo màu.
Mẫu 1
Mẫu 2
Hình 3.5. Phổ đồ UV mẫu trắng
Hình 3.6. Phổ đồ UV mẫu dịch chiết Bạch phục linh không tạo màu
Mẫu 3
Mẫu 4
Hình 3.7. Phổ đồ UV của dung
Hình 3.8. Phổ đồ UV của mẫu dịch
dịch D-glucose chuẩn có tạo màu
chiết Bạch phục linh có tạo màu
24 Nhận xét: mẫu trắng và mẫu dịch chiết Bạch phục linh chưa tạo màu không có cực đại hấp thụ tại 490 nm, trong khi đó mẫu dung dịch chuẩn và mẫu dịch chiết Bạch phục linh đã tạo màu đều có cực đại hấp thụ tại 490 nm chứng tỏ bước sóng 490 nm đặc trưng riêng cho chất cần phân tích, tương tự với kết quả nghiên cứu của tài liệu [16]. Vậy phương pháp có tính chọn lọc cao. 3.2.2.2. Tính tuyến tính: Với các dung dịch chuẩn D-glucose có nồng độ khác nhau trong khoảng từ 30 đến 105 μg/ml, thực hiện phản ứng màu và đo mật độ quang ở bước sóng 490nm, nhận thấy rằng trong khoảng nồng độ từ 30 đến 105μg/ml có sự phụ thuộc tuyến tính của mật độ quang vào nồng độ dung dịch. Ta có phương trình hồi quy tuyến tính trong khoảng nồng độ này: y = 0,0081x + 0,012 với hệ số tương quan R2=0,9999.
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml) 3.2.2.3.Đ ộ chính xác: Chuẩn bị 6 mẫu dung dịch chất thử và tiến hành tạo màu, quét phổ, đo quang. Tính RSD% nồng độ tìm lại.
25 Bảng 3.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp Mẫu đo
Độ hấp thu
Hàm lượng (%)
1
0,2139
100,40
2
0,2121
99,50
3
0,2130
99,95
4
0,2131
100
5
0,2139
100,40
6
0,2125
100,70
Trung bình: 100,16% RSD = 0,43% Độ chính xác nằm trong giới hạn cho phép. 3.2.2.4.Độ đúng: Cho vào dung dịch mẫu thử một lượng chất chuẩn là 20µg/ml, tiến hành phân tích hàm lượng polysaccharide trong 6 mẫu dung dịch chất thử có thêm chuẩn, kết quả được trình bày như sau: Bảng 3.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp Lượng mẫu
Lượng chuẩn
Lượng tìm thấy
Tỷ lệ phục
(µg)
thêm vào (µg)
(µg)
hồi (%)
1
26,2
20
19,9
99,5
2
26,2
20
19,4
97,0
3
26,2
20
19,3
96,5
4
26,2
20
19,7
98,5
5
26,2
20
19,3
95,0
6
26,2
20
20,2
101,0
Mẫu đo
Trung bình
98,33
RSD (%)
1,7
26 Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng cao (tỷ lệ phục hồi là 98,33%) với RSD là 1,8%, phù hợp với yêu cầu chung về đánh giá độ đúng trong phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất trong dược liệu. 3.2.2.5.Giới hạn định lượng(LOQ): Chuẩn bị dãy các dung dịch có nồng độ thấp dần 40, 30, 20, 10 µg/ml chất chuẩn D-glucose. Mỗi nồng độ tiến hành làm 6 lần song song. Tạo màu và tiến hành đo quang. Tính RSD% nồng độ tìm lại. -Nhận xét: Kết quả cho thấy ở nồng độ 20 µg/ml phổ đồ vẫn có cực đại hấp thụ tại 490nm với mật độ quang A gấp hơn 10 lần so với mẫu trắng, có độ chính xác cao (RSD(%) ≤ 2%). Ở nồng độ 10µg/ml, mật độ quang rất thấp, RSD > 2%. Vậy LOQ = 20µg/ml. 3.2.3 Áp dụng phương pháp đã xây dựng định lượng β –Glucan trong các mẫu Bạch phục linh Sau khi xây dựng phương pháp, chúng tôi áp dụng định lượng hoạt chất β-glucan trong các mẫu dược liệu Bạch phục linh , kết quả được trình bày trong bảng : Bảng 3.5. Kết quả định lượng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh phân phối tại Thành Phố Huế STT của mẫu
Lượng
Lượng cao
Hàm lượng β-
(phụ lục)
dược liệu
polysaccharide (%)
glucan (%) (so với
(g)
(so với dược liệu khô)
dược liệu khô)
2
5
24,32
3,62
3
5
27,73
7,87
4
5
35,47
9,02
5
5
23,05
9,53
9
5
7,46
1,40
11
5
12,94
1,32
27 13
5
25,62
3,99
14
5
30,76
9,05
15
5
22,15
2,99
17
5
27,18
9,04
18
5
26,17
4,04
21
5
27,35
22
5
19,28
4,46
23
5
31,56
9,12
24
5
30,52
9,32
25
5
22,12
5,36
26
5
28,89
9,05
27
5
18,46
3,31
28
5
19,96
3,37
29
5
26,01
9,05
30
5
24,56
4,45
31
5
25,22
9,25
32
5
32,40
8,34
34
5
19,26
3,37
35
5
27,36
9,31
40
5
23,29
3,78
42
5
27,98
6,01
43
5
35,78
9,66
44
5
18,45
3,12
45
5
23,05
5,56
46
5
28,86
9,11
47
5
31,49
9,27
48
5
21,92
5,01
49
5
42,56
9,32
3,84
28 50
5
22,86
4,44
53
5
36,01
9,38
56
5
21,37
3,46
57
5
24,13
6,42
58
5
28,96
9,12
59
5
21,26
5,32
60
5
25,13
6,67
61
5
33,89
9,11
62
5
9,32
2,32
63
5
28,82
6,37
65
5
25,89
7,82
66
5
13,48
1,72
67
5
36,72
9,13
68
5
25,15
4,95
69
5
32,36
9,45
70
5
18,76
5,52
71
5
32,46
9,29
72
5
40,18
8,59
73
5
45,52
9,47
75
5
25,56
7,56
76
5
27,18
9,36
77
5
25,15
9,12
Nhận xét: - Hàm lượng β-glucan của các mẫu đem khảo sát có sự chênh lệch lớn (từ 1,32-9,66%) - Hàm lượng β-glucan trung bình của tất cả các mẫu được định lượng là 6,59%.
29 Hàm lượng β-glucan trung bình của các mẫu dạng phiến hình khối vuông dẹt (phụ lục) là 6,09%. Hàm lượng β-glucan trung bình trong các mẫu dạng hình khối lớn và phiến lát mỏng (phụ lục) là 8,12%. - So sánh giá trị trung bình của hàm lượng β-glucan của các mẫu Bạch phục linh dạng phiến hình khối vuông dẹt so với 2 dạng hình khối và phiến lát mỏng bằng test t: Ta có t= 2,58>2,01 cho thấy có sự khác biệt giữa giá trị trung bình hàm lượng β-glucan trong Bạch phục linh ở các dạng trên. Nói cách khác,hàm lượng β-glucan trung bình trong 2 dạng hình khối và phiến lát mỏng là 8,12% lớn hơn dạng phiến hình khối vuông dẹt là 6,09% . - Có khoảng 41,07 % trong tổng số 56 mẫu dược liệu đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo tài liệu. [25] Kết luận chung: sau khảo sát 77 mẫu dược liệu thì có 23 mẫu dược liệu đạt tiêu chuẩn về Dược Điển Việt nam IV [3] và tiêu chuẩn về hàm lượng hoạt chất β-glucan [25], chiếm tỷ lệ 29,87%.
30
Chương 4 BÀN LUẬN ơ
4.1. VỀ VIỆC THIẾT KẾ MẪU Quy trình thiết kế mẫu phải được tiến hành theo các giai đoạn sau đây: - Xác định chính xác quần thể đích là quần thể mà từ đó chọn mẫu. Mẫu được chọn để điều tra sẽ đại diện cho quần thể đó. - Xác định độ chính xác mong muốn (sai số chọn) để tính cỡ mẫu. - Tính kích thước cỡ mẫu (nhỏ nhất hợp lý) để đạt được sự chính xác nói trên [4]. 4.1.1. Phương pháp thu mẫu Thành phố Huế có 27 phường với khoảng 100 nhà thuốc Bắc và cơ sở khám chữ bệnh bằng YHCT [24]. Trong quá trình khảo sát tôi nhận thấy rằng: - Các nhà thuốc đông y cũng như cơ sở khám chữa bệnh bằng YHCT tập trung ở một số phường nhất định chứ không phân bố đồng đều giữa các phường trong toàn thành phố nên việc thu mẫu với số lượng tương đương ở mỗi phường là không hợp lý. Vì vậy chúng tôi tiến hành chọn mẫu theo phương pháp mẫu xác suất tỷ lệ với kích thước và phương pháp mẫu ngẫu nhiên đơn để đảm bảo tính đại diện cho quần thể. - Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu ở hai thời điểm khác nhau (cách nhau 6 tháng) với mục tiêu: khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện thời tiết (nhiệt độ và độ ẩm) đối với chất lượng của Bạch phục linh trong quá trình bảo quản tại các địa điểm được thu mẫu. 4.1.2. Xác định độ chính xác mong muốn (sai số chọn) để tính cỡ mẫu Về xác suất sai sót, thông thường một nghiên cứu chấp nhận sai sót loại I khoảng 1% hay 5% (tức e=0,01 hay 0,05), và xác suất sai sót loại II (e=0,08 hay 0,09); khi e>0,1 thì cỡ mẫu không đạt cho nghiên cứu [9].
31 Trong đề tài tôi chọn e=0,08 nằm trong xác suất sai sót loại II nên cỡ mẫu phù hợp cho nghiên cứu. 4.1.3.Tính kích thước cỡ mẫu (nhỏ nhất hợp lý) để đạt được độ chính xác nói trên
Cỡ mẫu được tính dựa vào sự khác biệt giữa số đo của mẫu và tham số của quần thể theo công thức: n=
z 2 . p (1 − p) e2
Trong đó: z là độ tin cậy 95% =1,96; p là tỷ lệ ước đoán của một nghiên cứu trước đó, p=0,15 (với tỷ lệ Bạch phục linh không đạt tiêu chuẩn là 15% [20]); e là mức chính xác mong muốn =0,08. Theo công thức, tôi tính được cỡ mẫu: n = 77 Do thời gian nghiên cứu ngắn và kinh phí thực hiện đề tài còn hạn hẹp nên tôi lấy cỡ mẫu nhỏ nhất là 77 mẫu để đạt được độ chính xác mong muốn. 4.2. VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Trước tiên chúng tôi tiến hành xác định chất lượng của Bạch phục linh theo các tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV : + Đây là tiêu chuẩn cơ bản mà mỗi thuốc lưu thông trên thị trường cần phải có. + Các tiêu chuẩn của kiểm tra chất lượng dược liệu Bạch phục linh bao gồm soi bột, định tính, xác định độ ẩm, tỷ lệ vụn nát , tỷ lệ tạp chất.[3] + Vì các tạp chất để làm giả Bạch phục linh thường không thể phát hiện bằng mắt thường nên chúng tôi tiến hành các bước định tính tạp chất theo các chuyên luận riêng trong Dược Điển Việt Nam IV, một số các tạp chất thông thường dùng làm giả Bạch phục linh như các loại tinh bột, calci carbonat...[2], [5] - Trong quá trình tìm hiểu chúng tôi nhận thấy rằng Bạch phục linh thường được làm giả tinh vi bằng cách trộn một ít bột vụn của Bạch phục linh
32 với các chất giả mạo rồi đem dập thành phiến hình khối vuông dẹt (cách sơ chế thông thường của nấm Bạch linh). Vì vậy việc định tính hay soi bột khó có thể xác định chính xác chất lượng thực sự của Bạch phục linh. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành xây dựng quy trình định lượng hoạt chất chính là polysacchride dạng β-glucan trong Bạch phục linh. 4.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG β-GLUCAN - Hiện nay trên thị trường Việt Nam Bạch phục linh hầu hết vẫn được
nhập từ Trung Quốc nên chất lượng khó đảm bảo, thực tế đã cho thấy Bạch phục linh được làm giả mạo rất tinh vi nên việc sử dụng các bước định tính thông thường trong Dược Điển Việt Nam IV để tiêu chuẩn hóa dược liệu này trở nên khó khăn hơn. - Yêu cầu hiện nay cần phải xây dựng một quy trình xác định hàm
lượng các hoạt chất chiếm tỷ lệ và hoạt tính sinh học cao trong Bạch phục linh để làm cơ sở cho các hoạt động kiểm tra chất lượng Bạch phục linh được tốt hơn.Vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng hàm lượng polysaccharde dạng β-glucan trong Bạch phục linh. Từ đó áp dụng định lượng cho các mẫu Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế. 4.3.1 Mẫu đinh lượng: - Vì Bạch phục linh trên thị trường khó đảm bảo chất lượng, để tránh trường hợp định lượng các mẫu dược liệu hoàn toàn không có khả năng dùng làm thuốc gây hao tổn về công sức, hóa chất, thiết bị, chúng tôi chỉ tiến hành định lượng trên các mẫu dược liệu đã đạt các tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV. - Qua quá trình thực hiện các bước kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược Điển chúng tôi tiến hành định lượng trên 56 mẫu dược liệu trong tông số 77 mẫu . 4.3.2. Xử lý mẫu, chiết xuất dược liệu: - Dược liệu Bạch phục linh dưới dạng phiến hoặc dạng miếng phải được giã nhỏ thành bột để đảm bảo hiệu suất cho quá trình chiết xuất.
33 - Lựa chọn dung môi chiết xuất: polysaccaride dạng β-glucan trong
Bạch phục linh tan được trong một số dung môi như dung dịch kiềm, Cadoxen, dung dịch ethylendiamin bão hòa trong cadmium oxyd [16]. Qua nghiên cứu các tài liệu chúng tôi tiến hành lựa chọn dung môi chiết xuất là NaOH 0,1N, đây là loại dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không gây độc hại. - Phương pháp chiết xuất: + Qua tìm hiểu tài liệu cũng như tiến hành nghiên cứu chúng tôi thấy rằng sử dụng phương pháp chiết nóng đem lại hiệu suất cao, thời gian chiết ngắn.[10] + Để đảm bảo hiệu suất chiết xuất cao, chúng tôi tiến hành chiết nhiều lần bằng dung môi, trong quá trình chiết xuất chúng tôi tiến hành lấy dịch chiết để định tính với thuốc thử, chỉ khi dịch chiết âm tính với thuốc thử mới dừng chiết, bỏ bã dược liệu và gộp các dịch chiết lại. Quá trình chiết này đã loại được các chất béo trong dược liệu, triterpenoid... + Tiến hành cô dịch chiết thu được rồi cho kết tủa hoạt chất bằng cồn 96o, rồi rửa lại nhiều lần bằng cồn 80o thu được cao dược liệu, cao dược liệu này chứa hầu hết polysacchride dạng β-glucan , ngoài ra còn một số tạp chất cũng bị kết tủa trong cồn như các polyphenol... 4.3.3. Điều kiện định lượng Các điều kiện thực hiện phản ứng màu được đưa ra: thuốc thử, khảo sát nồng độ thuốc thử, thời gian phản ứng, điều kiện phản ứng. Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tạo màu phenol-sulfuric sau khi tham khảo về các tài liệu định lượng polysacchride [10],[18]. Đây là phương pháp định lượng đã được sử dụng từ lâu nên có độ tin cậy cao. Điều kiện đo thực nghiệm trên mẫu theo tài liệu [13], [18]. Kết quả, điều kiện đo ở tài liệu [13] có thể thực hiện được trên mẫu của đề tài, nhưng
34 có sự thay đổi, đó là tăng thời gian ổn định mẫu lên 45 phút (tài liệu [13] là 30 phút), vì sau 30 phút dung dịch vẫn còn ấm, độ hấp thụ chưa thật ổn định. 4.3.4. Thẩm định phương pháp Để đảm bảo phương pháp phân tích định lượng cho ra những kết quả chính xác thì phép định lượng cần được thẩm định theo quy định chung về thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS với các tiêu chí sau: Tính chọn lọc: Phổ đồ hấp thụ mẫu chuẩn và mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu có cực đại tại 490 nm, phổ đồ của mẫu trắng và mẫu dịch chiết Bạch phục linh chưa tạo màu không có cực đại hấp thụ nào trong vùng bức xạ 600400nm. Kết quả cho thấy phương pháp có tính chọn lọc cao. Khoảng nồng độ tuyến tính Mối tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ là chặt chẽ trong khoảng nồng độ 30-105 µg/ml với hệ số tương quan là 0,9999 (lớn hơn 0,995) đáp ứng yêu cầu phân tích. Đường chuẩn xây dựng từ 30µg/ml đến 105µg/ml là đáp ứng với yêu cầu thực tế khi định lượng polysaccharide dạng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh. Độ chính xác Kết quả khảo sát cho độ chính xác cao với độ lặp lại đại diện bởi độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) là 0,43% (nhỏ hơn 2%). Độ đúng Độ đúng được biểu thị phần trăm tìm lại trung bình của lượng chuẩn thêm vào đạt từ 98,33% (nằm trong khoảng 95 đến 105%), đáp ứng yêu cầu độ đúng trong phân tích định lượng. 4.4. VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.4.1. Kiểm tra chất lượng theo Dược Điển Việt Nam IV Soi bột: Có 4/77 mẫu không đạt tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV. Khi soi bột 4 mẫu dược liệu này phát hiện các sợi nấm có kích thước và
35 hình dạng khác biệt so với mô tả sợi nấm của dược liệu Bạch phục linh. Ví dụ như mẫu số 6 khi soi bột thấy một số sợi nấm dạng hạt khá nhỏ và có kích thước khá đều nhau (khác với tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV).
Hình 4.1. Hình ảnh soi bột mẫu 6 Nhận xét: Dựa vào đặc điểm của hình ảnh soi bột cũng như kết quả định tính phát hiện tinh bột của một số mẫu trong số các mẫu không đạt tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV về soi bột, có thể kết luận các mẫu này có chứa tinh bột trong thành phần. Định tính, xác định tạp chất: - Sau khi tiến hành định tính xác định sự có mặt của tinh bột bằng dung dịch iod đối với 77 mẩu kết quả cho thấy chỉ có 2 mẫu có trộn lẫn tinh bột, tỷ lệ là khá thấp. Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu trước đó của của Vụ Y Dược cổ truyền vào năm 2012.[2] - Qua quá trình tìm hiểu, chúng tôi biết được trước đây dược liệu Bạch phục linh đến 80% được làm giả bằng calci carbonat [2],[5] nên đã tiến hành định tính xác định sự có mặt của calci carbonat trong Dược liệu. Kết quả chỉ có 2 mẫu dược liệu xác định có chứa calci carbonat. Kết quả này cho thấy tỷ lệ làm giả dược liệu bằng cách trộn calci carbonat trên địa bàn thành phố Huế là thấp. So sánh chất lượng dược liệu được thu vào hai thời điểm khác nhau (tháng 9/2013 và tháng 3/2014) Kết quả thử bằng test thống kê χ2 cho thấy không có sự ảnh hưởng của điều kiện thời tiết (nhiệt độ và độ ẩm) đối với chất lượng của Bạch phục linh trong quá trình bảo quản tại các địa điểm được thu mẫu.
36 4.4.2. Kết quả định lượng β-glucan trong Bach phục linh: - Kết quả cho thấy rằng hàm lượng hoạt chất β-glucan trong các mẫu dược liệu thu được tại thành phố Huế chênh lệch khá lớn, từ 1,32-9,66%. - Theo tài liệu thì hàm lượng β-glucan trong Bạch phục linh chiếm khoảng 9% trọng lượng khô của Dược liệu [23].Vậy chỉ có khoảng 41,07% trong tổng số 56 mẫu dược liệu đạt tiêu chuẩn về hàm lượng này. - Điều này có thể được lý giải vì : + Người ta làm giả dược liệu Bạch phục linh bằng cách trộn một ít bột vụn dược liệu này với lượng lớn các tạp chất khác. Vì vậy, mặc dù đảm bảo được các tiêu chuẩn Dược Điển nhưng hàm lượng hoạt chất trong các mẫu này vẫn rất thấp. + Dược liệu được thu mua từ Trung Quốc nên dược liệu có thể xuất phát từ nhiều nơi khác nhau, với điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết khác nhau nên cũng ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất trong dược liệu. - Trong quá trình thu mẫu dược liệu chúng tôi nhận thấy rằng dược liệu được sơ chế thành nhiều dạng khác nhau (từ thể nấm ban đầu), gồm 3 dạng: dạng phiến hình khối vuông dẹt (dạng thông thường), dạng phiến lát mỏng, dạng khối lớn.
A
B Hình 4.2. Các dạng sơ chế Bạch phục linh A: Dạng phiến lát mỏng; B: Dạng khối lớn; C: Dạng phiến hình khối vuông dẹt
C
37 Tiến hành so sánh giá trị trung bình của hàm lượng β-glucan của các mẫu Bạch phục linh dạng phiến hình khối vuông dẹt so với 2 dạng hình khối lớn và phiến lát mỏng. Chúng tôi thấy rằng hàm lượng β-glucan trung bình của các mẫu dược liệu dạng hình khối vuông dẹt thấp hơn so với 2 dạng còn lại. Điều này có thể được lý giải như sau : qua quá trình tìm hiểu ở các địa điểm thu mẫu, chúng tôi biết được rằng một số cơ sở YHCT không thu mua dược liệu Bạch phục linh đã sơ chế sẵn từ Trung Quốc, thông thường ở dạng phiến hình khối vuông dẹt mà chỉ thu mua thể nấm nguyên vẹn , sau đó tự sơ chế thành các dạng khác nhau như dạng phiến lát mỏng hoặc dạng khối lớn (quá trình sơ chế dễ dàng hơn). Các cơ sở làm điều này để đảm bảo tránh mua phải dược liệu giả, kém chất lượng từ Trung Quốc. Vì vậy, chất lượng của các mẫu dược liệu này khá đảm bảo . Nhận xét: Dược liệu sơ chế sẵn nhập từ Trung Quốc không đảm bảo về hàm lượng hoạt chất.
38
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua quá trình thực nghiệm, đề tài đã thu được những kết quả sau: 1. Đã kiểm tra chất lượng của Bạch phục linh theo tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV, kết quả là có 21/77 mẫu không đạt chiếm tỷ lệ 27,27%. Không có sự khác nhau giữa tỷ lệ mẫu đạt trong 2 đợt thu mẫu vào tháng 9/2013 và tháng 3/2014. 2. Đã xây dựng được quy trình và thẩm định phương pháp định lượng polysacchride dạng β-glucan trong Bạch phục linh: + Quy trình xử lý mẫu, chiết xuất: dược liệu làm mịn thành bột, chiết bằng NaOH 0,5N ở nhiệt độ 800C đến khi dịch chiết không hiện màu với thuốc thử phenol-sulfuric. Kết tủa hoạt chất bằng cồn 96o, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 800. + Xây dựng phương pháp định lượng β-glucan bằng quang phổ UVVIS với chất tạo màu là phenol-sulfuric. + Đã thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn định lượng. Kết quả cho thấy phương pháp đạt yêu cầu đối với phép phân tích định lượng. 3. Đã áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng β-glucan trong 56 mẫu dược liệu Bạch phục linh ,kết quả cho thấy: có 23/56 mẫu đạt tiêu chuẩn về nồng độ hàm lượng β-glucan (tỷ lệ 41,07%). Vậy có 23/77 mẫu đạt tiêu chuẩn về Dược Điển Việt nam IV và tiêu chuẩn về hàm lượng hoạt chất β-glucan, chiếm tỷ lệ 29,87%.
39 KIẾN NGHỊ Để có thể đánh giá thực trạng và quản lý chất lượng dược liệu Bạch phục linh, chúng tôi đề xuất một số vấn đề sau: - Tiếp tục kiểm tra chất lượng Bạch phục linh với số lượng mẫu lớn hơn để đánh giá toàn diện hơn. - Áp dụng phương pháp định lượng hoạt chất β-glucan trong Bạch phục linh đã xây dựng trong kiểm tra chất lượng đối với dược liệu Bạch phục linh - Khuyến nghị các cơ quan chức năng tăng cường kiểm tra giám sát thị trường thuốc đông y nhằm ngăn chặn việc lưu hành dược liệu kém chất lượng, giả mạo có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.
40
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bộ Y tế (2012), Chỉ thị số 03/CT-BYT ngày 24/2/2012 của Bộ Y tế về việc tăng cường quản lý cung ứng, sử dụng dược liệu, thuốc đông y, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khám chữa bệnh, chữa bện bằng y học cổ truyền. 2. Bộ Y tế (2012), Công văn số 6143/BYT-YDCT ngày 12/9/2012 về việc tăng cường quản lý chất lượng thuốc YHCT. 3. Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học. 4. Đinh Thanh Huề (2012), “Phương pháp điều tra trên mẫu”, Phương pháp dịch tễ học, Đại học Y Dược Huế, trang 66-89. 5. Nguyễn Đăng Lâm, Tạp chí Cây thuốc quý, số 216/2012, trang 18-19. 6. Đỗ Tất Lợi (2004), những cây thuốc và vị thuốc việt nam, Nhà xuất bản Y Học, trang 222-223. 7. Lê Thị Lan Phương, Lâm Ngọc Thọ, Nguyễn Ngọc Khôi (2010), Xây dựng quy trình định lượng polysaccharide trong cao mã đề bằng phương pháp đo quang, trang 147-149. 8. Trần Thị Vân Thi, Nguyễn Thị Hoài, Lê Trung Hiếu (2012), Chiết xuất, xác định hàm lượng, khảo sát tác dụng dược lý của phân đoạn polysaccharide từ nấm Linh chi (Ganoderma culidum) nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế,Tạp chí Dược học (Bộ Y tế),Tập 5, Số 433, Trang 18-23. 9. Nguyễn Văn Tuấn (2011), Phương pháp ước tính cỡ mẫu cho một nghiên cứu y học, trang 10-13. 10. Lê Thị Bích Vân (2010), Xây dựng quy trình định lượng glucose trong chế phẩm Linh chi , Luận văn tốt nghiệp, Đại học Y Dược Huế 2010. 11. Sở y tế tỉnh Bình Dương (2014), Thông báo số 213/SYT-QLD của tỉnh Bình Dương về kết quả kiểm tra chất lượng dược liệu, thuốc đông y, thuốc từ dược liệu và phương thức xử lý các tồn tại, trang 2-3.
41 Tài liệu Tiếng Anh 12. Ding Qiong, Zhang Lina (2000), Isolation and structural analysis of polysaccharides from poria cocos mycelia, The Chinese University of hong Kong,Hong Kong. 13. Dubois M. et al (1956), Colorimetric method for Determination of Sugars and Related Substances, Analysis Chemistry 28, pp.350 – 356. 14. Gaosong Jian, Savan Vathansan (2000), MALDI-MS and HPLC Quanlification of Water-Soluble β-glucan from Ten Barley Varieties, pp.3305-3310. 15. JL Riós (2011),Chemical constituents and pharmacological properties of poria cocos, University of Valencia, Spain, pp.24-25. 16. Lee Chen Kun (2011),
Determination on the contents of
pachymanin in Poria cocos (Schw.) Wolf ., Journal of Traditional Chinese Medicine, pp.61-63. 17. Meng Yunlian, Cai Lihua, Wu Huifeng, Zhang Lina (2007), Immunohistochemical Observation on the Anti-tumor Effect of the Pachyman Polysaccharides Modified by Chemical Technique, pp.67-69. 18. Qiong Ding, Lina Zhang, Xiaojuan Xu, Xufeng Zhang, Chi Wu (2000), Solution properties of pachyman from poria cocos mycelia in dimethyl sulfuxide, Wuhan University, China, pp.147-148. 19. The United States Pharmacopoeia 29 (2006), pp.1189-1190. 20.
U.S Departement of health and human services FDA, Center for
evaluation and research, Center for Veterinary medicine (2001), Guidance for industry Bioanalytical method validation. 21.
WHO (2000), Development of National policy on Traditional
Medicine, pp.36-41.
42 22.
Zha Sheng-lan, ZhaoRong-hua,Chen Dong,Wei Hua (2006),
Optimal Extracting of Pachyman from Poria cocos Peels,Yunan College of Traditional Chinese Medicine. Nguồn từ Internet 23. http://en.wikipedia.org/wiki/Polysaccharide (updated: 11/10/2013) 24. http://danhba.bacsi.com/category/nha-thuoc/location/thuathien-hue/ (updated: 5/3/2014) 25. http://www.howdor.com/extract/Poria-extract.asp (updated: 20/10/2013) 26. http://duoclieu.hup.edu.vn/?p=1094 (updated: 16/11/2013)
PHỤ LỤC
STT
Ngày thu mẫu
Dạng sơ chế của dược liệu
Nơi lấy mẫu (phường)
1
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
2
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
3
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
4
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
5
15/9/2013
Phiến lát mỏng
Kim Long
6
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Kim Long
7
29/9/2013
Phiến lát mỏng
Phú Cát
8
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
9
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
10
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
11
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
12
15/9/2012
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
13
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
14
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
15
15/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
16
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
17
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
18
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
19
15/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
20
15/9/2013
Phiến lát mỏng
Phường Đúc
21
30/9/2013
Phiến lát mỏng
Phường Đúc
22
15/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Phường Đúc
23
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Tây Lộc
24
30/9/2013
Phiến lát mỏng
Tây Lộc
25
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Lộc
26
15/9/2013
Hình khối lớn
Thuận Lộc
27
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Thành
28
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Thành
29
29/9/2013
Phiến lát mỏng
Thuận Thành
30
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Thành
31
15/9/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Trường An
32
15/9/2013
Hình khối lớn
Vĩnh Ninh
33
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
34
30/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
35
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
36
29/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
37
15/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Xuân Phú
38
15/9/2013
Phiến hình khối vuông dẹt
Xuân Phú
39
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
40
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
41
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
42
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
An Cựu
43
31/3/2014
Phiến lát mỏng
Kim Long
44
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Kim Long
45
3/3/2014
Phiến lát mỏng
Phú Cát
46
3/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
47
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
48
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
49
31/3/2014/
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
50
3/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
51
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
52
10/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
53
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hòa
54
3/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
55
3/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
56
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
57
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phú Hội
58
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phước Vĩnh
59
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phước Vĩnh
60
10/3/2014
Phiến lát mỏng
Phường Đúc
61
31/3/2014
Phiến lát mỏng
Phường Đúc
62
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Phường Đúc
63
31/3/2014
Phiến lát mỏng
Tây Lộc
64
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Tây Lộc
65
30/3/2014
Hình khối lớn
Thuận Lộc
66
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận lộc
67
10/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Thành
68
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Thành
69
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Thuận Thành
70
30/3/2014
Phiến lát mỏng
Thuận Thành
71
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Trường An
72
10/3/2014
Hình khối lớn
Vĩnh Ninh
73
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
74
31/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
75
3/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
76
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Vĩnh Ninh
77
30/3/2014
Phiến hình khối vuông dẹt
Xuân Phú
Lưu ý: • Từ 1-38: mẫu thu vào tháng 9/2013 • Từ 39-77: mẫu thu vào tháng 23/2014
