Identificació i quantificació de Brettanomyces bruxellensis en el celler

Identificació i quantificació de Brettanomyces bruxellensis en el celler i en laboratoris especialitzats

La necessitat d’un control microbiològic adient en enologia obliga a conèixer les diferents tècniques disponibles, les seves característiques i propietats, però també els seus límits. Quina tècnica ens convé més?

Carmen Berbegal, Isabel Pardo i Sergi Ferrer Enolab. Institut Universitari de Biotecnologia i Biomedicina (BioTecMed) Universitat de València A bans d’entrar en matèria, voldríem precisar algunes dades sobre els mètodes d’identificació i quantificació de Brettanomyces bruxellensis.

La importància de la taxonomia i dels conceptes

Com és sabut, la denominació Brettanomyces bruxellensis correspon a l’estat anamorf (o estat «imperfecte», o de reproducció asexual) de Dekkera bruxellensis, que és el seu teleomorf (o estat «perfecte», o de reproducció sexual); la combinació d’ambdós estats es denomina holomorf.

La taxonomia de fongs permet aquestes descripcions amb noms de gènere diferents en aquestes ocasions, i mantenir així les denominacions de Brettanomyces i Dekkera per a dos estats del mateix organisme. Doncs bé, la gran majoria de mètodes d’identificació i quantificació d’aquesta espècie no distingeixen entre estats anamorf i teleomorf, per la qual cosa encara que es parla genèricament de «Brettanomyces», en realitat estem volent dir «Brettanomyces/Dekkera» en aquest tipus d’assaigs. O dit d’una altra manera, estarem detectant, identificant i quantificant qualsevol dels dos estats d’aquest holomorf sense distinció entre ells. En algunes ocasions això no comporta cap problema i no té cap transcendència, però en altres pot proporcionar una informació incompleta que podria tenir un interès tecnològic, com per exemple, el cas esmenat per Antonio Palacios (vegeu dossier introductori), on indica que Dekkera és bastant més resistent al sulfurós que Brettanomyces,1 probablement degut a la seva major càrrega gènica i/o a la seva capacitat d’esporular. Per diferenciar entre Brettanomyces i Dekkera quan realment interessi, podríem recórrer a altres tipus d’anàlisi genèrica.

Convé fer una altra precisió important quan parlem no es té en compte aquesta realitat i es confonen els dels termes identificació, detecció, tipificació o quan conceptes. tificació: En altres ocasions és usual que es pretengui que dos I què passa amb la «viabilitat» d’un microorganisme?

Molts cops tendim a pensar que determinar, per independent del mètode, i res més lluny de la realitat. mètodes diferents donin el mateix resultat (per exemple, • Identificació correspon a quan descrivim un orga cultiu en placa i tinció amb blau de metilè o PCR quantinisme posantli nom de gènere i espècie. tativa), quan en realitat mesuren propietats diferents. • Detecció és quan som capaços de trobarlo en un En un altre ordre de coses, i cada cop més sovint, determinat hàbitat, independentment del seu estat es parla de les cèl·lules «viables no cultivables», també o nombre. Lògicament, una detecció implica una per Brettanomyces,2,3 i es fa referència en aquest cas identificació: no podem detectar Brettanomyces si a cèl·lules que mantenen la seva capacitat metabòlica no podem afirmar que és Brettanomyces. però que donen negatiu en proves de viabilitat i no • Tipificació fa referència a la distinció entre soques poden ser recuperades en plaques de cultiu. El perill d’una mateixa espècie. potencial d’aquestes cèl·lules, en aquest cas, és degut • Quantificació és determinar el nombre o concen a que poden mantenir encara la seva capacitat d’alterar tració d’un determinat organisme. el vi a pesar de no ser detectables ni quantificables com a cèl·lules «vives».

També convé recordar que cada mètode d’identifi Aclarits tots aquests aspectes, passem ara a tractar cació, detecció, tipificació o quantificació té les seves pròpiament el tema de la identificació i la quantificació característiques i propietats, així com els seus límits. de Brettanomyces bruxellensis en el celler i en laboratoris

exemple, la «viabilitat» d’un microorganisme ha de ser Mètodes de cultiu especialitzats.

Mètodes de detecció de B. bruxellensis

Si ho fem mitjançant el mètode clàssic de sembrar en Probablement tots coneixereu que existeix un conjunt placa i quantificar el nombre de colònies que apareixen, de medis de cultiu més o menys especialitzats per a tindrem un determinat biaix se la detecció i quantificació de gons el mètode i solució en la Brettanomyces, normalment que realitzem les dilucions, i, medis sòlids,315 però també molt més important, el medi i «Cada mètode líquids.13,1618 En algunes ocacondicions de cultiu on es sem bren les cèl·lules. d’identificació, sions, aquest creixement líquid es combina amb l’anàlisi En aquest cas estarem observant la seva qualitat de «cul detecció, tipificació d’etilfenols produïts en aquests medis com a sistema de detectivable», és a dir, la capacitat de les cèl·lules de cultivarse en o quantificació té les ció/comprovació, i de vegades s’incrementa la sensibilitat facimedis de laboratori i, per tant, de créixerhi formant colònies seves característiques, litant la detecció enzimàtica del 4etilfenol.19 Alguns d’ells són aïllades. Podem, però, determinar la propietats i límits.» «selectius» per a Brettanomyces (teòricament només creix «viabilitat», per exemple, des aquesta espècie), i d’altres prés de la tinció amb blau de «diferencials» (poden créixer metilè i de l’observació al mi altres organismes, encara que croscopi, on el que marcarà la diferència entre vives es poden diferenciar per alguna característica com el i mortes vindrà determinada per la capacitat de cada color de la colònia), però realment cap d’ells és realment cèl·lula de reduir aquest colorant; res a veure amb la perfecte, i permet que creixin totes les cèl·lules vives (o seva capacitat de créixer formant colònies sobre les cultivables) de Brettanomyces bruxellensis, i només les plaques. Molt semblant passarà amb d’altres colorants d’aquesta espècie. Per això és fàcil que es produeixin com la rodamina, per exemple. tants errors (falsos negatius o falsos positius) com biai

Podem utilitzar també mesures de la impedància xos importants. del medi, mesura també indirecta de la «viabilitat» o la En algun dels mètodes de cultiu s’utilitza, a més, un capacitat de les cèl·lules per a ser tenyides o no amb «enriquiment» molt útil per a recuperar cèl·lules malmecolorants com el iodur de propidi o d’altres. ses o debilitades quan venim de condicions restrictives

I molts altres mètodes alternatius, que com ja hem com és el vi (presència d’inhibidors com SO2, etanol, dit tenen cada un les seves propietats, avantatges i fenols, etc.), i que permet la recuperació de les cèl·lules inconvenients, però que mesuren propietats diferents i, per tant, el seu cultiu o detecció molecular. i, per tant, ens donaran una informació diferent. És im El problema és que, si enriquim el cultiu en una espèportant conèixer aquesta distinció, ja que freqüentment cie, alterem les quantitats i proporcions dels organismes

inicialment presents a la mostra. És a dir, si un mètode usa un enriquiment, no ens serveix per a quantificar la població inicial, encara que sí per detectar.

Una altra particularitat del mètodes de cultiu és el requisit d’un temps elevat per a obtenir resultats (típicament d’una a dues setmanes), pel que les demores en la presa de decisions suposen un inconvenient important quan parlem de processos industrials.

És cert, d’altra banda, que aquests mètodes requereixen poc equipament i no són difícils d’adaptar a les condicions dels laboratoris de la major part dels cellers (existeixen diferents empreses que comercialitzen els medis ja preparats llestos per ser utilitzats), però en molts casos els enòlegs prefereixen recórrer, per a més seguretat, a microbiòlegs experts que realitzen les anàlisis en laboratoris especialitzats.

Mètodes moleculars

Pel que fa als mètodes moleculars, tenen l’avantatge que són molt més ràpids que els de cultiu, permetent obtenir resultats en unes poques hores la major part d’ells. En moltes ocasions, es basen d’una o altra forma en la tècnica de PCR –sigles de polymerase chain reaction

(reacció en cadena de la polimerasa)–, per la qual cosa s’obté una resposta ràpida, molt específica, i que de vegades permet la quantificació.24,9,1114,18,2035

Un avantatge d’aquesta tècnica de PCR quantitativa (o qPCR) és que es pot realitzar fins i tot amb cèl·lules senceres, sense necessitat de cap tipus d’extracció.35 Això proporciona un avantatge econòmic, però també el fet de presentar un menor biaix en no dependre d’una extracció i quantificació del DNA, pas que sempre pot introduir un error addicional en el mètode.

La quantificació de Brettanomyces per mètodes moleculars, com la de qualsevol organisme del vi, presenta una dificultat important si pretenem ferla de forma correcta, donat la presència, com ja hem dit anteriorment, d’inhibidors naturalment presents com SO2, etanol, fenols, etc. Però hi ha molts altres compostos que s’afegeixen habitualment al vi com la bentonita, quitosan, cel·lulosa, alginat, xips, poliaspartat, DMDC, nutrients, cultius iniciadors, carbonat càlcic, àcids orgànics, etc., que a més, en moltes ocasions, contenen una gran quantitat d’impureses de tipus i concentració desconeguda. Això es tradueix, d’una banda, en que la diversitat i quantitat de substàncies inhibidores en els vins sigui elevada i, d’altra, la seva presència introdueix un factor

addicional de diversitat en la composició química dels sibilitat o capacitat discriminant, com les tècniques de vins segons si s’afegeixen uns o uns altres compostos i DGGE, RFLP, ITS, AFLP, etc.,13,21,30,36 de manera que en una quantitat o en una altra. pot servir, per exemple, per a tipificar soques dintre de

De fet podríem considerar que cada vi és diferent en l’espècie B. bruxellensis.37,38 D’aquesta manera es pot aquest sentit: apart de la seva variada composició inicial, conèixer si la mateixa soca és la que està present en vins els tractaments que suportarà cada vi en concret poden diferents o no dintre del mateix celler, o veure diferents ser molt diversos. Per tant, si les matrius de partida per sensibilitats de diferents soques amb un mateix tractaa l’anàlisi microbiològica són diferents per als diferents ment antimicrobià. vins, serà molt difícil l’estandardització, essent necessari preveure cada cas per separat i estudiar cada vi inde PCR quantitativa. Un altre avantatge de les tècniques pendentment i amb suficient cura. de PCR, especialment la PCR quantitativa, és que es pot

La presència d’aquests inhibidors esmentats anteri usar conjuntament amb compostos com el PMA (monoorment fa que les tècniques de PCR, com de les altres azida de propidi), que permeten solament l’amplificació metodologies moleculars resultin inhibides, moltes de les cèl·lules vives.15,20 Si es realitza un experiment per vegades, de forma parcial, la qual cosa repercuteix ne duplicat amb PMA i sense PMA (PMAqPCR), es pot gativament en la seva especificitat i eficàcia. determinar, respectivament, el nombre de cèl·lules vives cèl·lules totals, calculant per diferència les cèl·lules mortes. Mitjançant aquesta tècnica també es poden detectar Com interpretar els resultats les cèl·lules viables no cultivables.39 Les possibilitats que obre aquest tipus d’aproxima

Per tot això és molt complicat obtenir resultats quanti ció són moltes per controlar Brettanomyces i molts tatius que siguin representatius de quina és la quantitat altres microorganismes d’interès enològic. Podem, per exacta de microorganismes pre exemple, conèixer l’efectisents a la mostra original; fins i tot, vitat d’un tractament antisi realitzem «neteja» de les mostres microbià com una filtració, per eliminar o reduir la quantitat d’inhibidors (amb PVP o PVPP, «La LAMP és un mètode sulfitat, addició de quitosan, DMDC, etc. Es pot utilitzar BSA, etc.), usem patrons interns, realitzem nombroses dilucions i que amplifica el DNA per veure l’efectivitat d’una neteja i higienització de borèpliques, etc. No volem dir que no sigui possible realitzar una quanti de forma específica, tes, línia d’embotellament, etc. Podem veure si durant ficació de B. bruxellensis present en un vi mitjançant mètodes mo molt més ràpidament el procés de criança les po blacions de B. bruxellen leculars, igual que amb qualsevol altre microorganisme, sinó que fins i tot que la PCR.» sis, tant vives com mortes, augmenten, disminueixen o realment s’ha de realitzar d’una es mantenen estables, com manera molt curosa i amb tots els els afecta la microoxigenacontrols i garanties pertinents. Per ció o un trasbals, què passa tant és molt probable que les eficiències de la tècnica quan es mesclen vins amb diferents característiques i variïn segons les característiques del vi, com també els quantitats de microorganismes, comprovar si l’efecte de límits de detecció i quantificació de B. bruxellensis. l’addició d’un nutrient pot ser contraproduent en incenti

En vins més «fàcils» (menors quantitats d’inhibidors var el creixement d’aquests llevats alterants, entre altres com sulfurós, etanol, polifenols, etc.) podem obtenir situacions. unes respostes quantitatives de molt ampli rang, límits Amb tot, aquesta tècnica de determinació de la «viade sensibilitat més baixos, consistència i repetitivitat bilitat» amb PMA (o compostos semblants) presenta un més grans, etc., mentre que en vins «difícils» la situació determinat biaix, com totes. En aquest cas depèn de la serà totalment la contrària, podent ser molt complicat capacitat de les cèl·lules «mortes» de permetre l’entrada obtenir resultats fiables i realment quantitatius. A més, d’un compost fotosensible, com el PMA, mentre que les en aquests vins amb més inhibidors s’obtindrà més «vives» presenten una membrana menys permeable que fàcilment un resultat fals negatiu a conseqüència de la di no permet la penetració d’aquests colorants. Quan el ficultat d’aquests per a permetre l’amplificació de DNA. PMA es troba dintre de la cèl·lula i és tractat amb llum, Com cada vi presenta, doncs, unes característiques s’uneix al DNA i no permet que aquest sigui amplificat; diferents, no ens serveix tenir «una recta de calibrat» per d’aquesta manera, nomes serà amplificable el DNA que quantificar, sinó que cal referla i comprovarla pràctica estigui dintre de les cèl·lules «vives», ja que no ha penement en cada cas. trat en aquestes el colorant. Com veiem es tracta d’una reacció que depèn de la permeabilitat de la membrana Tècniques de PCR d’una cèl·lula, no exactament la seva «viabilitat». Si tenim en compte que el vi és un líquid hidroalcohòlic

De vegades, la tècnica de PCR s’usa conjuntament amb pH baix, podem entendre que la membrana d’una amb altres que li proporcionen més especificitat, sen cèl·lula que visqui en vi no pot tenir la mateixa funciona

litat, composició ni integritat que si estigués en un medi de cultiu, sense inhibidors i al seu pH òptim. És a dir, molt probablement la integritat de la membrana d’una cèl·lula viva al vi ja serà, de partida, menor que en medi laboratori, i serà més difícil de distingir amb aquests mètodes una cèl·lula «viva» d’una cèl·lula «morta».

Recordem, a més, que cada vi és diferent. Serà necessari, doncs, filar molt prim si pretenem treballar de forma quantitativa amb aquests mètodes, i ser sempre molt conscients de quin és el paràmetre que estem avaluant: penetrabilitat d’un colorant a través de la membrana, en aquest cas.

qPCR amb mRNA. Una altra forma d’avaluar la viabilitat amb qPCR és utilitzant mRNA com a molècula diana per a la seva quantificació,3,39 atès que s’estima que el mRNA és una molècula que té una vida molt curta i solament detectarà les cèl·lules «vives».

Tornem a la consideració de què és el que estem realment mesurant per determinar que una cèl·lula està «viva»; en aquest cas, és que posseeixi una determinada quantitat d’un mRNA concret que serveix com a diana. És una tècnica molt menys emprada que d’altres amb la mateixa finalitat.

LAMP. Una tècnica molecular molt interessant és la de l’amplificació isotèrmica mediada per bucle o llaç (coneguda per LAMP, de loopmediated isothermal amplification), que permet una amplificació isotèrmica del DNA. No requereix un equipament costós (només un bany o incubador a temperatura constant) i permet la detecció, identificació o, fins i tot, la quantificació d’un microorganisme concret.

Per algunes aplicacions, s’ha aconseguit adaptar a un sistema convencional com les tires reactives (com les utilitzades en proves de l’embaràs o algunes reaccions immunològiques), de fàcil ús i interpretació. En el cas de Brettanomyces ja existeixen diferents treballs utilitzant aquesta tècnica de LAMP, 3,13,4042 que també pot acoblarse a l’ús de PMA per a diferenciar viables, o utilitzar fins i tot cèl·lules senceres sense necessitat d’extreure DNA42 .

Altres tècniques. Moltes altres tècniques s’han descrit per a la detecció/identificació/quantificació de Brettanomyces/Dekkera com, per exemple, la hibridació Dotblot,22 la hibridació sobre filtre per a mostres d’aire,43 l’electroforesi en camp pulsant (PFGE),30 mètodes d’immunologia mitjançant ELISA,14 immunosensor electroquímic amperomètric,44 la hibridació in situ sobre filtre (FISH),13,4550 la citometria de flux (CF),2,13,47,49,5153 la citometria d’imatges microscòpiques,54 la seqüenciació massiva (NGS),55,56 xip electrònic d’hibridació (Enoxip)57 o biosensors de ressonància de plasmó de superfície localitzat.58

Ens calen tantes tècniques?

Les preguntes que sorgeixen de forma immediata són evidents: per a què tantes tècniques? Són totes necessàries? Quina és la millor? Puc usar alguna d’aquestes tècniques al celler? Evidentment cadascuna tindrà avantatges i inconvenients i, com passa en molts altres casos, no n’hi ha cap que sigui perfecta. No és il·lògic que ens plantegem aquestes preguntes, ans al contrari, i el mateix passarà amb qualsevol altre paràmetre enològic que es pretengui determinar.

Per exemple, de quantes maneres es pot estimar el grau alcohòlic d’un vi, de l’acidesa volàtil, el sulfurós o l’àcid màlic? Moltes, cada una amb les seves propietats, avantatges i inconvenients. I entre aquests mètodes (uns més ràpids, altres més barats, altres més exactes,...) alguns són considerats mètodes oficials i emprats com a referència. Però aquesta situació que està molt clara i reglamentada per a paràmetres fisicoquímics, no ho està per als microbiològics i la microbiologia és també en això la germana pobra dintre de l’enologia (vegeu requadre a pàgina següent).

La microbiologia, germana pobra de l’enologia?

El vi és probablement l’únic aliment que no està subjecte a una normativa microbiològica. És curiós que alguns additius i nutrients que s’afegeixen al vi sí que han de complir unes normes microbiològiques, però no el vi. Així, doncs, no existeixen mètodes ofi cials per a l’anàlisi microbiològica de vins i, per tant, cada laboratori usarà el que li resulti més convenient també per al Brettanomyces.

Aquesta situació no facilita precisament la universalització dels mètodes ni la comparativa interlaboratorial sinó que difi culta contrastar resultats o verifi car l’efi càcia de tractaments en diferents cellers. En la presència de Brettanomyces, el perill que comporta no es tracta d’un cas de toxicitat per una infecció alimentària, però sí d’un detriment de la qualitat del vi i, per tant, una depreciació i una pèrdua d’imatge i confiança del consumidor, i per això està totalment justificada la necessitat d’un control microbiològic adient. 

Per tant, tornant a la pregunta: quina tècnica hem d’emprar per detectar/quantificar Brettanomyces/Dekkera?

A més dels mitjans selectius/diferencials esmentats abans, la PCR quantitativa és potser una de les més utilitzades, i cada cop són més els laboratoris que comencen a conjuntarla amb l’ús de PMA per a la diferenciació de cèl·lules vives i mortes (i de viables no cultivables). Cada vegada es té més experiència amb elles i es treballa d’una manera més controlada. Tot i així, no ens hem d’oblidar que «la» qPCR per a Brettanomyces (i per a tots els organismes en realitat) no ho és exactament, sinó «les» qPCR, ja que existeixen nombroses variants, utilitzant, per exemple, diferents tipus de sondes: simples, TaqMan, Scorpions, Molecular Beacons, etc. (independentment dels noms divertits de les sondes, aquesta varietat introdueix un element addicional de manca d’homogeneïtat dels mètodes, tal com comentàvem anteriorment). Però repetim que, amb els seus pros i contres, són una bona elecció qualsevol d’elles. Citometria de flux

Una altra tècnica que va adquirint cada cop més difusió (encara que molt lentament com totes les tècniques microbiològiques que s’adopten en enologia) és la citometria de flux (CF). Un dels avantatges d’aquesta tècnica és que ens permet la detecció directa de cada una de les cèl·lules d’una població de desenes de milers d’elles i en poc temps, així com conèixer altres característiques d’aquests organismes al mateix temps. Per tant, poden donar un important valor afegit a la informació que obtenim en un sol experiment, i constitueix una alternativa cada vegada més interessant a la qPCR, permetent també detectar, identificar o quantificar.

Conclusions

En el nostre cas, però, i si haguéssim de decantarnos per una sola tècnica de detecció/quantificació de Brettanomyces/Dekkera, possiblement ho faríem per la tècnica de LAMP. És un mètode que amplifica el DNA de forma específica, molt més ràpidament fins i tot que la PCR, no necessita equipament complex ja que es realitza en condicions isotermes (un incubador, bany o bloc tèrmic senzill és suficient), pot ferse de forma quantitativa, es pot efectuar amb cèl·lules senceres o mínimament processades, es pot aplicar a mostos i vins tant blancs com negres, és de fàcil visualització i interpretació, i es pot detectar directament per terbolesa (quantificable o detectable a simple vista), es pot facilitar la seva lectura mitjançant l’ús de colorants convencionals o fluorescents, adaptarse a sistemes de detecció tan fàcils i coneguts com les tires reactives, detectarse per electroforesi o utilitzarse amb equipaments de qPCR convencionals.

Per tant és una tècnica amb una gran versatilitat (l’adopció d’aquesta metodologia en els cellers pot ser molt fàcil, encara que també en laboratoris més especialitzats i sofisticats), precisa de poca inversió i manteniment, i esperem que en un futur proper es pugui comercialitzar àmpliament, no només per a Brettanomyces bruxellensis, sinó per a una gamma molt més àmplia de microorganismes enològics. 

Bibliografia

Es pot consultar la bibliografia a www.acenologia.com