“paradosso” o opportunità clinica?

di Mario Damiano Toro, Roman Paduch

Tollerabilità sulla superficie oculare ed efficacia antisettica sui patogeni del segmento anteriore: “paradosso” o opportunità clinica?

Negli ultimi anni, l’emergenza sempre maggiore di ceppi batterici oculari resistenti agli antibiotici ha modificato l’approccio terapeutico alla profilassi pre e post-operatoria, alla gestione delle infezioni del segmento anteriore, e anche le stesse prospettive della ricerca farmacologica orientandole verso lo sviluppo di nuovi antimicrobici differenti dagli antibiotici, gli antisettici.1 Tra essi, l’olio ozonizzato in liposomi è una molecola che negli ultimi anni è stata oggetto di diversi studi sia in vitro che in vivo, e può vantare oggi una robusta letteratura scientifica a supporto del meccanismo di azione, dell’efficacia microbicida e dell’attività di riparazione tissutale; l’efficacia antimicrobica della molecola si basa sul suo elevato potenziale di ossidazione, tra i più potenti che si conoscano,2 che si manifesta clinicamente in un effetto multi-target su batteri, virus e funghi, che non permette la comparsa di resistenze batteriche.3 Paradossalmente, però, l’ozono, somministrato a dosi terapeutiche, promuove un adattamento dei tessuti allo stress ossidativo (una caratteristica chiamata “ormesi”) e svolge un’azione antiossidante indiretta attivando i meccanismi antiossidanti endogeni (superossido dismutasi, glutatione perossidasi, catalasi) coinvolti nello scavenging dei perossidi e dei radicali liberi dell’ossigeno.4,5 Questi meccanismi compensatori non possono essere indotti nelle cellule microbiche che quindi subiscono un danno selettivo. A dimostrazione della tollerabilità biologica dell’ozono, vi è l’impiego clinico anche su tessuti particolarmente suscettibili al danno tossico, come il sistema nervoso, senza evidenza di tossicità o effetti collaterali a carico delle cellule.6 Grazie alla collaborazione tra il Dipartimento di Oftalmologia e l’Istituto di Microbiologia e Biotecnologia dell’Università di Lublino, quest’ultimo diretto dal prof. Roman Paduch, microbiologo e referee di diverse riviste scientifiche nell’ambito della microbiologia, biologia molecolare, farmacologia, ed esperto nello studio dei meccanismi di morte cellulare e di valutazione di sostanze con effetto antiapoptotico, antiossidante e favorenti la riparazione tissutale, sono state valutate sia la tollerabilità su cellule corneali e congiuntivali umane, che l’efficacia antibatterica sui comuni patogeni, gram+ e gram-, che possono causare infezioni del segmento anteriore dell’occhio, di una formulazione oftalmica a base di olio ozonizzato in liposomi (Ozodrop). Secondo le linee guida internazionali del Comitato Europeo per i Test di Suscettibilità Antimicrobica (EUCAST), le sostanze che vengono testate nella loro azione antisettica devono essere preventivamente valutate, in condizioni similari di concentrazione, anche nella loro tollerabilità (assenza di tossicità) sulle cellule epiteliali. Solo dopo aver determinato la concentrazione non citotossica, essa sarà la concentrazione di partenza con cui fare i test sui batteri. La sola azione microbicida, senza

Figura 1. Effetto di Ozodrop sulla vitalità dell’epitelio corneale umano in vitro dopo 1 e 3 ore di incubazione. Figura 2. Effetto di Ozodrop sull’attività metabolica dell’epitelio corneale umano in vitro dopo 1 e 3 ore di incubazione.

il dato di tollerabilità nelle condizioni sperimentali, potrebbe voler dire che una soluzione risulta tossica sulle cellule epiteliali e non solo antimicrobica. Altro aspetto mandatorio nella valutazione di un antisettico è la determinazione dei parametri quantitativi (es. MIC, MMC). È necessario valutare questi parametri, secondo linee guida EUCAST, per definire la concentrazione utilizzabile ed efficace. Lo studio, dal titolo “Ozone-based Eye Drops Activity on Ocular Epithelial Cells and Potential Pathogens Infecting the Front of the Eye” è stato recentemente pubblicato sulla prestigiosa rivista Antioxidants7, ad elevato impact factor (IF 6.313) e qui ne proponiamo una descrizione di ampia fruizione.

Materiali e metodi

Per valutare la tollerabilità biologica del collirio a base di olio ozonizzato in liposomi sono state utilizzate cellule epiteliali corneali e congiuntivali umane. L’attività antimicrobica è stata testata su batteri comunemente presenti sulla superficie oculare e che possono causare infezioni del segmento anteriore, sia gram+, anche resistenti agli antibiotici (Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus meticillinoresistente, Staphylococcus epidermidis - la principale specie coagulasi negativa, CoNS), sia gram- (Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli) provenienti da linee cellulari standard (ATCC), che su funghi di provenienza clinica (Candida albicans). Ozodrop è stato testato a diluzioni comprese tra 1:200 e 1:6.7 della soluzione in commercio, diluizioni che comprendono pertanto un vasto range, che include sia concentrazioni anche molto inferiori rispetto a quelle che si verificano in vivo sull’occhio dopo instillazione (per valutare la potenza antisettica del collirio), sia diluizioni compatibili con la situazione in vivo.

Risultati

Tollerabilità sulla superficie oculare I risultati dello studio dimostrano che, anche per tempi di contatto prolungati e continuativi di Ozodrop con le cellule corneali e congiuntivali (fino a 3 ore), superiori a quelli che si verificano normalmente sulla superficie oculare dopo l’instillazione di una goccia di collirio, non si sono avuti fenomeni di tossicità o di alterazione della struttura cellulare né per le cellule corneali (Figura 1), né per quelle congiuntivali (Figura 3). Anche l’attività metabolica delle cellule della superficie oculare, parametro ancora più sensibile rispetto alla sola vitalità cellulare perché “anticipa” possibili effetti tossici, non viene alterata dalla somministrazione di Ozodrop (Figure 2 e 4, per cellule corneali e congiuntivali, rispettivamente). Lo scopo di introdurre un tempo di contatto di 1 e 3 ore rappresenta un “worst case” della situazione che si verifica in vivo, dato che il tempo di

Figura 3. Effetto di Ozodrop sulla vitalità dell’epitelio congiuntivale umano in vitro dopo 1 e 3 ore di incubazione. Fig. 4. Effetto di Ozodrop sull’attività metabolica dell’epitelio congiuntivale umano in vitro dopo 1 e 3 ore di incubazione.

Figura 5. MIC e MMC relative all’Ozodrop per i batteri testati. Abbreviazioni: MIC, Minima Concentrazione Inibente; MMC, Minima Concentrazione Microbicida; S. aureus, Staphylococcus aureus; S. epidermidis, Staphylococcus epidermidis; M. catarrhalis, Moraxella catarrhalis; P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa; E. coli, Escherichia coli; C. albicans, Candida albicans; MRSA, Staphylococcus aureus meticillino-resistente.

permanenza di un collirio sulla superficie oculare è limitato dal wash out lacrimale e dall’ammiccamento.

Attività antisettica (battericida e batteriostatica) Nello studio la quantificazione dell’attività antimicrobica del collirio a base di olio ozonizzato in liposomi è stata effettuata sia attraverso la valutazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC), ovvero la più bassa concentrazione di principio attivo in grado di inibire la crescita batterica visibile, sia attraverso la Minima Concentrazione Microbicida (MMC), ovvero la più bassa concentrazione in grado di uccidere i batteri; le valutazioni sono state effettuate su diversi batteri che possono essere causa di infezioni oculari, sia gram+ che gram-. La concentrazione dell’olio ozonizzato contenuta nell’Ozodrop (0.5%) è risultata da 80 a 156 volte più elevata della MIC, e da 40 ad 80 volte più elevata della MMC. I ceppi più sensibili all’Ozodrop sono Staphylococcus aureus, anche meticillino-resistente, e Candida albicans, con valori di MIC di 32 μg/ml. I valori di concentrazione che inibiscono la crescita di Staphylococcus epidermidis e dei gram- sono 2 volte più elevati, 62.5 μg/ml. I valori di MMC variano da 62.5 μg/ml per Staphylococcus aureus e Candida albicans, a 125 μg/ml per gli altri ceppi (Figura 5).

Azione antiossidante Lo studio ha dimostrato che in un certo range di concentrazioni, come quelle che si raggiungono sulla superficie oculare, il collirio a base di olio ozonizzato in liposomi manifesta un potente effetto antiossidante, che si traduce in un’azione citoprotettiva sulle cellule corneali e congiuntivali attraverso la modulazione del pathway NF-β/ Nrf2, che regola infiammazione e risposta allo stress ossidativo. L’olio ozonizzato liposomiale presenta pertanto attività antimicrobica su vari ceppi batterici, compresi quelli di Staphylococcus aureus resistenti agli antibiotici e su funghi come Candida albicans, senza effetti tossici sulle cellule corneali e congiuntivali anche in caso di contatto protratto per 3 ore consecutive. La sua azione antisettica può limitare lo sviluppo della microflora patogena dell’occhio che può causare infezioni del segmento anteriore. Il collirio manifesta anche una potente attività antiossidante in un range di concentrazione specifico, e quindi può essere utile per proteggere le cellule della superficie oculare.

Conclusioni

Nella nostra esperienza sperimentale, l’olio ozonizzato in liposomi, alle concentrazioni terapeutiche e per i tempi di contatto che si raggiungono sulla superficie oculare, è ottimamente tollerato dalle cellule corneali e congiuntivali, e può avere un effetto favorevole sul trofismo di queste cellule in quanto manifesta un’attività antiossidante (scavanger dei radicali liberi). Esso, inoltre, riduce lo sviluppo della microflora patogena che può causare infezioni del segmento anteriore dell’occhio. Ozodrop, per la sua attività antisettica ad ampio spettro e antiossidante, può rappresentare un utile supporto alle preparazioni standard nel trattamento e nella prevenzione delle patologie del segmento anteriore dell’occhio.

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