ESTRAZIONE DNA DA VEGETALI
PRINCIPIO DEL METODO Questa tecnica permette l’estrazione del DNA da alcuni vegetali, sfruttando la naturale composizione della membrana esterna e nucleare delle cellule; tale membrana è composta da sostanze grasse denominate fosfolipidi. Le membrane vengono demolite facendo uso di un semplice detersivo sgrassante per stoviglie. Una volta separato, l’acido nucleico, può essere precipitato facilmente usando etanolo freddo. Per favorire l’azione del detersivo, il campione deve essere precedentemente frammentato in maniera opportuna, ovvero preparando una poltiglia ed evitando l’eccessiva frantumazione delle cellule che comporterebbe l’isolamento di filamenti di DNA troppo corti, e quindi poco visibili. La soluzione estraente è composta da detersivo e da sale; quest’ultimo ha il compito di facilitare l’eliminazione delle proteine su cui è avvolto il DNA, ovvero gli istoni, (allo stesso scopo possono essere usati al termine del procedimento degli enzimi proteolitici, come la bromelina contenuta nel succo di ananas). In questa tecnica è molto importante Il controllo della temperatura, infatti la poltiglia viene portata ad una temperatura di 60°C allo scopo di disattivare alcuni enzimi che potrebbero degradare il DNA stesso. Bisogna aver cura, tuttavia, di non prolungare la permanenza del preparato a questa temperatura (max 15 minuti) per evitare che l’acido nucleico si degradi ugualmente per azione del calore. Il DNA è molto solubile in acqua, quindi non è visibile in soluzione, per evidenziarlo è sufficiente usare dell’alcol freddo che ne causa la precipitazione. La presenza di alcune bollicine sarà dovuta al fatto che i gas più solubili nel liquido freddo, tenderanno di liberarsi a temperatura ambiente. Dall’osservazione al microscopio vengono individuate strutture vagamente filamentose raggruppate in ammassi.
PROCEDIMENTO Preparare la soluzione di estrazione sciogliendo 2 g di cloruro di sodio in 90 ml di acqua e 10 ml di detersivo per stoviglie, mescolare evitando la formazione di bolle.
Ridurre in poltiglia il campione da trattare, pesarne successivamente 30 g e aggiungere una stessa quantitĂ di soluzione di estrazione.
Mescolare il tutto, e porre la beuta a b.m. per 15 minuti ad una temperatura di 60°C. Trascorso il tempo inserire il tutto in un bagno di ghiaccio per circa 5 minuti e mescolare.
Filtrare il tutto con carta da filtro rapida e lasciare riposare per altri 5 minuti. (Eventualmente per allontanare gli istoni aggiungere a 5 ml di preparato 1 ml di succo d’ananas lasciando agire per 2-3 minuti).
Aggiungere molto lentamente e lungo le pareti, per favorire la stratificazione, un egual volume di alcol freddo (precedentemente tenuto nel congelatore), lasciare riposare qualche minuto per consentire al DNA di precipitare e rendersi visibile.
La massa lattiginosa ottenuta viene prelevata con un’ansa e posta su un vetrino portaoggetti, quindi si aggiunge una goccia di colorante nucleare, come ad esempio il blu di metilene, si copre il tutto con un vetrino coprioggetti, e si osserva al microscopio.
Le immagini che seguono sono state acquisite con un semplice microscopio ottico; esse sono il risultato finale dell’esperienza condotta su campioni di frutta, nell’ambito delle esercitazioni del laboratorio di chimica organica, effettuata dagli alunni della classe 5^ sez. A chimica, dell’Istituto Tecnico Industriale “Pacinotti” di Taranto durante l’a.s. 2012/2013.
FILAMENTO DI DNA ESTRATTO DA UN CAMPIONE DI KIWI
FILAMENTO DI DNA ESTRATTO DA UN CAMPIONE DI BANANA
a cura della prof.ssa Stefania Galeandro