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Reagentes de degradação de enzimas efetivamente removem micotoxinas Desoxinivalenol e Zearalenona de sucos digestivos artificiais de suínos e aves

Ko-Hua Tso, Jyh-Cherng Ju, Yang-Kwang Fan and Hsin-I Chiang

As micotoxinas (MX) são metabólitos secun- Zearalenona (ZEA) [6]. Por sua vez, os inativadores dários tóxicos produzidas por vários fungos enzimáticos têm demonstrado ser a melhor opção filamentosos, principalmente Aspergillus, para o controle dessas micotoxinas [10, 11]. Até Fusarium e Penicillium [1]. Ao consumir alimentos hoje, não existe um método analítico simples e contaminados com micotoxinas, os animais sofrem prático que possa avaliar a capacidade de remouma série de efeitos tóxicos, tais como diminuição ção das micotoxinas in vivo, portanto, os métodos do consumo de alimentos, diminuição do ganho de de avaliação padrão são os ensaios in vitro. Apesar peso, diarreia, imunossupressão, vômitos, lesões disso, é importante que as condições do ensaio ulcerativas, etc. [2]. Dentre as principais estraté- in vitro sejam estritamente controladas para que gias para controle de micotoxinas, a mais utilizada possam ser bem semelhantes ao modelo in vivo, é o emprego dos aditivos antimicotoxinas no ali- de maneira que os resultados possam ser replicamento, nas fábricas de rações e nas granjas, para dos [12]. reduzir a concentração das micotoxinas. Outras No presente ensaio, diagramou-se um alternativas são a inativação térmica, irradiação e modelo in vitro semelhante às condições do trato diluição física [3]. gastrointestinal dos suínos (Sus scrofa), replicando Os aditivos antimicotoxinas são, atual- os tempos de permanência do alimento em cada mente, a estratégia mais eficaz para diminuir a uma das estruturas anatômicas (estômago e intesconcentração de micotoxinas no animal. Existem tino), os pHs de cada uma das estruturas, a temdois grandes grupos de aditivos antimicotoxinas: peratura, o tempo de permanência, a motilidade os sequestrantes e os inativadores enzimáticos. Os intestinal e a presença de enzimas digestivas prósequestrantes evitam a absorção das micotoxinas prias do animal. por meio do trato gastrointestinal, ligando-se à sua Dessa maneira, foi possível criar um superfície. Eles podem ser inorgânicos (Bentonitas, modelo que mimetiza, satisfatoriamente, in vitro, Aluminossilicatos, etc.) ou orgânicos (Parede de as condições in vivo do animal. As simulações in leveduras) [4,5]. Os inativadores enzimáticos pos- vitro foram realizadas imergindo o alimento consuem uma atividade biológica que permite alterar taminado com micotoxinas em suco gástrico artifia estrutura química das MX e transformá-la em cial (SGA) a um pH de 2,5 por 5 horas, ou em suco metabólitos, com efeito tóxico menor ou nulo. intestinal artificial (SAI) em pH de 6,5 por 2 horas, Normalmente, eles podem ser uma bactéria, uma mimetizando as condições do estômago e inteslevedura ou só um extrato enzimático [6]. tino, respectivamente. As MX classificam-se em polares e com menor polaridade, de acordo com sua estrutura química Tabela 1. Aditivos antimicotoxinas, dose recomendada e a [7]. As micotoxinas polares, tais como marca/empresa dos respectivos produtos utilizadosa Aflatoxina B1 e a Fumonisina B1, são as mais polares das micotoxinas e adsorvidas mais facilmente do que Aditivo Antimicotoxinas Dose (%) Marca/Empresa as apolares. Por sua vez, o peso mole- EDR1 0,05 Detoxa Plus® New/Dr. Bata® cular, a solubilidade, a capacidade de dissociação e as cargas iônicas tamEDR2 0,10 Detoxa Plus® /Dr. Bata bém desempenham um papel essen- EDR3 0,10 Micofix Plux®MTV/Biomin cial em sua capacidade de ser adsorvidas [8]. A Aflatoxina B1 tem maior EDR4 0,10 Toxi-free®/Liferainbow taxa de adsorção do que Fumonisina EDR5 0,20 MLI®/Henan Yi-Wan Zhong-Yuan B1; é por isso que Aflatoxina B1 é o Adsorvente 1 0,20 Calibrin-Z®/Amlan principal objetivo dos adsorventes [9]. Adsorvente 2 0,20 Minazel Plus®/Patent A maioria dos adsorventes Fonte: Adaptado de Ko-Hua Tso et al, 2019. EDR: Reagentes de tem demonstrada baixa e/ou nula degradação enzimática. *Produto em fase de desenvolvimento, não capacidade para adsorver micoto- está disponível para comercialização. xinas com menor polaridade, tais *EDR1 - Detoxa Plus® New/Dr. Bata – Produto em fase de desenvolcomo o Desoxinivalenol (DON) e a vimento, não está disponível para comercialização.

Tabela 2. Recomendações do LAMIC de limites máximos toleráveis de micotoxinas (μg/kg) em alimentos para suínos Suínos Micotoxinas

Fase de Criação DON ZEA

Inicial 200 10

Crescimento 200 50

Terminação 400 25

Matrizes 400 0

Fonte: https://www.lamic.ufsm.br/site/legislacoes/legislacao-brasil

Os aditivos antimicotoxinas avaliados, expostos na Tabela 1, foram selecionados de acordo com sua maior prevalência no mercado, sendo que as doses utilizadas nos testes foram sugeridas pelos fabricantes. O método utilizado para a avaliação foi o HPLC, por ser considerado o mais preciso para a avaliação das micotoxinas. A dose de desafio de DON utilizada no estudo foi de 1.000 ppb, e a dose de desafio de ZEA foi de 500 ppb [13], de acordo com as diretivas da China Hygienic Standard for Feed (GB130782017) e os regulamentos da FDA. Ambas as doses de micotoxinas utilizadas no ensaio ultrapassam os limites máximos toleráveis para a espécie (Tabela 2). Vale lembrar que a prevalência média de DON conforme E-book de Micotoxinas Vetanco (2019) foi de 14% das amostras positivas para esta micotoxina, sendo a concentração média encontrada nas amostras de 500 ppb. Dados do LAMIC (20102020) referentes a aproximadamente 11.500 amostras trazem menores prevalências (5%) e concentrações (95 ppb) desta mesma micotoxina.

Resultados

No Gráfico 1 pode ser observada a capacidade de inativação ou adsorção de DON em função do tempo ao longo do modelo in vitro do trato gastrointestinal dos suínos. Após a avaliação das 5 primeiras horas em um pH de 2,5 (equivalente ao estômago dos suínos), os percentuais de remoção de DON no nível de 1.000 ppb foram 92%, 79%, 52%, 35% e 56% para EDRs (1 a 5), respectivamente, e 12% e 13% para adsorvente 1 e adsorvente 2, respectivamente. Após 5h de simulação estomacal, todos os EDRs apresentaram maior capacidade de remoção de DON do que os dois adsorventes (p <0,05), e a capacidade de remoção de EDR1 foi maior que todos os outros EDRs (p <0,05), exceto EDR2, do qual não foi observada diferença significativa na capacidade de remoção entre os dois adsorventes. Para as condições simuladas do intestino delgado (pH de 6,5) por 2h, os percentuais de remoção de DON no nível de 1.000 ppb foram 100%, 84%, 83%, 54% e 68% para os EDRs (1 a 5), respectivamente, e 15% e 19% para os adsorventes 1 e 2, respectivamente (Gráfico 1). Na simulação do intestino delgado (após 2h) a um pH de 6,5, todos os EDRs apresentaram maior capacidade de remoção de DON do que os dois adsorventes (p <0,05), e a capacidade de remoção de EDR1 foi maior que todos os outros EDRs (p <0,05). Não houve diferença estatística entre EDR2 e EDR3, ambos melhores que EDR4 e EDR5 (p <0,05). Também não foi encontrada diferença significativa no percentual de remoção entre dois adsorventes (Gráfico 1). Vale lembrar que a prevalência média de ZEA conforme E-book de Micotoxinas Vetanco (2019) foi de 4% das amostras positivas para esta micotoxina, sendo a concentração média encontrada nas amostras de 72 ppb. Dados do LAMIC

Gráfico 1. Percentual de remoção do desoxinivalenol (DON) 1.000 ppb com reagentes de degradação enzimática (linha sólida) e adsorventes (linha pontilhada) em simulações gastrointestinais de suínos

Fonte: Ko-Hua Tso et al., 2019..u: EDR1 a 0,05%; „: EDR2 a 0,1%;: 0,1% de EDR3; ×: EDR4 a 0,1%; □: 0,2% de EDR5; ●: 0,2% adsorvente 1; +: 0,2% e adsorvente2. a, b, c sem os mesmos sobrescritos diferem (p <0,05). SGA: Suco gástrico artificial; SIA: Suco intestinal artificial; DON: Desoxinivalenol; EDR: Reagentes de degradação enzimática.

Gráfico 2. Percentual de remoção da Zearalenona (ZEA) 500 ppb com reagentes de degradação enzimática (linha sólida) e adsorventes (linha pontilhada) em simulações gastrointestinais de suínos

Fonte: Ko-Hua Tso et al., 2019.. u: EDR1 a 0,05%; „: EDR2 a 0,1%; : 0,1% de EDR3; ×: EDR4 a 0,1%; □: 0,2% de EDR5; ●: 0,2% adsorvente 1; +: 0,2% de adsorvente2. a, b, c sem os mesmos sobrescritos diferem (p <0,05). SGA: Suco gástrico artificial; SIA: Suco intestinal artificial; ZEA: Zearalenona; EDR: Reagentes de degradação enzimática.

(2010-2020) referentes a aproximadamente 17.000 amostras trazem maiores prevalências (75%) e concentrações menores (20 ppb) desta mesma micotoxina. Após a avaliação das 5 primeiras horas em um pH de 2,5 (equivalente ao estômago dos suínos), os percentuais de remoção de ZEA no nível de 500 ppb foram de 100%, 89%, 50%, 30% e 57% para EDRs (1 a 5) e 0% e 30% para os adsorventes 1 e 2, respectivamente (Gráfico 2). O percentual de remoção de ZEA do EDR1 foi melhor que EDR2, que, por sua vez, foi maior que todos os demais do EDRs e adsorventes (p <0,05). Na simulação do intestino delgado (após 2h) a um pH de 6,5, os percentuais de remoção de ZEA a 500 ppb foram de 100%, 100%, 74%, 65%, e 68% para EDRs (1 a 5), respectivamente, e 0% e 36% para os adsorventes 1 e 2, respectivamente (Gráfico 2). Após 2h de simulação do intestino delgado, apenas o EDR1 e o EDR2 apresentaram 100% de remoção de ZEA (p <0,05).

Discussão

Foi possível observar como Detoxa Plus® e Detoxa Plus® New (produto em fase de desenvolvimento, não disponível para a venda) possuem uma capacidade de remoção significativamente superior aos outros inativadores enzimáticos e aos sequestrantes. Na diminuição do pH, devido à passagem da solução pelo estômago, ocorre aumento ainda maior da capacidade de remoção do Detoxa Plus® e do Detoxa Plus® New frente aos outros inativadores. Essa capacidade de eliminação das micotoxinas nos primeiros segmentos do trato gastrointestinal é específica do Detoxa Plus®, uma vez que, diferentemente dos demais produtos avaliados, as enzimas presentes neste produto possuem seu grau máximo de atividade enzimática em pH ácido, como pode ser observado no Gráfico 3. Quando da chegada da solução nos intestinos, provoca um aumento do pH (de 2,5 a 6,5). Desta forma, é perceptível que o processo de biotransformação do Detoxa Plus®mantém-se, e se nota aumento na capacidade dos demais inativadores. Essa variação ocorre porque as enzimas dos outros produtos avaliados possuem seu grau máximo de atividade em um pH perto da neutralidade. Por sua vez, a atividade dos sequestrantes não varia, demonstrando que a capacidade de adsorção deles não foi influenciada pelo pH. Durante a passagem total da solução pelo modelo animal (7,5 horas), foi possível obter uma capacidade de remoção total (100%) de DON com e Detoxa Plus® New e uma remoção de 84% com Detoxa Plus®, enquanto os outros inativadores enzimáticos tiveram uma ação de 83% (EDR3), 54% (EDR4) e 68% (EDR5). Por sua vez, os adsorventes tiveram a capacidade de eliminação de DON de 15% para adsorvente 1 e de 9% para adsorvente 2. Por último, na passagem total da solução pelo modelo animal (7,5 horas), foi possível obter uma capacidade de remoção total (100%) de ZEA com o Detoxa Plus® New e com o Detoxa Plus®, enquanto os outros inativadores enzimáticos tiveram uma ação de 74% (EDR3), 68% (EDR4) e 65% (EDR5). Por sua vez, os adsorventes tiveram a capacidade de eliminação de ZEA de 0% para adsorvente 1 e de 36% para adsorvente 2.

Gráfico 3. Porcentagem de atividade enzimática em pH diferentes do Detoxa Plus®

A diferença de eliminação total de DON entre Detoxa Plus® e dos demais produtos ocorre devido à capacidade de as enzimas do Detoxa Plus® agirem em um pH ácido nos primeiros segmentos do trato gastrointestinal, o que permite maior tempo de ação total. Os outros produtos aumentam sua velocidade de ação na chegada ao intestino; porém, para esse momento, o alimento permanece pouco tempo no interior do intestino e, ademais disso, uma vez nesta porção, já é iniciada a absorção das micotoxinas.

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Conclusão

Os inativadores enzimáticos são uma opção viável para a eliminação das micotoxinas Desoxinivalenol e Zearalenona no modelo in vitro e, dentre eles, Detoxa Plus® e Detoxa Plus® Newapresentaram maior capacidade de eliminação dentre os produtos testados, sendo que para a micotoxina Zearalenona, ambos tiveram 100% de efetividade na remoção dela ao longo do trato gastrointestinal dos suínos.

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DUROC DANBRED: Nova característica melhora a sobrevivência de leitões

A característica "fertilidade do macho", um dos objetivos do melhoramento do Duroc, foi alterada para "fertilidade e sobrevivência". De acordo com simulações da área de Pesquisa e Desenvolvimento da DanBred, o Centro Dinamarquês de Pesquisa em Suínos, essa mudança levará a uma melhor sobrevivência dos leitões ainda neste ano

Quando os leitões sobrevivem aos primeiros cinco dias pós-parto, as chances de eles chegarem até o abate aumentam significativamente. Isso foi comprovado por todos os estudos realizados pela área de Pesquisa e Desenvolvimento da DanBred, com base em dados de plantéis de granjas-núcleo e multiplicadoras. A característica LV-5 (leitões vivos ao quinto dia) foi, há muito tempo, incorporada como um dos objetivos do melhoramento das linhagens Large-White e Landrace e, agora, será implementada também no melhoramento do Duroc. "No caso do Duroc, que é a nossa linha de reprodutores terminadores, trabalhamos, nos últimos quatro anos, para melhorar a característica "fertilidade do macho". Essa característica foi incorporada aos objetivos do melhoramento em 2015 visando ao aumento do tamanho da leitegada, dentre outros aspectos, e foi um grande sucesso", afirma a cientista-chefe do Centro Dinamarquês de Pesquisa em Suínos, Birgitte Ask. "O tamanho da leitegada aumentou significativamente, produzindo efeitos quase imediatos na produção comercial. Ao alterarmos essa característica para "fertilidade e sobrevivência", como fizemos agora, estamos focando não apenas no tamanho da leitegada, mas também no aumento da sobrevivência dos leitões", explica a cientista-chefe.

Melhoria imediata na sobrevivência dos leitões

Essa mudança no objetivo do melhoramento do Duroc promoverá uma maior sobrevivência dos leitões, com reflexos já neste ano, de acordo com as estimativas da área de Pesquisa e Desenvolvimento da DanBred. "Além do efetivo positivo existente na sobrevivência, alcançado pelo melhoramento com base no LV-5, que faz parte dos objetivos do melhoramento das linhagens maternas da DanBred desde 2004, a inclusão dessa nova característica paterna entre os objetivos do melhoramento do Duroc contribuirá ainda mais para o aumento da sobrevivência dos leitões", explica Birgitte. "Veremos um aumento de 0,05 leitão vivo ao quinto dia por leitegada durante o primeiro ano e, durante o ano seguinte, o número aumentará para 0,10 leitão vivo a mais, e assim por diante", afirma a pesquisadora. Embora a melhoria possa parecer relativamente pequena, é importante levar em consideração o grande número de leitegadas que nasce a cada ano e o fato de que o número de leitões sobreviventes se acumulará ano após ano, resultando em um efeito positivo significativo na sobrevivência dos leitões.

Reavaliação do peso econômico

Com a introdução da nova característica, o peso econômico dos objetivos do melhoramento também foi reavaliado. Como consequência, o peso econômico reflete, agora, o fato de que um leitão vivo a mais ao quinto dia tem mais valor do que se fosse um leitão a mais ao parto. "Os leitões sobreviventes ao quinto dia valem mais dinheiro e, portanto, o peso econômico para "fertilidade e sobrevivência" é maior do que o da característica antiga "fertilidade do macho". Especificamente, o novo valor é de € 1,49 por leitão por leitegada, comparado a € 1,34 da característica anterior", finaliza Birgitte Ask.