NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana B.) by Dạy Kèm Quy Nhơn Plus

CHIẾT CÁC HỢP CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE

vectorstock.com/27117080

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana B.) WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana B.)

GVHD: TS. LÊ XUÂN TIẾN

TP. HỒ CHÍ MINH – 12/2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

----------

-----------

Số………/BKDT

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Kỹ thuật Hóa Học

Khoa:

Bộ môn: Kỹ thuật Hóa Hữu Cơ Họ và tên: Chuyên ngành: Hóa dược

Lớp: HC13HD

1. Đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt. 2. Nhiệm vụ: − Khảo sát quy trình chiết cỏ ngọt với dung môi nước. − Khảo sát quy trình tinh chế dịch chiết cỏ ngọt bằng phương pháp gia vôi. − Khảo sát quy trình tính chế dung dịch thu được sau quá trình gia vôi bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion. 3. Ngày giao nhiệm vụ:

03/2016

4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ:

12/2016

5. Giảng viên hướng dẫn:

TS. Lê Xuân Tiến

Luận văn này được thông qua bởi Bộ môn Hóa hữu cơ - Khoa Kỹ thuật hóa học. Tp. HCM, ngày

tháng

năm 2017

Trưởng bộ môn Hóa Hữu Cơ

Giáo viên phản biện

Giáo viên hướng dẫn

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cám ơn đến thầy Lê Xuân Tiến đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Xin cảm ơn các bạn cùng thực hiện luận văn tại Phòng thí nghiệm Kỹ thuật Hữu cơ và Phòng thí nghiệm Hóa dược đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt luận văn. Xin cảm ơn những lời động viên, hỗ trợ từ gia đình và bạn bè.

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng, khảo sát quy trình chiết và tinh chế các hợp chất ngọt steviol glycoside từ cây cỏ ngọt. Quy trình chiết được xây dựng như sau: trích ly cỏ ngọt với dung môi nước, loại màu sơ bộ dung dịch thu được bằng phương pháp gia vôi, sau đó tiến hành tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion. Đây là “phương pháp sạch” để thu các chất ngọt từ cây cỏ ngọt, không sử dụng các loại dung môi độc hại. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly được khảo sát bao gồm: dạng nguyên liệu, tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết. Dựa vào hiệu suất chiết và độ hấp thu UV (λ= 210 nm) để đánh giá chọn ra điều kiện thích hợp ở từng yếu tố khảo sát. Quy trình loại màu bằng phương pháp gia vôi khảo sát những yếu tố sau: nồng độ dung dịch, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao, nhiệt độ, thời gian gia vôi. Tiếp đến, khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế steviol glycoside bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion bao gồm: tốc độ dòng chảy, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch. Sử dụng phương pháp so sánh màu và độ hấp thu UV (λ= 210 nm) để xác định điều kiện tinh chế thích hợp nhất. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, điều kiện trích ly thích hợp là: dạng nguyên liệu lá nguyên, tỉ lệ rắn/lỏng 1/8 g/mL, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 90 oC, chiết 2 lần với hiệu suất chiết là 37.96%; điều kiện gia vôi thích hợp nhất: nồng độ dung dịch 90 g/mL, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 1/1 g/g, nhiệt độ 0 oC, thời gian 10 phút; điều kiện trao đổi ion tốt nhất: tốc độ dòng chảy 0.5 mL/phút, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 1/10 mL/mL với hiệu suất quá trình là 12.22%. Hiệu suất tổng toàn bộ quá trình chiết và tinh chế steviol glycoside là 4.64%.

ABSTRACT This study was carried out to develop and investigate the process of extracting and purifying steviol glycosides from Stevia. The extraction procedure was as follows: extraction of Stevia with water, preliminary decolorizing of the obtained extraction by Ca(OH)2, and purification by ion exchange chromatography. This is a "green – method" for obtaining sweeteners from Stevia, without the use of organic solvents. The factors influencing the extraction process were investigated including: material type, solid /liquid ratio, time and temperature of extraction, extraction times. Based on the extraction efficiency and UV absorption (λ = 210 nm), to determine the appropriate conditions for each factor. The decolorize process by Ca(OH)2 investigates the following factors: solution concentration, Ca(OH)2 mass/extract mass, temperature and time of reaction. Next, investigating the factors that affect the purification of steviol glycoside by ion exchange chromatography, including: flow rate, plastic volume /extract volume ratio. Use color difference and UV absorption (λ = 210 nm) to determine the most suitable refining conditions. The results show that the appropriate extraction conditions are: raw leaf material, solid /liquid ratio 1/8 g/mL for 30 minutes at temperature 90 °C, with extract efficiency is 37.96%; the most suitable liming condition: solution concentration 90 g/mL, Ca(OH)2 mass/extract mass 1/1 g/g at temperature 0 oC for 10 minutes; the best ion exchange condition: flow rate 0.5 mL/min, plastic ratio/extract volume 1/10 mL/mL with process efficiency of 12.22%. The total extraction and purification efficiency of steviol glycoside was 4.64%.

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................................. iv ABSTRACT .................................................................................................................. v MỤC LỤC .................................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... ix DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ xii DANH MỤC PHỤ LỤC ............................................................................................ xiii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ xiv CHƯƠNG 1. 1.1.

TỔNG QUAN ...................................................................................15

Giới thiệu về cỏ ngọt ......................................................................................15

1.1.1.

Nguồn gốc và phân bố...............................................................................15

1.1.2.

Mô tả thực vật ...........................................................................................16

1.1.3.

Bảo quản ....................................................................................................17

1.1.4.

Thành phần hóa học ..................................................................................18

1.1.5.

Tác dụng dược lý .......................................................................................22

1.1.6.

Ứng dụng ...................................................................................................24

1.2.

Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt .............................................25

1.2.1.

Nghiên cứu trong nước..............................................................................25

1.2.2.

Nghiên cứu nước ngoài .............................................................................29

CHƯƠNG 2.

Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm .....................................42

2.1.

Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ............................................42

2.2.

Nội dung nghiên cứu ......................................................................................42

2.3.

Hóa chất và thiết bị ........................................................................................42

2.3.1.

Hóa chất.....................................................................................................42

2.3.2.

Thiết bị ......................................................................................................42

2.4.

Thực nghiệm ...................................................................................................43

2.4.1.

Nguyên liệu ...............................................................................................43

2.4.2.

Phương pháp đo độ ẩm ..............................................................................43

2.4.3.

Khảo sát điều kiện chiết cỏ ngọt với dung môi nước................................43

2.4.4.

Khảo sát quy trình tinh chế các hợp chất steviol glycoside ......................46

CHƯƠNG 3. 3.1.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................52

Kết quả khảo sát quá trình chiết nước.........................................................52

3.1.1.

Khảo sát dạng nguyên liệu chiết ...............................................................52

3.1.2.

Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng ...............................................................................54

3.1.3.

Khảo sát thời gian chiết .............................................................................56

3.1.4.

Khảo sát nhiệt độ .......................................................................................57

3.1.5.

Khảo sát số lần chiết .................................................................................59

3.2.

Khảo sát quá trình gia vôi .............................................................................61

3.2.1.

Khảo sát nồng độ dịch chiết ......................................................................61

3.2.2.

Khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao ...........................................63

3.2.3.

Khảo sát nhiệt độ .......................................................................................65

3.2.4.

Khảo sát thời gian phản ứng .....................................................................67

3.3.

Khảo sát quá trình sắc ký cột nhựa trao đổi cation và anion ....................69

3.3.1.

Khảo sát tốc độ dòng chảy ........................................................................69

3.3.2.

Khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch ...................................................71

3.4.

Sản phẩm thu được sau quy trình chiết và tinh chế các chất ngọt steviol

glycoside ....................................................................................................................73 CHƯƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................76 vii

4.1.

Kết luận ...........................................................................................................76

4.2.

Kiến nghị .........................................................................................................76

TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................77 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 85

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh về cỏ ngọt ......................................................................................15 Hình 1.2. Khung steviol cơ sở xây dựng nên các glycoside có trong cỏ ngọt..............19 Hình 1.3. Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam[59] .............................26 Hình 1.4. Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt ....................................................27 Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant ......................................36 Hình 2.1. Quy trình tinh chế các chất ngọt trong cỏ ngọt .............................................46 Hình 3.1. TLC bột steviol glycoside có hàm lượng > 95% ..........................................52 Hình 3.2. Nguyên liệu dạng: A – lá nguyên; B – bán nguyên; C – bột mịn. ................53 Hình 3.3. Hiệu suất chiết theo dạng nguyên liệu chiết (Phụ lục 1) .............................53 Hình 3.4. TLC các dịch chiết trong khảo sát dạng nguyên liệu chiết ...........................54 Hình 3.5. Hiệu suất chiết theo tỉ lệ rắn/lỏng (Phụ lục 2) .............................................55 Hình 3.6. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng ...........................55 Hình 3.7. Hiệu suất chiết theo thời gian (Phụ lục 3)....................................................56 Hình 3.8. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết .........................57 Hình 3.9. Hiệu suất chiết theo nhiệt độ (Phụ lục 4) .....................................................58 Hình 3.10. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát nhiệt độ chiết ........................58 Hình 3.11. Hiệu suất chiết theo số lần chiết (Phụ lục 5)..............................................59 Hình 3.12. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết .......................60 Hình 3.13. TLC hiện màu và đã hiện màu của dịch chiết ban đầu A: là chất tạo màu vàng nâu của dịch chiết (hệ giải ly EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5) ..................61 Hình 3.14. Độ khác biệt màu sắc ∆E của các dịch thu được so với dung dịch gốc (Phụ lục 6) ..............................................................................................................................62 Hình 3.15. TLC các dung dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ .......................................................................................................................................62 ix

Hình 3.16. Các dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ ...............63 Hình 3.17. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao so với dung dịch gốc (Phụ lục 7) .........................................64 Hình 3.18. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao ................................................................................................64 Hình 3.19. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao ..................................................................................................................................65 Hình 3.20. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ so với dung dịch gốc (Phụ lục 8) ....................................................................66 Hình 3.21. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ ..............66 Hình 3.22. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ ...............................67 Hình 3.23. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát thời gian so với dung dịch gốc (Phụ lục 9).......................................................................................68 Hình 3.24. TLC các dung dịch thu được sau quá trình gia vôi trong khảo sát thời gian .......................................................................................................................................68 Hình 3.25. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát thời gian ..............................69 Hình 3.26. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy so với dung dịch gốc (Phụ lục 10) .......................................................................70 Hình 3.27. TLC các dung dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy ..................70 Hình 3.28. Các dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy ...................................71 Hình 3.29. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch so với dung dịch gốc (Phụ lục 11) ..................................................72 Hình 3.30. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tốc độ dòng chảy 72 Hình 3.31. Các dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch .............73 Hình 3.32. Dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion. ..................................................................................73

Hình 3.33. TLC của dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion. .................................................................74 Hình 3.34. A – Cao chiết thô; B – Cao sau tinh chế. ....................................................75

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt. Glc, Xyl, and Rha tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19]. .......................................................20 Bảng 1.2. Tính chất vật lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt[26] ..........21 Bảng 3.1. Hàm lượng chất ngọt thu được sau quá trình chiết và tinh chế ....................74

xii

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo dạng nguyên liệu trong quá trình chiết ................................................................................................................85 Phụ lục 2. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo tỉ lệ rắn/lỏng trong quá trình chiết .......................................................................................................................86 Phụ lục 3. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo thời gian trong quá trình chiết ...............................................................................................................................87 Phụ lục 4. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo nhiệt độ trong quá trình chiết ...............................................................................................................................89 Phụ lục 5. Bảng số liệu tính hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo số lần chiết trong quá trình chiết ................................................................................................................91 Phụ lục 6. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nồng độ dung dịch trong quá trình gia vôi .............................................................................................................92 Phụ lục 7. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao trong quá trình gia vôi ..................................................................................93 Phụ lục 8. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nhiệt độ trong quá trình gia vôi ............................................................................................................................95 Phụ lục 9. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo thời gian trong quá trình gia vôi ............................................................................................................................96 Phụ lục 10. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tốc độ dòng chảy trong quá trình trao đổi ion .....................................................................................................97 Phụ lục 11. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ thể tích nhựa/ thể tích dịch trong quá trình trao đổi ion .............................................................................98

xiii

LỜI MỞ ĐẦU Các nghiên cứu cho thấy mối liên hệ tiềm tàng giữa sử dụng đường ngọt và các vấn đề sức khỏe, bao gồm béo phì và sâu răng. Sử dụng quá mức đường có liên quan đến bệnh tiểu đường loại 2, béo phì, gia tăng bệnh tim và làm cho các tế bào ung thư phát triển nhanh hơn. Theo nhiều nghiên cứu, các hợp chất ngọt chiết xuất từ cây cỏ ngọt có độ ngọt gấp rất nhiều lần so với đường sucrose và rất tốt đối với sức khỏe con người khi dùng trong một giới hạn cho phép. Hiện nay, trên thế giới đặc biệt là Nhật bản, Hàn Quốc đã và đang sử dụng các hợp chất ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt này để thay thế dần cho đường sucrose và đường nhân tạo trong thực phẩm, dược phẩm. Tuy nhiên, ở Việt Nam cỏ ngọt ít được người dân biết đến do chưa có quy trình chiết xuất các hợp chất ngọt từ cỏ ngọt nào ứng dụng vào quy mô công nghiệp để sản xuất trong nước, nếu nhập khẩu thì giá rất cao nên các hợp chất ngọt này chưa được bán nhiều ở nước ta. Nhìn thấy được điều đó và dựa trên các nghiên cứu, thăm dò về cỏ ngọt, đề tài nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt hướng định hướng ứng dụng trong quy mô công nghiệp được đề xuất.

xiv

CHƯƠNG 1. 1.1.

TỔNG QUAN

Giới thiệu về cỏ ngọt

Tên thường gọi: cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc. Tên khoa học: Stevia rebaudiana Bertoni Giới: Plantae Bộ: Asterales Họ: Asteraceae Tông: Eupatorieae Chi: Stevia Loài: S. rebaudiana

Hình 1.1. Hình ảnh về cỏ ngọt

1.1.1.

Nguồn gốc và phân bố

Cỏ ngọt là cây bụi lâu năm thuộc họ Cúc Asteraceae, có nguồn gốc từ vùng Amambay và Iguacu thuộc biên giới Brazil và Paraguay[1, 2]. Ngày nay được trồng nhiều ở một số

quốc gia trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia, Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Paraguay, Mexico. Cây cỏ ngọt bắt đầu được du nhập từ Nam Mỹ vào Việt Nam từ năm 1988[3] . Hiện nay, đã có khá nhiều giống cỏ ngọt được trồng và phát triển trên nhiều vùng trong cả nước, từ các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Nội… cho đến các tỉnh phía Nam như Lâm Đồng, Đắc Lắc. Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên cứu về thành phần cỏ ngọt, cũng như dinh dưỡng của lá cỏ ngọt được trồng tại Việt Nam. 1.1.2.

Mô tả thực vật

Thân cỏ ngọt có thể cao tới 1 m dạng thân bụi tròn nhiều lông, mọc thẳng. Cỏ ngọt phân nhiều nhánh. Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triển mạnh. Lá mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có răng cưa. Lá hầu như không cuống, lá trưởng thành dài 3-4 cm, rộng 0.6-1 cm, có 3 gân song song, lá màu xanh lục. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá. Toàn thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá. Lá già ở dưới thấp chứa nhiều chất ngọt hơn lá non ở phía trên cao, lá chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không rụng (vẫn còn vị ngọt). Hoa tự, nhóm dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính. Mỗi hoa đơn hình chùy có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có màu vàng sáng, các chỉ nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ô, 1 noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc không có. Quả và hạt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu sẫm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi, nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ này mầm thấp. Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng ở đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20 – 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp, đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất[4].

Hạt cỏ ngọt có sức sống kém, tỷ lệ nảy mầm thấp nên cần chọn đất màu mỡ, dễ thấm nước và thoát nước, kín gió và tưới tiêu thuận lợi, được thu hoạch khi đạt độ cao 1m hoặc hơn[5]. Cỏ ngọt là cây lâu năm, có thể được thu hoạch trong 8 năm mỗi năm 6 lần thu, khối lượng lá thu được khác nhau từ 15 tới 30 g/cây[6]. Cỏ ngọt chịu được lạnh không thấp hơn 9 oC. Tốc độ phát triển nhanh nhất ở nhiệt độ 20-24oC[7]. Ở nước ta cỏ ngọt sinh trưởng quanh năm, nhưng cho thu hoạch cao nhất từ tháng 4 đến tháng 11 dương lịch (trừ 3 tháng rét nhất là tháng 12, tháng 1 và tháng 2 ở phía Bắc). Bởi vậy cỏ ngọt nên được trồng vào tháng 4 đến tháng 9, nhưng để có thu hoạch cao ngay từ những năm đầu nên trồng vào tháng 4 và 5 Dương lịch, trong điều kiện đất đai cho phép có thể trồng từ tháng 2-3, nhưng thời gian đầu cây sinh trưởng kém và thu hoạch thấp, chậm. Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam, lượng tiêu thụ cỏ ngọt là rất lớn. Vì vậy, ta cần quan tâm đến những yếu tố ảnh hưởng đến việc trồng cỏ ngọt để cho năng suất cao, hàm lượng chất ngọt nhiều. Tác giả Nguyễn Văn Tý và nhiều cộng sự[8] đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch đồng sulfat đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và năng suất cỏ ngọt trồng trên đất vườn đồi Bắc Thái. Sau đó cũng chính tác giả Nguyễn Văn Tý đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acid boric đến sinh trưởng và hàm lượng stevioside của cây cỏ ngọt trồng trên đất Trung Du Việt Bắc. 1.1.3.

Bảo quản

Phần lá sau khi thu hoạch đem rửa sạch, phơi nắng hoặc sấy thông gió cho đến khi khô. Sau khi phơi 1 – 2 ngày thì tuốt lá và bảo quản lá khô trong túi nilông để tránh hút ẩm. Bảo quản trong nơi khô mát, hàm lượng nước trong lá khô dưới 10%, tạp chất dưới 5% Trong thời kỳ có mưa phải sấy bằng máy hoặc là sấy ở 30oC trong 24h. Trong quá trình phơi sấy phải đảo nhẹ và không xếp lớp. Để sản phẩm lá khô có chất lượng cao, cần đảm bảo các đặc điểm cơ bản sau: −

Hình dáng bên ngoài: Lá khô có 1 phần cành ngọn

− Màu sắc: Nguyên liệu có màu xanh tự nhiên − Mùi: Có mùi cỏ khô và mùi thơm đặc trưng của cỏ ngọt. − Độ ẩm: <12% 17

− Tạp chất: không có lá mốc và đen, các tạp chất khác nhỏ hơn 5%[9]. 1.1.4.

Thành phần hóa học

Cây cỏ ngọt (chủ yếu là lá) chứa những diterpene glycoside đặc biệt, tạo ra vị ngọt nhưng không tạo ra hay tạo ra rất ít năng lượng. Steviol glycoside, tên gọi chung cho các diterpene glycoside ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt, là một hứa hẹn tái tạo những thứ thực phẩm sống mới trên thị trường thế giới và thực vật không calorie, vị ngọt tự nhiên có thể được sử dụng như một loại đường thay thế hoặc thay thế cho các chất làm ngọt nhân tạo [10]. Hiện nay, cỏ ngọt được biết nhiều đến về nồng độ diterpene ngọt cao khoảng 5-20% khối lượng lá khô [11], khoảng 0.9-1% khối lượng trong hoa[12]. Trong 240 loài thuộc chi Stevia, chỉ có loài rebaudiana và phlebophylla chứa các steviol glycoside

[13]

. Những

hợp chất ngọt trong lá cỏ ngọt là nhóm các dẫn xuất diterpene glycoside, ngày nay đã ghi nhận hơn 30 chất trong tài liệu khoa học

[14]

. Hợp chất chính trong lá cỏ ngọt là

stevioside (4-13% khối lượng lá khô), và tiếp theo có nhiều nhất là rebaudioside A (24%). Một số steviol glycoside khác như dulcoside A (0.3%), rebaudioside B, C (1-2%), D và F và steviolbioside cũng được xác định nhưng nồng độ thấp [15]. Các glycoside tìm thấy chủ yếu trong lá của cây, nồng độ lên đến 15% , tùy thuộc vào giống [16]. Nồng độ của các glycoside ngọt trong lá cỏ ngọt các nguồn khác nhau không giống nhau, nhiều nghiên cứu [17] cho thấy nồng độ của nó phụ thuộc vào điều kiện phát triển [18], cũng như về việc áp dụng các kỹ thuật nông học hiện đại [19, 20]. Đa số các giống cỏ ngọt đều chứa lượng rebaudioside A ít hơn nhiều so với stevioside [18]. Ở Việt Nam đã có vài nghiên cứu về nồng độ steviol glycoside trong cây cỏ ngọt Việt Nam. Năm 2001, Nguyễn Kim Cẩn và Lê Nguyệt Nga đã định lượng stevioside trong lá cỏ ngọt khô là từ 3% đến 6%. Năm 2009, Phạm Thành Lộc và Lê Ngọc Thạch cũng đã xác được định hàm lượng stevioside trong lá cỏ ngọt khô là 3,38%. Năm 2014, Trương Hương Lan đã xác định hàm lượng stevioside trong các giống cỏ ngọt của nước ta dao động từ 2,13% đến 7,72% và rebaudioside A thay đổi từ 2,05% đến 9,32%, trong đó lá cỏ ngọt S77 của Việt Nam có hàm lượng steviol glycoside lớn nhất 11,53%[21]. Tuy nhiên, cũng có một số công bố của các bằng sáng chế nước ngoài cho thấy một số giống cỏ ngọt có hàm lượng rebaudioside A lớn hơn stevioside. Các giống cỏ ngọt này 18

đã được sử dụng để sản xuất rebaudioside A tinh khiết phục vụ cho chế biến một số loại thực phẩm phẩm và đồ uống. Chiết xuất tinh khiết lấy từ lá cỏ ngọt và được cung cấp trên thị trường có chứa chủ yếu là stevioside (> 80%) hoặc rebaudioside A (> 90%) [22]. Tất cả các glycosides diterpene phân lập từ lá cỏ ngọt có cùng khung steviol (Hình 1.) và chủ yếu khác nhau về gốc carbohydrate (R1 và R2), mono-, di-, và trisaccharide có chứa glucose (C6H12O6) và / hoặc rhamnose (C6H12O5) và/ hoặc xylose (C5H10O5) tại các vị trí C13 và C19 [23].

Hình 1.2. Khung steviol cơ sở xây dựng nên các glycoside có trong cỏ ngọt

Bảng 1.1. Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt. Glc, Xyl, and Rha tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19]. Hợp chất

Steviol

Steviolbioside

β-Glc-β-Glc(2→1)

Stevioside

β-Glc

β-Glc-β-Glc(2→1)

Rebaudioside A

β-Glc-β-Glc(2→1) | β-Glc(3→1)

Rebaudioside B

β-Glc

β-Glc-β-Glc(2→1) | β-Glc(3→1)

Rebaudioside (Dulcoside B)

C β-Glc

β-Glc-α- Rha(2→1) | β-Glc(3→1)

Rebaudioside D

β-Glc-β-Glc(2→1)

β-Glc-β-Glc(2→1) | β-Glc(3→1)

Rebaudioside E

β-Glc-β-Glc(2→1)

Rebaudioside F

β-Glc

β-Glc-β-Xyl(2→1) | β-Glc(3→1)

Dulcoside A

β-Glc

β-Glc-α- Rha(2→1)

Tích chất hóa lý Vị ngọt của steviol glycoside tăng với sự gia tăng số lượng các đơn vị đường gắn với steviol aglycone. Tuy nhiên, nồng độ của chúng trong nguyên liệu thực vật giảm cùng một lúc [24]. Stevioside tinh khiết thường tạo ra một dư vị đắng đáng kể [25]. Rebaudioside A có thêm một đơn vị glucose so với stevioside, cả độ ngọt và chất lượng của hương vị đều tốt hơn, là chất duy nhất trong cỏ ngọt không có dư vị đắng khi sử dụng [17]. Vị ngọt của bất kỳ hợp chất steviol glycoside đều lớn hơn so với saccharose: stevioside (250-300 lần), rebaudioside A (250-450 lần); rebaudioside B (300-350 lần); rebaudioside

C (50-120 lần); rebaudioside D (250-450 lần); rebaudioside E (150-300 lần); dulcoside A (50-120 lần); và steviolbioside (100-125 lần). Tính trung bình, vị ngọt của các hợp chất steviol glycoside lớn 250-300 lần so với đường saccharose. Bảng 1.2. Tính chất vật lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt[26] Hợp chất

Số CAS

Khối lượng

Nhiệt độ nóng

Độ tan trong

phân tử

chảy (oC)

nước (%)

Stevioside

57817-89-7

804

196–198

0.13

Rebaudioside A

58543-16-1

966

242–244

0.80

Rebaudioside B

58543-17-2

804

193–195

0.10

Rebaudioside C

63550-99-2

958

215–217

0.21

Rebaudioside D

63279-13-0

1128

283–286

1.00

Rebaudioside E

63279-14-1

966

205–207

1.70

Steviolbioside

41093-60-1

642

188–192

0.03

Dulcoside A

64432-06-0

788

193–195

0.58

Stevioside có độ tan trong nước tương đối thấp và nhiệt độ nóng chảy cao [27]. Tuy nhiên, rebaudioside A lại tan tốt hơn stevioside 6-7 lần trong nước vì nó chứa thêm một đơn vị 21

glucose. Những phân tử này rất ổn định trong dung dịch nước trên phạm vi rộng giá trị pH và nhiệt độ [28, 29]. Đun nóng trong phạm vi pH 1-10 hơn 2 giờ ở 60oC, hầu như không có bất cứ sự phân hủy stevioside nào diễn ra, phân hủy chỉ nhẹ tới 5% (pH 2 và 10) ở nhiệt độ 80oC. Trong điều kiện có tính axit mạnh (pH 1.0) sự phân hủy của stevioside đã được quan sát mà kết quả tổng phân hủy sau khi ủ ở nhiệt độ 80oC trong 2 giờ [28]. Kết quả tương tự đã được báo cáo bởi Buckenhuskers và Omran (1997) cho thấy rằng stevioside có một nhiệt độ ổn định tuyệt vời ở 100oC trong 1 giờ ở khoảng pH 3-9, , không bị hóa nâu hay caramen hóa, nhưng phân hủy nhanh chóng xảy ra ở mức độ pH lớn hơn 9 dưới điều kiện tương tự hay nhiệt độ quá 140oC ở điều kiện tương tự [17]. Ngoài ra, cỏ ngọt còn chứa các hợp chất khác như sterol (stigmasterol, sitosterol, campesteol), flavonoid (Apigenin 4'-O-glucoside, Kampferol 3-O-rhamnoside, Luteolin 7-O-glucoside, 5,7,3'-Trihydroxy 3,6,4'-trimethoxyflavone), sterebin, cosmosiin, chất dễ bốc hơi caryophyllenm spathuienol, chlorophyll A, triterpenoid. Tannin, carotennoid, protein, xơ, cacbonhydrate, rutin… cũng tìm thấy trong cỏ ngọt với hàm lượng thấp. Và một số thành phần vi lượng như phosphorus, sắt, canxi, kali, magie, kẽm,mangan,… vitamin A, vitamin B2, vitamin C và axit folic cũng tồn tại trong cây cỏ ngọt[26]. 1.1.5.

Tác dụng dược lý

Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm Nhiều nghiên cứu cho thấy lá cây cỏ và chiết xuất callus có thể là một ứng cử viên lý tưởng để nghiên cứu sâu hơn về sử dụng của chúng trong việc bảo quản thực phẩm và dược phẩm do các chất chống oxy hoá và các hoạt động kháng khuẩn[30]. Dịch chiết cỏ ngọt có tính chất ức chế rotavirus[31], chống vi khuẩn Helicobacter pylori nên được đề nghị đem dùng trị u khối[32]. Phần chiết hay những hoạt chất của cỏ

ngọt có thể dùng để uống giảm hay chữa viêm tế bào[33]. Những người bị bệnh đái đường không những có thể dùng stevioside mà chất này có khả năng hạ đường trong máu[34], giảm huyết áp trên chuột[35], trên chó[36]. Cũng ở trên chuột, nó ức chế sự phát triển ung thư trên da. Cho trộn trong thuốc đánh răng, nó có tác dụng lên vi khuẩn Streptococcus mutans kết dính lên răng và cấu thành các mảng răng[37-39]. Nó đã được dùng làm thuốc

kích thích tóc mọc[40, 41], khử dioxin trong đất[42, 43]. Lá và cành có tính chất chống histamin nên có thể dùng để kiềm chế những triệu chứng như ngứa ngáy, đau đớn[44]. 22

Khả năng kháng oxi hóa Dịch chiết cỏ ngọt có khả năng kháng oxi hóa cao. Khả năng kháng oxi hóa của dịch chiết cỏ ngọt được cho là khử các eletron tự do và superoxide[45]. Một nghiên cứu in vitro năm 2009, chỉ ra rằng dịch chiết ethanol lá cỏ ngọt có tiềm năng được sử dụng như

một chất kháng oxi hóa tự nhiên[46]. Độc tính[47] − Nhiều thí nghiệm tiến hành cho chuột uống stevioside hoặc rebaudioside A tới liều 2g/kg vẫn không thấy biểu hiện độc tính hay những sai lệch về trọng lượng cơ thể, cũng như các phủ tạng sau 2 tuần theo dõi. − Những thí nghiệm ở Nhật và Hàn Quốc cho thấy những chỉ tiêu cân nặng, huyết học, sinh học và xét nghiệm tế bào mô học gan đều tỏ ra bình thường sau 56 ngày cho chuột ăn 0.25 hoặc 0.5g stevioside. − Độc tính với thận: Năm 1988, Panichkul T. thực nghiệm trên chuột, đã thông báo stevioside có thể gây độc với thận, làm tăng urê và creatinin huyết thanh khi cho quá liều, gây bại niệu, natri niệu và làm ức chế sự vận chuyển paraaminohippurate (PAH) trong ống gần thận[48-50]. − Theo GS Ryan Huxtable- đại học University of Arizona, Tuscon - cho biết stevioside có thể ảnh hưởng đến hoạt động của chức năng sinh dục, như làm giảm số lượng tinh trùng ở chuột đực, giảm kích thước tinh nang hoặc có thể dẫn đấn tình trạng vô sinh. Nhưng trong những thí nghiệm này người ta đã sử dụng những liều lượng stevioside khổng lồ, thực tế hằng ngày chúng ta chỉ sử dụng những liều lượng stevioside rất thấp xa so với những liều lượng đã dùng để thí nghiệm ở trên. Một số đánh giá an toàn của stevioside và chiết xuất cỏ ngọt đã được thực hiện để xác định mức độ độc tính, gây đột biến, gây ung thư, độc tính di truyền và các vấn đề sinh sản, tất cả đều được tìm thấy là âm tính[51-55]. Các kết quả này khẳng định rằng stevioside và các glycosid khác có trong chiết xuất Stevia có khả năng an toàn đối với người tiêu dùng và không ngụ ý bất kỳ mối nguy hiểm nào về sức khoẻ khi sử dụng lâu dài.

1.1.6.

Ứng dụng

Từ những năm đầu của thế kỷ 20, người dân Paraguay đã biết dùng cỏ ngọt như một loại nước giải khát, cho đến những năm 1960, việc trồng thương mại bắt đầu ở Paraguay và Nhật Bản, và sau đó ở các nước khác. Stevioside và rebaudioside A là chất chiết xuất từ lá cỏ ngọt hiện nay được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đông Nam Á và Nam Mỹ, như chất làm ngọt trong nhiều loại thực phẩm. Kể từ khi có sự chấp thuận của chất làm ngọt Stevia ở Hoa Kỳ bởi FDA và EU năm 2008, lợi ích công nghiệp của cỏ ngọt đã tăng lên nhanh chóng[56, 57]. Năm 2008, Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) đã phát hiện và phản hồi yêu cầu của European Commission về European Food Safety Authority (EFSA) để đưa ra những quan điểm khoa học về độ an toàn của steviol glycoside, chất ngọt được sử dụng trong thực phẩm. Sau khi xem xét tất cả các dữ liệu về độ ổn định, các sản phẩm xuống cấp, quá trình trao đổi chất và độc tính, EFSA đã thành lập ADI cho các hợp chất steviol glycoside có độ tinh khiết ≥95% là 4 mg/kg bw/day. Năm 2009, JECFA đã sửa đổi cho phép rebaudioside D và F được sử dụng như là một phần của hỗn hợp steviol glycoside với độ tinh khiết ≥ 95% và điều này đã được EFSA phê duyệt. Năm 2008, FDA đã xem xét các dữ liệu về steviol glycoside và tham khảo ý kiến từ các cơ quan có thẩm quyền như JECFA và Viện hàn lâm khoa học quốc gia đã chấp nhận hỗn hợp steviol glycoside có độ tinh khiết cao ≥ 95% được sản xuất phù hợp với FDA Good Manufacturing Practices được sử dụng trong thực phẩm với lượng ADI như JECFA đưa ra.[58] Cỏ ngọt được dùng như một loại trà dành cho những người bị tiểu đường, béo phì hay cao huyết áp. Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt dùng để pha chế làm tăng độ ngọt mà không làm tăng năng lượng của thực phẩm. Ngoài ra, cỏ ngọt còn được dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm như sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da.

1.2.

Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt 1.2.1.

Nghiên cứu trong nước Phương pháp chiết và tinh chế

1.2.1.1.

Ở Việt Nam chỉ mới đưa ra quy trình chiết và cô lập stevioside trong phạm vi phòng thí nghiệm, chưa ứng dụng được vào sản xuất. Đây là quy trình được đưa ra bởi các tác giả ở Viện dược liệu năm 2006.

Lá cành nhỏ

Dịch chiết -

Ethanol 80o, hồi lưu 30 phút, 60OC.

Lọc

(4 lần)

Bã

Cô quay loại dung môi

Cắn -

Nước nóng Khuấy -

Dịch sệt -

Pha ether dầu

Lắc với ether dầu hoả

Chiết

Pha nước -

Pha BuOH -

Đun cách thuỷ Lắc với BuOH Pha nước

Cô quay loại dung môi

Stevioside thô - Kết tinh lạnh nhiều lần trong MeOH - Lọc Chế phẩm Stevioside 25

Hình 1.3. Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam[59] Cỏ ngọt khô được chiết hồi lưu 4 lần mỗi lần 30 phút bằng ethanol 80% ở 60oC. Tập trung dịch chiết, cô quay chân không để thu hồi dung môi ethanol cho tới khi dịch cô đặc hu được cắn. Thêm khoảng 20% nước cất nóng so với lượng dịch ban đầu, tạo thành dịch sệt. Loại lipid bằng ether dầu hỏa. Dịch sau khi đã loại bỏ lipid đưa đi chưng cách thủy để tách ether dầu hỏa. Lắc dịch chiết với n-butanol bão hòa nước, cho đến khi dịch nước không còn stevioside nữa. Cất thu hồi n-butanol và cô đặc. Cuối cùng, kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được stevioside tinh khiết. Ưu điểm: − Stevioside thu được tương đối tinh khiết Nhược điểm: − Lượng stevioside thu được ít, dễ ngã màu trong không khí − Dung môi sử dụng tinh chế đắt tiền, tương đối độc hại − Quy trình tốn nhiều thời gian, phức tạp.

Theo Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tôn Nữ Liên Hương và đồng nghiệp đã đưa ra 2 phương pháp chiết tách và tinh chế stevioside từ cỏ ngọt[60]. Bột cỏ ngọt khô -

Ngâm với nước cất (tỉ lệ 25:30 g:ml)

Trong 2 giờ ở 65oC.

Lọc bỏ bã

(2 lần)

Dịch chiết -

Acid

hóa

citric

acid

Cách 2

Cách 1

bằng với

pH=3

Sắc ký cột với silicagel

Hệ giải ly chloroform và methanol với độ phân

- Khuấy 30 phút - Lọc với celite Dịch dưới lọc -

cực tăng dần Phân đoạn chứa stevioside

Kiềm hóa bằng Ca(OH)2

với pH=10,5

Lọc với celite

Khuấy 1 giờ ở 50oC

Trung hòa tới pH=7

Cô bớt dung môi -

Chiết với n-butanol Pha BuOH -

Loại hết dung môi

Rắn -

Hòa tan trong MeOH nóng

Làm lạnh 0-5oC , kết tinh

Tinh thể Hình 1.4. Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt

Chiết cỏ ngọt với nước 2 lần mỗi lần trong 2 giờ ở 65oC. Lọc dịch chiết, đuổi bớt dung môi còn khoảng 20% dịch so với ban đầu. Cách 1: Dịch chiết được acid hóa bằng citric acid đến pH gần bằng 3, khuấy nhẹ dung dịch trong 30 phút. Dung dịch sau khi acid hóa lọc qua cột celite. Dung dịch sau lọc được kiểm hóa bằng calcium hydroxide tới pH 10.5 ở 50oC, khuấy đều trong 1 giờ. Lọc dịch qua cột celite. Trung hòa dịch tới pH 7 bằng citric acid. Cô quay dung dịch loại bớt nước. Chiết lỏng lỏng với n-butanol để loại phần tạp còn lại, thu lấy lớp n-butanol, cô quay loại hoàn toàn dung môi. Kết tinh trong methanol, làm lạnh 0-5oC và để qua đêm, thu lấy tinh thể. Cách 2: Tiến hành sắc ký cột (SKC), sử dụng chất hấp phụ là silicagel. Giải ly cột sắc ký lần lượt với các hệ dung môi là những hỗn hợp chloroform và methanol với độ phân cực tăng dần. Theo dõi quá trình SKC bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), với hệ dung môi giải ly là n–butanol:nước:acid acetic = 4:5:1 (v/v), hiện vết với dung dịch acid sulfuric:methanol = 1:10 (v/v), sấy bản mỏng ở 110°C trong 2 phút. Thu phân đoạn cao chứa stevioside và tiếp tục sắc ký cột rồi kết tinh lại trong dung môi thích hợp để thu được stevioside tinh khiết. Kiểm tra độ tinh khiết của stevioside : Dùng SKLM, hệ giải ly: n-butanol:nước:acid acetic tỉ lệ 4:5:1 (v/v). Ưu điểm − Cách 1 dung môi tương đối không độc hại, trừ methanol; − Quy trình đơn giản, ít tốn thời gian. Nhược điểm − Hiệu suất chiết không cao; − Cách 2 khó ứng dụng vào quy mô công nghiệp. 1.2.1.2.

Phương pháp định lượng

Tất cả các bài báo nghiên cứu về thành phần và hàm lượng steviol glycoside trong cỏ ngọt ở nước ta đều dùng phương pháp định lượng bằng HPLC. Theo bài báo của Trương Hương Lan và đồng nghiệp, điều kiện chạy HPLC của dịch chiết nước cỏ ngọt ban đầu như sau[21]: 28

− Cột sắc ký: Supelco LC-NH2 250x4.6mm, 5µ − Pha động: acetonitrile:nước tỉ lệ 10:30 − Tốc độ dòng: 1.5 mL/phút − Nhiệt độ buồng cột: 30oC − Đầu dò: PDA 2996 ở bước sóng 210nm 1.2.2.

Nghiên cứu nước ngoài

1.2.2.1.

Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết và tinh chế các

hợp chất steviol glycoside Các kỹ thuật được sử dụng để thu được steviol glycoside có thể phân loại vào những hạng mục khác nhau, như dựa trên chiết dung môi [61, 62], hấp phụ sắc ký [63-66],trao đổi ion [67-69], kết tủa chọn lọc [70], phương pháp màng [67, 68, 71] và các chất lỏng siêu tới hạn [72]

Hầu hết các quy trình chế biến cỏ ngọt được tiến hành ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Brazil hoặc Paraguay. Quy trình chiết steviol glycoside từ lá cỏ ngọt phổ biến nhất bao gồm các bước sau: − Ngâm lá trong nược ấm/nóng để hòa tan steviol glycoside − Lọc với chất trợ lọc, lấy dịch lọc − Loại dung môi bằng bay hơi chân không − Sử dụng nhựa trao đổi để thu được các phân đoạn steviol glycoside có nồng độ cao − Tinh chế trao đổi ion (đôi khi) − Bay hơi và sấy phun hoặc, ít phổ biến hơn, kết tinh để tạo bột/tinh thể. Một số chế biến thứ cấp được thực hiện tại Nhật để cải thiện chất lượng hương vị. Quy trình trên giống với quy trình chiết đường thô từ mía[26]. Phương pháp chiết dung môi Dung môi hữu cơ thường được sử dụng để chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật, do tính chọn lọc của chúng đối với các thành phần hữu cơ. Các dung môi hòa lẫn vào nước, methanol, chloroform, n-butanol, ethanol và rượu béo đã được sử dụng để chiết xuất stevioside từ lá cỏ ngọt (Fumio 1980[73], Jackson và cộng sự, 2006[74]; Pol và Shigeji 29

1980[75], Tadaaki 1976[76], Tadashi và Masato 1995[77], Toyoshige và Usei 2002[78]). Stevioside và rebaudioside A được tinh chế thêm bởi quá trình kết tinh và kết tinh lại từ dung môi. Tuy nhiên, nhược điểm chính của các phương pháp này là sử dụng các hóa chất độc hại có hại cho sức khoẻ. Vì vậy, đa số các nghiên cứu sử dụng nước như một dung môi để chiết. Việc sử dụng nước và methanol làm phương tiện chiết xuất trong điều kiện áp suất được nghiên cứu bởi Pol (2007)[75]. Trong một nghiên cứu, Chhaya[79] đã sử dụng cách tiếp cận có hệ thống để đánh giá các điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất stevioside từ lá cỏ ngọt bằng phương pháp phản ứng bề mặt. Các điều kiện tối ưu để chiết là: − Nhiệt độ 78 ° C − Thời gian đun nóng 56 phút − Tỉ lệ lá và nước 1:14 (w / v). Dưới điều kiện này, chiết xuất stevioside là 10,5g / 100g lá khô Stevia. Cần lưu ý rằng các điều kiện trên liên quan đến giống cỏ ngọt của Ấn Độ, cần khảo sát lại khi sử dụng giống cỏ ngọt khác. Phương pháp chiết siêu âm Chiết stevioside bằng phương pháp này đầu tiên do Jaunak và cộng sự (2009). Họ đã tiến hành chiết bột lá cỏ ngọt sử dụng các dung môi khác nhau (nước, methanol, ethanol, hỗn hợp nhị phân của methanol-nước và ethanol-nước) trong một bồn siêu âm ở 35°C trong 30 phút. Dịch chiết được lọc và sấy khô thành bột (ở 50°C). Hàm lượng 4,2% đối với stevioside và 2,0% đối với rebaudioside A đối với hỗn hợp methanol-nước (80: 20) gần như tương đương với kết quả thu được bằng phương pháp thông thường (sử dụng methanol-nước làm dung môi với thời gian 12 giờ), tức là 6,04% stevioside và 1,2% rebaudioside A[26]. Bằng sáng chế Trung Quốc (Ruihua và cộng sự, 2010)[80] cũng mô tả sự hỗ trợ siêu âm trong quá trình chiết xuất lá cỏ ngọt. Bột stevioside 85-98% được sản xuất bằng cách sử dụng các phương pháp khác nhau (keo tụ, lọc, hấp thụ, khử màu, cô đặc và sấy phun) sau khi chiết siêu âm.

Phương pháp chiết bằng vi sóng Một số lợi thế chiết xuất bằng vi sóng (MAE) giúp nó cạnh tranh với các quy trình thông thường khác. Đây là những phương pháp tách nhanh hơn, giảm sử dụng dung môi và tinh chế nhanh hơn. MAE của stevioside và rebaudioside A lần đầu tiên được báo cáo bởi Jaitak et al. (2009)[81]. Trong nghiên cứu này, việc chiết xuất lá cỏ ngọt bằng nước, methanol, ethanol và hỗn hợp nhị phân methanol-nước và etanol-nước được tiến hành với sự hiện diện của lò vi sóng ở các mức công suất khác nhau trong khoảng từ 20 đến 160W với thời gian chiết 30 giây đến 5 giây ở nhiệt độ 10-90°C. Kết luận rằng sản lượng stevioside (8,64%) và rebaudioside A (2,34%) cao hơn so với phương pháp truyền thống (6,54% và 1,20%). Công suất 80W, 50°C và thời gian 1 phút cho kết quả tối ưu. Dung môi nước:methanol (80:20) là môi trường chiết tốt nhất với sự hỗ trợ vi sóng mức tới mức cao nhất. Phương pháp tinh chế bằng các chất tạo phức: Để khắc phục việc sử dụng các hoá chất độc hại và thiết bị chậm, chuyên dụng và đắt tiền như sắc ký và trao đổi ion, các chất tạo phức đôi khi được sử dụng để loại các thành phần không mong muốn / tạo thành phức hợp với các chất này, dẫn đến sự loại bỏ dễ dàng hơn. Kumar (1986)[70] đã đề xuất một quy trình chiết stevioside có sử dụng chất tạo phức. Trong đó lá đã được nghiền nhỏ thành kích thước mong muốn và được chiết xuất với nước nóng ở 60-80°C trong 2-5 giờ. Dịch chiết nước được cho tạo phức với axit carboxylic, chẳng hạn như axit citric, để loại bỏ vật liệu kim loại, protein hoặc màu tạo thành ở khoảng pH 2-4. Hỗn hợp được khuấy khoảng 1-2 giờ ở nhiệt độ 30-80°C và lọc qua celite (chất trợ lọc). Độ pH của dung dịch kết quả tăng lên 10-13 bằng cách sử dụng canxi oxit hoặc canxi hydroxit, được đun nóng trong khoảng từ 35-80oC trong 1-2 giờ và làm lạnh đến nhiệt độ phòng với sự khuấy chậm. Dung dịch này được lọc lại bằng diatomit để loại bỏ các prôtêin, chất màu,… Các dung dịch đã được khử màu sau đó được trung hòa bằng axit cacboxylic hữu cơ như axit citric. Dịch lọc chiết với dung môi như n-butanol bão hòa. Lớp nước sau đó được làm lạnh đến 5-12°C trong 8-14 giờ để lấy tinh thể stevioside đem lọc và sấy khô. Hiệu suất của quá trình là 7.5%. 31

Năm 1990, Giovanetto[68] trong một nghiên cứu về quy trình chiết cỏ ngọt đã sử dụng canxi hydroxit cho vào dịch chiết nước để tạo tủa loại bỏ các hợp chất không mong muốn. Deji (2009) đã phát minh ra một phương pháp cải tiến để chiết xuất stevioside bao gồm các bước sau: − Chiết hoàn lưu với nước − Keo tụ bằng đất sét biến tính − Vi lọc − Hấp thụ bằng nhựa ADS-4 và -7 − Dịch giải ly được cô đặc bằng cô quay chân không Những thuận lợi của quá trình này là: tốc độ nhanh và độ tinh khiết cao (lên đến 90%); các vật liệu nhạy nhiệt không bị phá hủy; Thông lượng cao, và có thể được thực hiện một quá trình liên tục. Weiping và Zhou (1999)[82] mô tả một quy trình để chiết xuất các STEVIOL GLYCOSIDE: − Chiết cỏ ngọt trong nước nóng hoặc dung dịch ethanol trong 1-3 giờ − Dịch chiết được trộn với một dung dịch bão hoà của canxi hoặc nhôm hydroxyd và trộn đều trong 1-3h, kết tủa các chất không mong muốn − Dịch lọc cho qua một cột hấp phụ trung tính, nó hấp thụ các glycosid − Giải ly cột bằng dung dịch ethanol để làm sạch các glycosid − Dịch giải ly bằng ethanol được cho qua cột kiềm thứ hai, nơi các chất không mong muốn được hấp phụ, thu được dung dịch ethanol với glycosid tinh khiết. − Sau đó, dung dịch được sấy phun hoặc cô quay bằng chân không ở 50°C và thu được bột rắn, khoảng 80% độ tinh khiết. Abelyan và cộng sự (2010)[83] đã phát minh ra một phương pháp để trích xuất stevioside và rebaudioside A độ tinh khiết cao từ nhà máy: − Chiết cỏ ngọt với nước ở 50-60 ° C trong khoảng 1-6 giờ. − Tăng hiệu suất chiết bằng cách bổ sung enzym pectinase (2g / L)

− Dịch lọc được kết tủa bằng canxi hydroxit ở khoảng 50°C trong khoảng 1 giờ đến pH khoảng 10,0 và làm mát đến nhiệt độ môi trường xung quanh − Keo tụ dung dịch với bentonit (2-3 g / l) − Dịch lọc trộn với ethanol ở khoảng 50°C trong khoảng 30 phút); Tủa đã được loại ra và bột chứa khoảng 84% rebaudioside A − Dịch thu được cho qua một cột nhựa trao đổi ion sau khi đó bay hơi ethanol, cô đặc và làm khô. Cắn thu được chứa stevioside tinh khiết 93%. Một loạt các bằng sáng chế của Nhật Bản có sẵn để sử dụng các chất tạo phức khác nhau để tinh chế chiết xuất cỏ ngọt. Một số trong đó bao gồm việc sử dụng thiếc chloride, thiếc sulfate, axit stannic,…, các muối Ca và Fe khác nhau (Shinichi và cộng sự, 1980[84]), và sử dụng CaCl2 và Ca(OH)2 (Kotaro Và Tokuo 1987[85], Taku và Yukio 1983[86], Yukio và cộng sự, 1983[87]). Phương pháp trao đổi ion: Trao đổi ion là một quá trình trong đó tạp chất tích điện âm và nó được loại bỏ khỏi dòng nước bằng các chất nhựa tích điện dương[88]. Năm 1973, Persinos[89] đã nộp một bằng sáng chế về sản xuất stevioside từ nhà máy Stevia. Cây và lá đã được sấy khô và nghiền nhỏ trộn với canxi cacbonat và nước và hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20 giờ. Sau đó, chất cặn được lọc, sau đó cô quay loại bớt dung môi và quy trình được lặp lại hai lần. Dịch lọc được trộn với Amberlite IR-120 nhựa trao đổi ion. Chất kết tủa gồm nhựa đã được lọc. Dịch lọc được khử ion bằng cách cho qua hai cột nhựa trao đổi ion (Amberlite IR-120(+) và Duolite A4 (-)). Tập trung dịch qua cột để qua đêm ở 50°C. Cô dịch thu được cắn, sau đó hòa tan trong methanol và làm lạnh đến 5°C để có được tinh thể stevioside. Tăng độ tinh khiết bằng cách kết tinh lại nhiều lần. Năm 1987, Adduci[90] báo cáo cách chiết stevioside bằng ba bước chính: trích nước nóng và sự khử màu bằng điện phân và sau đó trao đổi ion. Độ tinh khiết của stevioside đạt được 70-80% và năng suất khoảng 10%. Nhiệt độ chiết nước là 90-100°C. Điện phân được thực hiện bằng cách sử dụng dòng điện dòng 30 Ampe trong 2 giờ bằng cách bổ sung 0,02M HCl / lít dịch chiết. Lọc hỗn hợp và điện phân lần thứ hai được thực hiện trong khoảng 20-30 phút theo các điều kiện hoạt động ở trên. Sau khi lọc thu được dung dịch có màu vàng, sau đó cho dịch qua một cột nhựa trao đổi ion hỗn hợp bao gồm 33

Amberlite MB-1 (Amberlite IR-120 (+) và Amberlite IRA-401 (-)). Trong dịch đi ra, có một dung dịch trong suốt với độ dẫn điện nhỏ hơn 50 S/m. Cắn thu được sau khi cô quay dung dịch đó không có vị hậu, có thể kết luận đó là rebaudioside A. Bằng sáng chế Hàn Quốc[91] có một phương pháp trong đó dịch chiết được cho qua cột nhựa trao đổi ion tích điện dương (Diaion SKIB) và sau đó cho qua cột nhựa tích điện âm (Amberlite IRA-904). Trong phương pháp này, thu được một hỗn hợp các steviol glycoside. Một quy trình được cấp bằng sáng chế của cùng một công ty bao gồm việc xử lý dịch chiết nước với canxi clorua và sau đó đi qua cột nhựa phân cực vừa Amberlite XAD-7. Giải ly cột bằng methanol và được tinh chế bằng sắc ký cột. Stevioside được tinh chế tiếp bằng cách kết tinh với methanol. Tuy nhiên, trong phương pháp này, cả hóa chất, canxi clorua và methanol, đều độc hại. Phép sắc ký cột cũng không khả thi về mặt thương mại. Trong một bằng sáng chế khác[92], chiết xuất nước đã được xử lý bằng nhựa anion thì stevioside thu được có độ tinh khiết thấp. Trong các bằng sáng chế khác ở Nhật Bản, tinh chế stevioside bằng nhựa trao đổi ion không cần thiết (Toyoshige 1984). Năm 1990, Giovanetto[68] công bố một phương pháp, trong đó dịch chiết nước được ly tâm và sau đó xử lý bằng canxi hydroxit. Dịch đã được lọc tủa được tinh chế bằng cách sử dụng nhựa trao đổi ion tích điện âm (Dowex 50 W và Rohm và Haas IRA 120,…) và ion tích điện dương (Dowex WGR, Dowex MWA-1,Rohm và Haas IR4B,…). Có thể lặp lại nhiều lần, sau đó cô dung dịch thành cắn, chứa 75% stevioside. Năm 1999, Payzant[69] đề xuất một quy trình trao đổi ion hai bước để làm sạch steviol glycoside từ lá cỏ ngọt. Tính năng nổi bật của phương pháp này là tách từng steviol glycoside riêng ra khỏi hỗn hợp của chúng. Trong bước đầu tiên của phương pháp này, chiết lá cỏ ngọt bằng nước. Sau khi chiết, dịch lọc được loại tạp bằng cách tủa với Ca(OH)2. Tiếp theo, lọc loại tủa rồi cho dịch lọc qua một loạt các loại nhựa trao đổi ion để loại bỏ các axit hữu cơ, muối vô cơ, các chất phenol, protein,… Dung dịch thu được có chứa hỗn hợp 70% steviol glycoside. Thu hồi dung môi, thu được bột khô được hòa tan trong nước và được đưa đi qua một lớp nhựa Amberlite XAD-7 (nhựa không phân cực). Steviol glycoside và tạp dầu gây ra vị đắng được hấp thụ trong lớp nhựa, các glycoside không ngọt và tạp chất carbohydrate không bị hấp phụ. Cột được giải ly bằng dung dịch methanol, sau đó cô quay thu được 95% steviol glycoside. Cắn hòa tan vừa 34

đủ với methanol khan, sau đó làm mát thu được kết tinh stevioside, lọc lấy tính thể. Dịch lọc được đun nóng và làm mát sau đó để cho kết tủa thu được rebaudioside A. Chất này có thể tinh chế tiếp bằng cách hòa tan với methanol và đưa nó vào một loạt các bước đun nóng và làm mát để độ tinh khiết cuối cùng của rebaudioside A lên tới 95%. Quy trình có ưu điểm: − Quy trình đơn giản − Ứng dụng được trong công nghiệp − Sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao

Tủa với Ca(OH)2

Dịch chiết nước

Lọc loại tủa Dịch lọc Cô bớt dịch lọc Cột trao đổi ion >70% hỗn hợp steviol glycoside Cột nhựa phân Giải ly cột

cực vừa

bằng MeOH Cô bớt dung môi dịch

>90% hỗn hợp steviol glycoside

giải ly Làm lạnh để tủa

Lọc tủa kết tinh lại nhiều lần thu được stevioside 95% Dịch lọc − Cô bớt dịch lọc − Thêm một ít nước

Kết tủa

Thu được rebaudioside tinh khiết trên 90% Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant Năm 2006, Kumar[93] đã phát triển một quy trình sản xuất stevioside từ lá cỏ ngọt. Trong quá trình này, bột nghiền bột của lá Stevia được chiết xuất với nước ở 50-120°C trong 0.25-4 giờ dưới áp suất 1-8 bar. Chiết xuất sau đó được trộn với calcium hydroxide đến pH 9.2 và xuất hiện tủa. Sau đó, lọc tủa và dịch lọc được cho qua cột nhựa trao đổi cation 36

mạnh, tiếp theo là một nhựa trao đổi anion yếu. Dịch thu được là hỗn hợp steviol glycoside hàm lượng 65%. Năm 2011, Yang và cộng sự[94] đã phát triển một quy trình để thu hồi 99% rebaudioside A tinh khiết 99% từ lá cỏ ngọt. Lá được chiết bằng nước hoặc ethanol hoặc một hỗn hợp của hai ở 50-80°C trong khoảng 30 phút dưới áp suất cao trong khoảng 200-3000MPa. Dịch chiết được cô đặc bằng cách bốc hơi ở nhiệt độ cao, lọc và đi qua một lớp nhựa phân cực chọn lọc, steviol glycoside bị hấp thụ. Cột được giải ly bằng hỗn hợp ethanolnước thu được hỗn hợp steviol glycoside và rebaudioside A được tinh chế bằng cách kết tinh dung dịch giải ly thu được , thu được rebaudioside A tinh khiết 85%. Sau đó tiếp tục kết tinh lại nhiều lần cho đến khi rebaudioside A đạt độ tinh khiết 99%. Một phương pháp để đạt được độ tinh khiết cao stevioside và rebaudioside A đã được đề xuất bởi Purakayastha (2010)[95] và Magomet (2011)[96]. Trong phương pháp này, lá cây đã được nung nóng ở 45-75°C bằng cách sử dụng nước (tỉ lệ lá:nước từ 1kg: 10 L) trong khoảng 1-6 giờ. Dịch chiết lọc được làm nóng đến khoảng 50°C trong 0.5-1.0 giờ bằng cách bổ sung canxi hydroxyd lên pH khoảng 10, lọc loại tủa và dung dịch được trung hòa bằng dung dịch sắt clorua trong khoảng 10-15 phút. Dịch thu được cho qua cột celite (một cột nhựa) để khử ion, và qua ba cột Amberlite để khử màu. Dung dịch được sấy phun và chứa khoảng 65% stevioside và 25% rebaudioside A. Cắn hòa tan trong methanol (ở 20-25°C trong 0.5-1.0 giờ có khuấy, tỉ lệ cắn:dung môi khoảng 1:5 (g:mL)). Làm lạnh để kết tinh, các tinh thể thu được sau lọc và sấy khô, đem phân tích khoảng 90% stevioside. Dung dịch lọc còn lại được cho bay hết methanol. Cắn thu được hòa tan trong ethanol (tỉ lệ 1:5 (g:mL), ở 40-45 ° C trong khoảng 30 phút, khuấy nhẹ). Chất kết tủa được lọc và sấy đạt được khoảng 90% rebaudioside A.

Phương pháp tính chế bằng sắc kí và hấp phụ: Lựa chọn tách một chất từ chất lỏng thường có thể dùng phương pháp hấp phụ. Các hợp chất có tính đặc thù cao có thể được tách một cách chọn lọc bằng các quá trình sắc ký. Sắc ký là một phương pháp phổ biến để phân tách và phân tích các hỗn hợp phức tạp. Năm 2011, Chiang[97] và cộng sự đề xuất phương pháp tách rebaudioside A bằng sắc ký trong đó hỗn hợp steviol glycoside chứa stevioside (38%), rebaudioside A (42%) và các glycoside khác (20%) được hòa tan trong hỗn hợp nước-ethanol. Dung dịch được đưa qua cột nhựa với tỷ lệ cụ thể. Dịch giải ly chứa 69% rebaudioside A, 31% stevioside và các glycoside khác; 93% tổng số rebaudioside A nạp vào cột đã được tinh chế. Sử dụng cột phát triển, một dòng có chứa stevioside và rebaudioside A cũng có thể được phân chia. Một bằng sáng chế của Hoa Kỳ (Yang và các cộng sự, 2011)[94] đã tiết lộ một quy trình trong đó rebaudioside A trong cỏ ngọt bằng cách sử dụng nhựa phân cực trong sắc ký cột silica gel và sử dụng dung môi thích hợp. Sau đó, thu được tinh thể rebaudioside A. Năm 2012, Liu và cộng sự[98] đề xuất một phương pháp tách sắc ký giữa hai STEVIOL GLYCOSIDE, stevioside và rebaudioside A. Những ưu điểm của phương pháp này là nó đơn giản, nhanh và hiệu quả về chi phí. Việc tách và tách cả hai glycosides được thực hiện trong một cột đơn và một bước. Một hỗn hợp gồm 41% stevioside và 35,8% rebaudioside A hòa tan trong dung dịch ethanol được đưa lên trên cột sắc ký đặc biệt bao gồm một thành phần đặc biệt của nhựa polyme polymetacrylate / DVB có chức năng chịu áp suất cao đến khoảng 1500 psi. Cột được rửa bằng áp suất trung bình (dưới 300psi) với dung môi methanolacetone với tốc độ 4-5 mL / phút. Các phân đoạn của stevioside và rebaudioside A được thu thập lại và sau đó kết tinh. Lọc tính thể thu được stevioside và rebaudioside có độ tinh khiết 98% độ tinh khiết với mỗi chất. Sự hấp phụ chọn lọc trên zeolit X và A đã được nghiên cứu với cỏ ngọt và được báo cáo bởi Moraes và Machado (2001)[99]. Nghiên cứu này kết luận rằng CaX Zeolite có hiệu quả hơn trong việc làm rõ sự trích xuất của Stevia trong nước nóng. Cả zeolit bột và hạt đều gần như hiệu quả. Các điều kiện điều trị tối ưu là zeolit 40% (g/g), thời gian tiếp xúc 60 phút ở 30°C. Thu được độ tinh khiết 70%. Zeolite tái sử dụng cũng cho thấy hiệu suất tương đương. Các tác giả cũng tiến hành thí nghiệm cột liên tục cho thấy sử dụng 38

tốc độ dòng chảy 30 L/ngày, có thể tinh chế cỏ ngọt bằng cách sử dụng zeolite lên đến khoảng 60% trong 11 giờ. Năm 2009, Rajab [100] đã phát triển một quy trình gồm hai bước để làm trong và tinh chế dịch chiết. Lá cỏ ngọt khô được đun sôi với nước (tỷ lệ lá:nước 1 kg: 5 L) trong 3 giờ và lọc dịch chiết xuất. Tiếp theo, dịch chiết được xử lý bằng 10% than hoạt tính trong 20 phút. Dịch chiết được và than hoạt tính được trộn với nước sôi trong 10 phút và lọc để thu hồi stevioside. Lặp lại quá trình này ba lần. Trong quá trình này, một số lượng chlorophyll, phenol và carotenoid đã được loại bỏ. Trong bước tiếp theo, dịch chiết vàng được xử lý với 5% celite và khuấy trong 20 phút. Ly tâm dịch chiết không màu ở tốc độ 12.000 vòng / phút trong vòng 15 phút và dung dịch nước sạch được thu hồi và lưu trữ. Dịch thu được đem sấy khô (nhiệt độ đầu vào 180°C, nhiệt độ đầu ra 95°C, áp suất 500 psi) để có bột màu trắng. Nồng độ cuối cùng của Stevioside là 11,6%. Năm 2002, Rongfu Shi[101] và các đồng nghiệp đã tổng hợp các chất hấp phụ polyme bằng cách đưa vào nhóm amoni thành vật liệu hấp phụ nhựa thông thường tinh chế các hợp chất steviol glycoside. Kết quả của thí nghiệm đã kết luận rằng khả năng hấp phụ các hợp chất steviol glycoside giảm và hiệu quả khử màu tăng vì nồng độ của nhóm amoni bậc bốn trong chất hấp phụ tăng. Cơ chế hấp phụ và khử màu cũng đã được đề xuất[101]. Một số phương pháp khác Năm 1997, Liu[102] trích stevioside từ lá cỏ ngọt khô với methanol nóng. Họ cũng nghiên cứu dịch chiết của steviol glycoside, như rebaudioside A, rebaudioside C, và dulcoside A bằng cách chiết xuất chất lỏng dưới tới hạn (Sub FE). Phương pháp đơn giản Sub FE hiệu suất nhỏ được phát triển và hiệu xuất hơn 88% dịch chiết thu được bằng cách sử dụng methanol. Một số nghiền cứu tinh chế steviol glycoside bằng công nghệ màng, có thể được sử dụng ở nhiệt độ phòng dẫn đến không có sự thay đổi pha; không có hóa chất được thêm vào; nó rất dễ dàng để mở rộng quy mô [103]. Như vậy, công nghệ đã được sử dụng rộng rãi để xử lý nước táo, nước mosambi nước ép lựu, nước ép cà rốt…[103]. Có khá nhiều bằng sáng chế sử dụng công nghệ màng. Năm 1990, Fuh và Chiang sử dụng muối vô cơ và màng siêu lọc giảm khối lượng phân tử (MWCO) 25,000 và 100,000 Da để tinh chế 39

stevioside, sau đó thẩm thấu ngược và sử dụng trao đổi ion, 45% stevioside thu hồi sau siêu lọc[67]. Năm 2000, Zhang và Kumar[71] sử dụng màng vi lọc, sau đó dùng màng siêu lọc, cuối cùng dùng màng lọc nano để lọc sạch dịch chiết cỏ ngọt[71]. Năm 2007, Sliva và Bergamasco đã dùng Zeolite hiệu chỉnh (NaX) trước khi lọc bằng màng vi lọc, lọc sạch xấp xỉ 80-100% dịch chiết cỏ ngọt với màng kích cỡ khe lọc thay đổi và áp suất vận hành khác[104]. Năm 2009, Reis sử dụng màng vi lọc ceramic đê lọc dịch chiết Cỏ ngọt. Một nghiên cứu khác bởi , so sánh sự khác nhau sử dụng màng PES may đo và thương mại trong lọc sạch stevioside[105]. Phương pháp Accelerated Solvent Extraction (ASE) là công nghệ chiết tự động sử dụng ở nhiệt độ và áp suất cao thực hiện trong thời gian ngắn. Nhiệt độ cao dẫn đến khả năng hòa tan tốt hơn chất phân tích, tốc độ khuếch tán nhanh hơn, độ nhớt dung môi thấp hơn và sự suy yếu các tương tác chất tan – chất dính. Áp suất cao cho phép làm việc với các dung môi dạng lỏng trên điểm sôi của chúng và tăng tốc quá trình chiết tổng thể [106]. Cuối cùng, so với phương pháp thông thường khác, tự động hóa, hiệu suất chiết, độ thu hồi cao và thu được sản phẩm trong thời gian ngắn [107]. 1.2.2.2.

Các phương pháp định lượng các hợp chất steviol glycoside

Trước đây từ rất lâu trên thế giới, đã có rất nhiều phương pháp có sẵn để xác định độ ổn định và độ tinh khiết của rebaudioside A và stevioside, và các phương pháp đó đã được áp dụng cho các mẫu cỏ ngọt trồng ở các khí hậu và các nước khác nhau, cũng như những đồ uống và thực phẩm chứa những chất ngọt đó [1, 4, 108]. Các phương pháp cơ bản định tính và định lượng cho chất làm ngọt cỏ ngọt được phân loại trước đây dựa trên sự xác định màu, phương pháp enzyme sử dụng enzyme hesperidinase thô, phương pháp sắc kí khí-lỏng (GLC), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí bản mỏng (TLC)/phép đo tỉ trọng [1]. Năm 1977, H. Sugisawa cùng đồng nghiệp đã định lượng stevioside bằng cách ứng dụng phương pháp màu Carr-Price, phản ứng tạo màu xanh lam với thuốc thử SbCl3/cloroform, đo E ở bước sóng 524 nm[109]. Trước đây có một phương pháp được công bố về stevioside, rebaudiana A và steviolbioside trong trích ly cỏ ngọt thương mại, nó sử dụng điện di mao mạch ở chế độ mixen (MEKC) [110]. Một cách tiếp cận khác là phân tích định lượng stevioside trong lá cỏ ngọt sử dụng phương pháp phổ phản xạ hồng ngoại gần

[111]

. Dần dần, các phương pháp phân tích liên quan đến stevioside, 40

rebaudioside và chất ngọt tương tự, các sản phẩm phân hủy và chuyển hóa không yêu cầu dẫn xuất hóa học. Ngày nay, có một vài phương pháp xác định nồng độ glycoside, xác định các hợp chất đa glycoside, một vài glycoside phức tạp trong cây cỏ và ngũ cốc như sắc kí khí quang phổ hồng ngoại, quang phổ khối lượng

[10]

[103]

, cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ,

HPLC,… Trong đó, phương pháp đơn giản nhất, phổ biến nhất và hiệu quả nhất là HPLC, còn được sử dụng để xác định hợp chất trong cỏ ngọt ở những vùng địa lý khác nhau[24]. Trong tài liệu khoa học, chỉ ra nhiều cách xác định stevioside, rebaudioside A và steviol như thủy phân men & dò hóa chất, GC, TLC áp suất dư, đo tỉ trọng, HPLC và điện di mao dẫn [22]. Mô hình quang phổ hồng ngoại gần (NIR) đã được thiết lập để đo trực tiếp nồng độ các stevioside glycoside (rebaudioside A và stevioside) trong lá S. rebaudiana Bertoni. Mô hình này có thể được áp dụng để đo nồng độ rebaudioside A và stevioside trong lá lá S. rebaudiana Bertoni, và giải quyết được vấn đề giá cao và vận hành phức tạp trong các phương pháp trong phòng thí nghiệm hiện nay [112]. Phương pháp LC-TOF định tính đã được dự kiến để đánh giá các hợp chất steviol glycoside

[18]

cùng với phương pháp HPTLC được phê chuẩn cùng với thiết bị dò tỷ

trọng[113] và phương pháp NIRS cho việc định lượng steviol glycosides [114]. Trước đây, một phương pháp xác định bán định lượng các hợp chất steviol glycoside được thực hiện bằng phương pháp khối phổ ion hóa tia điện không thấm [115]. Đối với định lượng steviol năm 2009 Minne thực hiện phương pháp RP-LC với đầu dò fluorometric sau khi dẫn xuất bởi một sản phẩm phụ coumarin. Cuối cùng, phương pháp định lượng syevioside phổ biến nhất, được sử dụng rộng rãi nhất là HPLC với cột Silicagel pha đảo C18. Điều kiện vận hành cột: − Nhiệt độ thường − Hệ dụng môi giải ly acetonitrile:nước tỉ lệ 80:20 − Tôc độ dòng: 1µm/mL − Đầu dò UV-vis 210nm

CHƯƠNG 2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1.

Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu

Hoàn thiện và khảo sát quy trình tách chiết chất ngọt từ cỏ ngọt, định hướng ứng dụng trong quy mô công nghiệp. Đối tượng nghiên cứu là lá và cành cây cỏ ngọt được phân phối bởi công ty Thảo dược Tấn Phát. 2.2.

Nội dung nghiên cứu

Với mục tiêu như trên, đề tài dự kiến tiến hành các công việc như sau: − Khảo sát quy trình chiết cỏ ngọt với dung môi nước − Khảo sát quy trình quy trình tinh chế các chất ngọt steviol glycoside

2.3.

Hóa chất và thiết bị 2.3.1.

Hóa chất

− Nước cất, PTN hóa dược, Đại học Bách Khoa TpHCM − Ca(OH)2, CHEMSOL, Việt Nam − Citric acid, CHEMSOL, Việt Nam − HCl, CHEMSOL, Việt Nam − NaOH, CHEMSOL, Việt Nam − Nhựa trao đổi cation, Việt Nam − Nhựa trao đổi anion, Việt Nam

2.3.2.

Thiết bị

− Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis Thermo Genesys 10S UV-Vis; − Máy đo màu Minonta CR400; − Máy đo độ ẩm Satorius MA 35.

2.4.

Thực nghiệm 2.4.1.

Nguyên liệu

Thu gom nguyên liệu: Lá và cành cỏ ngọt khô dùng làm nguyên liệu được mua tại công ty thảo dược Tấn Phát Xử lý nguyên liệu: Lá và cành khô mua về được bảo quản trong bọc kín có túi hút ẩm. 2.4.2.

Phương pháp đo độ ẩm

Độ ẩm được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius MA 35. Cách tiến hành: Cân 0.2 g nguyên liệu trải thành một lớp mỏng trên đĩa nhôm, cho vào máy đo độ ẩm. Nguyên liệu được sấy ở 105 oC đến khối lượng không đổi. Kết thúc đo khi màn hình máy hiện chữ END vả đọc độ ẩm trên máy. Độ ẩm được xác định bằng công thức: W(%) =

khối lượng đầu − khối lượng sau × 100 khối lượng đầu

Phép đo dược thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình. Từ độ ẩm (W), khối lượng nguyên liệu khô (mnlk) được tính theo công thức:

m = 2.4.3.

â ×(!""#$) !""

(g)

Khảo sát điều kiện chiết cỏ ngọt với dung môi nước

Quá trình tối ưu điều kiện chiết sẽ khảo sát theo các yếu tố: dạng nguyên liệu, tỉ lệ rắn/lỏng, nhiệt độ, thời gian và số lần chiết để thu được hiệu suất chiết tốt nhất. Đáp ứng: − Cân khối lượng − Đo độ ẩm cao − UV-Vis: đo độ hấp thu chất ngọt trong vùng UV (λ=210 nm) − TLC: bán định lượng chất ngọt

Thực hiện bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): 43

− Pha tĩnh: Sắc ký lớp mỏng Merck GF 60 tráng sẵn − Pha động: EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5 − Thuốc thử nhận danh: H2SO4:Cồn = 1:5

Hiệu suất chiết được tính theo công thức:

m cao × (1 − w cao ) × 100% m nlk

Trong đó: mcao: khối lượng cao tổng thu được (g); mnlk: khối lượng nguyên liệu quy khô (g); wcao: độ ẩm cao (%).

 Khảo sát yếu tố dạng nguyên liệu chiết Mục đích: Chọn ra dạng nguyên liệu chiết thích hợp hòa tan tối đa lượng chất ngọt có trong cỏ ngọt. Phương pháp: Lần lượt với mỗi dạng nguyên liệu: lá nguyên, bán nguyên, bột mịn lấy 50 g cỏ ngọt chiết với dung môi nước, tỉ lệ rắn/lỏng 1:6 (g/mL), thời gian chiết 30 phút, ở nhiệt độ 80 oC, chiết 2 lần.  Khảo sát yếu tố tỉ lệ rắn/lỏng Mục đích: Chọn ra tỉ lệ rắn/lỏng đủ để chiết ra các hợp chất ngọt trong cỏ ngọt, việc khảo sát yếu tố tỉ lệ rắn/lỏng giúp tiết kiệm dung môi sử dụng. Phương pháp: Lấy 50 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi nước lần lượt với tỉ lệ rắn/lỏng là 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 (g/mL), trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 80 oC, chiết 2 lần.  Khảo sát yếu tố thời gian mỗi lần chiết Mục đích: nhằm xác định thời gian chiết đủ để hòa tan tối đa các chất ngọt trong cỏ ngọt, yếu tố này ảnh hưởng đến tính kinh tế và năng suất đáng kể.

Phương pháp: Lấy 25 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi nước tỉ lệ rắn/lỏng thích hợp, trong khoảng thời gian lần lượt 10, 20, 30, 40, 50, 60 (phút) ở nhiệt độ 80 oC, chiết 2 lần.  Khảo sát yếu tố nhiệt độ Mục đích: nhiệt độ có thể làm thay đổi đến tính chất của dung môi, các chất ngọt steviol glycoside trong cỏ ngọt, làm thay đổi khả năng hòa tan các hợp chất đó, dẫn đến thay đổi hiệu suất chiết. Do đó, cần khảo sát yếu tố nhiệt độ để chọn ra nhiệt độ thích hợp để hiệu suất chiết là cao nhất. Phương pháp: Lấy 25 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi nước tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian thích hợp, ở các nhiệt độ lần lượt 60, 70, 80, 90, 100 (oC), chiết 2 lần.  Khảo sát yếu tố số lần chiết Mục đích: nhằm xác định số lần chiết để thu được hiệu suất chiết cao đồng thời thỏa mãn được yếu tố tiết kiệm chi phí dung môi, năng lượng và thời gian trong quá trình chiết. Phương pháp: Lấy 25 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi nước theo tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian, nhiệt độ thích hợp, số lần chiết thay đổi lần lượt 1, 2, 3,4 lần. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.

2.4.4.

Khảo sát quy trình tinh chế các hợp chất steviol glycoside Dịch chiết nước

Gia vôi

Trung hòa bằng citric acid Loại màu

Trao đổi nhựa anion

Trao đổi nhựa cation

Cô đặc dung dịch

Hình 2.1. Quy trình tinh chế các chất ngọt trong cỏ ngọt Mô tả quy trình Dịch chiết nước cỏ ngọt thu được đem tủa với Ca(OH)2 để loại acid tạo tủa, chất màu, nhựa, chất béo, sáp,...Tiến hành lọc loại tủa với chất trợ lọc diatomite. Trung hòa dịch lọc thu được bằng citric acid. Sau đó, tiếp tục loại màu bằng cột nhựa trao đổi cation và anion. Cô đặc dung dịch thu được cao có nồng độ các chất ngọt cao. Tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (TLC) trong quá trình loại màu để bán định lượng dung dịch thu được so với dung dịch chiết ban đầu. Đồng thời, đo UV/Vis tại bước sóng hấp thu của stevioside (λ=210 nm), và cường độ màu (L*, a*, b*) để so sánh với dung dịch gốc và các dung dịch với nhau để tối ưu các yếu tố khảo sát. Phương pháp so sánh màu: 2 2 2 Độ khác biệt màu sắc: ∆E*ab = (L*-L0 ) +(a*-a 0 ) +(b*-b0 )

Trong đó: L*, a*, b*: của dung dịch sau loại màu; L0, a0, b0: của dung dịch gốc trước khi loại màu.

2.4.4.1.

Khảo sát quá trình gia vôi

Nguyên tắc: vôi là chất vô định hình có độ phân tán cao. Khi hòa tan trong nước có tính chất keo. Độ hòa tan của vôi trong nước, trong dung dịch cỏ ngọt có ý nghĩa rất lớn vì các quá trình lý hóa của giai đoạn làm sạch loại màu phụ thuộc vào độ hòa tan của vôi. Vôi

đường

hòa tan keo tụ Khi vôi cho vào dung dịch cỏ ngọt, sẽ có những tác dụng sau đây: − Kết tủa hoặc đông tụ những chất không đường, đặc biệt protein, pectin, chất màu và những acid tạo muối không tan; − Phân hủy một số chất không đường;Tác dụng cơ học: những kết tủa được tạo thành có tác dụng kéo theo những chất lơ lửng, và những chất không đường khác; − Sát trùng dung dịch, làm vi sinh vật không sinh trưởng được. Quá trình gia vôi sẽ khảo sát các yếu tố: nồng độ dung dịch, tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao, nhiệt độ, thời gian để chọn điều kiện loại các chất màu trong dịch chiết cỏ ngọt tốt nhất đồng thời hạn chế lượng các chất ngọt bị mất trong quá trình loại màu bằng gia vôi ít nhất. Đáp ứng: − UV-Vis: đo độ hấp thu chất ngọt trong vùng UV (λ=210nm) − L, a, b: đo màu dung dịch sau phản ứng − TLC: bán định lượng chất ngọt  Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch Mục đích: nồng độ dung dịch cũng ảnh hưởng đến độ hòa tan vôi trong dung dịch, dẫn đến ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa loại tạp màu của vôi, nên chọn nồng độ dung dịch thích hợp để gia vôi có hiệu quả tốt nhất và phù hợp vơi nồng độ ban đầu của dịch chiết thu được. Phương pháp: Lấy 100 g cỏ ngọt chiết với dung môi nước theo các điều kiện thích hợp đã được khảo sát. Dịch chiết thu được cô quay loại bỏ hoàn toàn dung môi. Sau đó, cân 47

22.5 g cao (bỏ qua độ ẩm cao) hòa tan rồi định mức trong bình định mức 250 mL, ta được dung dịch gốc nồng độ 90 g/mL. Lần lượt lấy 10 mL dung dịch gốc pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 (g/mL). Sau đó, cho phản ứng với Ca(OH)2 với tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 1.5/1 (g/g), ở nhiệt độ phòng, trong khoảng thời gian 10 phút. Lọc các dịch thu được sau đó đem trung hòa với citric acid đến khoảng pH=6, cô quay và định mức về 10 mL dung dịch ban đầu. Lúc này, các dung dịch với nồng độ khác nhau đã quay về thể tích ban đầu giúp cho việc so sánh độ giảm màu dễ dàng hơn.  Khảo sát yếu tố tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao Mục đích: lượng Ca(OH)2 cho vào dung dịch cần lớn hơn lượng Ca(OH)2 có thể hòa tan, do đó cần khảo sát lượng Ca(OH)2 cho vào thích hợp nhất để loại màu tốt nhất và thỏa mãn tính kinh tế. Phương pháp: với nồng độ dung dịch thích hợp cho phản ứng với Ca(OH)2 theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao lần lượt là 0.5/1, 1/1, 1.5/1, 2/1 (g/g) , ở nhiệt độ phòng, trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó, đem các dung dịch thu được sau khi lọc loại tủa trung hòa đến khoảng pH=6.  Khảo sát yếu tố nhiệt độ Mục đích: nhiệt độ ảnh hưởng đến độ hòa tan của vôi trong dung dịch, dẫn đến ảnh hưởng đến khả năng loại màu của vôi. Do đó, cần khảo sát nhiệt độ thích hợp để quá trình loại màu diễn ra tốt nhất. Phương pháp: với nồng độ dung dịch thích hợp cho phản ứng với Ca(OH)2 theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao thích hợp, ở các nhiệt độ lần lượt 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 (oC), trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó, đem các dung dịch thu được sau khi lọc loại tủa trung hòa đến khoảng pH=6.  Khảo sát yếu tố thời gian Mục đích: nhằm xác định thời gian phản ứng tốt nhất cho quá trình gia vôi loại màu, đồng thời thỏa mãn tính kinh tế. Phương pháp: với nồng độ dung dịch thích hợp cho phản ứng với Ca(OH)2 theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao, nhiệt độ thích hợp, trong các khoảng thời gian lần lượt 48

là 2, 5, 10, 15 (phút). Sau đó, đem các dung dịch thu được sau khi lọc loại tủa trung hòa đến khoảng pH=6. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.

2.4.4.2.

Khảo sát quá trình sắc ký trao đổi cation và anion

Nguyên tắc: trao đổi ion là một phương pháp mà trong một số điều kiện, một chất không tan (nhựa) hút một ion dương hay âm của một dung dịch và nhả ra một ion khác cùng dấu. Hiện tượng này dựa trên phản ứng tổng quát sau: n(R-A+) + Bn+ → Ra-Bn+ + nA+ Trong đó: R- gốc hút anion của nhựa trao đổi ion; A+ các ion trao đổi của nhựa; Bn+ các ion hòa tan trong dung dịch. Sau một thời gian nhất định, phản ứng trao đổi xảy ra cân bằng.  Quá trình chuẩn bị nhựa trao đổi ion Cho dung dịch HCl 1N đối với nhựa cation và dung dịch NaOH 1N đối với nhựa anion chảy qua cột với tốc độ dòng chảy rất nhỏ (8 mL/phút) cho đến khi dung dịch ra khỏi cột có nồng độ HCl và NaOH bằng nồng độ đầu vào (có thể dùng giấy pH để ước tính). Phản ứng chuyển đổi ion trao đổi của nhựa xảy ra như sau: R – Na+ + H+ → R – H+ + Na+ R – Cl- + OH- → R – OH- + Cl Quá trình tái sinh cột nhựa trao đổi ion trong các thí nghiệm Quá trình tái sinh cột trao đổi ion sau các thí nghiệm là quá trình tái sinh cùng chiều. Bao gồm các bước sau: − Rửa cột bằng nước cất sau mỗi thí nghiệm nhằm loại bỏ dung dịch trong khoảng trống giữa các hạt nhựa. − Thực hiện quá trình tái sinh cùng chiều, dung dịch HCl 1N (đối với nhựa cation), dung dịch NaOH 1N (đối với nhựa anion) được cho chảy qua cột với tốc độ dòng 49

chảy 4mL/phút, cho đến khi dung dịch đầu ra có nồng độ bằng dung dịch đầu vào. − Sau khi tái sinh cột cũng được rửa lại bằng nước cất với tốc độ dòng chảy cao cùng chiều với dòng tái sinh nhằm loại bỏ dung dịch HCl (hay NaOH) trong khoảng trống giữa các hạt nhựa. Mặt khác còn làm rỗng tầng nhựa để thuận lợi cho thí nghiệm tiếp theo. Cột trao đổi ion sử dụng trong thí nghiệm là cột nhựa có các thông số sau đây: − Chiều cao cột: 20 cm − Đường kính cột trong: 2.7 cm Quá trình trao đổi nhựa ion cần khảo sát 2 yếu tố: tốc độ dòng chảy, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dung dịch để chọn điều kiện loại màu tốt nhất và làm hao hụt rất ít lượng chất ngọt steviol glycoside có trong dịch. Đáp ứng: − UV-Vis: đo độ hấp thu chất ngọt trong vùng UV (λ=210 nm) − L*, a*, b*: đo màu dung dịch sau sắc ký − TLC: bán định lượng chất ngọt  Khảo sát yếu tố tốc độ dòng chảy Mục đích: tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến tốc độ trao đổi cột do đó cần khảo sát để chọn điều kiện loại màu nhất, chất ngọt bị hấp thu ít nhất đồng thời đảm bảo tính kinh tế. Phương pháp: Lấy 80 mL dung dịch đã được loại màu bằng gia vôi với các điều kiện thích hợp nhất đã khảo sát ở trên, cho chảy qua cột có thể tích nhựa 8mL với tốc độ dòng chảy lần lượt là 0.5, 1, 1.5, 2 (mL/phút), tái sinh nhựa sau mỗi thí nghiệm.  Khảo sát yếu tố tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dung dịch Mục đích: cột nhựa trao đổi sau một thời gian nhất định sẽ xảy ra trạng thái cân bằng, nhựa hết khả năng trao đổi, thành phần hóa học của dung dịch đầu vào và ra giống nhau, khi đó cột cần tái sinh. Vì vây, chọn tỉ lệ thể tích dịch trên thể tích nhựa thích hợp sao cho cột chưa đạt cân bằng và loại màu tốt nhất mà vẫn thỏa mãn tính kinh tế.

Phương pháp: Lấy lần lượt 40, 80, 120, 160 (mL) dung dịch đã được loại màu bằng gia vôi với các điều kiện thích hợp nhất đã khảo sát, cho chảy qua cột có thể tích nhựa 8mL với tốc độ dòng chảy thích hợp, tái sinh nhựa sau mỗi thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.

CHƯƠNG 3. 3.1.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả khảo sát quá trình chiết nước

Đánh giá nguyên liệu: − Nguyên liệu có độ ẩm trung bình 10.60% − Nguyên liệu có màu xanh nhạt Đánh giá quá trình chiết: − Dịch chiết cỏ ngọt thu được có màu nâu đen, mùi thơm nhẹ giống mùi nước trà; − Quá trình lọc có nhiều bọt − Cao sau khi cô quay chân không có màu nâu đen đậm, cao khá giống với mạch nha nhưng khô hơn.

Stevioside Rebaudiana A

Hình 3.1. TLC bột steviol glycoside có hàm lượng > 95% Năm 2009, tác giả Nguyễn Thị Lý cùng cộng sự đã phân lập và nhận danh được rebaudiana A và stevioside, vết của hai hợp chất được thể hiện trong Hình 3.1.

3.1.1.

Khảo sát dạng nguyên liệu chiết

Điều kiện khảo sát: − Nhiệt độ: 80 oC − Thời gian: 30 phút − Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/6 (g/mL) 52

− Chiết 2 lần.

Hình 3.2. Nguyên liệu dạng: A – lá nguyên; B – bán nguyên; C – bột mịn. 2.0

40.0

1.8

35.0

1.6 1.4 25.0

1.2

20.0

1.0 0.8

15.0

Abs (A)

Hiệu suất chiết (%)

30.0

0.6 10.0 0.4 5.0

0.2

0.0

0.0 Lá nguyên

Bán nguyên

Bột mịn

Dạng nguyên liệu Hiệu suất (%)

Abs (A)

Hình 3.3. Hiệu suất chiết theo dạng nguyên liệu chiết (Phụ lục 1) 53

Hình 3.4. TLC các dịch chiết trong khảo sát dạng nguyên liệu chiết Dựa vào Hình 3.3 và Hình 3.4, nhận thấy nguyên liệu dạng bột mịn có hiệu suất cao nhất, đồng thời vết rebaudiana A đậm nhất. Tuy nhiên, quá trình lọc dịch chiết nguyên liệu dạng bán nguyên và bột mịn bị cản trở bởi bọt nên tốn nhiều thời gian lọc hơn dạng lá nguyên. Bên cạnh đó, hiệu suất chiết giữa các dạng chênh lệch không đáng kể. Vì vậy, chọn nguyên liệu dạng lá nguyên để khảo sát tiếp.

3.1.2.

Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng

Điều kiện khảo sát: − Dạng nguyên liệu: lá nguyên − Nhiệt độ: 80 oC − Thời gian: 30 phút − Chiết 2 lần

40.0 1.4 35.0 1.2 1.0

25.0

0.8

20.0

0.6

15.0 10.0

0.4

5.0

0.2

0.0

Abs (A)

Hiệu suất chiết (%)

30.0

0.0 1/6

1/7

1/8

1/9

Tỉ lệ rắn/lỏng Hiệu suất (%)

Abs (A)

Hình 3.5. Hiệu suất chiết theo tỉ lệ rắn/lỏng (Phụ lục 2)

Hình 3.6. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng Tỉ lệ rắn/lỏng càng cao thì hiệu suất chiết và lượng chất ngọt càng tăng, đến tỉ lệ 1/8 (g/mL) thì lượng chất tách ra hầu như không đổi (Hình 3.5). Nguyên nhân khi lượng dung môi tăng lên thì khả năng tiếp xúc với nguyên liệu càng lớn, khi đó lượng chất

ngọt steviol glycoside tách ra càng nhiều và hầu như được tách hoàn toàn ở tỉ lệ 1/8. Do đó, chọn tỉ lệ rắn/lỏng 1/8 (g/mL) là thích hợp nhất.

3.1.3.

Khảo sát thời gian chiết

Điều kiện khảo sát: − Dạng nguyên liệu: lá nguyên − Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/8 (g/mL) − Nhiệt độ: 80 oC − Chiết 2 lần 40.0 1.4 35.0 1.2 30.0

0.8

20.0

Abs (A)

Hiệu suất chiết

1.0 25.0

0.6

15.0 10.0

0.4

5.0

0.2

0.0

0.0 10

Thời gian (phút) Hiệu suất (%)

Abs (A)

Hình 3.7. Hiệu suất chiết theo thời gian (Phụ lục 3)

Hình 3.8. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết Dựa vào Hình 3.7 thời gian khảo sát càng dài khối lượng cao thu được càng tăng, hiệu suất tăng mạnh trong khoảng thời gian 20 đến 30 phút, đồng thời lượng chất ngọt thu được từ 30 phút trở đi có xu hướng không thay đổi. Điều này có thể giải thích như sau: các hợp chất ngọt steviol glycoside rất dễ tan trong nước, lá cỏ ngọt mỏng và xốp nên truyền khối tốt, do đó thời gian 30 phút cho phép tách gần như hoàn toàn lượng chất ngọt có trong mẫu. Vậy để tiết kiệm thời gian và chi phí gia nhiệt chọn 30 phút là thời gian trích ly phù hợp.

3.1.4.

Khảo sát nhiệt độ

Điều kiện khảo sát: − Dạng nguyên liệu: lá nguyên − Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/8 (g/mL) − Thời gian: 30 phút − Chiết 2 lần

40.0 1.4 35.0 1.2

1.0 25.0 0.8

20.0

Abs (A)

Hiệu suất chiết (%)

30.0

0.6

15.0 10.0

0.4

5.0

0.2

0.0

0.0 60

100

Nhiệt độ ( C) Hiệu suất (%)

Abs (A)

Hình 3.9. Hiệu suất chiết theo nhiệt độ (Phụ lục 4)

Hình 3.10. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát nhiệt độ chiết Từ Hình 3.9 cho thấy khi nhiệt độ càng cao thì hiệu suất chiết và lượng chất ngọt steviol glycoside thu được càng tăng, đạt cực đại tại 90 oC. Nguyên nhân là khi nhiệt độ tăng thì thuận lợi cho việc phá hủy màng tế bào thực vật, độ hòa tan của các chất ngọt tăng, dẫn đến tăng hiệu suất chiết. Vì vậy, chọn nhiệt độ chiết là 90 oC để khảo sát tiếp. 58

3.1.5.

Khảo sát số lần chiết

Điều kiện khảo sát: − Dạng nguyên liệu: lá nguyên − Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/8 (g/mL) − Nhiệt độ: 90 oC − Thời gian: 30 phút. 45.0 1.4 1.2

35.0 30.0

1.0

25.0

0.8

20.0

0.6

Abs (A)

Hiệu suất chiết (%)

40.0

15.0 0.4

10.0

0.2

5.0 0.0

0.0 1

Số lần chiết (lần) Hiệu suất (%)

Abs (A)

Hình 3.11. Hiệu suất chiết theo số lần chiết (Phụ lục 5)

Hình 3.12. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết Khi tăng số lần chiết, hiệu suất chiết tăng mạnh, tuy nhiên sau lần chiết 2 thì lượng tăng đó không đáng kể. Do ở lần chiết thứ nhất lượng chất tách ra chưa hết, kể từ lần chiết thứ 2, lượng chất ngọt cũng như các chất hữu cơ khác trong cỏ ngọt được tách ra gần như tối đa, dẫn đến hiệu suất chiết tăng không đáng kể ở các lần chiết sau. Để tiết kiệm dung môi và thời gian cho quá trình cô dung môi để thực hiện các giai đoạn tinh chế sau, chọn số lần chiết thích hợp là 2 lần.

3.2.

Khảo sát quá trình gia vôi

Stevioside Rebaudioside A

Hình 3.13. TLC chưa hiện màu và đã hiện màu của dịch chiết ban đầu A: là chất tạo màu vàng nâu của dịch chiết (hệ giải ly EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5) Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy tạp chất gây màu vàng sậm (A) của cao chiết ban đầu có độ phân cực thấp hơn stevioside, rebaudioside A. Các chất màu (A) cần phải được loại bỏ thông qua việc khử màu bằng quá trình gia vôi và sắc kí cột trao đổi nhựa ion. Vì (A) là các chất màu, nên hiệu quả của quá trình khử màu được đánh giá thông qua độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dung dịch sau khi được loại màu bằng gia vôi và sắc kí nhựa; độ chênh lệch màu ∆E*ab càng lớn, hiệu quả khử màu càng cao. Ngoài ra còn đánh giá độ hấp thu chất ngọt stevioside trong vùng UV (λ=210 nm) để ước chừng độ giảm lượng chất ngọt sau quá trình loại màu, do dung dịch có màu do các chất màu gây ra nó có thể che các hợp chất ngọt làm giảm độ hấp thu của nó nên cách đánh giá này mang tính chất tương đối không có độ chính xác cao.

3.2.1.

Khảo sát nồng độ dịch chiết

Điều kiện khảo sát: − Nhiệt độ: nhiệt độ phòng − Thời gian: 10 phút 61

− Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng chất rắn : 1.5/1 (g/g) . 20.0 1.4

18.0 16.0

1.2 1.0

12.0 0.8

10.0 8.0

0.6

6.0

Abs (A)

∆ E*ab

14.0

0.4

4.0 0.2

2.0

0.0

0.0 10

Nồng độ dung dịch trước phản ứng (g/ml) Delta E*ab

Abs (A)

Hình 3.14. Độ khác biệt màu sắc ∆E của các dịch thu được so với dung dịch gốc (Phụ lục 6)

Hình 3.15. TLC các dung dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ

Hình 3.16. Các dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ Từ Hình 3.14 cho thấy khả năng loại màu hiệu quả tại nồng độ 80 g/mL và 90 g/mL, trong đó nồng độ 80 g/mL cho hiệu quả tốt nhất. Điều này có thể giải thích như sau: nồng độ dung dịch tăng thì độ hòa tan của vôi tăng dẫn đến phản ứng keo tụ diễn ra tốt hơn. Tuy nhiên, dịch chiết thô ban đầu có nồng độ khoảng 30 g/mL, để thuận lợi cho quá trình cô đặc nên chọn nồng độ 90 g/mL (cô dịch chiết cho đến khi còn 1/3 so với thể tích dung dịch đầu) là nồng độ tốt nhất để khảo sát quá trình gia vôi.

3.2.2.

Khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao

Điều kiện khảo sát: − Nồng độ dung dịch: 90 g/mL − Nhiệt độ: nhiệt độ phòng − Thời gian: 10 phút

25.0 1.4 20.0

1.2

∆ E*ab

15.0 0.8

10.0

Abs (A)

1.0

0.6 0.4

5.0 0.2 0.0

0.0 0.5/1

1/1

1.5/1

2/1

Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao Delta E*ab

Abs (A)

Hình 3.17. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao so với dung dịch gốc (Phụ lục 7)

Hình 3.18. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao

Hình 3.19. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao Từ Hình 3.17 Hình 3.17khi tỉ lệ lượng Ca(OH)2 càng lớn hơn khối lượng cao thì độ khác biệt màu sắc ∆E*ab càng lớn (đồ thị 3.7) chứng tỏ loại màu càng tốt và ở tỉ lệ 1/1 loại màu tốt nhất. Điều này có thể giải thích như sau: lượng vôi càng lớn thì độ hòa tan càng lớn, với tỉ lệ 1/1 (g/g) thì độ hòa tan của vôi gần như tối đa nên khi tăng tỉ lệ thì khả năng loại màu dung dịch hầu như không tăng. Mặt khác, độ hấp thu UV (λ=210 nm) càng giảm khi khả năng loại màu càng tốt nhưng giảm rất ít. Do đó, chọn tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao tốt nhất là 1/1 (g/g).

3.2.3.

Khảo sát nhiệt độ

Điều kiện khảo sát: − Nồng độ dung dịch: 90 g/mL − Thời gian: 10 phút − Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng chất rắn: 1/1 (g/g)

25.0 1.4

20.0

1.2

1.0

∆ E*ab

0.8

10.0

Abs (A)

15.0

0.6

0.4 5.0 0.2

0.0

0.0 0

Nhiệt độ ( C) Delta E*ab

Abs (A)

Hình 3.20. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ so với dung dịch gốc (Phụ lục 8)

Hình 3.21. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ

Hình 3.22. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ Dựa vào Hình 3.20 cho thấy nhiệt độ càng thấp thì khả năng loại màu càng tăng và tốt nhất ở 0 oC. Điều này theo Herzfelt nghiên cứu độ hòa tan của vôi trong nước ở những nhiệt độ khác nhau và thấy rằng khi nhiệt độ càng giảm[116], độ hòa tan của vôi càng tăng. Vậy, chọn nhiệt độ tốt nhất cho quá trình gia vôi là 0 oC.

3.2.4.

Khảo sát thời gian phản ứng

Điều kiện khảo sát: − Nồng độ dung dịch: 90 g/mL − Nhiệt độ: 0 oC − Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng chất rắn: 1/1 (g/g)

25.0 1.4

20.0

1.2

∆ E*ab

1.0

0.8

10.0

Abs (A)

15.0

0.6

0.4 5.0 0.2

0.0

0.0 2

Thời gian (phút) Delta E*ab

Abs (A)

Hình 3.23. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát thời gian so với dung dịch gốc (Phụ lục 9)

Hình 3.24. TLC các dung dịch thu được sau quá trình gia vôi trong khảo sát thời gian

Hình 3.25. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát thời gian Trong khoảng thời gian khảo sát thì giá trị thời gian loại màu tốt nhất là 10 phút (Hình

3.23). Điều này có thể giải thích như sau: thời gian phản ứng càng lâu thì phản ứng keo tụ càng tốt và ở thời gian 10 phút là thời gian mà phản ứng diễn ra gần như tốt nhất. Vì vậy, chọn thời gian gia vôi tốt nhất là 10 phút.

3.3.

Khảo sát quá trình sắc ký cột nhựa trao đổi cation và anion 3.3.1.

Khảo sát tốc độ dòng chảy

Điều kiện khảo sát: − Tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch: 1/10 mL/mL.

45.0

1.0

40.0

0.9 0.8

35.0

0.7

30.0

0.5 20.0

Abs (A)

∆ E*ab

0.6 25.0

0.4 15.0

0.3

10.0

0.2

5.0

0.1 0.0

0.0 0.5

1.5

Tốc độ chảy (ml/phút) Delta E*ab

Abs (A)

Hình 3.26. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy so với dung dịch gốc (Phụ lục 10)

Hình 3.27. TLC các dung dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy

Hình 3.28. Các dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy Từ Hình 3.26 thấy rằng trong khoảng tốc độ dòng chảy khảo sát, dung dịch được loại màu tốt nhất ở tốc độ 0.5 mL/phút. Điều này có thể được giải thích như sau: tốc độ dòng chảy càng chậm thì thời gian tiếp xúc lâu hơn, dẫn đến tăng khả năng trao đổi ion. Độ hấp thu UV (λ=210 nm) của dung dịch ở 4 tốc độ so với dung dịch ban đầu gần như không đổi, chứng tỏ tốc độ dòng chảy không ảnh hưởng lớn đến lượng chất ngọt trong dịch. Do đó, chọn tốc độ dòng chảy 0.5 mL/phút là tốc độ dòng chảy tốt nhất.

3.3.2.

Khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch

Điều kiện khảo sát: − Tốc độ dòng chảy: 0.5 mL/phút.

45.0

1.0

40.0

0.9 0.8

35.0

0.7

30.0

0.5 20.0

Abs (A)

∆E*ab

0.6 25.0

0.4 15.0

0.3

10.0

0.2

5.0

0.1

0.0

0.0 1/5

1/10

1/15

1/20

Tỉ lệ Vnhựa/Vdịch Delta E*ab

Abs (A)

Hình 3.29. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch so với dung dịch gốc (Phụ lục 11)

Hình 3.30. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tốc độ dòng chảy

Hình 3.31. Các dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch Dựa vào Hình 3.29 thấy rằng ∆E*ab của dung dịch giảm mạnh từ tỉ lệ 1/10 đến 1/15 mL/mL. Nguyên nhân do cột nhựa trao đổi sau một thời gian nhất định sẽ xảy ra cân bằng, nồng độ dung dịch vào bằng nồng độ dung dịch sau, nên khả năng loại màu sẽ càng giảm khi thời gian trao đổi càng lâu. Mặt khác, ta thấy tỉ lệ 1/5 và 1/10 khả năng loại màu chênh lệch không đáng kể. Vì vậy, để tiết kiệm thời gian và hóa chất cho quá trình tái sinh nhựa, chọn tỉ lệ 1/10 (mL/mL) là tỉ lệ tốt nhất.

3.4.

Sản phẩm thu được sau quy trình chiết và tinh chế các chất ngọt steviol

glycoside

Hình 3.32. Dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion.

Hình 3.33. TLC của dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion.

Bảng 3.1. Hàm lượng chất ngọt thu được sau quá trình chiết và tinh chế Cao chiết thô

Cao sau tinh chế

Khối lượng (g)

35.12

4.20

Độ ẩm (%)

3.37

1.25

Hiệu suất (%)

37.96

12.22

Hiệu suất tổng (%)

4.64

Khối lượng nguyên liệu : 100 g (độ ẩm 10.06%)

Hình 3.34. A – Cao chiết thô; B – Cao sau tinh chế.

CHƯƠNG 4. 4.1.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Đề tài: “Nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt” đã thực hiện những nội dung đưa ra như sau: − Khảo sát quy trình chiết với dung môi nước thu được cao có hiệu suất chiết tốt nhất. Kết quả khảo sát như sau: dạng nguyên liệu lá nguyên, tỉ lệ rắn/lỏng 1/8 g/mL, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 90 oC, chiết 2 lần. − Khảo sát quy trình gia vôi làm sạch dịch chiết cỏ ngọt thu được dung dịch với điều kiện loại màu tốt nhất. Kết quả khảo sát như sau: nồng độ dung dịch 90 g/mL, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 1/1 g/g, nhiệt độ 0 oC, thời gian 10 phút. − Khảo sát quá trình trao đổi ion đã thu được dung dịch chứa các chất ngọt steviol glycoside có độ tinh khiết khá cao. Kết quả khảo sát như sau: tốc độ dòng chảy 0.5 mL/phút, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 1/10 mL/mL.

4.2.

Kiến nghị

Trong tương lai, đề nghị có thể phát triển theo hướng sau: − Kết tinh các hợp chất ngọt steviol glycoside với dung môi an toàn trong thực phẩm. − Xây dựng đường chuẩn stevioside trong HPLC để định lượng chính xác nồng độ các hợp chất steviol glycoside trong dung dịch khảo sát. − Khảo sát quá trình loại màu với các chất hấp phụ như diatomite,than hoạt tính, Al2(SO4)3… nhằm nâng cao hàm lượng các hợp chất ngọt steviol glycoside và loại màu từ dịch trích từ cây cỏ ngọt. So sánh tính hiệu quả của các quy trình nhằm tìm quy trình thích hợp, có khả năng triển khai ở quy mô lớn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A.D. Kinghorn, D.D. Soejarto, Current status of stevioside as a sweetening agent for human use, Economic and medicinal plant research/edited by H. Wagner, Hiroshi Hikino, Norman R. Farnsworth, (1985). [2] S.-J. Wu, L.-T. Ng, Y.-M. Huang, D.-L. Lin, S.-S. Wang, S.-N. Huang, C.-C. Lin, Antioxidant activities of Physalis peruviana, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 28 (2005) 963-966. [3] Trần Đình Long, Liakhovkin A. G., M.P. Anh, Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni), NXB Nông nghiệp, (1992). [4] A.D. Kinghorn, Stevia: the genus Stevia, CRC Press, 2003. [5] C.C. Shock, Experimental cultivation of Rebaudi’s stevia in California, Univ. California, Davis Agron. Progr. Rep, 122 (1982). [6] P. Mishra, R. Singh, U. Kumar, V. Prakash, Stevia rebaudiana–A magical sweetener, Global J Biotechnol Biochem, 5 (2010) 62-74. [7] S. Singh, & Rao, G., Stevia: The herbal sugar of 21st Century, Sugar Tech, 71, 7 (2005) 17-24. [8] Nguyễn Văn Tý, Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đồng sulfat đến một số chỉ tiêu sinh lí-sinh hóa và năng suất cây cỏ ngọt trồng trên đất vườn đồi Bắc Thái, (1996) 2829. [9] Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Thoa, N.V. Tiếp, Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả, NXB KHKT, (1996). [10] S.D. Anton, C.K. Martin, H. Han, S. Coulon, W.T. Cefalu, P. Geiselman, D.A. Williamson, Effects of stevia, aspartame, and sucrose on food intake, satiety, and postprandial glucose and insulin levels, Appetite, 55 (2010) 37-43. [11] S. Ghanta, A. Banerjee, A. Poddar, S. Chattopadhyay, Oxidative DNA damage preventive activity and antioxidant potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a natural sweetener, Journal of agricultural and food chemistry, 55 (2007) 10962-10967. [12] M. Darise, H. Kohda, K. Mizutani, R. Kasai, O. Tanaka, Chemical constituents of flowers of Stevia Rebaudiana Bertoni., Agri Biol Chem 47, (1983) 133-135. [13] J. Brandle, P. Telmer, Steviol glycoside biosynthesis, Phytochemistry, 68 (2007) 1855-1863. [14] U. Wölwer-Rieck, The leaves of Stevia rebaudiana (Bertoni), their constituents and the analyses thereof: a review, Journal of agricultural and food chemistry, 60 (2012) 886-895. [15] Geuns, Jan, Stevia and steviol glycosides, Euprint bvba, 2010. [16] C. Giraldo, L. Marín, D. Habeych, Obtención de edulcorantes de Stevia rebaudiana Bertoni, Revista CENIC Ciencias Biológicas, 36 (2005) 3-10.

[17] R. Lemus-Mondaca, A. Vega-Gálvez, L. Zura-Bravo, K. Ah-Hen, Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects, Food Chemistry, 132 (2012) 1121-1132. [18] J. Pól, B. Hohnová, T. Hyötyläinen, Characterisation of Stevia rebaudiana by comprehensive two-dimensional liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1150 (2007) 85-92. [19] Geuns, Jan MC, Stevioside, Phytochemistry, 64 (2003) 913-921. [20] A. Nepovim, H. Drahosova, P. Valicek, T. Vanek, The effect of cultivation conditions on the content of stevioside in Stevia rebaudiana Bertoni plants cultivated in the Czech Republic, Pharmaceutical and Pharmacological Letters, 8 (1998) 19-21. [21] Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, N.T. Làn, Nguyễn Thị Việt Hà, Phạm Linh Kho, Lê Hồng Dũng, Xác định thành phần dinh dưỡng của lá Cỏ ngọt Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Phát triển. Tập, 12 (2014) 73-77. [22] C. Gardana, M. Scaglianti, P. Simonetti, Evaluation of steviol and its glycosides in Stevia rebaudiana leaves and commercial sweetener by ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry, Journal of chromatography A, 1217 (2010) 14631470. [23] V. Kochikyan, A. Markosyan, L. Abelyan, A. Balayan, V. Abelyan, Combined enzymatic modification of stevioside and rebaudioside A, Applied Biochemistry and Microbiology, 42 (2006) 31-37. [24] G. Kovylyaeva, G. Bakaleinik, Strobykina, I., Gubskaya, V., Sharipova, R., Al¢fonsov,, L.G. Vieira, Glycosides from Stevia rebaudiana, Chemistry of Natural Compounds, 43 (2007) 81-85. [25] B.H. de Oliveira, J.F. Packer, M. Chimelli, D.A. de Jesus, Enzymatic modification of stevioside by cell-free extract of Gibberella fujikuroi, Journal of biotechnology, 131 (2007) 92-96. [26] Sirshendu De, Sourav Mondal, and Suvrajit Banerjee, I.I.o.T.I. Kharagpur, I. Kharagpur, Stevioside, Technology, Applications and Health, Indian Institute of Technology (IIT) Kharagpur Kharagpur, India, (2013). [27] B. Crammer, R. Ikan, Sweet glycosides from the stevia plant, Chemistry in Britain, 22 (1986) 915. [28] Abou-Arab, A Esmat, A Azza, Abu-Salem, M. Ferial, Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant, African Journal of Food Science, 4 (2010) 269-281. [29] V.V. Panpatil, K. Polasa, Assessment of stevia (Stevia rebaudiana)--Natural sweetener: A review, Journal of Food Science and Technology, 45 (2008) 467. [30] Abou-Arab, Esmat A, Abu-Salem, F. M, Evaluation of bioactive compounds of Stevia rebaudiana leaves and callus, African Journal of Food Science, 4 (2010) 627634. 78

[31] K. Takahashi, S. Shigeta, N. Sato, Stevia extracts for the inhibition of rotavirus, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001106635 (2001). [32] K. Takahashi, S. Shigeta, N. Sato, Stevia rebaudiana Bertoni extraction as antibacterials against Helicobacter pylori,, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001122793, (2001). [33] B. Bogicevic, Oral application of extract of Stevia rebaudiana or its active substances for the elimination of cellulite, , Pct Int. Appl. WO 29005048973, (2005). [34] S. Gregersen, P.B. Jeppesen, K.H. J.J. Holst, Antihyperglycemic effects of stevioside in type diabetic subjets,, Metab., Clin. Exp. (1) 53, (2004) 73. [35] P. Chan, D.E. Xu, J.C. Liu , Y.J. Chen, B. Tomlinson, J.T.C. W.P. Huang, The effect of stevioside on blood pressure and plasma catecholamines in spontaneously hypertensive rats,, Life Sci. (19) 63, (1998) 1679. [36] J.C. Liu, P.K. Kao, P. Chan, Y.H. Hsu, C.C. Hoi, G.S. Lien, M.H. Hsieh, Y.J. Cheng, J.T. Cheng, Mechanism of the antihypertensive effect of stevioside in anesthetized dogs,, Pharmacol. (1) 67, (2003) 14. [37] H. Hanada, H. Senpuku, M. Arakawa, T. Ishizaki, S. Sakuma, Dental drug delivery system agents containing hydroxyapatite, and control of cariogenic bacteria using them, , Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2004035416, (2004). [38] S. Sugiyama, N. Doi, S. Ejiri, Y. Ishii, Dentifrices containing apatite and polymers,, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001131041, (2001). [39] Y. Suzuki, T. Yokoo, Liquid dentifrice compositions containing cationic bactericides, polyoxyethylene alkyl ethers, and cationic polymers, , Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001139433, (2001). [40] E. Takeoka, C. Hamada, O. Suzuki, M. Tajima, Hair growth period extended agent, , Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 10265347 (1998). [41] H. Takada, K. Teraoka, B.H. Kim, Hair growth stimulants containing Stevia and Udo extracts,, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2003040790, (2003). [42] B.E. Kim, M.K. Kim, K.T. Kim, R.W. Chang, J.W. Jong, Y.G. Kim, Study on the degradation of dioxin by the Stevia extract, , Organohalogen Comp.54, (2001). [43] Y.G. Kim, A method for preparing dioxin decomposers from Stevia, a dioxin decomposer prepared by the method and a method for decomposing dioxins using it, , PCT Int. Appl. WO 2001040495, (2001). [44] M. Sato, M. Takeuchi, N. Sato, Antihistaminic substance of stevia origin,, U.S. US 5958419, (1999). [45] J. Thomas, M. Glade, Stevia: it’s not just about calories. , Open Obes J 2, , (2010) 101–109. [46] S. Shukla, A. Mehta, V. Bajpai, S. Shukla, In vitro antioxidant activity and total phenolic content of ethanolic leaf extract of Stevia Rebaudiana Bert. , Food Chem Toxicol 47,, (2009) 2338–2343. 79

[47] PGS.PTS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Bài giảng chiết suất dược liệu, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh-Bộ môn Dược liệu, (1998). [48] M.S. Melis, Chronic administration of aqueous extract of Stevia Rebaudiana in rats: renal effects., J. Ethnopharmacol 47,, (1995) 129− 134. [49] M.S. Melis, A.R. Sainati, Effect of calcium and verapamil on renal function of rats during treatment with Stevioside., J. Ethnopharmacol 33, , (1991) 257 −262. [50] M.S. Melis, A.R. Sainati, Participation of prostaglandins in the effect of Stevioside on rat renal function and arterial pressure. , Braz J Med Biol Res 24, , (1991) 1269−1276. [51] W.W.H.O.S.E.o.C.F. Additives., S.G.A.J.F.W.E.C.o. Food, A.W.F.A.S.N.G. WHO., Safety Evaluation of Certain Food Additives. Steviol Glycosides (Addendum). , Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. WHO Food Additive Series No. 60. Geneva: WHO., (2009). [52] E.E.F.S. Authority), Scientific opinion on the safety of Steviol glycosides for the proposed uses as a food additive. , EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS). EFSA J 8,, 1537. [53] L.L. Curry, Agency Response Letter GRAS Notice No. , GRN 000287. Washington, DC: Food and Drug Administration. , (2010). [54] F.F.a.A. Organisation), Steviol Glycosides., FAO JECFA Monographs 10. Rome: Food and Agriculture Organisation., (2010). [55] F.F.S.A.N. Zealand), Final Assessment Report, Application A540, Steviol Glycosides as Intense Sweeteners. , Canberra: Food Standards Australia New Zealand., (2008). [56] C. González, M. Tapia, E. Pérez, D. Pallet, M. Dornier, Main properties of steviol glycosides and their potential in the food industry: a review, Fruits, 69 (2014) 127-141. [57] S. Stoyanova, J. Geuns, É. Hideg, W. Van Den Ende, The food additives inulin and stevioside counteract oxidative stress, International journal of food sciences and nutrition, 62 (2011) 207-214. [58] P.D. Richard C. Kraska, DABT, P.D. Robert S. McQuate, P.D. Madhusudan G. Soni, FACN, Gras assessment of high purity steviol glycosides ( 95%) Food Usage Conditions for General Recognition of Safety for Compound Solutions, Inc. Vista, CA, (July 2011). [59] Hoàng Văn Phiệt, Hoàng Thanh Phương, Trương Tất Hiếu, Nguyễn Kim Sơn, Đào Đình Kim, Chiết suất Steviolside từ lá cỏ ngọt,, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học 1994-1995, 1995,, 28-29. [60] Tôn Nữ Liên Hương, Võ Hoàng Duy, Dương Mộng Hòa, Đỗ Duy Phúc, và Nguyễn Duy Thanh, CHIẾT XUẤT STEVIOSIDE TỪ CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni), Tạp chí Khoa học Đại học Cần thơ, (2015) 73-76.

[61] N. Bondarev, O. Reshetnyak, A. Nosov, Peculiarities of diterpenoid steviol glycoside production in in vitro cultures of Stevia rebaudiana Bertoni, Plant Science, 161 (2001) 155-163. [62] T. Morita, I. Fujita, J. Iwamura, Sweetening compound, method of recovery, and use thereof, in, Google Patents, 1978. [63] R.H. Dobberstein, M.S. Ahmed, Extraction, separation and recovery of diterpene glycosides from Stevia rebaudiana plants, in, Google Patents, 1982. [64] N. Kolb, J. Herrera, D. Ferreyra, R. Uliana, Analysis of sweet diterpene glycosides from Stevia rebaudiana: improved HPLC method, Journal of agricultural and food chemistry, 49 (2001) 4538-4541. [65] H. Makapugay, N. Nanayakkara, A.D. Kinghorn, Improved high-performance liquid chromatographic separation of the Stevia rebaudiana sweet diterpene glycosides using linear gradient elution, Journal of Chromatography A, 283 (1984) 390-395. [66] J. Striedner, F.C. Czygan, G. Braunegg, Contributions to the biotechnological production of sweeteners from Stevia rebaudiana Bertoni. I. A method for the serial analysis of diterpene glycosides by HPLC, Engineering in Life Sciences, 11 (1991) 495499. [67] W.S. FUH, B.H. CHIANG, Purification of steviosides by membrane and ion exchange processes, Journal of food science, 55 (1990) 1454-1457. [68] R.H. Giovanetto, Method for the recovery of steviosides from plant raw material, in, Google Patents, 1990. [69] J.D. Payzant, J.K. Laidler, R.M. Ippolito, Method of extracting selected sweet glycosides from the Stevia rebaudiana plant, in, Google Patents, 1999. [70] S. Kumar, Method for recovery of stevioside, in, Google Patents, 1986. [71] S.Q. Zhang, A. Kumar, O. Kutowy, Membrane-based separation scheme for processing sweeteners from stevia leaves, Food Research International, 33 (2000) 617620. [72] U. Kienle, Method of making a natural sweetener based on Stevia rebaudiana, and use thereof, in, Google Patents, 1992. [73] M. Fumio, Stevioside extracted from Stevia containing sweetener., Japanese Patent 55-0007039. , (1980). [74] M.C. Jackson, G.J. Francis, R.G. Chase, High yield method of producing pure rebaudioside A. , US Patent 0083838, (2006). [75] J. Pol, E.V. Ostra, P. Karasek, M. Roth, B. Karolinka, J. Kaslavsky, Comparison of two different solvents employed for pressurized fluid extraction of stevioside from Stevia Rebaudiana: methanol versus water., Anal Bioanal Chem 388, , (2007) 1847–1857. [76] H. Tadaaki, I. Ryoichi, K. Teruo, A method for purifying stevioside., Japanese Patent 51-131900. 81

, (1976). [77] K. Tadashi, K. Masato, Production of Stevia sweetener. , Japanese Patent 07143860., (1995). [78] M. Toyoshige, B. Usei, Sweetener obtained from plant body of variety of Stevia Rebaudiana cultivatable from seed., Japanese Patent 2002-262822., (2002). [79] M. Chhaya, G.C., S. De, O.o.p.p.f.w.e.o.s.u. response, surface methodology. Separation Science and Technology, s.f. publication., Optimization of process parameters for water extraction of stevioside using response surface methodology, , Separation Science and Technology, submitted for publication., (2012). [80] G. Ruihua, S. Jingwen, Y. Xinwei, Method for ultrasonic extraction of stevioside. , Chinese Patent 101798329A., (2010). [81] V. Jaitak, B.S. Bandna, V. Kaul, An efficient microwave‐assisted extraction process of stevioside and rebaudioside‐A from Stevia rebaudiana (Bertoni), Phytochemical Analysis, 20 (2009) 240-245. [82] H. Weiping, J.H. Zhou, Process for extracting sweet diterpene glycosides. , US Patent 6,228,996. , (1999). [83] V.H. Abelyan, V.T. Ghochikyan, A.A. Markosyan, M.O. Adamyan, L.A. Abelyan, Extraction, separation and modification of sweet glycosides from the Stevia Rebaudiana plant. , US Patent 7,838,044 B2., (2010). [84] K. Shinichi, T. Masaaki, F. Masahiro, Purification of stevioside solution. , Japanese Patent 55-120770., (1980). [85] K. Kotaro, O. Tokuo, Extraction and purification of sweetener component from dry leaf of Stevia. , Japanese Patent 62-166861., (1987). [86] T. Taku, O. Yukio, Preparation of stevioside., Japanese Patent 58-028246., (1983). [87] O. Yukio, I. Hajime, T.P.m.o.s.s.J. Taku, P. 58-028247., Purifying method of stevioside solution., Japanese Patent 58-028247. , (1983). [88] P.C. Wankat, Separation Process Engineering. , New York: Prentice-Hall., (2007). [89] G.J. Persinos, Method of producing stevioside. , US Patent 3,723,410, (1973). [90] J. Adduci, D. Buddhasukh, B. Ternai, Improved isolation and purification of stevioside. , J Sci Soc Thai 13, , (1987) 179–183. [91] S.H. Won, C.K. Jin, C.H. Hoon, b.P.p.o.s. Korean, P. B1., Purification process of stevioside. , Korean Patent 1019900005468 B1., (1990). [92] O.D.a.p.o.s.s.c.J. Susumu, P. 55-111768., Decolorization and purification of stevia sweet component., Japanese Patent 55-111768., (1980). 82

[93] J.K. Kumar, G.K. Babu, V.K. Kaul, P.S.P.f.p.o. Ahuja, s.f.S.R.B.I.P.W. 2006/, A1., Process for production of stevioside from Stevia Rebaudiana Bertoni. , International Patent WO 2006/038221 A1., (2006). [94] M. Yang, J. Hua, L. Qin, High purity rebaudioside A and method of extracting same. , US Patent 7,923,541B2., (2011). [95] S. Purakayastha, A. Markosyan, M. Malsagov, Process for manufacturing a sweetener and use thereof., US Patent Application 2010/0227,034., (2010). [96] M. Magomet, T. Tomov, T. Somann, V.H. Abelyan, Process for manufacturing of a sweetener and use thereof., US Patent 7,862,845B2., (2011). [97] C. Chiang, J.C. Evans, J.J. Hahn, Separation of rebaudioside A from Stevia glycosides using chromatography., US Patent 2011/0087011 A1., (2011). [98] J. Liu, K. Zhang, S. Guo, Separation and purification of stevioside and rebaudioside A. , US Patent 2012/0083593A1., (2012). [99] E.P. Moraes, N.R.C.F. Machado, Clarification of Stevia Rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites. , Acta Scientiar 23 (2001) 1375– 1380. [100] R. Rajab, C. Mohankumar, K. Murugan, M. Harish, P.V.P. Mohanam, and toxicity studied of stevioside from Stevia Rebaudiana Bertoni. Toxicol Int 16, 49–54., Purification and toxicity studied of stevioside from Stevia Rebaudiana Bertoni., Toxicol Int 16, (2009) 49–54. [101] Rongfu Shi, Mancai Xu, Zuoqing Shi, Yunge Fan, Xianzhi Guo, Yongning Liu, Chunhong Wang, Binglin He, Synthesis of bifunctional polymeric adsorbent and its application in purification of Stevia glycosides, Reactive and Functional Polymers, 50 (2002) 107-116. [102] J. Liu, C. Ong, S. Li, Subcritical fluid extraction of Stevia sweeteners from Stevia rebaudiana, Journal of chromatographic science, 35 (1997) 446-450. [103] C. Sharma, S. Mondal, G. Majumdar, S. De, Clarification of Stevia extract by ultrafiltration: selection criteria of the membrane and effects of operating conditions, Food and bioproducts processing, 90 (2012) 525-532. [104] F.V. Silva, R. Bergamasco, C.M.G. Andrade, N. Pinheiro, N.R.C.F. Machado, M.H.M. Reis, A.A. de Araujo, S.L. Rezende, Purification process of stevioside using zeolites and membranes, International Journal of Chemical Reactor Engineering, 5 (2007) 1443. [105] M. Reis, F. Da Silva, C. Andrade, S. Rezende, M. Wolf Maciel, R. Bergamasco, Clarification and purification of aqueous stevia extract using membrane separation process, Journal of food process engineering, 32 (2009) 338-354. [106] A. Mustafa, C. Turner, Pressurized liquid extraction as a green approach in food and herbal plants extraction: A review, Analytica chimica acta, 703 (2011) 8-18. [107] W. Kukula-Koch, N. Aligiannis, M. Halabalaki, A.-L. Skaltsounis, K. Glowniak, E. Kalpoutzakis, Influence of extraction procedures on phenolic content and antioxidant activity of Cretan barberry herb, Food chemistry, 138 (2013) 406-413. 83

[108] K. Phillips, Stevia: steps in developing a new sweetener, Developments in sweeteners, 3 (1987) 1-43. [109] H. Sugisawa, T. Kasai, and H. Suzuki, ibid.,, 51 (1977) 175. [110] P. Mauri, G. Catalano, C. Gardana, P. Pietta, Analysis of Stevia glycosides by capillary electrophoresis, Electrophoresis, 17 (1996) 367-371. [111] P. Nishiyama, M. Alvarez, L.G. Vieira, Quantitative analysis of stevioside in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy, Journal of the Science of Food and Agriculture, 59 (1992) 277-281. [112] C. Yu, K. Xu, Y. Shi, The spectrum model established for measuring the contents of Rebaudioside A and Stevioside quickly in the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni, Energy Procedia, 5 (2011) 855-861. [113] V. Jaitak, A. Gupta, V. Kaul, P.S. Ahuja, Validated high-performance thin-layer chromatography method for steviol glycosides in Stevia rebaudiana, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 47 (2008) 790-794. [114] L. Hearn, P. Subedi, Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy, Journal of Food Composition and Analysis, 22 (2009) 165-168. [115] A.U. Jackson, A. Tata, C. Wu, R.H. Perry, G. Haas, L. West, R.G. Cooks, Direct analysis of Stevia leaves for diterpene glycosides by desorption electrospray ionization mass spectrometry, Analyst, 134 (2009) 867-874. [116] PGS. Nguyễn Ngộ, Công nghệ đường mía, Nhà suất bản Bách Khoa - Hà Nội, (2011) 272.

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo dạng nguyên liệu trong quá trình chiết

Dạng nguyên liệu chiết

Khối lượng cao thu được (g) Lá nguyên

Bán nguyên

Bột mịn

Thí nghiệm 1

15.79

16.21

18.17

Thí nghiệm 2

15.52

16.60

18.12

Trung bình

15.66

16.41

18.15

Hiệu suất chiết

33.41

35.35

39.12

Dạng nguyên liệu chiết

Độ ẩm cao Lá nguyên

Bán nguyên

Bột mịn

Thí nghiệm 1

0.036

0.0352

0.0353

Thí nghiệm 2

0.0372

0.0359

0.0361

0.04

Trung bình

Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô Dạng nguyên liệu chiết Lá nguyên Bán nguyên Bột mịn Thí nghiệm 1

45.15

44.75

44.72

Thí nghiệm 2

45.14

44.75

44.73

Trung bình

45.14

44.75

44.72

Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%

Độ hấp thu (A)

Dạng nguyên liệu chiết

Bước sóng 210 nm

Lá nguyên

Bán nguyên

Bột mịn

TN1

TN2

0.92

0.904

0.939

0.933

0.954

0.906

1.308

1.303

1.192

1.315

1.235

1.362

1.233

1.193

1.207

1.149

1.292

1.201

Định mức dung dịch: 100mL

Phụ lục 2. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo tỉ lệ rắn/lỏng trong quá trình chiết Tỉ lệ rắn/lỏng (g/mL)

Khối lượng cao thu được (g) 1/6

1/7

1/8

1/9

Thí nghiệm 1

15.79

16.53

16.60

16.96

Thí nghiệm 2

15.52

16.20

17.61

17.34

Trung bình

15.66

16.37

17.11

17.15

Hiệu suất chiết cao tổng

33.44

35.26

36.81

36.93

Tỉ lệ rắn/lỏng (g/mL)

Độ ẩm cao 1/6

1/7

1/8

1/9

Thí nghiệm 1

0.035

Thí nghiệm 2

0.0362 0.0359 0.0364 0.0353

Trung bình

0.04

0.0352 0.0357 0.0377 0.04

0.04

Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô

Tỉ lệ rắn/lỏng (g/mL)

1/6

1/7

1/8

1/9

Thí nghiệm 1

45.15

44.77

44.79

44.75

Thí nghiệm 2

45.14

44.74

44.80

44.73

Trung bình

45.14

44.76

44.79

44.74

Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%

Tỉ lệ rắn/lỏng (g/mL)

Độ hấp thu (A) Bước sóng 210 nm

1/6

1/7

1/8

1/9

TN1

TN2

0.92

0.904

0.939

0.933

0.954

0.906

0.998

0.972

0.984

0.977

0.957

0.979

0.993

1.072

0.973

1.051

1.006

1.054

1.042

1.005

1.027

1.042

1.009

1.003

Định mức dung dịch: 100mL

Phụ lục 3. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo thời gian trong quá trình chiết

Thời gian (phút)

Khối lượng cao thu được (g) 10

Thí nghiệm 1

7.42

Thí nghiệm 2 Trung bình Hiệu suất chiết cao tổng

7.67

8.02

8.07

8.40

8.42

7.34

7.73

8.16

8.39

8.15

7.38

7.70

8.09

8.12

8.40

8.29

32.30

33.55

35.29

35.35

36.67

36.14 87

Thời gian (phút)

Độ ẩm cao 10

Thí nghiệm 1

0.0225 0.0233 0.0245 0.0245 0.0235 0.0285

Thí nghiệm 2

0.0214 0.0289 0.0257 0.0282 0.0238 0.0215

Trung bình

Thời gian (phút)

0.02

0.03

0.02

0.03

Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô 10

Thí nghiệm 1

22.35

Thí nghiệm 2

22.35

Trung bình

22.35

Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%

Thời gian (phút)

Độ hấp thu (A) Bước sóng 210 nm TN1

TN2

0.801

0.789

0.801

0.799

0.798

0.814

0.823

0.805

0.821

0.802

0.816

0.835

0.861

0.825

0.859

0.835

0.867

0.836

0.847

0.845

0.872

0.842

0.850

0.879

0.871

0.901

0.882

0.892

0.902 88

0.890

0.825

0.890

0.867

0.889

0.873

Định mức dung dịch: 100mL

Phụ lục 4. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo nhiệt độ trong quá trình chiết Nhiệt độ (oC)

Khối lượng cao thu được (g) 60

100

Thí nghiệm 1

6.05

8.02

8.37

8.85

8.02

Thí nghiệm 2

6.24

7.89

8.16

8.39

8.15

Trung bình

6.15

7.96

8.27

8.62

8.09

Hiệu suất chiết cao tổng

26.74

34.32

35.70

37.14

34.83

Độ ẩm cao

Nhiệt độ (oC)

Thí nghiệm 1

0.027

0.036

0.0352

0.0373

Thí nghiệm 2

0.028

0.0357

0.0341

0.037

Trung bình

0.028

0.036

0.035

0.037

Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô Nhiệt độ (oC)

100

Thí nghiệm 1

22.35

Thí nghiệm 2

22.35

Trung bình

22.35

Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%

Nhiệt độ (oC)

100

Độ hấp thu (A) Bước sóng 210 nm TN1

TN2

0.785

0.787

0.796

0.786

0.792

0.794

0.855

0.778

0.839

0.766

0.842

0.758

0.845

0.830

0.867

0.823

0.872

0.826

0.903

0.851

0.893

0.862

0.882

0.875

0.839

0.825

0.830

0.819

0.842 90

Định mức dung dịch: 100mL

Phụ lục 5. Bảng số liệu tính hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo số lần chiết trong quá trình chiết Khối lượng cao thu được (g)

Số lần chiết (lần)

Thí nghiệm 1

6.22

8.84

9.05

9.25

Thí nghiệm 2

6.15

8.69

9.19

9.30

Trung bình

6.19

8.77

9.12

9.28

Hiệu suất chiết cao tổng (%)

19.34

38.09

39.58

40.44

Độ ẩm cao

Số lần chiết (lần)

Thí nghiệm 1

0.304

0.0283

0.0301

0.028

Thí nghiệm 2

0.298

0.0294

0.0298

0.0232

Trung bình

0.301

0.03

Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô

Số lần chiết (lần)

Thí nghiệm 1

22.35

Thí nghiệm 2

22.35

Trung bình

22.35

Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%

Số lần chiết (lần)

1 2

Độ hấp thu (A) Bước sóng 210 nm TN1

TN2

0.775

0.789

0.785

0.778

0.784

0.769

0.879

0.859 91

0.855

0.862

0.867

0.879

0.875

0.897

0.883

0.882

0.894

0.905

0.901

0.889

0.886

0.897

Định mức dung dịch: 100mL

Phụ lục 6. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nồng độ dung dịch trong quá trình gia vôi Nồng độ dung dịch trước phản ứng (g/mL) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dịch gốc: 90g/L

Nồng độ dung dịch trước phản ứng (g/mL) 10

Độ hấp thu (A) TN1 TN2 0.605 0.606 0.603 0.606 0.597 0.608 0.602 0.607 0.587 0.607 0.578 0.604 0.601 0.605 0.623 0.632 0.572 0.608 0.583 0.604 0.557 0.587 0.555 0.567 0.569 0.597 0.582 0.592 0.533 0.541 0.538 0.533 0.54 0.578 0.545 0.567 1.200 1.264

TN1

TN2

27.31 27.19

5.54 5.61

7.06 7.06

27.12 27.22

5.54 5.35

6.98 6.83 92

27.09 29.13 20 29.11 29.05 30.3 30 30.14 30.63 28.83 40 29.52 28.8 29.8 50 29.91 30.04 30.69 60 31.6 31.16 30.98 70 30.99 30.82 33 80 32.9 32.77 32.11 90 32.27 32.34 24.14 Dịch gốc: 90g/L 25.49 24.2

5.65 6.99 7.05 6.78 6.14 6.20 6.07 5.42 4.78 5.58 5.72 5.65 5.61 5.89 5.14 5.65 5.87 5.63 5.78 5.76 5.94 5.88 6.18 6.12 5.98 -1.66 -1.86 -1.81

7.07 9.83 9.79 9.60 12.58 12.76 12.37 10.02 9.28 10.26 12.58 12.57 12.49 14.04 12.93 14.06 12.80 12.24 12.52 16.16 16.61 16.38 16.07 15.84 15.76 2.22 2.3 2.27

27.13 28.94 28.94 29.05 29.04 29.02 29.05 29.03 28.98 28.84 29.14 29.15 29.2 29.98 29.97 29.88 31.89 31.78 31.84 32.87 32.79 32.74 32.24 32.31 32.35 24.14 25.49 24.2

5.45 6.89 6.83 6.78 6.15 6.21 6.26 5.12 4.78 5.18 5.52 5.54 5.42 5.79 5.74 5.65 5.98 5.93 5.89 5.57 5.65 5.65 6.08 6.11 6.13 -1.66 -1.86 -1.81

6.91 9.74 9.79 9.63 12.14 12.16 12.17 11.82 12.08 11.86 12.59 12.49 12.59 12.44 12.43 12.56 12.70 12.64 12.62 16.06 16.01 16.18 16.17 16.14 15.96 2.22 2.3 2.27

Phụ lục 7. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao trong quá trình gia vôi Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao (g/g) 0.5/1 1/1 1.5/1 2/1 Dịch ban đầu: 90g/L

Độ hấp thu (A) TN1 TN2 0.588 0.583 0.608 0.589 0.559 0.561 0.568 0.559 0.577 0.567 0.578 0.579 0.566 0.571 0.571 0.569 1.569 1.659 93

Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng rắn (g/g) 0.5:1 1:1 1.5:1 2:1 Dịch ban đầu: 90g/L

TN1

TN2

29.22 29.27 29.24 29.98 30.02 30.09 30.58 30.48 30.55 30.52 30.34 30.27 19.85 20.22 20.27

5.49 5.67 5.48 6.73 6.74 6.67 6.49 6.46 6.50 6.69 6.74 6.75 -1.04 -1.08 -1.09

14.50 14.62 14.45 15.99 15.94 15.95 15.37 15.33 15.35 15.34 15.41 15.42 1.34 1.33 1.37

29.43 29.47 29.54 30.18 30.11 30.10 30.48 30.50 30.49 30.32 30.29 30.30 19.85 20.22 20.27

5.59 5.56 5.49 6.88 6.84 6.79 6.57 6.54 6.58 6.89 6.84 6.79 -1.04 -1.08 -1.09

15.05 15.02 15.03 16.00 16.02 16.01 15.77 15.87 15.85 15.79 15.71 15.82 1.34 1.33 1.37

Phụ lục 8. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nhiệt độ trong quá trình gia vôi Nhiệt độ (oC) 0 10 20 30 40 50 60 Dịch ban đầu: 90g/L

Nhiệt độ (oC) 0 10 20 30 40 50 60

L* 31.71 31.71 31.66 29.29 29.22 29.46 28.38 28.67 28.33 27.66 27.88 27.62 26.76 26.65 26.91 26.30 26.42 25.67 25.21

TN1 a* 3.33 3.35 3.39 3.92 3.81 3.80 3.79 3.64 3.80 4.44 4.38 4.37 4.33 4.34 4.29 4.16 4.08 4.15 3.27

Độ hấp thu (A) TN1 TN2 0.603 0.610 0.583 0.601 0.555 0.570 0.545 0.563 0.576 0.578 0.570 0.580 0.568 0.586 0.597 0.562 0.606 0.598 0.619 0.588 0.615 0.601 0.628 0.602 0.697 0.612 0.682 0.603 1.14 1.181

b* 18.31 18.39 18.35 16.34 16.21 16.17 15.10 15.01 15.10 13.08 13.16 13.04 11.31 11.28 11.19 11.21 11.20 11.24 9.63

L* 31.62 31.63 31.7 29.07 29.11 29.03 28.31 28.54 28.42 27.28 27.28 27.37 25.96 26.05 26.01 25.98 25.87 25.89 25.01

TN2 a* 3.41 3.45 3.38 3.82 3.71 3.86 3.83 3.59 3.67 4.33 4.32 4.14 4.03 4.12 4.03 3.79 3.87 3.88 3.37

b* 18.11 18.19 18.05 16.12 16.20 16.27 15.17 15.11 15.21 13.11 13.09 13.14 10.98 10.87 10.99 10.20 10.35 10.42 9.73 95

Dịch ban đầu: 90g/L

25.28 24.42 20.75 21.27 21.18

3.23 3.17 -1.16 -1.20 -1.14

9.64 9.63 1.14 1.10 1.18

25.19 25.20 20.75 21.27 21.18

3.28 3.18 -1.16 -1.20 -1.14

9.84 9.73 1.14 1.10 1.18

Phụ lục 9. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo thời gian trong quá trình gia vôi Thời gian (phút) 2 5 10 15 Dịch ban đầu: 90g/L

Thời gian (phút) 2 5 10 15 Dịch ban đầu: 90g/L

L* 33.28 33.51 33.47 34.50 34.45 34.53 34.91 34.76 34.61 33.78 33.95 33.79 24.36 24.15 23.91

TN1 a* 4.97 4.85 4.92 2.54 2.70 2.63 3.43 3.50 3.49 5.28 5.17 5.28 -1.76 -1.74 -1.82

Độ hấp thu (A) TN1 TN2 0.514 0.567 0.528 0.562 0.550 0.557 0.542 0.557 0.520 0.538 0.519 0.545 0.533 0.554 0.542 0.556 1.326 1.298

b* 17.78 17.75 17.97 19.94 20.11 20.07 20.35 20.17 20.14 18.44 18.14 18.14 2.41 2.40 2.40

L* 32.98 32.95 32.97 34.02 34.04 34.13 34.06 34.02 34.01 33.98 34.01 33.99 24.36 24.15 23.91

TN2 a* 4.37 4.36 4.32 2.39 2.36 2.03 3.13 3.19 3.20 4.95 4.90 5.01 -1.76 -1.74 -1.82

b* 16.98 16.87 16.87 19.78 19.88 19.72 19.99 20.03 20.04 19.31 19.23 19.34 2.41 2.40 2.40

Phụ lục 10. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tốc độ dòng chảy trong quá trình trao đổi ion Tốc độ chảy (mL/phút) 0.5 1 1.5 2 Dịch sau gia vôi

Tốc độ chảy (mL/phút) 0.5 1 1.5 2 Dịch sau gia vôi

L* 52.89 52.81 53.81 46.65 46.83 46.60 46.29 46.32 46.43 46.13 46.36 46.48 31.94 31.94 31.78

TN1 a* -6.06 -6.10 -6.12 -5.25 -5.33 -5.25 -4.84 -4.81 -4.84 -4.75 -4.68 -4.77 3.21 3.11 3.13

Độ hấp thu (A) TN1 TN2 0.434 0.511 0.434 0.510 0.456 0.512 0.447 0.510 0.466 0.504 0.467 0.509 0.463 0.512 0.461 0.511 0.566 0.578

b* 18.95 19.01 19.00 22.17 22.18 21.93 25.29 25.06 25.06 25.86 25.35 25.37 15.47 15.49 15.42

L* 51.65 51.61 51.74 45.45 45.27 45.27 45.11 45.17 45.18 45.13 45.16 45.18 31.94 31.94 31.78

TN2 a* -6.11 -6.09 -6.02 -4.15 -4.28 -4.27 -4.24 -4.21 -4.34 -4.15 -4.08 -4.17 3.21 3.11 3.13

b* 18.78 18.91 18.36 21.06 21.35 21.37 24.89 24.86 24.76 24.86 24.75 24.77 15.47 15.49 15.42

Phụ lục 11. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ thể tích nhựa/ thể tích dịch trong quá trình trao đổi ion Tỉ lệ thể tích nhựa/ thể tích dịch (mL/mL) 1/5 1/10 1/15 1/20

Độ hấp thu (A) TN1

TN2

0.427 0.436 0.415 0.419 0.443 0.425 0.435 0.423

0.435 0.445 0.432 0.437 0.467 0.478 0.487 0.479 0.566 0.578

Dịch sau gia vôi

Tỉ lệ thể tích nhựa/ thể tích dịch (mL/mL) 1:5 1:10 1:15 1:20 Dịch sau gia vôi

TN1

TN2

55.06 55.03 55.04 54.59 54.51 54.59 53.19 53.23 53.22 48.43 48.51 48.59 31.94 31.94 31.78

-5.37 -5.33 -5.35 -5.29 -5.25 -5.31 -4.66 -4.66 -4.66 -3.46 -3.45 -3.44 3.21 3.11 3.13

19.14 19.03 19.11 20.21 20.04 20.17 22.61 22.59 22.68 22.59 22.51 22.67 15.47 15.49 15.42

54.96 54.97 54.89 54.07 54.12 54.15 51.88 51.90 51.95 48.01 48.01 48.00 31.94 31.94 31.78

-5.63 -5.67 -5.77 -4.98 -4.95 -4.87 -4.11 -4.10 -4.03 -3.26 -3.28 -3.31 3.21 3.11 3.13

18.78 18.89 18.99 19.50 19.47 19.58 21.78 21.64 21.72 22.98 22.87 22.94 15.47 15.49 15.42

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana B.)

Articles inside

Hình 3.12. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant

1.1.6. Ứng dụng

1.1.5. Tác dụng dược lý

1.1.4. Thành phần hóa học

1.2.2. Nghiên cứu nước ngoài

1.1.3. Bảo quản