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Testen, testen, testen
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mAx J. KellneR
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Ein Hauptgrund für die rasante Verbreitung von SARSCoV2 findet sich unter anderem in der stark unterschiedlichen klinischen Ausprägung von CoVID19, wobei mehr als 60 % aller nachweislich infizierten Personen keine oder nur milde Krankheitssymptome aufweisen3. Dabei sind gemessene Viruslasten in asymptomatischen Personen oftmals in der derselben Größenordnung wie bei symptomatisch erkrankten Individuen4. Asymptomatische Verbreitung von SARSCoV2 ist demnach als zentrale Triebfeder der CoVID19Pandemie anzusehen5. Neben medizinischen Vorsorgemaßnahmen, wie dem Tragen von Masken und der Immunisierung durch Impfungen, steht vor allem das Testen im Vordergrund der Pandemiebekämpfung. Nur ein erfolgreicher Nachweis des Virus, gefolgt von der Isolation der infizierten Person, erlaubt die Unterbrechung von Infektionsketten, und demnach die Verbreitung der Krankheit.
Strukturproteine versus Genom, Unterschiede im Testprinzip
Zugelassene Testverfahren für SARSCoV2 basieren auf zwei unterschiedlichen Testprinzipien6. Beim Antigentest wird mittels Antikörper und chromatographischem Trennprinzip der Nachweis von viralen Strukturproteinen erzielt. Unter Strukturproteinen versteht man im allgemeinen Proteine, aus denen der Virus zusammengesetzt ist, wie etwa der Hülle oder dem Nukleokaspid, einem Trägerprotein, in dem das virale Genome eingewickelt ist. Molekularbiologische Testverfahren wie die PolymeraseKettenreaktion (PCR) basieren hingegen auf dem gezielten Nachweis des viralen Genoms7 . Hierbei wird zunächst ein kurzer Abschnitt der viralen RNA in DNA umgeschrieben, und anschließend durch den Einsatz von Enzymen milliardenfach vervielfältigt. Das vervielfältigte Produkt wird üblicherweise mittels einer virusspezifischen Sonde in Echtzeit detektiert, wodurch eine genaue Bestimmung der ursprünglichen Virusmenge ermöglicht wird. In der Praxis ergibt sich ein wesentlicher Unterschied in der Handhabung und Aussagekraft zwischen Antigenund dem PCRTest. Der Antigentest benötigt keine aufwändige Laborausrüstung, da sich die benötigten Komponenten für den Test einfach auf Teststreifen auftragen lassen. Somit ist der Teststreifen selbst das Labor, weshalb Systeme dieser Art vor allem in der PointofCare (PoC) Diagnostik Anwendung finden. Weitere Vorteile des Antigentests liegen in der einfachen Handhabung und Testdauer von weniger als 20 Minuten. Eine Vergleichsstudie der Berliner Charité hat allerdings erhebliche Unterschiede in der diagnostischen Sensitivität, also die Wahrscheinlichkeit eines positiven Ergebnisses bei vorliegender Virusprobe, bei kommerziellen Antigentests festgestellt7 . Die diagnostische PCR benötigt in der Regel eine Laborausstattung und kostspielige Geräte für die Echtzeitauswertung. Dennoch
ist die Sensitivität der PCR etwa tausendfach höher als bei Antigentests, weshalb der molekularbiologische Nachweis von SARSCoV2 durch PCR als Goldstandard in der medizinischen Virusdiagnostik gilt8 .
RT-LAMP, eine 20 Jahre alte Technologie
Unter den molekularbiologischen Methoden findet sich mit RTLAMP ein Testverfahren, welches vor mehr als 20 Jahren von japanischen Wissenschaftlern entwickelt wurde9. Anders als bei der PCR, basiert RTLAMP auf einem isothermen Vervielfältigungsprinzip. Darunter versteht man einen Reaktionsablauf mit konstanter Temperatur, wodurch einfachste Geräte wie Wasserbäder oder Inkubatoren zum Einsatz kommen können. RTLAMP bietet wesentliche Vorteile gegenüber der PCR. Durch den isothermen Reaktionsablauf ist die Reaktionszeit stark verkürzt, sodass die Testdauer bei etwa 30 Minuten liegt10 . Das entspricht einem Zeitgewinn von bis zu 4 Stunden im Vergleich zur herkömmlichen diagnostischen PCR8. Die benötigte Grundausstattung von RTLAMP ist einfach und kostengünstig, wodurch RTLAMP in mobilen Laboratorien als PointofCareTest eingesetzt werden kann. Der Reaktionsnachweis mit RTLAMP erfolgt entweder über Fluoreszenzmessung oder durch einen kolorimetrischen Farbumschlag der Reaktion10. Bei der kolorimetrischen Methode wird der RTLAMP Reaktion ein Farbstoff zugesetzt, welcher als pH oder Metallindikator in der analytischen Chemie eine wichtige Rolle spielt. Je nach verwendetem Farbstoff schlägt die Reaktion bei einem positiven TestErgebnis von Violett nach Himmelblau (Metallindikator), oder von Pink nach Gelb (pHIndikator)10 . Dieser Farbumschlag ist mit freiem Auge erkennbar, so dass keine kostspieligen Geräte für die Analyse benötigt werden. RTLAMP schöpft somit aus den Vorteilen von Antigen und PCRTests. RTLAMP ist ein molekularbiologischer Schnelltest, welcher etwa 10–100fach sensitiver ist als der Antigentest und durch einfachste Laborgeräte für ortsgebundene und ressourcenlimitierte Anwendungen geeignet ist.
RT-LAMP für SARS-CoV-2
RTLAMP eignet sich besonders für den Nachweis von Viren aus Proben der oberen Atemwege, wie etwa Nasen/Rachenabstriche oder Gurgellösungen. Im Zuge der Pandemie wurde am Vienna BioCenter hierzu ein SARSCoV2 Assay entwickelt (VBC RTLAMP), welches auf dem ursprünglichen RTLAMPTestprinzip basiert und auf SARSCoV2Nachweis aus Gurgelproben optimiert wurde10: Zum einen wurde die Probenaufbereitung stark vereinfacht, sodass lediglich ein 5minütiger Auf
RT-LAMP – Praxisbericht
Schon Ende 2020 wurde es dem Wewalka Corona Management Team klar, dass eine genaue Methode mit hohem Probendurchsatz benötigt wird, um das Infektionsgeschehen der CoVID19Pandemie so gut wie möglich zu beherrschen. Im Jänner 2021 sind wir auf das innovative RTLAMPVerfahren aufmerksam geworden. Sehr rasch erkannten wir die Vorteile dieser Methode und entschlossen uns zur Ausrollung im betriebseigenen Labor am Firmenstandort Sollenau. Seither werden wöchentlich, auch vom ungarischen Tochterwerk, hunderte Proben am Standort Sollenau analysiert. Durch RTLAMP ist es uns möglich geworden, unseren Mitarbeitern den bestmöglichen Schutz zu bieten und aktiv Betriebsausfällen vorzubeugen. Das sind weitere wichtige Schritte zur Sicherung unserer Lieferfähigkeit und unseres Qualitätsversprechens, das wir gegenüber unseren Kunden haben. Darüber hinaus kommen wir als Arbeitgeber der Verantwortung gegenüber unseren Mitarbeitern nach.
Mag. Hannes Scherbichler, Wewalka GmbH Nfg. KG, Sollenau
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kochungsschritt der Probe in einem speziellen Puffer ausreicht, um Viren zu inaktivieren und das aufgeschlossene Probenmaterial zu stabilisieren. Damit ergibt sich in der Praxis eine Zeitersparnis von mehreren Stunden und eine Unabhängigkeit von kostspieligen Aufreinigungssystemen, die in der klinischen PCRDiagnostik Anwendung finden. Weiteres wurde der Assay auf den Einsatz von Gurgelproben mittels einfacher kolorimetrischer Analyse optimiert. Hierzu wird Hydroxynaptholblau (HNB)Farbstoff der RTLAMPReaktion beigefügt, welcher bei einem positiven Ergebnis von Violett auf Himmelblau umschlägt. Als Unterstützung bei der Interpretation des Farbumschlags dient eine eigens entwickelte computergestützte BildbearbeitungsApplikation11 . Der SARSCoV2VBC RTLAMPAssay wurde in einer gemeinsamen Kooperation mit der AGES an hunderten Gurgel und Nasen/Rachenabstrichproben validiert11, wobei eine Spezifität von mehr als 99 % und eine Sensitivität von mehr als > 95 % für Proben mit einer infektiösen Viruslast (ca. 1.000 Kopien SARSCoV2Virus pro µl originalprobe) im Vergleich zu GoldstandardPCR erzielt wurde12 . Somit ist der Einsatz von RTLAMP für die sichere Identifizierung von infektiösen Personen geeignet. Die Gesamtdauer von der Probenannahme bis zum Ergebnis liegt bei etwa 35 Minuten und ist durch den Einsatz von Gurgelproben unabhängig von medizinischem Fachpersonal für die Probenabnahme.
RT-LAMP, kommerzieller Status und Zulassung
Das am Vienna BioCenter entwickelte RTLAMPVerfahren ist mittlerweile als CEIVD in Deutschland (BfArM) beim Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) für die EU zugelassen13. Zudem bietet das Vienna BioCenter in einer gemeinsamen Kooperation mit der Krisenplaner GmbH Schulungen für RTLAMP an14 . Alternativ zum VBC SARSCoV2 RTLAMPAssay wurde am Klinikum Donaustadt ein weiterer SARSCoV2 RTLAMPAssay entwickelt, welcher als CEIVD Medizinprodukt von Ingenetix auf den Markt gebracht wurde15 . Dieser Assay bedarf ebenso keiner aufwändigen Aufreinigung von RNA, ist allerdings auf medizinische Nasen/Rachenabstriche in Salzlösung angewiesen. Allerdings liegen derzeit keine Daten von einer unabhängig durchgeführten Studie zu diesem Verfahren vor.
Max J. Kellner, Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna BioCenter, Wien
