ANALISI DI HANSENIASPORA UVARUM IN BIRRIFICAZIONE: I RISULTATI

Nel mio ultimo articolo per BNM (numero 4/22), avevo illustrato l’importanza dei lieviti non convenzionali in birrificazione, in particolare evidenziando le interessanti caratteristiche del ceppo di Hanseniaspora uvarum nel ruolo di lievito starter. Nel frattempo, si è giunti al termine della ricerca che ha visto come protagonista il ceppo YGA34: la tolleranza di questo lievito a valori di 7-8% (v/v) di alcool, un’eccezionale resistenza ai composti bio-attivi del luppolo (di oltre 90 ppm di iso-alfa acidi – pari a 90 IBU), insieme a un rapido avvio del processo fermentativo sono soltanto alcune killer feature di questo lievito. Al fine di valutare le performance e le caratteristiche di questo ceppo non convenzionale, sono stati condotti numerosi studi sperimentali di birrificazione presso il laboratorio di Microbiologia Agroalimentare del dipartimento SAAF dell’Università degli Studi di Palermo. L’obiettivo ultimo è stato quello di valutare l’effetto dell’inoculo di questo ceppo in diverse fasi della fermentazione alcolica (FA) di un mosto di birra all-grain, analizzando i parametri fisico-chimici e microbiologici, la produzione di composti organici volatili e la qualità sensoriale del prodotto imbottigliato ottenuto alla fine del processo.

Figura 1 - Il piano sperimentale.

Il piano sperimentale

Per comprendere meglio l’effetto dell’inoculo di H. uvarum durante la FA, sono state prodotte birre sperimentali ad alta fermentazione su media scala (batch da 10 litri) utilizzando quattro diverse combinazioni di inoculo tra il ceppo YGA34 H. uvarum e il ceppo commerciale US-05 Saccharomyces cerevisiae (Fermentis), usato anche come ceppo di controllo (Figura 1). Le quattro tesi sperimentali (T1, T2, T3 e T4) e una prova di controllo (Tc) sono state inoculate come riportato di seguito: ❱ Tesi T1: co-inoculo (inoculo contemporaneo) dei ceppi YGA34 e US-05 (rapporto 1:1); ❱ Tesi T2: co-inoculo dei ceppi YGA34 e

US-05 (rapporto 10:1); ❱ Tesi T3: inoculo sequenziale: ceppo

YGA34 e, dopo 48 ore, inoculo del ceppo US-05; ❱ Tesi T4: monocoltura (inoculo singolo) del ceppo YGA34 di H. uvarum; ❱ Tesi Tc: monocoltura del ceppo US05 di S. cerevisiae.

Ciascun ceppo di lievito è stato inoculato nel mosto con una densità cellulare pari a 2 × 106 Unità Formante Colonia (UFC)/mL nelle prove T1, T3 e T4, mentre nella prova T2, H. uvarum YGA34 e S. cerevisiae US-05 sono stati inoculati rispettivamente a 2 × 106 e 2 × 105 UFC/ mL. Le birre sono state prodotte presso l’impianto pilota del SAAF, Dipartimento - Università di Palermo (Italia), utilizzando un sistema AIO (all-in-one) Klarstein da 50 litri. Il mosto è stato realizzato

impiegando 9 kg di malto Pilsen (BestMalz, Heidelberg, Germania) macinato tramite un mulino regolabile a due rulli, aggiungendolo a 30 litri d’acqua minimamente mineralizzata con aggiunta di 10 g di cloruro di calcio (CaCl2). Il mash (single-step) è stato riscaldato fino a 70 °C, per circa 40 minuti, fino alla completa conversione degli amidi in zuccheri semplici, verificando l’avvenuta reazione con il test della soluzione di iodio. Successivamente, i grani di malto sono stati risciacquati (sparging) con 20 L di acqua riscaldata a 80 °C, ottenendo un volume totale di 45 litri. Il mosto ottenuto è stato fatto bollire per 60 minuti, all’inizio dei quali sono stati aggiunti i luppoli (pellet, 40 g, 11,5% di α-acidi) per raggiungere una concentrazione finale di 25 IBU, realizzando quindi una luppolatura esclusivamente “da amaro”, per permettere di valutare meglio gli aromi prodotti dai diversi lieviti inoculati. Dopo la bollitura, sono stati ottenuti 42 L di mosto a 13,5 °Bx (gradi Brix). Il mosto è stato poi chiarificato attraverso un whirlpool costituito da 10 minuti di ricircolo e 10 minuti di riposo. Il mosto è stato infine raffreddato a 21 °C in preparazione all’inoculo dei ceppi di lievito selezionati. Le analisi sui parametri qualitativi standard del mosto di birra sono riportati nella Tabella 1.

Tabella 1 - Parametri qualitativi del mosto (media ± σ).

° Brix 13,5 ± 0,10

pH 5,62 ± 0,01 Gravità specifica (SG) 1052,5 ± 0,70 Azoto α-amminico (mg/L) 71,44 ± 0,42 Azoto ammoniacale (mg/L) 106,6 ± 0,60 Composizione zuccherina (g/L) D-glucosio D-fruttosio 7,16 ± 0,01

0,94 ± 0,04

Saccarosio

Maltosio 10, 02 ± 0,02

75,63 ± 0,23 Tabella 2 - Percentuale di consumo dei diversi zuccheri durante la fermentazione alcolica.

D-GLUCOSIO (%) D-FRUTTOSIO (%) SACCAROSIO (%) MALTOSIO (%)

T1 99.4 ± 0.02 97.3 ± 0.05 100 ± 0.05 82.0 ± 0.04

T2 99.5 ± 0.05 97.9 ± 0.01 100 ± 0.07 89.2 ± 0.10

T3 99.5 ± 0.02 98.1 ± 0.07 100 ± 0.49 84.6 ± 0.03

T4 99.2 ± 0.03 96.8 ± 0.02 37.9 ± 0.39 2.2 ± 0.07

Tc 99.4 ± 0.05 96.8 ± 0.08 100 ± 0.07

I risultati indicano i valori medi ± σ di tre misurazioni. 84.3 ± 0.01

Alla fine della FA primaria, le birre prodotte sono state imbottigliate e sottoposte a rifermentazione in bottiglia, aggiungendo 4,5 g/L di destrosio e 5,0 × 106 UFC/mL di lievito US-05. Durante le diverse fasi di birrificazione sono state condotte analisi come il monitoraggio delle popolazioni microbiche dei lieviti inoculati, analisi dei principali parametri fisico-chimici (pH, zuccheri residui, etanolo, glicerolo e acido acetico), analisi sui composti organici volatili (COV) e analisi sensoriale da parte di un panel di giudici. Infine, i dati sono stati elaborati dal punto di vista statistico, per evidenziare le differenze e le similitudini tra le tesi, tenendo conto di tutti i parametri monitorati.

Risultati

Conte microbiche Riguardo l’evoluzione delle popolazioni di lieviti inoculati, l’andamento delle curve di crescita dei due ceppi ha fatto registrare senz’altro dei risultati interessanti. I livelli di conta (Figura 2) evidenziano la capacità del ceppo YGA34 di dominare la FA rispetto a US-05. Come si può vedere dall’immagine, infatti, sia nella tesi T1 che, ancor di più, in quella T2, H. uvarum ha fatto registrare un miglior tasso di crescita e di dominanza nelle prime fasi della FA. Per quanto riguarda la tesi T3, inoculata sequenzialmente, la dominanza di YGA 34 è durata per tutto il corso della FA. Nella prova T4, nonostante l’incapacità di H. uvarum di consumare gli zuccheri complessi del mosto, carattere confermato anche dai database pubblici dei genomi dei lieviti, i suoi livelli hanno sfiorato i 70 milioni di UFC per mL. Anche altre specie del genere Hanseniaspora non sembrano possedere questo gene specifico che produce l’enzima maltasi.

Parametri chimici Alla fine della FA, le tesi sperimentali non hanno fatto registrare differenze sostanziali in termini di pH, risultato compreso tra valori di 3,95 e 4,10, a eccezione della tesi T4, che ha fatto registrare una fermentazione incompleta e quindi un pH superiore (4,85). Anche la final gravity (FG) è risultata simile nelle tesi T1, T2, T3 e Tc, con valori pari a 1.015. La percentuale degli zuccheri residui fermentati è riportata nella Tabella 2. Fruttosio e glucosio sono stati completamente fermentati in tutte le tesi. A eccezione della tesi T4, il saccarosio contenuto nel mosto è stato metabolizzato in tutte le altre prove, evidenziando quindi la capacità del ceppo YGA34 di fermentare soltanto zuccheri semplici; per questa ragione non è stata condotta la rifermentazione per questa tesi. Il consumo di maltosio è risultato compreso tra l’82 e l’89% per le tesi T1, T2, T3 e Tc, ove era presente il lievito S. cerevisiae. In Tabella 3 sono riportati i risultati delle analisi eseguite su alcool, glicerolo e acido acetico.

Figura 2 - Evoluzione delle popolazioni microbiche di H. uvarum (in verde) e S. cerevisiae (in rosso).

Il valore più alto di etanolo è stato raggiunto nella tesi T2, con il 5,16% (v/v). Il glicerolo è un composto che riveste un ruolo principale nella birra, in quanto rappresenta il terzo metabolita prodotto durante la FA (dopo alcool e anidride carbonica). Esso ha un’influenza positiva su diverse proprietà sensoriali, fra cui morbidezza e rotondità al palato; solitamente la sua concentrazione nelle birre è compresa fra 1,5 e 3,5 g/L. Tra le prove sperimentali condotte, la tesi che ha fatto registrare la maggiore produzione è stata quella che ha previsto l’inoculo se-

ETANOLO (%) RESA IN ETANOLO (g/g) GLICEROLO (g/l) ACIDO ACETICO (g/l)

T1 5.05 ± 0.16ab 0.498 ± 0.064a 3.20 ± 0.18b 0.03 ± 0.02c

T2 5.16 ± 0.13a 0.476 ± 0.042a 3.09 ± 0.08b 0.17 ± 0.03b

T3

T4 4.80 ± 0.07c 0.461 ± 0.049a

0.52 ± 0.01d 0.309 ± 0.023b 3.80 ± 0.06a

1.28 ± 0.40c 0.26 ± 0.04a

0.27 ± 0.01a

quenziale tra H. uvarum e S. cerevisiae, con un valore pari a 3,8 g/L. L’acido acetico ha invece fatto riscontrare i suoi valori minimi nelle tesi T1 e Tc (0,03 g/L), mentre il suo valore più alto nella tesi T3 con 0,27 g/L. Il ceppo H. uvarum YGA34 è stato in grado di produrre discrete quantità di acido acetico, anche se a concentrazioni inferiori rispetto allo studio di controllo, già durante le prime 48 ore di FA. Composti organici volatili (COV) In totale, dall’analisi delle birre prodotte, sono stati identificati 18 composti organici volatili. Le birre sperimentali, prodotte con l’inoculo del ceppo selezionato YGA34, hanno mostrato un profilo COV diverso sia fra loro che soprattutto rispetto alla tesi di controllo inoculata con US-05. Nella Figura 3 è rappresentata una heat-map che indica i diversi livelli di COV nelle varie tesi, evidenziando le differenze tramite una scala colorimetrica dal giallo (concentrazioni più basse) al rosso (concentrazioni più elevate) La categoria di COV più abbondante è stata quella degli alcoli, noti per esaltare aromi floreali, ma anche di solvente o di alcolici; tuttavia, la loro presenza oltre una certa soglia potrebbe essere indesiderata. Le principali differenze tra le tesi sono state riscontrate nella produzione di esteri, che è risultata la seconda classe di COV più abbondante. Il livello di esteri dipende quasi esclusivamente dall’attività specifica del ceppo di lievito impiegato, in particolare dalla produzione e dall’equilibrio tra gli enzimi di sintesi e di degradazione. Esistono infatti dei ceppi come quelli classicamente impiegati per brassare le Saison

Tabella 3 - Concentrazioni di etanolo, glicerolo e acido acetico prodotti nelle birre, utilizzando le diverse combinazioni di inoculo.

Tc

Significatività statistica 4.90 ± 0.11bc 0.470 ± 0.050a 3.08 ± 0.04b 0.03 ± 0.02c

I risultati indicano i valori medi ± σ di tre misurazioni. I dati riportati nella stessa colonna seguiti dalla stessa lettera non sono significativamente diversi secondo il Tukey’s test. Valori di significatività statistica (P-value): *, P < 0,01; ***, P < 0.001.

che, a causa dell’elevata produzione di enzimi che sintetizzano gli esteri, permettono di ottenere birre molto speziate e fruttate. I livelli di esteri nella tesi T3 (32,7 mg/L) sono stati infatti di oltre tre volte superiori rispetto alla tesi di controllo Tc (9,2 mg/L). Il principale estere è stato l’acetato di etile (o etil-acetato), un metabolita secondario della FA, responsabile dell’aroma fruttato delle birre e la cui soglia di percezione è pari a 25 mg/L. La tesi che ha previsto l’inoculo sequenziale ha fatto registrare il valore maggiore (32,2 mg/L) di questo composto, superando così la soglia di percezione sensoriale. Altri esteri, come l’esanoato di etile e l’acetato di isoamile, responsabili dell’aroma di banana, mela e anice, sono stati anch’essi prodotti in misura maggiore nella tesi T3.

Analisi sensoriale La valutazione sensoriale delle birre sperimentali è stata condotta con un’analisi descrittivo-quantitativa condotta dai panelisti per definire colore, odore, sapore e qualità complessiva. Undici giudici (di età compresa tra i 23 e i 52 anni) sono stati reclutati dall’Università di Palermo, da associazioni birrarie e da birrai professionisti, tutti con esperienza nella produzione e nell’assaggio di birra. I giudici hanno generato consensualmente 28 attributi descrittivi sensoriali su aspetto, odore, sapore, gusto e qualità complessiva in diverse sessioni. Gli attributi sono stati: aspetto (intensità giallo); odore (intensità, complessità, fruttato, agrumato, floreale, luppolato, cereale, maltato, miele/caramello, tostato/ bruciato, sulfureo, acetico, ossidato/ invecchiato, alcool e off-odours); gusto (dolce, amaro, acido e salato); sensazione in bocca (corpo e astringenza); sapore (intensità, complessità, fruttato, agrumi, luppolo, cereale, maltato, miele/caramello, tostato/bruciato, alcolico, solforoso e off-flavours). È stato incluso anche il descrittore “qualità complessiva” sia per l’odore che per il sapore. Nessuna delle birre prodotte ha fatto registrare off-odours o off-flavours, così come non si sono segnalate differenze sostanziali per il parametro del colore. Il punteggio più alto per la qualità complessiva è stato riscontrato per le birre delle prove T2 e T3. Le birre fermentate in presenza del ceppo YGA34, in particolare le prove T1 e T3, hanno mostrato i punteggi più alti per intensità, complessità e descrittori floreali nel profilo odoroso, così come per intensità, complessità, acidità e sapidità nel profilo gusto-olfattivo. Le differenze sensoriali sono state riconosciute anche all’interno delle tre prove fermentate con il ceppo YGA34; la prova T3, che prevedeva l’inoculo di H. uvarum 48 ore prima di quello di S. cerevisiae, ha mostrato il valore più alto dei descrittori di acidità e sapidità nel profilo gustativo, mentre la prova T2 ha mostrato i valori più bassi per gli stessi attributi, segno che la tempistica e la modalità di inoculo possono

Figura 3 - Heat-map dei composti organici volatili.

Figura 4 - Spider-plot dei descrittori sensoriali aromatici.

Figura 5 - Spider-plot dei descrittori sensoriali gustativi. giocare un ruolo chiave per modulare il profilo sensoriale della birra. I descrittori sensoriali che hanno maggiormente caratterizzato le birre prodotte sono riportati nelle Figure 4 e 5.

Conclusioni

In conclusione, la diversità dei lieviti presenti nell’antica bevanda a base di miele prodotta in Sicilia, lo “Spiritu Re Fascitrari”, è stata investigata per la selezione di starter microbici da impiegare in bevande fermentate. Il presente studio ha difatti fornito dati scientifici sulle proprietà tecnologiche dei lieviti appartenenti a questa nicchia ecologica, per la produzione di birra. Questo lavoro arricchisce le limitatissime conoscenze scientifiche sul ruolo dei lieviti non convenzionali, fra cui il genere Hanseniaspora, come potenziali co-starter per la produzione di birra. Attraverso un approccio polifasico (genotipico e fenotipico) è stato possibile identificare e caratterizzare cinque ceppi di H. uvarum. Per la prima volta è stata segnalata un’elevata resistenza all’etanolo e al luppolo per dei ceppi di questa specie. L’applicazione di questi lieviti durante la produzione di birra ha mostrato differenze in termini di parametri fisico-chimici, COV e caratteristiche sensoriali, evidenziando come questi lieviti possano essere impiegati con successo come co-starter in un’ampia gamma di produzioni di birra. Tuttavia, sono necessarie ulteriori indagini per valutare il ruolo di questi e altri ceppi durante la fermentazione, sia in singolo che in presenza di altri ceppi di S. cerevisiae, per la produzione di stili specifici, valutando i risultati anche per l’impiego in mosti con un diverso grist di malti.

A cura di Michele Matraxia, Antonino Pirrone, Rosario Prestianni, Vincenzo Naselli, Giuliana Cinquemani, Antonio Alfonzo, Giancarlo Moschetti,

Nicola Francesca Nicola.francesca@unipa.it Dip. SAAF Universit. degli Studi di Palermo