Reet Mändar

KEHAVÄLISEL VILJASTAMISEL KASUTATAVA MATERJALI MIKROBIOLOOGILINE KONTROLL

Determination of bacteria in the in vitro fertilization materials

Juliana Baranova, Ülle Parm, Jelena Štšepetova, Reet Mändar

Abstract

Over the past few years, a lot of studies have been carried out in the fi eld of in vitro fertilization (IVF). Some of these studies have indicated the presence of high variety bacteria in the IVF materials. However, no similar studies have been conducted in Estonia. Th e aims of this study were to determine the prevalence and counts of bacteria in the IVF materials, connections between them, clinical patient data and procedure outcome. Studied samples (n=50) of infertile couples included: collected semen, treated semen, incubated semen and fertilization solutions 1 and 2. Collected samples were quantifi ed by real time PCR for total counts and three groups of bacteria: Enterobacteriaceae, Corynebacterium spp. and Staphylococcus spp. Descriptive statistics, t-, Mann-Whitney, χ2-tests and Spearman’s correlation were used for the comparison of studied groups. Statistically signifi cant diff erence was considered by p <0.05.

Th e prevalence and counts of bacteria in the IVF materials were lower in the semen after incubation compared to the semen after collection and treatment. Unexpectedly, the prevalence and counts of total bacteria and Corynebacterium spp. were higher in fertilization solution 2 than in solution 1, although the same treated semen was used for fertilization and Corynebacterium spp. count reduced with treatment remarkably. Th e count of Enterobacteriaceae was higher in solution 1 in comparison to solution 2. Th e positive correlation

between counts of bacteria and semen motility in the treated semen was found. Staphylococcus spp. was found only in the semen sampled from patients with infl ammation. No diff erence in the prevalence or counts of bacteria presented between fertilization solutions 1 and 2 and between the groups of pregnant and non-pregnant women was found.

Keywords: in vitro fertilization (IVF), IVF in Estonia, IVF and bacteria, IVF contamination, IVF specimen control, real-time PCR.

Sissejuhatus

Kehavälise viljastamise abil sünnib Eestis ligikaudu 3% vastsündinutest, kuid vaid 30%-l vastava protseduuri läbinud naistest lõpeb see sünnitusega (Kehavälise... 2013). Seega võib öelda, et kuigi protseduur on populaarne, on ebaõnnestumise protsent siiski suur. Selle üheks põhjuseks peetakse kehavälise viljastamismaterjalides esinevaid mikroobe (Abeysundara jt 2013, Kiessling jt 2008, Pelzer jt 2013, Weng 2014). Analoogseid uuringuid ei ole Eestis korraldatud ja seega puuduvad tõenduspõhised andmed mikroobide esinemisest viljastamismaterjalides ning nende mõjust protseduuri tulemusele.

Uurimistöö eesmärk oli selgitada viljastamismaterjalide kontaminatsiooni ja mikroobide mõju protseduuri tulemuslikkusele. Uurimisülesanneteks oli selgitada (1) bakterite esinemissagedust ja kontsentratsiooni analüüsitavates materjalides, kasutades selleks molekulaardiagnostilist meetodit; (2) seoseid kliiniliste andmete ja bakterite esinemise vahel uuritavates materjalides; (3) bakterite mõju protseduuri tulemuslikkusele.

Märksõnad: kehaväline viljastamine ehk IVF, IVF Eestis, IVF ja bakterid, IVF-i kontaminatsioon, IVF-i materjalid, reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon (PCR).

Metoodika

Uuringuks kasutati Nova Vita kliinikus 2012. aastal IVF-i protseduuri läbinud paaride (n = 50) materjale. Kuna vastavaks protseduuriks valmistatakse sperma ette, siis analüüsiti värskelt kogutud spermat ehk spermat enne pesu (n = 48), spermat pärast pesu (n = 49) ja inkubeeritud spermat, mida kasutati viljastamiseks (n = 50). Kuna viljastamiseks kasutatud sperma jaotati kahe tassi vahel, millest teist kasutati vaid vajaduse korral, siis jälgiti eraldi viljastamise lahuse proove esimesest (n = 50) ja teisest tassist (n = 37). Patsientide terviseseisundit kajastavad andmed saadi arstliku läbivaatuse ja küsitluse teel.

DNA eraldamiseks uuritavatest proovidest kasutati QIAamp Blood Mini komplekti (QiaGen, Saksamaa). Ekstraheeritud DNA hulk määrati Nanodrop™-i spektofotomeeteriga (NanoDrop Technologies, USA) lainepikkusel 260 nm, et kontrollida eraldamise õnnestumist ja DNA puhtusastet. Viljastamismaterjalide kontaminatsiooni jälgiti kolmes bakterite rühmas: Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp. ja Corynebacterium spp. (kirjandusele tuginedes esinevad need spermas sagedamini (Abeysundara jt 2013; Al-Mously jt 2009; Bernard 2012; Korrovits jt 2006; Moretti jt 2009; Shalika jt 1996.)), ning bakterite üldise esinemise osas. Kolme bakterite rühma tüüptüved (Escherichia coli ATCC700336, Staphylococcus epidermidis ATCC12228, Corynebacterium seminale CM12-4) hangiti Ameerika tüüpkultuuride kollektsioonist ja spermast isoleeritud C. seminale tuvastati 16S rRNA sekveneerimisega.

Uuringus kasutatud praimerid ja sondid on mõeldud bakterite 16S rRNA geenide tuvastamiseks (tabel 1). Bakterite koguhulga määramiseks kasutatud oligonukleotiidsond oli märgistatud märgisega 6-FAM ja TAMRA (Applied Biosystems, Holland).

Tabel 1. Uuringus kasutatud praimerid ja sondid.

Rühmad (amplikoni pikkus, Tm) T otal bacteria Praimerid/ proovid Järjestused (5’–3’)

(466 bp, 60 °C, TaqMan) Univ-f

Univ-r

Univ (probe) TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA

TGCGGGACTTAACCCAACA

CACGAGCTGACGACA(AG)CCATGCA

Enterobacteriaceae Eco1457-f ACAGATGCAGCCAAAGTGGTTGAATT

(195bp,58 °C, Sybr) Staphylococcus spp.

(560bp, 62 °C, Sybr) Corynebacterium spp.

(516bp, 60 °C, Sybr) Eco1652-r

TStaG422:

TStaG765:

CF-1

CF-2 CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC

GAAGAATTGCTTGAATTGGTTGAA

GGACGGTAGTTGTTGAAGAATGG

CGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCG

CGTTGCGGGACTTAACCCAACACT

Iga tüüptüve PCR-i amplikon sisestati eraldi plasmiidvektorisse. Rekombinantne vektor viidi keemiliselt pädeva E. coli JM109 tüve rakkudesse. Märklaudbakterite amplifi tseeritavat piirkonda sisaldavad plasmiidid klooniti pGEM-T Easy vektorsüsteemi (Promega, USA). Plasmiidid puhastati NucleoSpin Plasmid Quick pure komplektiga tootja juhiste kohaselt (Macherey-Nagel, Saksamaa). Puhastatud plasmiidide kogus määrati spektrofotomeetriga (Nanodrop ND-1000, USA) seda mitmekordselt lahjendades. Reaktsioonide jaoks valmistati plasmiidi lahused selle pideva kümnekordse lahjendamise teel (standardite kontsentratsioon 105 kuni 101 plasmiidi koopiat ml kohta).

DNA amplifi tseerimine ja tuvastamine reaalaja PCR-i meetodil viidi läbi 7500 Fast Real-Time PCR-i termotsükleril (Applied Biosystems Europe BV, Šveits) kolmes paralleelis, kasutades 96 süvendiga optilisi plaate. Analüüsitava segu kogumahuks oli 25 μl (sh 5 μl uuritavat DNA lahust). PCR-i analüüsile järgnes dissotsiatsioonkõvera analüüs, mille abil kontrolliti produkti ja SYBR Greeni segu puhtust. TaqMan PCR-i reaktsiooni kogumaht oli samuti 25 μl (sh 5 μl uuritavat DNA lahust). Reaalaja PCR-i

analüüsimeetod hõlmas denaturatsiooni ja amplifikatsiooni etappe (40 tsüklit). Iga amplifi katsiooni tsükkel koosnes denaturatsioonist ja elongatsiooni perioodist. Standardeid kasutati iga plaadi analüüsimises. Tulemuste analüüsimiseks kasutati Sequence Detectioni tarkvara 1.6.3 versiooni (Applied Biosystems, USA).

Statistilise analüüsi tegemiseks kasutati tarkvara SigmaStat 2.0 (Jandel Scientifi c Corporation, USA). Rühmade võrdlemiseks arvväärtuste korral kasutati t-testi või Mann-Whitney testi, mittearvuliste väärtuste korral χ2-testi ja šansside suhte määramist, korrelatsioonanalüüs tehti Spearmani testiga. Statistiliselt oluliseks erinevuseks loeti pväärtus < 0,05.

Tulemused Uuritavate taustandmed

Meeste ja naiste keskmine vanus oli vastavalt 37,1 ±6,3 ja 33,7 ±4,4 aastat. Sperma mahu, kontsentratsiooni ja liikuvuse keskväärtused vastasid WHO kehtestatud normidele (WHO 1999). 20%-l meestest esines suguteede põletik. Sperma kontsentratsioon oli suurem enne pesu võrreldes pärast pesu ja inkubeeritud spermaga (vastavalt 76,5 x 106 vs. 20,9 x 106 vs. 3,7 x 106 spermi/ml; mõlemal juhul p ˂ 0,001). Spermide liikuvus oli enne pesu spermas väiksem kui pärast pesu ja inkubeeritud spermas (mõlemal juhul p ˂ 0,001). Bakteriaalset vaginoosi diagnoositi Nugenti skoori järgi 16%-l, ülemineku mikrobioota esinemist 12%-l ja normaalset mikrobiootat 72%-l naistest. Pärast kunstlikku viljastamist tuvastati rasedus biokeemilise testiribaga 36%-l ja ultraheliga 28%-l naistest.

Bakterite esinemine ja nende kontsentratsioon uuritavas materjalis

Sperma töötlemise käigus väheneb bakteritega kontamineeritud materjali hulk. Nimelt esineb baktereid sisaldavat materjali pärast pesu ja inkubeeritud spermas harvemini kui enne pesu. Seejärel kontamineeritud materjalide hulk jälle suureneb, kusjuures viljastamise lahuses nr 2 on bakteritega materjale rohkem kui inkubeeritud spermas, samuti on

see suurem kui spermas pärast pesu (joonis 1). Võrreldes Staphylococcus spp.-ga on materjalide sagedamad kontamineerijad Enterobacteriaceae ja Corynebacterium spp. hulka kuuluvad mikroobid. Spermas pärast pesu ja inkubeeritud spermas esineb sagedamini Enterobacteriaceae sugukonna baktereid kui Corynebacterium spp.-d.

Joonis 1. Üldiselt bakteritega ja eraldi kolme bakterirühma arvestades kontamineeritud uuringumaterjalid. Šansside suhte arv on esitatud suurem vs väiksem väärtus. 1 – OR = 15 (95% UV 4,94‒45,52); 2 – OR = 12 (95% UV 3,98‒36,22); 3 – OR = 11,72 (95% UV 3,65‒37,61); 4 – OR = 9,6 (95% UV 2,62‒35,21); 5 – OR = 10,76 (95% UV 1,31‒88,48) 6 – OR = 13,33 (95% UV 1,61‒110,57); 7 – OR = 24,55 (95% UV 3,03‒198,97).

Võrreldes mikroobide esinemist erinevates materjalides, selgus, et töötlemise käigus Enterobacteriaceae sugukonna esindajatega kontamineerunud materjali hulk väheneb ja on väikseim viljastamise lahustes. Corynebacterium spp. esinemine vähenes spermas pärast pesu kõige rohkem võrreldes teiste bakterite rühmadega ehk nad on pesu suhtes kõige tundlikumad. Edaspidisel töötlusel jäi Corynebacterium spp. esinemissagedus muutumatuks, v.a viljastamise lahus nr 2. Seal esines korünebaktereid sagedamini kui töödeldud spermas ja ka lahuses nr 1 (joonis 1).

Kui bakterite hulkade analüüsimisel arvestati kõiki proove (st ka neid, kus mikroobe ei esinenud või oli neid sellisel määral, mida molekulaarse meetodiga ei saanud tuvastada), oli bakterite üldine kontsentratsioon statistiliselt suurem spermas enne pesu võrreldes teiste materjalidega (joonis 2). Mitteootuspärane tulemus ilmnes viljastamise lahuste osas: nimelt oli viljastamise lahuses nr 2 bakterite kontsentratsioon suurem kui lahuses nr 1, kuigi teine viljastamise lahus sisaldab samu komponente (sperma, munarakud), kuid rakkude osakaal võis olla erinev.

Joonis 2. Bakterite üldine kontsentratsioon uuritavates materjalides. ┬ – maksimumväärtus; must kast – ülemine kvartiil; hall kast – alumine kvartiil; halli ja musta kasti valge piirjoon – mediaan; ┴ - miinimumväärtus; X – keskväärtus.

Arvestades kõiki proove (ka neid, kus mikroobe ei tuvastatud), väheneb Enterobacteriaceae kontsentratsioon pesemise käigus ja on väikseim viljastamise lahustes. Korünebakterite kontsentratsioon on suurim töötlemata spermas ja väheneb selle töötluse käigus, olles väikseim viljastamise lahuses nr 1. Teises viljastamise lahuses on see suurem kui eelmistes materjalides, v.a töötlemata sperma (joonis 3).

Joonis 3. Enterobacteriaceae ja Corynebacterium spp. kontsentratsioonid erinevates materjalides. ┬ – maksimumväärtus; must kast – ülemine kvartiil; hall kast – alumine kvartiil; halli ja musta kasti valge piirjoon – mediaan; ┴ – miinimumväärtus; X – keskväärtus.

Arvestades vaid mikroobide suhtes positiivseid proove, oli Staphylococcus spp. esindajate kontsentratsioon spermas enne pesu suurem kui esimeses (2,97E + 03 vs. 3,84E + 02; p = 0,016) ja ka teises viljastamise lahuses (2,97E + 03 vs. 1,50E + 02; p = 0,017). Samas esineski mõlemas viljastamise lahuses (st lahustes nr 1 ja 2) vaid üks positiivne proovimaterjal. Kui arvestati ka bakterite suhtes negatiivseid proove, siis kontsentratsioon spermas enne pesu ja viljastamise lahustes ei erine. Pärast pesu ja inkubeeritud spermas Staphylococcus spp.-d ei leitud.

Kliinilised andmed ja bakterite mõju protseduuri tulemuslikkusele

Pesujärgses spermas on bakterite üldise suurema kontsentratsiooni korral spermide liikuvus parem (r = 0,341; p = 0,017). Selgus, et põletikuga spermas esineb Staphylococcus spp.d sagedamini (5/10) kui põletikuta spermas (0/35; p ˂ 0,001). Esineb positiivne korrelatsioon neutrofi ilide

leiu ja Staphylococcus spp. esinemise vahel (r = 0,448; p = 0,002). Selgus, et Enterobacteriaceae esinemissagedus viljastamise lahuses nr 1 on suurem bakteriaalse vaginoosiga (4/8) kui bakteriaalse vaginoosita (5/42) naistel (p = 0,039) ning esineb nõrk korrelatsioon Enterobacteriaceae suurema kontsentratsiooni ja Nugenti skoori (0‒10) vahel (r = 0,31; p = 0,029). Viljastamise lahuses nr 2 esineb negatiivne korrelatsioon Corynebacterium spp. suurema kontsentratsiooni ja Nugenti skoori vahel (r = –0,34; p = 0,039). Bakterite (arvestades ka eraldi kolme bakterite rühma) esinemine ja nende kontsentratsioon viljastamise lahustes ei erinenud IVF-i tulemustes rasestunud naistel ega nende puhul, kes ei rasestunud.

Arutelu

Töö tulemused näitavad, et üldine bakterite esinemissagedus töötlemata spermas (90,5%) oli isegi suurem võrreldes teiste tööde (56–74%) tulemustega (Kiessling jt 2008; Abeysundara jt 2013). Varasemast uuringust selgub, et IVF-i jaoks sperma töötlemine tihedusgradiendi lahusega vähendab bakterite hulka, kuid ei eemalda neid täielikult (Abeysundara jt 2013). Seega ei ole viljastamiskeskkond steriilne. Analoogne tendents ilmneb käesolevas töös. Bakterite sagedasem esinemine just viljastamise lahustes võib olla seotud soodsate inkubeerimistingimustega (toiterikas lahus, temperatuur 37 °C), mis tagab rakkude arengu, samas aga soosib sinna spermast sattunud bakterite kasvu.

Loomuliku viljastamise (in vivo) tingimustes on oportunistlikud bakterid tavapärased keskkonna komponendid ja nende hulga vähenemiseks ei kasutata erilisi meetmeid – seega nii in vitro kui ka in vivo viljastamise keskkonnad sisaldavad baktereid. IVF-i puhul on viljastamise keskkonnaks tass ja juhul, kui mikroobide kasv ületab teatud piiri (ehk kontsentratsiooni), ei saa seal embrüod areneda. Nad hävivad toitainete vaeguse ja keskkonna bakterite metaboolsete produktidega üleküllastatuse tõttu (Manual of...2012).

Varem on leitud, et sperma kontaminatsioon ehk bakteriaalne saastus vähendab spermide liikuvust (Moretti jt 2009), mis takistab IVF-i protsessi edukust. Lisaks on teada, et enterobakterite esinemine spermas on seotud viljatute meeste sperma halva kvaliteediga (Moretti jt 2008, Weng jt 2014). Selles töös need seisukohad kinnitust ei leidnud. Vastupidi, pärast pesu spermas oli bakterite suurema kontsentratsiooni foonil spermide liikuvus parem.

Spermas esinevate bakterite kohta on väidetud, et ükski kultiveeritud sperma mikroobidest (Enterococcus spp., E. coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Proteus spp., Bacillus spp.) ei mõjutanud IVF-i abil rasestumise määra (Shalika jt 1996). Samuti on uuritud bakteriaalse vaginoosi mõju IVF-i abil rasestumise määrale ja leitud, et bakteriaalne vaginoos ei mõjuta rasestumist (Liversedge jt 1999; Mangot-Bertrand jt 2013). Uuringu tulemused kinnitavad seda väidet.

Järeldused

Kõigi bakterite ja eraldi Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp. ning Corynebacterium spp. esinemissagedus ja kontsentratsioon uuritavates materjalides vähenevad sperma töötlemise käigus, kuid need suurenevad taas pesemisele järgneva sperma üleöö kehatemperatuuril inkubeerimise käigus. Eriti kõrged on vastavad näitajad viljastamise lahuses nr 2, mille põhjusi antud töö ei võimaldanud selgitada.

Mikroobide esinemine ei mõjutanud spermide liikuvust. Meeste suguteede põletikku võib seostada Staphylococcus spp. sagedasema esinemisega spermas. Bakteriaalse vaginoosi korral oli mikroobide osakaal viljastamiseks kasutatavates lahustes erinev. Nimelt leiti vaginoosiga naistel esimeses viljastamise lahuse tassis positiivne korrelatsioon Enterobacteriaceae ja teises negatiivne korrelatsioon Corynebacterium spp. esindajatega.

Uuritud bakterite rühmade esinemine viljastamise lahustes ei ole seotud kehavälise viljastamise tulemuslikkusega.

Allikaloend

Abeysundara, P. K., Dissanayake, D. M. A. B., Wijesinghe, P. S, Perera, R. R. D. P., Nishad, A. A. N. (2013). Effi cacy of two sperm preparation techniques in reducing non-specifi c bacterial species from human semen. Journal of Human Reproductive

Sciences, 6(2): 152–157. Al-Mously, N., Cross, N. A., Eley, A., Pacey, A. A. (2009). Real-time polymerase chain reaction shows that density centrifugation does not always remove Chlamydia trachomatis from human semen. Fertility and sterility, 92(5): 1606–1615. Bernard, K. (2012). Th e Genus Corynebacterium and Other Medically Relevant Coryneform-Like Bacteria. Journal of Clinical Microbiology, 50(10): 3152–3158. Kehavälise viljastamise efektiivsus ja kulud Eestis (2013). Tervisetehnoloogia hindamise raport TTH04. Tartu Ülikooli Tervishoiu Institut. Kiessling, A., Desmarais, B. M., Yin, H.-Z., Eyre, R. C. (2008). Detection and Identifi cation of Bacterial DNA in Semen. Fertility and sterility, 90(5): 1744–56. Korrovits, P., Punab., M, Türk, S., Mändar, R. (2006). Seminal Microfl ora in Asymptomatic Infl ammatory (NIH IV Category) Prostatitis. European Urology, 50: 1338–1346. Liversedge, N. H., Turner, A., Horner, P. J., Keay, S. D., Jenkins, J. M., Hull, M. G. R. (1999). Th e infl uence of bacterial vaginosis on in-vitro fertilization and embryo implantation during assisted reproduction treatment. Human Reproduction, 14(9): 2411-2415. Mangot-Bertrand, J., Fenollar, F., Bretelle, F., Gamerre, M., Raoult, Courbiere B. (2013).

Molecular diagnosis of bacterial vaginosis: impact on IVF outcome. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 32(4): 535–541. Manual of Assisted Reproductive Technologies and Clinical Embryology, 1st edition (2012). Lt Col Pankaj Talwar VSM. Jaypee Brothers Medical Publisher (P) Ltd. Moretti, E., Capitani, S., Figura, N., Pammolli, A., Federico, M. G., Giannerini, V.,

Collodel, G. (2008). Th e presence of bacteria species in semen and sperm quality.

Journal of Assisted Reproduction and Genetetics, 26(1): 47–56. Pelzer, E. S., Allan, J. A., Waterhouse, M. A., Ross, T., Beagley, K. W., Knox, C. L. (2013). Microoganisms within human follicular fl uid. PLoS ONE e59062. doi: 10.1371/journal. pone.0059062

Shalika, S., Dugan, K., Smith, R. D. J., Padilla, S. L. (1996). Th e eff ect of positive semen bacterial and Ureaplasma cultures on in-vitro fertilization success. Human

Reproduction, 11(12): 2789–2792. Weng, S.-L., Chiu, C.-M., Lin, F.-M., Huang, W-C., Liang, C., Yang T., Yang T.-Z., Liu,

C.-Y., Wu, W.-Y., Chang, Y.-A., Chang, T.-H., Huang, H.-D. (2014). Bacterial Communities in Semen from Men of Infertile Couples: Metagenomic Sequencing Reveals

Relationships of Seminal Microbiota to Semen Quality. PLoS One, 9(10): e110152. doi: 10.1371/journal.pone.0110152 WHO Laboratory Manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 4th edition (1999). Cambridge University Press.