Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHỬ SULFATE

vectorstock.com/27117080

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được tốt đồ án tốt nghiệp này, ngoài những kiến thức đã được học trong suốt 5 năm qua và sự tìm hiểu của bản thân, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xuân Đông đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian làm đồ án. Đồng thời, em cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học - Khoa Hóa- trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã có những góp ý hữu ích để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp của mình. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn là KS. Võ Công Tuấn và KS. Phạm Thị Kim Thảo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành tốt các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm tại bộ môn Công nghệ Sinh học. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ phản biện và các thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đã dành thời gian để xem xét đánh giá và góp ý cho đồ án tốt nghiệp của em.

Trong thời gian làm đồ án không thể tránh khỏi những thiếu sót, em kính mong quý thầy cô thông cảm và bỏ qua cho em.

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình, quý báu của các thầy cô và bạn bè.

Ngày 4 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Trịnh Thị Mỹ Hạnh

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang i

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC ..................................................................................................................ii DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ iv DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... vi DANH MỤC ĐỒ THỊ .............................................................................................vii TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................ viii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 2 1.1. Nước ngầm bị nhiễm phèn sắt và các vấn đề liên quan ...................................... 2 1.1.1. Tình trạng ô nhiễm nguồn nước ngầm ở Việt Nam ...................................... 2 1.1.2. Tình trạng nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt tại khu vực Đà NẵngQuảng Nam ................................................................................................................. 4 1.1.3. Nguyên nhân nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt...................................... 5 1.1.4. Ảnh hưởng của nước ngầm bị nhiễm phèn sắt ............................................. 7 1.1.5. Phương pháp xử lý nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt ............................ 7 1.2. Tìm hiểu chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) ....................................................... 9 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chủng vi khuẩn khử sulfate trong và ngoài nước ...... 9 1.2.2. Đặc tính sinh học ........................................................................................ 10 1.2.3. Đặc tính sinh lý ........................................................................................... 10 1.2.4. Giới thiệu vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus .............................................. 11 1.3. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 15 2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất sử dụng ................................................................. 15 2.1.1. Vật liệu ................................................................................................... 15 2.1.2. Thiết bị và hóa chất sử dụng .................................................................. 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 17 2.2.1. Thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự hiện diện của vi khuẩn SRB trong phân bò.17 2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn SRB .............................................. 18 2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi quang học (Hans Christian Gram, 1884) ................................................................. 24 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang ii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.4. Thử nghiệm tính di động của vi khuẩn ....................................................... 26 2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng SRB mới được phân lập.......... 27 2.2.6. Thiết kế mô hình khảo sát khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt của vi khuẩn khử sulfate (SRB) ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................. 28 2.2.7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .................................................... 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 36 3.1. Kết quả khảo sát sơ bộ sự hiện diện của vi khuẩn khử sulfate (SRB) trong phân bò ............................................................................................................................... 36 3.2. Kết quả quá trình phân lập và định danh vi khuẩn khử sulfate (SRB) ............. 36 3.2.1. Kết quả quan sát đặc điểm hình thái của khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch ..... 36 3.2.2. Kết quả nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ............ 37 3.2.3. Kết quả thử nghiệm tính di động của vi khuẩn khử sulfate (SRB)............ 38 3.3. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóacủa chủng vi khuẩn SRB vừa mới phân lập được ..................................................................................................................... 39 3.4. Kết quả khảo sát khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt.................................. 44 3.4.1. Kết quả sự thay đổi pH theo thời gian ........................................................ 45 3.4.2. Kết quả sự thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian .................................... 45 3.4.3. Kết quả sự thay đổi hàm lượng sulfate theo thời gian, thông qua việc đo hàm lượn H2S sinh ra ................................................................................................ 47 3.5. Giữ giống vi khuẩn SRB trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng ................. 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 49 4.1. Kết Luận ............................................................................................................. 49 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 55

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang iii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Báo động ô nhiễm nguồn nước ngầm ......................................................... 2 Hình 1.2: Nguồn nước bị nhiễm phèn sắt Hòa Vang - Đà Nẵng ................................ 5 Hình 1.3: Người dân thôn Tây Gia - Đại Lộc dùng nước nhiễm phèn sắt.................. 5 Hình 1.4: Một số bệnh ngoài da do sử dụng nước bị nhiễm phèn sắt ......................... 7 Hình 1.5: Ảnh hưởng của nước bị nhiễm phèn sắt tới trồng trọt và chăn nuôi .......... 7 Hình 1.6: Qúa trình khử sulfate thành sulfide của SRB............................................ 10 Hình 1.7: Hình thái vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus.............................................. 11 Hình 1.8: Qúa trình khử sulfate thành sulfide ........................................................... 13 Hình 1.9: Sự kết tủa ion sắt qua hoạt động sinh hóa của vi khuẩn ........................... 14 Hình 2.1: Mẫu phân bò.............................................................................................. 15 Hình 2.2: Mẫu nước thải ........................................................................................... 15 Hình 2.3: Mẫu nước bị nhiễm phèn sắt ..................................................................... 15 Hình 2.4: Qúa trình làm giàu vi khuẩn SRB ............................................................. 18 Hình 2.5: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri .......................... 21 Hình 2.6: Kỹ thuật trải đĩa......................................................................................... 23 Hình 2.7: Một số dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường rắn ...................................... 22 Hình 2.8: Các kiểu cấy ria trên đĩa thạch dinh dưỡng .............................................. 24 Hình 2.9: Thành tế bào vi ......................................................................................... 24 Hình 2.10: Các bước nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả ................................ 26 Hình 2.11: Mô hình xử lý nước nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm ......... 28 Hình 2.12: Máy đo pH .............................................................................................. 29 Hình 2.13: Một số dụng cụ và kỹ thuật cấy giữ giống trên thạch nghiêng ............... 34 Hình 3.1: Bình serum xuất hiện khí có mùi trứng thối ............................................. 36 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch ............................................................ 37 Hình 3.3: Kết quả nhuộm Gram bào tử vi khuẩn sulfate (SRB) .............................. 37 Hình 3.4: Kết quả nhuộm Gram mẫu đối chứng vi khuẩn Bacillus subtilis ............. 37 Hình 3.5: Tính di động của vi khuẩn SRB trong môi trường ................................... 38 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang iv

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6: Tính di động của vi khuẩn Lactobacillus casei trong môi trường ............ 38 Hình 3.7: Mô hình xử lý nước nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm ............ 44 Hình 3.8: Giữ giống vi khuẩn SRB trên môi trường thạch có lớp dầu .................... .48

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang v

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Các loại biết bị sử dụng chính .................................................................. 15 Bảng 2.2. Thành phần môi trường N92M1................................................................ 16 Bảng 2.3. Thành phần môi trường N92M2................................................................ 17 Bảng 3.1. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường khi sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau ..................................................... 39 Bảng 3.2. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường không bổ sung nấm men và môi trường có bổ sung 10% nấm men ......... …40 Bảng 3.3. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ khác nhau ....................................................... 41 Bảng 3.4. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường có điều kiện pH khác nhau ............................................................................ 42 Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn SRB mới phân lập được ..................................................................................................... 43 Bảng 3.6. Tóm tắt thí nghiệm xử lý nước bị nhiễm phèn sắt trên mô hình phòng thí nghiệm ....................................................................................................................... 44 Bảng 3.7. Sự thay đổi pH theo thời gian ................................................................... 45 Bảng 3.8. Kết quả đo OD510nm để xây dựng đường chuẩn ........................................ 45 Bảng 3.9. Sự thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian ............................................... 46 Bảng 3.10. Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian ............................................. 47

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang vi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Hàm lượng khí H2S tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường sử dụng nguồn cơ chất khác nhau ............................................................................. 40 Đồ thị 3.2: Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường không bổ sung nấm men và môi trường có bổ sung 10% nấm men ............. 41 Đồ thị 3.3: Hàm lượng khí H2S tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ khác nhau ................................................................... 42 Đồ thị 3.4: Hàm lượng khí H2S tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường có điều kiện pH khác nhau ........................................................................................ 43 Đồ thị 3.5: Sự thay đổi pH theo thời gian ................................................................. 45 Đồ thị 3.6: Đường tương quan tuyến tính giữa OD510nm và nồng độ [Fe2+].............. 45 Đồ thị 3.7: Sự thay đổi nồng độ Fe2+ theo thời gian ................................................. 46 Đồ thị 3.8: Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian ............................................. 47

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang vii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÓM TẮT LUẬN VĂN Tóm tắt – Đề tài nghiên cứu trình bày một số kết quả phân lập chủng vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria - SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt. Dựa trên một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, cấu tạo tế bào, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn phân lập được và khóa phân loại của Bergey (năm 1994) nhận thấy độ tương đồng với vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus đạt 60%. Khảo sát và đánh giá sơ bộ khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt của chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) ở quy mô phòng thí nghiệm và thu được kết quả khả quan: hàm lượng H2S tăng từ 45.7 mg/l lên 92.5 mg/l; Nồng độ ion sắt [Fe2+] giảm từ 57mg/l còn 28.6 mg/l; pH môi trường từ 3.8 tăng lên 7.4 sau 8 ngày khảo sát.

Từ khóa: Desulfovibrio Oxamicus; nước bị nhiễm phèn sắt; phân lập vi khuẩn; vi khuẩn khử sulfate; xử lý nước thải.

Abstract – Research project results present some isolated bacteria capable of reducing sulfate (Sulfate reducing bacteria-SRB) for applications in water treatment equipment iron alum. Based on some morphological characteristics of colonies, cellular, physiological characteristics, biochemistry of bacteria isolated and locked classification of Bergey (1994) found that the degree of similarity with bacteria Desulfovibrio oxamicus reached 60%. Surveys and preliminary assessment of the ability of water treatment equipment iron alum of sulfate reducing bacteria (SRB) in laboratory scale and obtained positive results: H2S content increased from 45.7mg/l to 92.5 mg/l; Iron ion concentration [Fe2+] decreased from 57mg/l was 28.6 mg/l; environmental pH from 3.8 to 7.4 after 8 day increase survey.

Key words: Desufovibrio Oxamicus; water treatment by infected feather alum; isolated bacteria; sulfate reducing bacteria; wastewater treatment

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang viii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI MỞ ĐẦU Nước là một nguồn tài nguyên vô cùng quý giá đối với con người. Cũng giống như không khí nước là một thành phần thiết yếu để duy trì cuộc sống. Con người, cây cối, thú vật đều cần nước để tồn tại. Trên trái đất, ¾ lãnh thổ là nước, nước trong các đại dương, ở biển, sông ngòi, ao hồ, nước ngầm ở trong lòng đất. Tuy nhiên nguồn nước sạch không phải dồi dào như chúng ta vẫn nghĩ.

Tốc độ công nghiệp hoá và đô thị hoá khá nhanh và với sự gia tăng dân số, cùng với đó là cơ sở hạ tầng yếu kém, lạc hậu, nhận thức của con người về vấn đề môi trường còn chưa cao…đã làm cho nguồn nước mặt đang ngày càng bị ô nhiễm một cách trầm trọng. Trong khi đó khí hậu đang biến đổi thất thường, nắng nhiều, sự bốc hơi nước cũng tăng lên theo là nguyên nhân của việc thiếu nước trầm trọng. Ở các khu vực miền núi, vùng sâu vùng xa, lượng nước mặt rất khan hiếm, người dân chủ yếu sử dụng nguồn nước ngầm để sinh hoạt và sản xuất. Một thực trạng đang diễn ra tại một số huyện của khu vực Đà Nẵng - Quảng Nam đó là nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt nặng. Gây ra những tác động xấu đến sinh hoạt, sản xuất của con người cũng như các vấn đề môi trường liên quan.

Có nhiều phương pháp để xử lý nước bị nhiễm phèn sắt như: phương pháp hóa học, sục khí, hay dùng thiết bị lọc,...tuy nhiên các phương pháp này khá tốn kém và không an toàn, thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp. Trước thực trạng đó, em xin đưa ra phương pháp sinh học đó là dùng vi khuẩn khử sulfate (SRB) để xử lý nước bị nhiễm phèn sắt. Vi khuẩn khử sulfate (SRB) là vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa hydro hay các hợp chất hữu cơ và tận thu năng lượng cho mục đích sinh trưởng. Lượng sulfide sinh ra trong quá trình khử sulfate có tác dụng kết tủa ion kim loại sắt. Góp phần giảm hàm lượng sulfate và ion sắt hòa tan trong nước.

Với tính cấp thiết như trên, em tiến hành đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt” tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nước ngầm bị nhiễm phèn sắt và các vấn đề liên quan 1.1.1. Tình trạng ô nhiễmnguồn nước ngầm ở Việt Nam Được cho là một tài nguyên quan trọng và quý giá nhưng hiện nay, trữ lượng và chất lượng nguồn nước ngầm ở Việt Nam đang ngày một suy giảm nghiêm trọng. Cụ thể, tình trạng ô nhiễm nguồn tài nguyên nằm sâu trong lòng đất này đang ở mức báo động, với những chỉ số hết sức đáng lo ngại. Bên cạnh yếu tố khách quan là sự biến đổi khí hậu, tình trạng xâm thực của nước mặn thì nguyên nhân quan trọng nhất vẫn chính là con người, với những chất thải công nghiệp, chất thải khu dân cư, thuốc bảo vệ thực vật…đang làm biến đổi nguồn nước ngầm hiện nay theo chiều hướng xấu đi [38].

Theo Tổng cục môi trường, Bộ Tài nguyên và Môi trường thì ở nước ta, nước ngầm chiếm khoảng 35% đến 40% tổng số lượng nước sinh hoạt của người dân.

Ngoài ra, nó còn là nguồn nước quan trọng của ngành nông nghiệp và công nghiệp.

Cụ thể, cả nước hiện nay có khoảng gần 300 nhà máy có sử dụng nước ngầm để biến nguồn tài nguyên thiên nhiên này thành sản phẩm phục vụ cuộc sống của con người. Cùng với đó là vô vàn các giếng đào, giếng khoan tự phát của người dân vùng nông thôn tiếp cận với nguồn nước ngầm để phục vụ sản xuất, tưới tiêu và sinh hoạt. Với trữ lượng khai thác đạt chừng 20 triệu m3 mỗi ngày nên đây có thể nói là tài nguyên cực kỳ quan trọng trong đời sống sinh hoạt cộng đồng. Tuy nhiên, theo rất nhiều các chuyên gia môi trường, nước ngầm ở Việt Nam đang bị xâm hại bởi những hóa chất độc hại từ những nhà máy, xí nghiệp, khu công nghiệp và cả khu dân cư. Cộng thêm đó là sự xâm thực của nước mặn khiến nước ngầm biến đổi, có tỷ lệ phèn cao khiến nó đang mất dần giá trị sử dụng [34].

Hình 1.1: Báo động ô nhiễm nguồn nước ngầm.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mặc dù nước ngầm đã được thiên nhiên chắt lọc bằng rất nhiều cơ chế khác nhau với sự thẩm thấu từ nguồn nước bề mặt nhưng nó cũng bị ảnh hưởng rất nhiều của nguồn nước bề mặt, khi nguồn nước này bị ô nhiễm. Những hóa chất độc hại mà các nghiên cứu gần đây tìm thấy ở các mẫu nước ngầm khắp các địa phương như Hà Nội, Đà Nẵng, đồng bằng sông Cửu Long…đang gióng lên hồi chuông báo động về những nguy hại mà chúng ta sẽ phải gánh chịu nếu không có những biện pháp kịp thời bảo vệ nguồn tài nguyên quý giá này [39].

Dựa theo kết quả của Trung tâm Quan trắc và Dự báo tài nguyên (Bộ Tài nguyên và Môi trường), hầu hết các kết quả nghiên cứu về nước ngầm thời gian vừa qua đều cho thấy rằng, nước ngầm đang bị ô nhiễm bởi những hóa chất độc hại. Cụ thể, ở khu vực đồng bằng Bắc Bộ, lượng amoni lên đến 23,3 mg/l, cao hơn 200 lần so với quy định về an toàn. Ngoài ra, khoảng 60% các mẫu quan sát được có chứa chất Mn (Mangan) vượt quá hàm lượng tiêu chuẩn hay khoảng 15% số mẫu thử có chứa hàm lượng Asen, một trong những hóa chất độc hại đối với sức khỏe con người, xuất hiện ở trong nước ngầm. Trong khi đó, tại khu vực đồng bằng Nam bộ, các mẫu quan sát được cho thấy, các hàm lượng chất Mn và mêtan cũng vượt ngưỡng cho phép. Cá biệt, nhiều nơi ở khu vực miền Tây Nam Bộ, nơi có địa hình thấp hơn, được bao phủ bởi nhiều hệ thống sông ngòi thì những hóa chất này cũng nhiều hơn. Ở khu vực miền trung, nếu trước kia, mực nước ngầm ở độ sâu 30 đến 45 mét thì nay, nhiều nơi giảm xuống tới hơn 50 mét. Vì thế, tình trạng hạn hán, thiếu nguồn nước tưới tiêu, sinh hoạt khiến con người, cây trồng, vật nuôi bị khát nước vừa qua đã khá phổ biến. Nhiều người dân than thở rằng, nếu trước kia chỉ cần đào sâu xuống lòng đất vài chục mét là chạm tới nguồn nước ngầm để sinh hoạt, tưới tiêu thì nay, họ phải dùng những mũi khoan lớn, có khi sâu hàng trăm mét mới có thể tìm ra mạch nước ngầm để sử dụng. Điều đó cho thấy, nguồn nước ngầm ở nhiều nơi đã sụt giảm nghiêm trọng, nhất là vào mùa khô khi mà trữ lượng nước bề mặt cũng bị giảm sút [35].

Hậu quả đầu tiên của tình trạng này là việc người dân đã phải sử dụng nguồn nước ngầm bị ô nhiễm và rất nhiều nguy cơ bệnh dịch có thể mắc phải. Như thời gian vừa qua, Bộ Y tế đã kiểm tra mẫu nước sạch tại Nhà máy nước Tương Mai, nơi cung cấp nước cho hàng ngàn hộ dân ở quận Hoàng Mai (Hà Nội) bằng nguồn nước SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ngầm thì phát hiện trong nước có chứa chất Amoni và Manganat. Đặc biệt, khi hai hóa chất này kết hợp với nhau sẽ sinh ra một số độc tố, gây hại trong cơ thể và có nguy cơ dẫn đến bệnh ung thư cho người sử dụng. Tuy nhiên, đây chỉ là một trong số các trường hợp về ô nhiễm nguồn nước ngầm được phát hiện và xử lý mà thôi.

Thói quen sử dụng nguồn nước ngầm bằng cách đào giếng, khoan giếng xuống lòng đất của người dân vẫn diễn ra ở hầu hết các vùng nông thôn trên khắp đất nước và đó là nguy cơ nhưng lại không có giải pháp cụ thể để hạn chế [38].

1.1.2. Tình trạng nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt tại khu vực Đà Nẵng Quảng Nam Trong tự nhiên, theo vòng tuần hoàn của nước, một phần nước được thẩm thấu vào đất và được giữ lại trong các lớp đất đá dưới lòng đất, đó là nước ngầm. Con người khai thác và sử dụng nước ngầm cho các hoạt động sinh hoạt, trồng trọt, thậm chí cho công nghiệp; dẫn đến sự cạn kiệt về tài nguyên nước ngầm và các lỗ hổng dưới lòng đất ngày nay, làm cho nguồn nước bị ô nhiễm nghiêm trọng đặc biệt là nước nhiễm phèn. Nhất là khu vực Đà Nẵng – Quảng Nam. Chỉ cách trung tâm thành phố Đà Nẵng chưa đầy 20km nhưng nhiều năm nay, hàng trăm hộ dân phải sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm. Xã Hòa Nhơn, huyện Hòa Vang có gần 3.400 hộ, trong đó hơn 98% bà con sử dụng nước ngầm. Đặc điểm của loại nước này là chứa nhiều sắt (Fe) mà ta còn gọi là nước nhiễm phèn. Chỉ tính riêng thôn Phú Hòa 1 có đến gần 400 hộ dân vẫn đang sử dụng nước giếng phèn chưa qua xử lý để sinh hoạt và sản xuất [37].

Còn đối với Hòa Khương, xã giáp ranh với xã Đại Hiệp, tỉnh Quảng Nam lại càng khó khăn hơn. Nhiều năm nay, thôn Phước Sơn, một trong những thôn xa nhất của xã Hòa Khương, luôn trong tình trạng thiếu nước sạch. Hầu hết nước giếng khoan và giếng đóng của bà con nhiễm phèn nặng, một số giếng gần suối khoáng nóng Phước Nhơn còn hơi lợ, bốc mùi phèn rất khó chịu. Qua kiểm tra mẫu nước do Sở Khoa học Công nghệ thành phố tiến hành, nước giếng của thôn Phước Sơn nhiễm phèn sắt nặng, vượt 18 lần tiêu chuẩn cho phép. Để có nước sạch, gia đình có điều kiện kinh tế khá hơn thì mua nước bình để dùng, còn hầu hết phải dùng bể lọc lắng phèn, song cũng chỉ hạn chế một phần nào đó chứ không xử lí được triệt để chất phèn và các tạp chất khác [36].

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 4

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.2: Nguồn nước bị nhiễm phèn sắt tại Hòa Vang- Đà Nẵng.

Cùng nỗi khổ thiếu nước sạch ,nhiều năm qua, hàng trăm hộ dân thuộc xã Đại Hồng, huyện Đại Lộc, Quảng Nam mỏi mòn chờ nước sạch. Nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn trầm trọng. Để có nguồn nước sinh hoạt, nhiều người dân thôn Hòa Hữu Tây, Hòa Hữu Đông (xã Đại Hồng) phải vay mượn hàng chục triệu đồng để khoan giếng, nhưng khi khoan xong đành phải bỏ vì nguồn nước bị nhiễm phèn, không sử dụng được [36].

Hay tại xã Đại Minh - Đại Lộc, đặc biệt là thôn Tây Gia, tình hình đã trở nên báo động. Toàn thôn có 420 hộ dân thì 1/3 trong số đó thiếu hụt nghiêm trọng nguồn nước sinh hoạt lẫn nước uống bởi nguồn nước mặt và nước ngầm tại khu vực này bị suy kiệt và ô nhiễm. Hơn 100 hộ dân đội 13 của thôn Tây Gia gần như điêu đứng khi toàn bộ giếng đào, giếng đóng đều bị nhiễm phèn và có mùi tanh hôi, không thể dùng để sinh hoạt. Gần đây, đội 13 có tới 5 trường hợp bị bệnh ung thư khiến người dân rất hoang mang [36].

Hình 1.3: Người dân thôn Tây Gia-Đại Lộc dùng nước nhiễm phèn sắt.

1.1.3. Nguyên nhân nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt Ở khu vực Đà Nẵng - Quảng Nam nước có độ acid cao, tức pH thấp, người SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dân gọi là nước phèn vì có vị chua. Kết quả nghiên cứu cho thấy acid trong nước phèn ở khu vực này là sulphuric acid. Được hình thành khi các khoáng sulfide (như pyrite, FeS2) trong quặng tiếp xúc với oxy và nước (Brown và cs, 2002).

Quá trình oxy hóa khoáng sulfide: FeS2 + 7/2O2 +H2O → Fe2+ + 2SO42- + 2H+ • Quá trình hình thành phèn sắt -

Giai đoạn hình thành khoáng pyrite FeS2:

Sự hình thành pyrite là nguy cơ của phèn hóa đất và nước.Trong quá trình phân hủy yếm khí sulfat bị chuyển thành hydrosulfua-SH. Sản phẩm này khử oxít sắt tạo thành sunfua sắt (FeS). Sau đó FeS chuyển hóa dần thành khoáng FeS2, pyrite dần dần bồi tụ lại thành tầng dày. Những vùng đất có tầng pyrite được gọi là đất phèn tiềm tàng.

-

Giai đoạn hình thành H2SO4:

Sự hình thành H2SO4 do oxy hóa pyrite là nguyên nhân trực tiếp làm đất và nước nhiễm phèn. Có nhiều nguyên nhân khác nhau làm cho oxy không khí xâm nhập sâu vào đất như: mực nước biển hạ thấp xuống, oxy hòa tan vào nước mưa rồi thấm vào đất, cây cối bề mặt chuyển từ phía trên thân lá xuống rễ và vào đất, con người khai phá đất…Đây là cơ hội để vi sinh vật (Thiobacillus ferrooxydants) trong đất oxy hóa pyrite làm nguồn năng lượng cho chúng hoạt động.

4FeS2 + 15O2 + 2H2O = 4Fe3+ + 8SO42- + 4H+ -

Giai đoạn phá hủy pyrite và hình thành Fe2+:

Khi môi trường có tính axit mạnh, quá trình oxy hóa pyrite (quá trình hóa sinh) chậm lại, nhưng quá trình phân hủy pyrite tạo thành Fe2+ (quá trình hóa học) tăng cường: FeS2 + 2Fe3+ = 3Fe2+ + 2S0 Đây là nguyên nhân hình thành ion Fe2+ trong nước phèn. Quá trình oxy hóa và phân hủy pyrite làm nước phèn tích tụ H+, SO42-, Fe2+, pH thấp…[3] • Đặc điểm của nước bị nhiễm phèn sắt: nước có hàm lượng ion Fe2+và SO42- cao, nước có mùi tanh và có nhiều cặn bẩn màu vàng. Làm giảm chất lượng nước ăn uống, sinh hoạt và sản xuất.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.4. Ảnh hưởng của nước ngầm bị nhiễm phèn sắt

Hình 1.4: Một số bệnh ngoài da do sử dụng nước bị nhiễm phèn sắt.

• Đối với con người: sử dụng nước bị nhiễm phèn sắt để ăn uống và sinh hoạt lâu ngày gây cho con người một số bệnh như: sỏi thận, tiêu chảy, ung thư da, ảnh hưởng đến khả năng lọc máu của thận,…Tắm rửa thì bị rộp da; làm cho các dụng cụ nhà bếp bị hoen ố; đường ống bằng kim loại bị ăn mòn.

• Ảnh hưởng tới môi trường: do nước chứa nhiều phèn sắt nên có màu đục gây mất cảnh quan môi trường, đồng thời nước có mùi trứng thối rất khó chịu.

• Ảnh hưởng tới hoạt động sản xuất: hàm lượng sắt cao gây hại cho cây trồng và vật nuôi, gây ăn mòn đường ống, thiết bị trong ngành công nghiệp.

Hình 1.5: Ảnh hưởng của nước bị nhiễm phèn sắt tới trồng trọt và chăn nuôi.

1.1.5. Phương pháp xử lý nguồn nước ngầmbị nhiễm phèn sắt Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp xử lý nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt như: • Khử sắt bằng phương pháp hóa chất: các chất oxy hóa mạnh thường sử dụng để khử sắt là: Cl2, KMnO4, O3 [2]…Phản ứng diễn ra như sau: 2Fe2+ + Cl2 + 6H2O → 2Fe(OH)3 ↓ + 2Cl- + 6H+ 3Fe2+ + KMnO4 + 7H2O → 3Fe(OH)3 ↓ + MnO2 + K+ + 5H+ SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 7

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Khử sắt bằng vôi: khi cho vôi vào nước, độ pH của nước tăng lên. Ở điều kiện giàu ion OH-, các ion Fe2+ thuỷ phân nhanh chóng thành Fe(OH)2 và lắng xuống một phần, thế ôxy hoá khử tiêu chuẩn của hệ Fe(OH)2/Fe(OH)3 giảm xuống, do đó sắt (II) dễ dàng chuyển hoá thành sắt (III). Sắt (III) hyđroxyt kết tụ thành bông cặn, lắng trong bể lắng và có thể dễ dàng tách ra khỏi nước [11].

• Khử sắt bằng phương pháp làm thoáng: Thực chất của phương pháp khử sắt bằng làm thoáng là làm giàu oxy cho nước, tạo điều kiện để Fe2+ oxy hóa thành Fe3+ thực hiện quá trình thủy phân để tạo thành hợp chất ít tan Fe(OH)3 rồi dùng bể lọc để giữ lại [11].

• Dùng tro bếp.

• Dùng hệ thống bể lọc nước.

Tuy nhiên các phương pháp trên còn nhiều mặt hạn chế như: - Phương pháp hóa học được sử dụng từ lâu và có hiệu quả nhanh chóng nhưng tốn kém và không an toàn, thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp (Skousen và cs, 1996).

- Lọc thô bằng vật liệu cát sạn ban đầu thì nước rất sạch nhưng sau một thời gian nước trở lại như cũ bởi vì các cặn bẩn đã làm tắc các vật liệu lọc làm cho tốc độ cũng như chất lượng lọc kém.

- Làm thoáng tự nhiên không hiệu quả, chỉ xử lý được rất ít.

- Sử dụng Công nghệ lọc chất lượng rất tốt nhưng giá thành cao.

• Phương pháp sinh học: Sử dụng vi khuẩn khử sulfate (SRB) [1].

Cơ sở khoa học công nghệ: vi khuẩn khử sulfate (SRB) là vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa hydro hay các hợp chất hữu cơ và tận thu năng lượng cho mục đích sinh trưởng [20].

Lượng sulfide sinh ra làm ion sắt trong nước kết tủa và lắng xuống bể xử lý, từ đó góp phần làm sạch nước bị nhiễm phèn sắt.

2CH2O + SO42- + H+-> H2S + 2HCO3H2S + Me2+ -> MeS + 2H+ Ưu điểm của phương pháp này là giá thành xử lý phù hợp, không tạo hóa chất tồn dư gây ô nhiễm thứ cấp, lượng cặn tạo ra từ kết tủa sulfide không đáng kể. Hơn SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 8

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nữa, kết tủa sắt dưới dạng sulfide bền vững không những an toàn với môi trường mà còn có thể thu hồi và tái chế [5].

1.2. Tìm hiểu chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chủng vi khuẩn khử sulfate trong và ngoài nước Trong những năm gần đây chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu để ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau và đã thu được những thành công nhất định.

Năm 2007, Abhishek Mishra và Anushree Malik đã nghiên cứu về khả năng sử dụng ethanol từ bã nhà máy chưng cất ethanol như là chất nền cho vi khuẩn khử sulfate (SRB) tăng trưởng và đánh giá hiệu quả loại bỏ kim loại nặng có trong nước thải giàu sulfate hữu cơ [18].

Năm 2008, Martijn F.M. Bijmans trong báo cáo luận văn tiến sĩ của mình ông đã công bố khả năng hoạt động của vi khuẩn khử sulfate trong môi trường acid để phục hồi một số kim loại chọn lọc như Fe, Pb, Cr,…[19].

Năm 2008, Nghiêm Ngọc Minh, Phạm Ngọc Long, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà đã nghiên cứu một số đặc điểm phân loại chủng kỵ khí khử sulfate BDNS3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin tại khu vực sân bay Đà Nẵng. Kết quả nghiên cứu đã đóng góp thêm những hiểu biết về nhóm vi sinh vật kỵ khí khử sulfate trong các lô xử lý ô nhiễm tại sân bay Đà Nẵng [10].

Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Huyền, Trương Đại Dương, Lại Thúy Hiền đã phát hiện được khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunfate ưa ấm

Desulfovibrio và Desulfuricans phân lập tại giếng khoan dầu khí mở Đại Hùng, Vũng Tàu [7].

Năm 2012, Nguyễn Thị Hải đã thực hiện đề tài Phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khoáng sản, theo đó tác giả đã phân lập và định danh được 3 chủng vi khuẩn khử sunfate là

Desulfomicrobium sp, Desulfobulbus sp , Desulfovibrio sp. Tác giả cũng khảo sát được mức độ xử lý nước thải của các chủng đó và kết quả đạt được sau 7 ngày gồm: pH tăng từ 4 lên 8,15, nồng độ sulfate giảm từ 13,75 mM còn 4,5 mM, hàm lượng sắt giảm từ 200 mg/l còn 36 mg/l thể hiện khả năng ứng dụng thực tế của công nghệ [4].

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 9

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2. Đặc tính sinh học SRB là vi khuẩn hô hấp kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa các hợp chất hữu cơ đơn giản và hydro. SRB được tìm thấy trong các ao, hồ trầm tích, trong phân trâu, bò…nơi chúng có vai trò quan trọng trong cả chu trình lưu huỳnh và chu trình cacbon [24] .

1.2.3. Đặc tính sinh lý • Nhu cầu dinh dưỡng của chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB): Hầu hết vi khuẩn SRB có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và sinh trưởng tốt trong môi trường có nguồn cacbon/năng lượng ổn định [28]. Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với SRB bao gồm các axit hữu cơ mạch ngắn như acetate, lactate, pyruvate và rượu [22].

• Phụ thuộc vào cách oxy hóa chất hữu cơ mà SRB có thể được phân chia thành hai nhóm trao đổi chất như sau [29]: - Nhóm oxy hóa không hoàn toàn: oxy hóa các hợp chất hữu cơ đến acetate.

Thuộc nhóm này chủ yếu là các loài thuộc chi Desulfovibrio spp.

- Nhóm oxy hóa hoàn toàn: Oxy hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả acetate) hoàn toàn thành CO2…Trong nhóm này có đa dạng các loài SRB khác nhau, như Desulfobac spp., Desulfobacterium spp., Desulfosarcina spp.

• Vi khuẩn SRB thực hiện trao đổi chất oxy hóa các cơ chất hữu cơ sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng (Postgate, 1984). Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử và các quá trình sinh hóa thông qua nhiều bước trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme [23].

Hình 1.6: Qúa trình khử sulfate thành sulfide của SRB.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 10

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.4. Giới thiệu vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus Vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus có thể tìm thấy trong đất, ruột động vật, trong phân, dưới đáy trầm tích của các ao tù nước ngọt và nước lợ…[7].

1.2.4.1. Phân loại Loài vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus thuộc Giới Bacteria; Ngành Proteobacteria;

Lớp:

Deltaproteobacteria;

Bộ

:

Desulfovibrionales;

Họ:

Desulfovibrionaceae; Chi:Desulfovibrio [34].

1.2.4.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1.7: Hình thái vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus.

- Desulfovibrio oxamicus là vi khuẩn Gram âm, thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí khử sulfate [20].

- Hình dạng khuẩn lạc được xác định khi nuôi cấy trên môi trường N92M [33] được lấy từ danh mục của bộ sưu tập “All-Russian collection of Microorganisms – VKM” trong điều kiện yếm khí ở 300C/48 giờ: khuẩn lạc có màu đen, nhỏ, tròn, mép khuẩn lạc không gọn có hình múi khế.

- Hình thái tế bào [34]: + Tế bào có kích thước khoảng 1× 2÷3µm. + Hình phẩy khuẩn, duy chuyển nhờ roi. + Không hình thành bào tử, cơ thể đơn bào.

1.2.4.3. Cấu trúc gen và tế bào học - D. Oxamicus có một bộ gen gồm 3.570.858 cặp Nu. Nhiễm sắc thể có tỉ lệ guanine và cytosine 64,2% [34].

- D. Oxamicus là một vi khuẩn Gram (-), nó có chung nhiều đặc điểm tương tự các vi khuẩn Gram (-) khác như: bắt màu đỏ hồng với thuốc nhuộm Gram, thành tế SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 11

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bào chỉ có một lớp peptidoglycan mỏng. Nó có một thành tế bào bao quanh nguyên sinh chất (periplasmic). Không gian periplasmic này là mạng lưới của các protein heme cytochrome c, màng bị ràng buộc và không ràng buộc cho phép hydrogenases cho khả năng thích ứng vượt trội của D. Oxamicus [26].

- Tế bào chứa Cytochrome c – là một phân tử protein lưu động, có vai trò như vật mang điện tử. Cytochrome c nằm ở mặt ngoài của màng trong ti thể, tiếp xúc với khoảng không giữa hai lớp màng và có nhiệm vụ chuyển điện tử từ các phức hợp III lên IV [26].

1.2.4.4. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa - D. Oxamicus là loài vi khuẩn yếm khí tùy nghi, có khả năng khử sulfate.

- Vi khuẩn D. Oxamicus có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và sinh trưởng tốt trong môi trường có nguồn cacbon/năng lượng ổn định [30]. + Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với vi khuẩn bao gồm các axit hữu cơ mạch ngắn như acetate, lactate, pyruvate, malat, và rượu [22][30]. + Nguồn Nito: chiết xuất cao nấm men amoni và các axit amin.

- Điều kiện cần cho sự sinh trưởng của D. Oxamicus: + Không cần chất kích thích tăng trưởng. + Khoảng pH 6,5÷8,0 với tối ưu ở 7,2÷7,4. + Nhiệt độ cho sự sinh trưởng: t0C = 25÷300C, tối ưu ở 300C. 1.2.4.5. Cơ chế làm sạch nước của vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus • Trong quá trình trao đổi chất để tăng sinh vi khuẩn D. Oxamicus thực hiện việc oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước thải bằng cách sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng [31].

CH2O + SO42-+H+ -> H2S + 2HCO3H2S + Me2+ -> MeS + 2H+ - Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử và các quá trình sinh hóa thông qua nhiều bước trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme [25].

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 12

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.8: Qúa trình khử sulfate thành sulfide.

• Phản ứng có thể được tóm tắt như sau: SO42- SO32-HSO3-HSS2• Qúa trình phân hủy kỵ khí hợp chất hữu cơ và kết tủa ion sắt kim loại trong nước phèn gốm các giai đoạn: + Giai đoạn phân hủy các chất hữu cơ cao phân tử: dưới tác dụng của enzyme Hydrogenases do vi khuẩn tiết ra, các phức chất và các chất không tan (lipid, protein, polysaccharides,…) được chuyển hóa thành các phức đơn giản hơn hoặc chất hòa tan (đường, các amino acid, acid béo). Quá trình này xảy ra chậm. Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào pH, kích thước hạt và đặc tính dễ phân hủy của cơ chất.

Chất béo thủy phân rất chậm [15]. + Giai đoạn acid hóa: vi khuẩn D. Oxamicus dùng sulfate làm chất oxi hóa, chuyển hóa các chất hữu cơ đơn giản thành các loại axit hữu cơ thông trường như axit axetic hoặc glixerin, axetat,…[15].

2CH3CHOHCOOH + H2SO4 CH3COOH + 2CO2 + 2H2O + H2S + Năng lượng + Sulfide hữu cơ sinh ra phản ứng với ion kim loại nặng trong nước như Fe, Cu, Cr,…tạo thành sulfua không hòa tan, kim loại độc chuyển thành dạng ít độc và không hòa tan. Phản ứng xảy ra như sau: Fe2+ + S2-FeS ↓ SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 13

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.9: Sự kết tủa ion sắt qua hoạt động sinh hóa của vi khuẩn D. Oxamicus.

Như vậy qua một chuỗi các hoạt động trao đổi chất của chủng vi khuẩn D. Oxamicus đã làm cho hàm lượng sulfate hữu cơ, hàm lượng ion kim loại sắt (II) giảm đáng kể, giảm màu, giảm mùi đồng thời làm cho pH của nước bị nhiễm phèn sắt tăng lên ở mức trung tính.

1.3. Tính cấp thiết của đề tài Nước là một nguồn tài nguyên vô cùng quý giá đối với con người. Cũng giống như không khí nước là một thành phần thiết yếu để duy trì cuộc sống. Con người, cây cối, thú vật đều cần nước để tồn tại. Thế nhưng một thực trạng đang diễn ra tại một số huyện của khu vực Đà Nẵng - Quảng Nam đó là nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt nặng. Gây ra những tác động xấu đến sinh hoạt, sản xuất của con người cũng như các vấn đề môi trường liên quan.

Có nhiều phương pháp để xử lý nước bị nhiễm phèn sắt như: phương pháp hóa học, sục khí, hay dùng thiết bị lọc,...Tuy nhiên các phương pháp này không thực sự mang lại hiệu quả cao vì khá tốn kém, không an toàn và thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp.

Với tính cấp thiết như trên, em đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt”. Nước sau khi xử lý được dùng cho hoạt động động trọt và chăn nuôi.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 14

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất sử dụng 2.1.1. Vật liệu

Hình 2.1: Mẫu phân bò. Hình 2.2: Mẫu nước thải.

Hình 2.3: Mẫu nước bị nhiễm

phèn sắt.

- Phân bò thu nhận tại trang trại nuôi bò của anh Đạt, ngụ tại Hòa Vang - Đà Nẵng.

- Mẫu nước thải để làm giàu vi khuẩn SRB được thu nhận từ trạm xử lý Phú Lộc-Hòa Minh-Đà Nẵng.

- Mẫu nước bị nhiễm phèn sắt tại xã Hòa Nhơn-Hòa Vang-Đà Nẵng.

2.1.2. Thiết bị và hóa chất sử dụng • Thiết bị Trong nghiên cứu này em sử dụng một số thiết bị chính sau: Bảng 2.1. Các loại biết bị sử dụng chính STT 01 02 03 04

Tên thiết bị Cân phân tích Máy đo pH Bếp đun Tủ cấy vô trùng

Model Nhà sản xuất Xuất xứ AUY220 Shimadu Nhật MP220 pH Metter Thụy sỹ HP-2100 Gali electric Trung Quốc ESCO SMART Esco Australia CONTROL MicroPte.Ltd 05 Tủ ấm INB500 Memmert Đức 06 Kính hiển vi quang học CX31RTSS Olympus Phillipine 07 Nồi hấp (Autoclave) CL-40L ALP Nhật 08 Nồi lên men để bàn BF-115 New Brunswick Mỹ 09 Máy ấm lắc SI500 Stuart Anh 10 Máy cất nước một lần 2104 GFL Đức 11 Tủ mát LC-300D Alaska Nhật Và các thiết bị thông dụng khác trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Dụng cụ - Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, lọ penicillin, lọ serum, ống đong 100ml và 200 ml, cốc thủy tinh 100ml và 250ml.

- Bình tia chứa nước vô trùng, bình xịt chứa cồn 900.

- Que cấy: que cấy vòng, que trang…

- Đèn cồn, bật lửa, eppendorf.

- Bông thấm nước và bông không thấm nước.

- Giấy báo, giấy kít nylon, găng tay, khẩu trang, viết.

• Hóa chất Để thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu em sử dụng các hóa chất chính như: - Nước cất vô trùng, cồn 700 và cồn 900 - Thuốc nhuộm Gram: gồm dung dịch tím kết tinh (Crystal violet), dung dịch Iốt, dung dịch tẩy màu Etanol, dung dịch nhuộm bổ sung Safranin.

- Thuốc thử 1,10-Phenantrolin.

- Các hóa chất như: BaCl2, KI, Na2S2O3, NaOH, HCl, hồ tinh bột,…

- Thành phần môi trường N92M1 dùng để phân lập vi khuẩn SRB [34].

Bảng 2.2. Thành phần môi trường N92M1.

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Thành phần K2HPO4 NH4Cl NaCl CaCl2x2H2O KCl MgSO4x7H2O Na2SO4 NaHCO3 Na2Sx9H2O Chiết xuất nấm men Axit lactic (40%) Nước cất Agar

Số lượng 0.2 0.3 1.0 0.16 0.5 0.4 3.0 1.0 0.3 0.1 1 1000 1,5÷2%

Đơn vị g g g g g g g g g g ml ml

Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 2 giờ.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 16

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Thành phần môi trường N92M2 dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn SRB [34].

Bảng 2.3. Thành phần môi trường N92M2.

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Thành phần K2HPO4 NH4Cl NaCl CaCl2x2H2O KCl MgSO4x7H2O Na2SO4 NaHCO3 Na2Sx9H2O FeSO4x7H2O Chiết xuất nấm men Axit lactic (40%) Nước cất

Số lượng 0.2 0.3 1.0 0.16 0.5 0.4 3.0 1.0 0.3 0.4 0.1 1 1000

Đơn vị g g g g g g g g g g ml ml ml

Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 2 giờ.

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự hiện diện của vi khuẩn SRB trong phân bò • Thí nghiệm khảo sát - Hòa tan 10g phân bò vào bình serum chứa 90ml nước thải giàu chất hữu cơ (thu nhận từ trạm xử lý Phú Lộc) [16].

- Ủ trong tủ ấm ở 300C trong vòng 5÷7 ngày.

• Thí nghiệm nhận biết sự xuất hiện của khí H2S - Nhận biết bằng cảm quan thông qua mùi của khí thoát ra.

- Nhận biết bằng hóa chất dùng dung dịch SO2 [17]. + Lấy 10ml dung dịch trong bình serum (sau ngày ủ thứ 7) cho vào ống nghiệm. + Cho từ từ dung dịch SO2 vào ống nghiệm trên.

Dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu trắng đục và sau chuyển thành màu vàng nhạt của tinh thể lưu huỳnh. Vì đã xảy ra phản ứng hóa học: 2H2S + SO2 3S↓ +2H2O SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 17

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn SRB

2.2.2.1. Phương pháp làm giàu kỵ khí vi khuẩn SRB [12].

- Mẫu phân bò có chứa vi khuẩn SRB được thu nhận và bảo quản trong tủ lạnh ở 40C và phân tích trong vòng 24h.

- Mẫu nước thải giàu chất hữu cơ thu nhận từ trạm xử lý Phú Lộc –Đà Nẵng và phân tích ngay.

- SRB có trong mẫu phân bò thu thập về được làm giàu bằng cách cấy vào bình serum chứa môi trường dịch thể kỵ khí giàu chất hữu cơ cho vi khuẩn khử sulfate SRB với tỷ lệ 10%, nuôi trong tủ ấm 300C. Các lần cấy truyền tiếp theo được tiến hành sau 5 ÷7 ngày nuôi cấy theo tỷ lệ 10% thể tích. Qua mỗi lần cấy truyền, số lượng vi khuẩn SRB trong mẫu được tăng lên [9].

Hình 2.4: Qúa trình làm giàu vi khuẩn SRB. SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 18

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn SRB a. Nguyên tắc [12].

- Phân lập vi khuẩn là quá trình tách rời một loại vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật ban đầu tạo thành các chủng thuần khiết để khảo sát và định loại.

- Sau khi gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc và ủ ở các điều kiện thích hợp các vi khuẩn sẽ tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc mang tính đặc trưng của từng loài vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn. Các nhà vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc.

- Môi trường chọn lọc là môi trường dùng để phân lập từng nhóm vi sinh vật riêng biệt từ một quần thể vi sinh vật trong tự nhiên. Dựa vào yêu cầu dinh dưỡng đặc biệt của từng nhóm vi sinh vật hoặc tính mẫn cảm khác nhau đối với hóa chất, với chất kháng sinh mà đưa thêm vào môi trường những chất tương thích, nhằm ức chế sự sinh trưởng của các nhóm vi sinh vật khác và giúp cho phân lập được nhóm vi sinh vật cần nghiên cứu. Có những môi trường chọn lọc được thiết kế dựa trên nhu cầu dinh đưỡng đặc biệt của từng nhóm vi sinh vật nhất định. * Lưu ý: Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng. b. Cách tiến hành Bước 1: Chuẩn bị môi trường - Chuẩn bị môi trường đặc để cấy trang vi sinh vật. Pha chế môi trường N92M1 với thể tích 100ml. Cân từng thành phần môi trường cho vào nước cất, lắc đều. Tiến hành lần lượt như thế đến hết các thành phần có trong môi trường.

- Xác định pH của môi trường bằng máy đo pH và dùng dung dịch HCl 1% hoặc NaOH 1M để điều chỉnh đến khoảng pH=7,2÷7,4.

- Cân agar (khối lượng bằng 1,5÷ 2% thể tích môi trường) rồi cho vào dung SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 19

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP dịch vừa pha chế (đối với môi trường lỏng N92M2 dùng để tăng sinh vi sinh vật tiến hành tương tự như pha chế môi trường đặc nhưng không bổ sung agar).

Bước 2: Khử trùng - Khử trùng môi trường vừa pha chế, các dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, ống nghiệm…bằng phương pháp hấp với hơi nước bão hoà ở áp suất cao (1210C, 1 atm, trong 2 giờ).

- Khử trùng buồng cấy: Dùng bông thấm cồn vệ sinh toàn bộ bề mặt thao tác đổ đĩa hay thao tác nuôi cấy vi sinh vật. Che chắn buồng cấy cẩn thận và bật tia UV trong 15 phút đề tăng hiệu quả khử trùng.

- Trong quá trình thao tác nuôi cấy vi sinh cần chú ý: các que cấy trải hay cấy ria cần được ngâm vào cồn 900 trong các ống nghiệm.

Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ.

Qúa trình được thực hiện trong tủ cấy vô trùng: - Đốt đèn cồn, mở bao giấy gói các đĩa petri đã hấp khử trùng.

- Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường. Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn.

- Mở hé nắp đĩa. Nghiêng bình, rót môi trường vào đĩa petri khoảng 15ml.

- Đậy nắp, xoay tròn đĩa để môi trường đông đặc trong phạm vi bán kính 20cm của ngọn lửa đèn cồn [12].

- Lật ngược đĩa lại, kít giấy nylon, gói giấy báo.

- Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện việc theo dõi, sử dụng và bảo quản. * Lưu ý: + Thao tác đổ môi trường phải nhanh và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. + Đối với ống nghiệm: để tăng sinh vi sinh vật trên môi trường lỏng thể tích môi trường cần phân phối là 5ml. + Đối với đĩa petri cho vào mỗi đĩa khoảng 15÷20ml môi trường đặc.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 20

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.5: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri.

Viết vào nhãn: Tên môi trường…………………tên người pha………………..... khử trùng ngày………..tháng………năm………………………..

Bước 4: Thu mẫu và pha loãng mẫu - Mẫu làm giàu ở lần thứ 2 được dùng để phân lập vi khuẩn SRB. - Hút 1ml mẫu làm giàu lần thứ 2, pha loãng với 9ml nước cất vô trùng. Sau đó dùng dịch pha loãng này để cấy trang trên đĩa petri.

Bước 5: Cấy trang trên môi trường N92M1 đặc.

- Dùng pipetman loại P200 với đầu côn vô trùng, hút 100µl dịch vi sinh pha loãng từ mẫu làm giàu lần thứ 2 chuyển vào các đĩa petri chứa môi trường đặc vô trùng.

- Nhúng đầu que trang thủy tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.

- Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa vài lần, mỗi lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy nylon.

- Nuôi trong bình hút chân không để hạn chế sự tiếp xúc với oxi không khí. Đảm bảo điều kiện nhiệt độ phòng 28÷300C và nuôi trong 48 giờ [12].

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.6: Kỹ thuật trải đĩa.

A. Que trải

B. Trải đĩa

C.Các khuẩn lạc mọc lên trên đĩa thạch.

Bước 6: Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch riêng biệt, ghi nhận hình thái và đặt ký hiệu cho từng khuẩn lạc riêng biệt.

2.2.2.3. Quan sát khuẩn lạc, mô tả đặc điểm khuẩn lạc trên đĩa thạch - Hình dạng: tròn, bầu dục hay không có hình dạng xác định.

- Kích thước: to, nhỏ bằng cách đo đường kính khuẩn lạc.

- Bề mặt khuẩn lạc: nhẵn bóng hay xù xì, nhăn nheo.

- Mép khuẩn lạc phẳng đều hay lồi lõm, răng cưa.

- Độ chắc của khuẩn lạc: mềm, cứng hay dai, có khả năng bám chắc vào môi trường hay không.

- Màu sắc của khuẩn lạc [13].

Hình 2.7: Một số dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường rắn.

Hàng 1: nhìn từ trên xuống, hàng 2: nhìn ngang, hàng 3: dạng rìa khuẩn lạc.

2.2.2.4. Phương pháp làm thuần a. Nguyên tắc SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 22

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chọn lọc các khuẩn lạc đơn sau khi phân lập sơ bộ, đem tăng sinh trên môi trường lỏng để gia tăng số lượng giống vi sinh vật đồng nhất về đặc điểm và hình thái do chúng bắt nguồn từ một tế bào hay một cụm tế bào ban đầu. Sau đó, vi khuẩn được làm thuần tiếp bằng cách cấy ria nhiều lần trên môi trường đặc [1]. b. Cách tiến hành Bước 1: Tăng sinh trên môi trường lỏng - Lần tăng sinh đầu tiên cho vào ống nghiệm 5ml môi trường lỏng N92M2.

Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy từng khuẩn lạc đặc trưng chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng tương ứng. Viết nhãn và ghi chú các loại ống nghiệm. Nuôi trong bình hút chân không ở 300C, trong 48h.

- Các lần tăng sinh tiếp theo, cho vào từng ống eppendorf 1ml môi trường N92M2 lỏng. Dùng que cấy vô trùng, lấy từng khuẩn lạc đặc trưng chuyển vào ống eppendorf. Viết nhãn và ghi chú các loại ống giống eppendorf, rồi đem ủ ở 300C trong bình hút chân không, nuôi trong 48h.

Bước 2: Cấy ria trên môi trường N92M2 đặc.

- Đốt đèn cồn, thao tác phải nhanh tay trong buồng cấy vô trùng.

- Để đĩa petri có chứa thạch dinh dưỡng lên bàn.

- Nung đỏ đầu que cấy vòng, làm nguội trong không khí khoảng 15s. Cho vòng que cấy chấm vào khuẩn lạc vi sinh vật đã được chọn lọc trên đĩa thạch dinh dưỡng.

- Tay trái hé mở nắp hộp thạch. Đặt đầu que cấy vào 1 góc hộp thạch, chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch theo đường zích zắc hay theo các kiểu khác [5].

- Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường zích zắc sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các khuẩn lạc mọc rời nhau ra. Đậy nắp hộp. Khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá.

- Ủ ở 300C trong bình hút chân không trong 48h.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 23

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.8: Các kiểu cấy ria trên đĩa thạch dinh dưỡng. a.Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch

b.Theo những đường song song

c.Theo 4 hình chữ chi 4 góc

d.Theo các kiểu khác

2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi quang học (Hans Christian Gram, 1884) 2.2.3.1. Nguyên lý - Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm do nhà khoa học người đan mạch Hans Christian Gram sáng chế năm 1884. Phương pháp này giúp phân biệt vi khuẩn bắt màu Gram (Gram dương) và vi khuẩn không bắt màu Gram (Gram âm), từ đó giúp cho việc chẩn đoán xác định loại vi khuẩn [1].

- Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của thành tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím kết tinh-iod không bị tẩy màu bởi cồn, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của phức hợp tím kết tinh, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của Safranin.

2.2.3.2. Cơ chế bắt màu Gram

a

b Hình 2.9: Thành tế bào vi khuẩn.

a. Vi khuẩn Gram (+) SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

b. Vi khuẩn Gram (-) Trang 24

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Có sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) về cấu tạo của lớp peptidoglycan ở thành tế bào vi khuẩn.

- Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày 15 đến 50 nm, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể-iot. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn (chỉ khoảng 10nm) và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài.

- Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên trong tế bào. Sau khi nhuộm với dung dịch bổ sung Safranin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram (+).

- Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu. Khi nhuộm fucshin vi khuẩn bắt màu đỏ hồng, đó là vi khuẩn Gram (-).

2.2.3.3. Vật liệu, hóa chất • Dụng cụ, thiết bị: Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết.

• Vật liệu: - Mẫu quan sát: khuẩn lạc SRB nuôi cấy trên môi trường thạch ở ngày thứ 2.

- Mẫu đối chứng: vi khuẩn Bacillus subtilis (của phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh Học - Khoa Hóa - Bách Khoa Đà Nẵng).

• Hóa chất - Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet- C25H30N3Cl.9H2O) - Dung dịch Iod (Iodine) - Dung dịch tẩy màu: Cồn tẩy 950 - Dung dịch nhuộm bổ sung: dung dịch Safranin (C20H19N4Cl ) 2.2.3.4. Các bước tiến hành [36] Bước 1: Chuẩn bị vết bôi SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 25

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.

Bước 2: Cố định tế bào Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2÷3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.

Bước 3: Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước, thầm khô.

Bước 4: Nhuộm bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

Bước 5: Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.

Bước 6: Nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin trong 2÷3 phút, rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ hồng (nhuộm safranin).

Bước 7: Soi kính, dùng vật kính dầu 100x.

Hình 2.10: Các bước nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.

2.2.4. Thử nghiệm tính di động của vi khuẩn • Mục đích: xác định khả năng di động của vi khuẩn • Cơ sở: vi sinh vật di động đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường [1].

• Cách tiến hành: - Chuẩn bị môi trường N92M2 thạch mềm (0,5% agar).

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 26

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Dùng đầu nhọn que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn, thận trọng di chuyển đầu que cấy trên một đường vào sâu trong ống nghiệm chứa môi trường thạch mềm, không chọc que cấy xuống tận đáy ống nghiệm.

- Nuôi trong bình hút ẩm khị khí ở nhiệt độ phòng, tiến hành quan sát sau 2÷3 ngày nuôi cấy.

- Tiến hành tương tự với mẫu đối chứng là vi khuẩn Lactobacillus casei, dùng môi trường Cao thịt- Peptone (Thành phần môi trường bao gồm: Agar 20g, peptone 10g, cao thịt 10g, NaCl 5g, hòa tan trong 40ml nước cất, thanh trùng ở 1210C/2h) [16].

- Quan sát hiện tượng xảy ra: + Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường, và phát triển lan ra khỏi vết cấy. + Vi khuẩn không có khả năng di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.

2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng SRB mới được phân lập Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [11].

Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương pháp truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại được sử dụng rộng rãi nhất là khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology) [24]. Để xác định được đâu là điều kiện tối ưu cho khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn SRB các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cơ chất, nguồn nito, yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, đã tuần tự được thực hiện.

Chủng vi khuẩn SRB được nuôi cấy trên môi trường N92M2 với sự thay đổi một số thành phần của môi trường như: nguồn cơ chất, nguồn nito, yếu tố nhiệt độ, pH. SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 27

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sự sinh trưởng của chủng này trong các điều kiện khác nhau được đánh giá thông qua hàm lượng H2S tạo thành (xác định bằng phương pháp chuẩn độ Iôt).

2.2.6. Thiết kế mô hình khảo sát khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt của vi khuẩn khử sulfate (SRB) ở quy mô phòng thí nghiệm

Hình 2.11: Mô hình xử lý nước nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm.

(1) Ngăn điều hòa chứa nước nhiễm phèn sắt đầu vào (2) Ngăn xử lý nước nhiễm phèn sắt bằng vi khuẩn SRB (3) Ngăn lắng chứa nước đầu ra sau khi xử lý • Nguyên vật liệu: - Nguồn nước bị nhiễm phèn sắt: được lấy tại xã Hòa Nhơn-Hòa Vang-Đà Nẵng với các đặc điểm lý hóa như sau: - pH = 3.8 - Nồng độ sắt : [Fe2+] = 57 mg/l - Nồng độ sulfide: [H2S] = 45.7mg/l - Gía thể: phoi bào được lót dưới đáy của bể xử lý.

- Nguồn vi sinh vật: Dịch làm giàu vi khuẩn SRB sau lần cấy truyền thứ 2.

• Nguyên lý hoạt động: Nước bị nhiễm phèn sắt được cho vào ngăn điều hòa số 1 để làm lắng một số cặn sỏi, cát có trong nước. Sau đó nước bị nhiễm phèn sắt được chuyển sang ngăn thứ 2 có chứa sẵn một lớp phoi bao phía dưới, đồng thới bổ sung dịch làm giàu vi khuẩn SRB sau lần cấy truyền thứ 2 vào. Ủ trong điều kiện kỵ khí trong vòng 8 ngày.

2.2.6.1. Khảo sát sự thay đổi pH của nước bị nhiễm phèn sắt qua quá trình xử lý bằng vi khuẩn SRB SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 28

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dùng máy đo pH để xác định sự thay đổi pH của nước bị nhiễm phèn sắt qua 8 ngày xử lý bằng vi khuẩn SRB.

Hình 2.12: Máy đo pH. • Đặc trưng kỹ thuật: dải đo pH: 0÷14; Khả năng đọc: 0,01 đơn vị pH • Mục đích sử dụng: Máy dùng để đo pH của các loại nước thải, nước mặt, nước ngầm...

• Hoạt động: - Cắm nguồn điện, bấm nút “ON/OFF” - Vặn nhẹ bình chứa dung dịch bảo quản điện cực (bên trong chứa dung dịch KCl 3M).

- Rửa lại điện cực bằng nước cất, thấm khô.

- Cài đặt giá trị chuẩn: + Bấm “Cal” + Cho đầu đo vào dung dịch pH chuẩn ( pH 7, pH 4, pH 10). Đợi giá trị hiển thị trên màn hình đúng như pH chuẩn, bấm “Cal” để mặc định.

- Đo dung dịch cần đo.

- Sau khi đo xong bấm nút “ON/OFF” để tắt máy.

- Đóng đầu điện cực vào bình chứa dung dịch bảo quản điện cực và treo lên giá.

2.2.6.2 Xác định hàm lượng Hydro sulfua trong nước nhiễm phèn sắt bằng phương pháp chuẩn độ Iot [14] a. Nguyên tắc

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 29

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào phản ứng oxi hóa khử giữa S2- và I2 khi cho một lượn dư Iot đã biết trước thể tích và nồng độ vào trong mẫu nước có chứa H2S. I2 + H2S = 2HI + S Sau đó chuẩn độ ngược lượng dư Iot bằng dung dịch natrithiosunfat (Na2S2O3) với chỉ thị hồ tinh bột.

2Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 + 2NaI Từ đó xác định hàm lượng H2S có trong mẫu nước. b. Dụng cụ: - Bình định mức 100ml - Bình tam giác 250ml - Ống chuẩn độ 25ml - Ống hút các loại c. Hóa chất: - Dung dịch Iot 0,01N: hòa tan 3,5g KI trong ít nước cất, cho tiếp 1,27g I2 vào trong dung dịch KI, định mức thành 1 lit.

- Dung dịch natrithiosunfat 0,01N. - Dung dịch hồ tinh bột 0,5%: cân 0,5g hồ tinh bột và hòa tan trong 100ml nước cất, khuấy cho tan hết và đun sôi để nguội. d. Trình tự tiến hành: Lấy chính xác 100ml mẫu nước thử cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào 20ml dung dịch I2 0,01N, 0,5ml HCl đậm đặc, lắc đều và để yên trong bóng tối khoảng 10 phút sau đó thêm 1ml dung dịch hồ tinh bột rồi đem chuẩn độ mẫu nước thử bằng dung dịch natrithiosunfat 0,01N chuyển từ màu xanh sang không màu thì kết thúc chuẩn độ. Ghi thể tích dung dịch natrithiosunfat 0,01N tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ.

Tiến hành một thí nghiệm trắng với 100ml nước cất và tiến hành tương tự. e. Tính toán kết quả: Hàm lượng H2S của mẫu thử được tính theo công thức sau:

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 30

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

. . 17 . 1000 / V

Trong đó: - V1: thể tích dung dịch Na2S2O3 tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ với mẫu thử (ml) - V2: thể tích dung dịch Na2S2O3 tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ với mẫu trắng (ml) - N: nồng độ của dung dịch Na2S2O3 đem chuẩn độ (N) - 17: đương lượng gam của H2S - V: thể tích mẫu nước thử (ml) 2.2.6.3. Xác định tổng sắt hòa tan bằng phương pháp trắc phổ dùng thuốc thử 1,10-phenantrolin (DIN 38406 E1-1, 1983) [14]. a. Nguyên lý Sắt bị khử thành dạng Fe2+ bằng cách đun sôi với acid và hydroxylamine sau đó được xử lý với 1,10-phenantrolin. Ba phân tử phenantrolin tạo hợp chất càng cua với mỗi một nguyên tử Fe2+ tạo thành phức chất có màu đỏ- cam.

Fe(OH)3 + 3H+ Fe3+ + 3H2O 4Fe3+ + 2NH2OH  4Fe2+ + N2O +H2O +4H+

Phức chất [Fe(phe)3]2+ có độ hấp thu cao nhất đo ở bước sóng (λmax) 510nm, cường độ màu khá bền trong khoảng pH từ 2,5 đến 9 và màu sắc tỷ lệ với hàm lượng Fe (II).

Quan hệ giữa nồng độ sắt và độ hấp thu là tuyến tính. b. Dụng cụ - Máy đo quang phổ có thể đo ở bước sóng 510nm - Cuvet - Màng lọc kích thước lỗ trung bình 0,45 µm SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 31

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Micropipet 1000µl - Bình định mức 50ml - Bình tam giác 250ml c. Hóa chất - Axit sulfuric - Dung dịch đệm acetate: Hòa tan 40g amoni acetate CH3COONH4 và 50ml axit acetic CH3COOH trong nước và pha loãng tới 100ml.

- Hydroxylamine NH2OH, dung dịch 100g/l: hòa tan 10g hydroxylamine trong nước. Thêm nước đến 100ml.

- Dung dịch 1,10-phenantrolin: Hòa tan 0,5g 1,10-phenentrolin clorua ngậm một phân tử nước (C12H9ClN2.H2O) trong nước và pha loãng 100ml.

- Dung dịch Sắt chuẩn 10mg/l. d. Trình tự tiến hành • Xác định độ hấp thu của mẫu - Lọc mẫu ngay sau khi lấy mẫu, axit hóa dung dịch lọc cho đến pH bằng 1 (khoảng 1ml axit sulphuric đậm đặc cho 100ml mẫu).

- Lấy 50ml mẫu cho vào bình tam giác.

- Khử thành sắt (II) thêm 1ml hydroxylamine và trộn kỹ. Thêm 2ml dung dịch đệm acetat và chỉnh pH = 3.5÷5.5, tốt nhất là 4.5.

- Sự tạo thành chất hấp thu: thêm 2ml dung dịch 1,10-phenantrolin vào dung dịch và để ở chỗ tối trong khoảng 15 phút.

- Đo quang: đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 510nm bằng máy quang phổ.

• Lập đường chuẩn Chuẩn bị dung dịch chuẩn: chuẩn bị dãy dung dịch Sắt chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0 đến 5mg/l bằng cách pha loãng từ dung dịch sắt chuẩn 10mg/l vào bình định mức 50ml: Dung dịch Sắt 10mg/l (ml) Nước cất (ml) Nồng độ Sắt đạt được (mg/l) SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

50 0 0

49,5 0,5 0,1

47,5 2,5 0,5

45 5,0 1

40 10 2 Trang 32

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cho các dung dịch này vào bình tam giác 250ml sau đó xử lý như đối với mẫu thử.

Dựng đường chuẩn: Với mỗi dãy dung dịch Sắt chuẩn, chuẩn bị đồ thị chuẩn bằng cách đặt nồng độ dung dịch Sắt (mg/l) trên trục hoành tương ứng với độ hấp thu trên trục tung. Từ đồ thị này và độ hấp thu của dung dịch trong mẫu thử suy ra được nồng độ Sắt trong mẫu thử đó. e. Tính kết quả Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ C và độ hấp thụ quang A của mẫu chuẩn, lập phương trình tương quan dạng A = aC + b.

Trong đó : + A: độ hấp thụ quang + C: nồng độ của mẫu chuẩn (mg/l) Sau khi thiết lập phương trình, chúng ta thế độ hấp thụ quang (AM) của mẫu nước cần phân tích vào phương trình chúng ta sẽ tính được nồng độ (CM) của Fe có trong mẫu nước.

b

2.2.7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 2.2.7.1. Nguyên tắc Bảo quản giống thực chất là quá trình hạn chế hay đình chỉ sự trao đổi chất, sự sinh sản và phát triển…của các chủng vi sinh vật cần quan tâm trong các điều kiện môi trường khác nhau. Giống vi sinh vật là một yếu tố quan trọng quyết định tới chất lượng và năng suất của quá trình sản xuất. Chính vì vậy, ta phải tiến hành bảo quản sao cho giống vẫn giữ được nguyên tính chất, đặc điểm hình thái và đặc biệt là hoạt lực của nó trong thời gian dài. Tùy vào đặc tính của mỗi loài vi sinh vật mà có cách bảo quản giống khác nhau, sau đây là một số phương pháp bảo quản giống vi sinh vật: - Phương pháp cấy truyền vi sinh vật định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/lần).

- Phương pháp bảo quản lạnh sâu.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 33

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Trộn vi sinh vật với glycerol, tỉ lệ 1:20 và giữ ở nhiệt độ -200C. - Phương pháp đông khô vi sinh vật .

- Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt [12].

Hình 2.13: Một số dụng cụ và kỹ thuật cấy giữ giống trên thạch nghiêng. a. Que cấy vòng b. Pipet Pasteur

b. que cấy hình kim d, g, h. Một số kiểu cấy

2.2.7.2. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền nhiều lần cụ thể là hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi trường thạch có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm. Lớp parafin này sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxygen không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch nên nồng độ, các chất hoà tan không bị thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống của vi sinh vật. Những chủng đã được xử lý ở trên, sau đó được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4÷50C và có thể bảo quản nhiều năm [2].

- Yêu cầu của phương pháp này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay vazơlin phải trung tính, có độ nhớt cao, không chứa các sản phẩm độc với vi sinh vật và vô trùng.

- Cách bảo quản: + Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 1210C trong 2h. Sau đó sấy khô ở tủ sấy (1700C) trong 1÷ 2h; để nguội.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 34

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2. Để nguội 45oC. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2. + Sau đó giống được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4÷50C [2].

- Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trường không bị mất nước và khô. Giống bảo quản dưới lớp dầu khoáng sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình thường.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 35

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát sơ bộ sự hiện diện của vi khuẩn khử sulfate (SRB) trong phân bò Để khảo sát sự hiện diện của SRB (tạm đặt tên là SBR) nhằm rút ngắn quá trình phân lập nhóm nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm quan sát, cảm quan và xử lý bằng phản ứng hóa học với các mẫu được xử lý trong bình serum. Nhận thấy các hiện tượng như sau: Thứ nhất, trong bình serum xuất hiện bọt khí, ngửi có mùi trứng thối của khí H2S.

Hình 3.1: Bình serum xuất hiện khí có mùi trứng thối.

Thứ hai, khi cho từ từ dung dịch SO2 vào ống nghiệm có chứa dịch ủ của phân bò và nước thải giàu chất hữu cơ (sau 7 ngày ủ) thì dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu trắng đục và sau chuyển thành màu vàng nhạt của tinh thể lưu huỳnh. Vì đã xảy ra phản ứng hóa học: 2H2S + SO2  3S↓ +2H2O Kết quả thí nghiệm chứng minh trong bình serum đã xảy ra quá trình khử sulfate thành sulfide dưới sự hoạt động của vi khuẩn khử sulfate. Từ đó, nhóm tác giả sử dụng mẫu nguyên liệu đem xử lý trong bình serum để phân lập vi khuẩn SRB. 3.2. Kết quả quá trình phân lập và định danh vi khuẩn khử sulfate (SRB) 3.2.1. Kết quả quan sát đặc điểm hình thái của khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch Sau khi cấy dung dịch làm giàu có chứa vi khuẩn khử sulfate (SRB) trên môi trường thạch N92M chọn lọc trong điều kiện kỵ khí 48h, thì trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc (hình 3.2).

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 36

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quan sát hình thái các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, nhận thấy một số đặc điểm như sau: - Khuẩn lạc có hình dạng: tròn, nhỏ.

- Bề mặt khuẩn lạc xù xì, mép khuẩn lạc không đều, hình răng cưa.

- Màu sắc: khuẩn lạc có màu đen.

- Độ chắc của khuẩn lạc: mềm, có khả năng bám dính vào môi trường [7].

Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch.

Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Huyền (2011) khi phân lập vi khuẩn khử sulfate Desulfovibrio ưa ấm sử dụng dầu thô về đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch.

3.2.2. Kết quả nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học Bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quang học, nhóm tác giả thu được một số kết quả như sau (hình 3.3 và 3.4):

Hình 3.3:Kết quả nhuộm Gram bào tử vi khuẩn sulfate (SRB).

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Hình 3.4:Kết quả nhuộm Gram mẫu đối chứng vi khuẩn Bacillus subtilis.

Trang 37

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Bào tử vi khuẩn sulfate (SRB) bắt màu đỏ tía với thuốc nhuộm Gram, chứng tỏ đây là vi khuẩn Gram (-). Còn bào tử của mẫu đối chứng là vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu xanh với thuốc nhuộm Gram, đây là vi khuẩn Gram (+).

- Hình thái tế bào: hình phẩy khuẩn, kích thước 1x2÷3µm.

Kết quả nhuộm Gram và hình thái tế bào vi khuẩn khử sulfate (SRB) quan sát được hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu năm 2012 của Nguyễn Thị Hải về đề tài “Phân lập vi khuẩn khử sulphate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khoáng sản”, công bố trên Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(7): 42 – 40, 2012 [9].

3.2.3. Kết quả thử nghiệm tính di động của vi khuẩn khử sulfate (SRB) Năm 1996, Hao OJ, Chen JM, Huang L, Buglass RL, “Sulphate reducing bacteria”, Crit. Rev. Enviro. Sci. Technol., 26, pp. 155-187.Theo đó Hao OJ và cộng sự đã nghiên cứu được khả năng di động của chủng vi khuẩn khử sulfate [22].

Tiến hành quan sát hiện tượng xảy ra trong 2 ống nghiệm sau 2÷3 ngày nuôi cấy. Kết quả thu được như sau: - Mẫu thí nghiệm:chủng vi khuẩn SRB + Vi khuẩn làm đục môi trường + Phát triển lan ra khỏi vết cấy.

- Chứng tỏ vi khuẩn SRB có khả năng di động nhờ sử dụng lông roi.

- Mẫu đối chứng: vi khuẩn lactobacillus casei không có khả năng di động. + Môi trường không bị đục. + Vi khuẩn phát triển quanh đường cấy.

Hình 3.5: Tính di động của vi khuẩn SRB trong môi trường.

Hình 3.6: Tính di động của vi khuẩn Lactobacillus casei trong môi trường.

Từ những kết quả thu được qua quá trình phân tích trên, cho thấy vi khuẩn phân lập được từ phân bò thuộc chủng vi khuẩn khử sulfate và được ký hiệu là vi SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 38

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khuẩn SRB. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu về vi khuẩn khử sulfate đã công bố trong và ngoài nước [5][7][10][23].

3.3. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn SRB vừa mới phân lập được Để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương pháp truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại được sử dụng rộng rãi nhất là khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology) [23].

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như: nguồn cơ chất, nguồn nitơ, nhiệt độ, pH để xác định được đâu là điều kiện tối ưu cho khả năng sinh trưởng của vi khuẩn SRB. Sự sinh trưởng của chủng này trong các điều kiện khác nhau được đánh giá thông qua hàm lượng H2S tạo thành (xác định bằng phương pháp chuẩn độ Iôt).

Kết quả thu được như sau: Bảng 3.1. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường khi sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau Nguồn cơ chất Lacte Acetate Methanol

Ngày thứ 2 125.2 72.4 103.5

Ngày thứ 4 147.3 75.8 115.3

Ngày thứ Ngày thứ 6 8 186.2 203.4 82.1 85.3 127.8 130.7

Ngày thứ 10 225.7 90.1 145.8

Khi nuôi cấy chủng vi khuẩn SRB trên môi trường có các nguồn cơ chất cacbon khác nhau, qua 10 ngày khảo sát ta thấy: vi khuẩn SRB tăng trưởng mạnh nhất trên môi trường có bổ sung lacte làm nguồn cơ chất, tăng trưởng bình thường trên môi trường có methanol và tăng trưởng kém trên môi trường có acetate là nguồn cơ chất. Điều này được thể hiện rõ qua đồ thị 3.1 bên dưới.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 39

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đồ thị 3.1: Hàm lượng khí H2S tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường sử dụng nguồn cơ chất khác nhau.

Kết quả thu được bên trên hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu khác nhau trên thế giới về khả năng sử dụng lactate là nguồn cung cấp hidro cacbon chính cho hoạt động của vi khuẩn khử sulfate [Rabus et.al., 1996; Kniemyer et.al., 2003; Ommedal, Torsvik, 2007; Nakagawa et.al., 2008].

Bảng 3.2. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường không bổ sung cao nấm men và môi trường có bổ sung 10% cao nấm men Nguồn Ngày thứ Nitơ 2 Không bổ sung cao 125.2 nấm men Có bổ sung 10% cao 148.5 nấm men

Ngày thứ 4

Ngày thứ 6

Ngày thứ 8

Ngày thứ 10

147.3

186.2

203.4

225.7

195.4

226.7

267.6

285.2

Qua 10 ngày khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn khử sulfate trên hai môi trường khác nhau. Môi trường không bổ sung cao nấm men và môi trường có bổ sung 10% cao nấm men. Ta thấy khả năng sinh trưởng của chủng SRB tăng rõ rệt khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung thếm 10% cao nấm men làm nguồn cung cấp nito. Điều này được thể hiện rõ qua đồ thị 3.1 bên dưới.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 40

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đồ thị 3.2: Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường không bổ sung cao nấm men và môi trường có bổ sung 10% cao nấm men.

Bảng 3.3. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ 200C 300C 370C 450C

Ngày thứ 2 15 51.2 15.5 8.9

Ngày thứ 4 31.2 68.4 42.4 16.2

Ngày thứ 6 57.4 83.8 63.8 35.4

Ngày thứ 8 67.2 102 81.2 65.1

Ngày thứ 10 81 113 92.1 72.6

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn SRB cho thấy chủng này không sinh trưởng được ở 40C và 550C. Có khả năng sinh trưởng trong dải nhiệt độ từ 200C đến 450C và sinh trưởng tối ưu ở 300C. Điều này được thể hiện rõ qua đồ thị 3.3.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 41

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đồ thị 3.3: Hàm lượng khí H2S tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ khác nhau Kết quả này phù hợp với điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn khử sulfate đã được nghiên cứu [Davidova et al., 2006; Cravo-Lauveau et al., 2007; Ommedal, Torsvik, 2007; Madigan et al., 2009].

Bảng 3.4. Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường có điều kiện pH khác nhau pH 5 6.5 7 7.5 8.5

Ngày thứ 2 35.1 41 41 50.2 35.4

Ngày thứ 4 44.1 65.4 75.7 84.1 45.3

Ngày thứ 6 65.2 74.2 85.5 94.8 62.4

Ngày thứ 8 70.1 81.5 91.1 97 62.6

Ngày thứ 10 82 94.2 98.7 112 78.4

Môi trường trung tính là môi trường thích hợp với đa số vi khuẩn. Đối với vi khuẩn khử sulphate, khoảng pH thích hợp nhằm trong khoảng 6÷9. Tuy nhiên đối với chủng vi khuẩn SRB pH tối ưu nhất cho sự tăng trưởng nằm trong khoảng 7÷7.5. Tuy vậy chủng cũng có thể sống được nếu pH giảm xuống đến 5 hay tăng lên 8.5. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới [ Dang et al., 1996; Lien, Beeder, 1997; Feio et al., 2004].

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 42

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đồ thị 3.4: Hàm lượng khí H2S tạo thành của chủng vi khuẩn SRB trong môi trường có điều kiện pH khác nhau Từ những nghiên cứu trên, có thể tóm tắt những kết quả thu được về đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn SRB mới phân lập được trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn SRB mới phân lập được STT Đặc điểm 1 Hình thái các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch: - Hình dạng khuẩn lạc - Bề mặt khuẩn lạc - Màu sắc khuẩn lạc - Độ chắc của khuẩn lạc 2 3 4 5

6

Nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học.

Tính di động của vi khuẩn Đặc tính sinh lý: - pH môi trường - Nhiệt độ môi trường Đặc tính sinh hóa - Nguồn Cacbon - Nguồn Nito

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Kết quả - Tròn, nhỏ.

- Xù xì, mép khuẩn lạc không đều, hình răng cưa.

- Khuẩn lạc có màu đen.

- Mềm, có khả năng bám dính vào môi trường.

Vi khuẩn Gram (-) - Hình phẩy khuẩn - Kích thước 1x2÷3µm Vi khuẩn có khả năng di động nhờ roi.

-pH=6.5÷8, tối ưu ở khoảng pH=7÷7.5 - t0=20÷370C, tối ưu ở 300C -Sinh trưởng tốt trên nguồn cơ chất lacte.

-Nguồn nitơ bổ sung: chiết xuất cao nấm men Trang 43

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of SystematicBacteriology) [23]. Có thể kết luận chủng vi khuẩn phân lập được từ phân bò là chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB), và có độ tương đồng khoảng 60% với vi khuẩn Desulfovibrio Oxamicus.

3.4. Kết quả khảo sát khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm Bảng 3.6. Tóm tắt thí nghiệm xử lý nước bị nhiễm phèn sắt trên mô hình phòng thí nghiệm Nước bị nhiễm phèn sắt: - pH = 3.8 -Nồng độ sắt: [Fe2+] = 57 mg/l - Hàm lượng H2S: [H2S]= 45.7mg/l .

Nguồn nước thải giàu chất hữu cơ dùng để làm giàu vi khuẩn SRB.

Nguồn SRB từ dịch làm giàu lần thứ 2.

Hình 3.7: Mô hình xử lý nước nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm.

(1) Ngăn điều hòa chứa nước nhiễm phèn sắt đầu vào (2) Ngăn xử lý nước nhiễm phèn sắt bằng vi khuẩn SRB (3) Ngăn lắng chứa nước đầu ra sau khi xử lý Nguyên lý hoạt động: Nước bị nhiễm phèn sắt được cho vào ngăn điều hòa để làm lắng một số cặn sỏi, cát có trong nước. Sau đó nước bị nhiễm phèn sắt được chuyển sang ngăn thứ 2 có chứa sẵn một lớp phoi bao phía dưới, đồng thời bổ sung dịch làm giàu vi khuẩn SRB sau lần cấy truyền thứ 2 vào. Ủ trong điều kiện kỵ khí trong vòng 8 ngày.

Sau 8 ngày khảo sát khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm ta thu được kết quả sau:

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 44

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4.1. Kết quả sự thay đổi pH theo thời gian Bảng 3.7. Sự thay đổi pH theo thời gian Thời gian (ngày) pH

0 3.8

1 5

2 5.4

3 5.7

4 6.0

5 6.3

6 6.8

7 7

8 7.4

Sau 8 ngày xử lý nước bị nhiễm phèn sắt bằng vi khuẩn SRB thì pH của môi trường tăng lên từ 3.8 lên 7.4, đưa môi trường nước lên mức trung tính.

Đồ thị 3.5: Sự thay đổi pH theo thời gian.

3.4.2. Kết quả sự thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian Bảng 3.8. Kết quả đo OD510nm để xây dựng đường chuẩn [Fe2+]mg/l OD510nm

0 0

0.1 0.003

0.5 0.013

1 0.03

5 0.096

K 1.075

Đồ thị 3.6: Đường tương quan tuyến tính giữa OD510nm và nồng độ [Fe2+].

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 45

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Kết quả đo OD510nm của mẫu nước bị nhiễm phèn sắt theo thời gian: +Trước khi xử lý với SRB: OD510K(0) = 1.075 nm y=0.0188x+0.0036 Mà y=1.075 1.075=0.0188x+0.0036 x=57 (mg/l ) Vậy nồng độ [Fe2+] trong mẫu nước nhiễm phèn sắt ban đầu là: [Fe2+]=57mg/l Thực hiện phép đo tương tự ta có bảng sau: Bảng 3.9. Sự thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian Thời gian (ngày) [Fe2+] (mg/l) (mẫu thí nghiệm) [Fe2+] (mg/l) Số liệu đối chứng [6]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

57

55.4

51.6

46.3

43.7

37.1

32.8

30.1

28.6

60.2 56.9

51.1

43.8

38.2

34.5

30.2

26.1

22.8

Đồ thị 3.7: Sự thay đổi nồng độ Fe2+ theo thời gian.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 46

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4.3. Kết quả sự thay đổi hàm lượng sulfate theo thời gian, thông qua việc đo hàm lượn H2S sinh ra Bảng 3.10. Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian Thời gian (ngày) [H2S] (mg/l) (mẫu thí nghiệm) [H2S] (mg/l) (Số liệu đối chứng) [6]

0

45.7

1

2

3

51.2

59.1

68.4

4

5

77.6 85.3

6

7

8

88.3

90.7

92.5 102.1

40.2

47.8

56.2

69.5

80.1 88.3

95.7

98.3

Đồ thị 3.8: Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian.

Như vậy qua quá trình xử lý nước bị nhiễm phèn sắt trong quy mô phòng thí nghiệm bằng vi khuẩn khử sulfate (SRB) ta thấy: nồng độ sulfate, nồng độ [Fe2+] đều giảm đồng thời pH môi trường tăng lên sau 8 ngày khảo sát. Điều này chứng tỏ khả năng khử khử sulfate và loại bỏ ion sắt ra khỏi nước bị nhiễm phèn sắt của chủng vi khuẩn SRB. 3.5. Giữ giống vi khuẩn SRB trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng Để hạn chế hay đình chỉ sự trao đổi chất, sự sinh sản và phát triển…của vi khuẩn SRB trong các điều kiện môi trường khác nhau. Ta phải tiến hành bảo quản sao cho giống vẫn giữ được nguyên tính chất, đặc điểm hình thái và đặc biệt là hoạt lực của nó trong thời gian dài.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 47

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sử dụng phương pháp giữ giống vi khuẩn SRB trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng. Giống được giữ trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4÷50C.

Hình 3.8: Giữ giống vi khuẩn SRB trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết Luận SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 48

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Qua quá trình thực hiện đề tài: ““Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt ”. Nhóm nghiên cứu đã thu được một số kết quả như sau: 1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn SRB vừa mới phân lập được như sau: - Sinh trưởng tốt trên nguồn cơ chất lacte.

- Nguồn nitơ bổ sung: chiết xuất cao nấm men.

- Điều kiện môi trường: + pH=6.5÷8, tối ưu ở khoảng pH=7÷7.5 + Nhiệt độ: t0=20÷370C, tối ưu ở 300C Dựa vào khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of SystematicBacteriology) [23]. Có thể kết luận chủng vi khuẩn phân lập được từ phân bò là chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB), và có độ tương đồng khoảng 60% với vi khuẩn Desulfovibrio Oxamicus.

2. Khảo sát và đánh giá sơ bộ khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt của chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) trong quy mô phòng thí nghiệm và thu được kết quả khả quan: hàm lượng H2S, nồng độ [Fe2+] giảm, đồng thời pH môi trường tăng lên sau 8 ngày khảo sát. Cụ thể: - Hàm lượng H2S tăng từ 45.7 mg/l lên 92.5 mg/l.

- Nồng độ ion sắt [Fe2+] giảm từ 57mg/l còn 28.6 mg/l.

- pH môi trường từ 3.8 tăng lên 7.4 3. Giữ giống vi khuẩn SRB bằng phương pháp: giữ giống vi sinh vật trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng.

4.2. Kiến nghị Do thời gian, hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị…nghiên cứu có hạn nên nhóm nghiên cứu chỉ mới thu được những kết quả như trên và xin đề xuất một số nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện quá trình phân lập và khảo sát hoạt tính của vi khuẩn khử sulfate (SRB): • Phương pháp phân tích trình tự gen 16S rDNA: gen 16S rDNA của chủng phân lập trên được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 49

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (AGAGTTTGATCCTGGTCAG) (weisburg và cs,1991) để xây dựng được cây phân loài và định danh được chủng vi khuẩn khử sulfate SRB phân lập được [32].

• Khảo sát khả năng xử lý của vi khuẩn khử sulphate SRB với các kim loại nặng độc hại khác như: Crom, đồng, kẽm, uranium,…

• Nghiên cứu điều khiển quá trình lên men để sản xuất ra chế phẩm vi sinh có khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng (chủ biên), Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003).

Vi sinh vật Học. NXB Giáo Dục.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 50

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [2] Vũ Thị Minh Đức (2001). Giáo trình Thực Tập vi sinh vật học. NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, trang 28-39.

[3] Đặng Thị Cẩm Hà (2006). Giáo trình Công nghệ Sinh học bảo vệ môi trường. Trường ĐHBK Đà Nẵng.

[4] Nguyễn Thị Hải (2012). “Phân lập vi khuẩn khử sulphate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khoáng sản”. Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 6 + 7, trang 42 – 40.

[5] Lại Thúy Hiền, Đặng Phương Nga (1998). “Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn KSF phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, tạp chí khoa học 20(2): 33-38.

[6] Lại Thúy Hiền, Lê Phi Nga (1992). “Nghiên cứu khả năng gây ăn mòn kim loại của vi khuẩn Desulfovibrio vulgaris”. Tạp chí sinh học 14(4): 26-29.

[7] Nguyễn Thị Thu Huyền, Trương Đại Dương, Lại Thúy Hiền (2011). “Vi khuẩn khử sulphate ưa ấm sử dụng dầu thô Desulfovibrio Desulfuricans DH3P phân lập từ giếng khoan dầu khí mỏ Đại Hùng, Vũng Tàu”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ biển T11. Số 4. Trang 21-33.

[8] Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhật (2012). Giáo trình Thực tập Vi Sinh Đại Cương. Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh.

[9] Biền Văn Minh (2003). Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật kiểm định ở Thừa Thiên Huếdùng làm đối tượng dạy thực hành vi sinh vật tại khoa sinh, trường ĐHSP-ĐH Huế. Tạp chí khoa học giáo dục số 3, trường ĐHSP Hà Nội, trang 84-86.

[10] Nghiêm Ngọc Minh, Phạm Ngọc Long, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2008). “Nghiên cứu một số đặc điểm phân loại chủng kỵ khí không bắt buộc BDNS3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin tại khu vực sân bay Đà Nẵng”.

Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(3): 391-396, 2008.

[11] Đoàn Thị Hoài Nam (2008). Giáo trình Công Nghệ Sinh Học Môi Trường. Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.

[12] Lê Xuân Phương (2010). Giáo Trình Thí Nghiệm Vi Sinh Vật Học. Khoa Hóa, Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 51

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [13] Lê Xuân Phương (2008). Giáo trình Hình thái, Cấu tạo và đặc tính cơ bản của vi sinh vật. Khoa Hóa, Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.

[14] Võ Công Tuấn (2012). Giáo trình Thí nghiệm kỹ thuật phân tích trong công nghệ Sinh Học. Khoa Hóa, trường Đại học Bách Đà Khoa Nẵng.

[15] Trần Thị Thanh (2009). Công nghệ vi sinh. NXB giáo dục Việt Nam. [16] Trần Linh Thước (2005). Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước,Thực Phẩm Và Mĩ Phẩm. NXB Giáo Dục.

[17] Đào Hữu Vinh, Từ Vọng Nghi (1996). Các phương pháp hóa phân tích – tập 1. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội.

Tài liệu Tiếng Anh [18] Abhishek Mishra and Anushree Malik (2007). “Heavy metal removal from synthetic wastewaters in an anaerobic bioreactor using stillage from ethanol distilleries as a carbon source”. Environmental science and Technology, DOI: 10,1080 / 10934529.2011.627044.

[19] Bijmans, M.F.M., (2008).” Sulfate reduction under acidic conditions for selective metal recovery”. Thesis Wageningen doctorship, Wageningen, The Netherlands. Netherlands Research School for the Socio-Economic and Natural Sciences of the Environment.

[20] DeMaré, Frank, Donald M. Kurtz Jr, và Pär Nordlund. " Desulfovibrio vulgaris rubrerythrin rubredoxin". (1996): 539-546.

[21] Gallegos-Garcia M., Celis L.B., Rangel-Mendez R., Razo-Flores E ( 2009).

Precipitation and recovery of metal sulfides from metal containing acidic wastewater in a sulfidogenic down-flow fluidized bed reactor. Biotechnol and Bioeng., 102:91-99.

[22] Hao OJ, Chen JM, Huang L, Buglass RL (1996). “Sulphate reducing bacteria”. Crit. Rev. Enviro. Sci. Technol., 26, pp. 155-187.

[23] Hemme, Christopher, và Judy Wall (2004). "Insights Desulfovibrio vulgaris Hildenborough". Omics Integrative Biology 8: 43-55.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 52

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [24] Holt J.G, Krieg N.R.,Sneath PHA., Staley J.T., Williamss.T (1994).

“Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”, Ninth Edition, The wiliams willins company, pp, 88-145.

[25] Kremer DR, Hansen TA (1988). “Pathway of propionate degradation in Desulfobulbus propionicus”. FEMS Microbiol. Lett., 49, pp. 273-277.

[26] Lovley, Derek, và Elizabeth Phillips (1994). "Cromat Desulfovibrio vulgaris và c3 cytochrome". 60: 726-728.

[27] Lansing M. Prescott, john P. Harley, Donal A. Klein (2005). Microbiology.

Mc Graw Hill Science.

[28] Metcalf and Eddy (March 26, 2002). Wastewater Engineering : Treatment and Reuse. McGraw-Hill [29] Peck HD, Lissolo T (1988). “Assimilatory and dissimilatorymsulphate reduction: enzymology and bio energentics”. The Ntrogen and Sulphur Cycles, pp.

99-132.

[30] Postage JR (1984). The sulphate reducing bacteria. Cambridge Univertsity Press, Cambridge.

[31] Widdel F (1988). “Microbiology and ecology of sulphate- and sulphurreducing bacteria”. in Biology of Anaerobic Microorganism, pp. 469-585.

[32] Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991). "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study". J. Bacteriol., 173: 697–703.

Tài liệu internet [33] <http://www.findpatent.ru/patent/235/2355756.html> (Ngày 20.09.2014) [34] <http://www.ncbi.nlm.nih.gov> (Ngày 25.10.2014) [35]<http://www.decc.com.vn/khoa-hoc-va-doi-song/87-hi-tho-tp-nhung phuong-phap-xu-ly-nuoc-nhiem-phen> ( Ngày 02.01.2015) [36]

<http://danviet.vn/dien-dan-ban-doc/quang-nam-hang-tram-ho-dan-moi-

mon-cho-nuoc-sach-534297.html> (Ngày 02.01.2015) [37]

<http://www.danang.gov.vn/portal/page/portal/danang/chinhquyen/diem

_bao?p_pers_id=&p_folder_id=9370276&p> (Ngày 15.02.2015) [38] <http://en.wikipedia.org/wiki/Gram_staining> (Ngày 07.03.2015) SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 53

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [39] <http://maxreading.com/sach-hay/viet-nam-moi-truong-va-cuoc-song/dacdiem-cua-tai-nguyen-va-moi-truong-nuoc-luc-dia-cua-viet-nam-11342.html> (Ngày 03.04.2015)

PHỤ LỤC SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 54

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Một số công thức pha hóa chất.

1.Pha thuốc nhuộm Gram • Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): + 2g tím kết tinh hoà tan trong 20ml etanol 95% . + 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất.

Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.

• Dung dịch Iod:Hoà tan 1g Iod (Iodine) trong 3÷5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.

• Dung dịch tẩy màu:Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.

• Dung dịch nhuộm bổ sung:Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.

2. Pha dung dịch đệm acetate Hòa tan 40g amoni acetate CH3COONH4 và 50ml axit acetic CH3COOH trong nước và pha loãng tới 100ml.

3. Pha dung dịch 1,10-phenantrolin Hòa tan 0,5g 1,10-phenantrolin clorua, ngậm một phân tử nước (C12H9ClN2.H2O) trong nước và pha loãng 100ml. Có thể thay thế bằng cách hòa tan 0,42g 1,10-phenantrolin ngậm một phân tử nước (C12H9N2.H2O) trong 100ml nước chứa hai giọt axit clohydric HCl. Dung dịch này ổn định trong một tuần nếu được bảo quản trong tối.

4. Pha hóa chất trong thí nghiệm xác định nồng độ H2S • Dung dịch Iot 0,01N: Hòa tan 3.5g KI trong ít nước cất, cho tiếp 1,27g I2 vào trong dung dịch KI, định mức thành 1 lít.

• Dung dịch Natrithisunfat (Na2S2O3) 0,01N: Pha từ ống chuẩn có bán trên thị trường.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 55

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Dung dịch hồ tinh bột 0,5%: Cân 0,5g hồ tinh bột và hòa tan trong 100ml nước cất, khuấy cho tan hết và đun sôi để nguội.

SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH

Trang 56